Αλκαλική Φωσφατάση. τους οργανισµούς από τους οποίους έχουν αποµονωθεί και χαρακτηρισθεί ένζυµα µε τη συγκεκριµένη ενεργότητα.

HTML
DOWNLOAD

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "Αλκαλική Φωσφατάση. τους οργανισµούς από τους οποίους έχουν αποµονωθεί και χαρακτηρισθεί ένζυµα µε τη συγκεκριµένη ενεργότητα."

Νικάτωρ Αντωνιάδης
8 χρόνια πριν
Προβολές:

1 Αλκαλική Φωσφατάση Από τα βακτήρια στα Θηλαστικά Οι αλκαλικές φωσφατάσες είναι συνήθως διµερείς, µη ειδικές φωσφοµονοεστεράσες. Συναντώνται σε µια µεγάλη ποικιλία οργανισµών από βακτήρια έως θηλαστικά. Οι προκαρυωτικοί µικροοργανισµοί Bacillus subtilis και Escherichia coli, ο ζυµοµύκητας Saccharomyces cerevisiae, τα θηλαστικά ποντίκι και άνθρωπος είναι ορισµένοι από τους οργανισµούς από τους οποίους έχουν αποµονωθεί και χαρακτηρισθεί ένζυµα µε τη συγκεκριµένη ενεργότητα. οµή της αλκαλικής φωσφατάσης από το βακτήριο Escherichia coli. Η συγκεκριµένη πρωτεΐνη είναι ένα οµοδιµερές µεταλλοένζυµο που καταλύει την µη ειδική υδρόλυση φωσφορικών µονοεστέρων σε ανόργανο φώσφορο και αλκοόλη. Η όλη δοµή είναι περίπου 100Åχ50Åχ50Å µε τα ενεργά κέντρα να απέχουν µεταξύ τους 30Å, τοποθετηµένα στις αντίθετες πλευρές του µορίου (Εικόνα 1). Το ένζυµο έχει µια α/β δοµή µε 10 περιφερικές α έλικες και στο κέντρο µια β-πτυχωτή επιφάνεια. Κάθε ενεργό κέντρο φέρει δύο ισχυρά προσδεµένα ιόντα ψευδαργύρου (Zn1 και Zn2) και ένα ιόν µαγνησίου. Οι τρεις αυτές θέσεις δέσµευσης µετάλλων είναι κοντά τοποθετηµένες η µια µε την άλλη σε µια τριγωνική διάταξη. Οι θέσεις πρόσδεσης ψευδαργύρου απέχουν 4Å µεταξύ τους και η θέση πρόσδεσης µαγνησίου απέχει 5Å από την θέση Zn2 και 7Åαπό την Zn1. Εικόνα 1. Σχηµατική αναπαράσταση της δευτεροταγούς δοµής της της αλκαλικής φωσφατάσης από το βακτήριο Escherichia coli

2 Εφαρµογές της αλκαλικής φωσφατάσης. Η αλκαλική φωσφατάση είναι ένα ένζυµο µε πολύ σηµαντικό λειτουργικό ρόλο για τα θηλαστικά. Χαρακτηριστικό παράδειγµα είναι η θνησιγόνος γενετική ασθένεια του ανθρώπου υποφωσφατασία, που οφείλεται στην έλλειψη ενεργότητας αλκαλικής φωσφατάσης στα οστά. Στην επιστήµη της ιατρικής, τα επίπεδα της αλκαλικής φωσφατάσης στον ανθρώπινο ορό είναι πολύ σηµαντικά για την διάγνωση φυσιολογικών ή παθολογικών καταστάσεων άµεσα συσχετιζόµενων µε το σκελετό, το ηπατοχοληφόρο σύστηµα και τον πλακούντα. Αξιοσηµείωτο είναι άλλωστε ότι τα τεστ για αλκαλική φωσφατάση αποτελούν περισσότερο από το 1/4 των συνολικά χρησιµοποιούµενων τεστ για ανίχνευση ενζυµικών ενεργοτήτων σε κλινικά εργαστήρια. Επίσης, η αλκαλική φωσφατάση χρησιµοποιείται ευρέως ως αντιδραστήριο σε µια σειρά τεχνικών της µοριακής βιολογίας. Η αποµάκρυνση φωσφόρου από τα άκρα DNA και RNA τµηµάτων, η δηµιουργία υβριδικών πρωτεϊνών για την µελέτη της έκφρασης διαφόρων γονιδίων, η σύνδεση του ενζύµου σε αντισώµατα για χρήση σε ενζυµικές ανοσοπροσροφητικές δοκιµασίες (ELISA), η χρήση του ενζύµου για ενεργοποίηση φθορίζοντων υποστρωµάτων στη διαδικασία µη ραδιενεργής ανίχνευσης DNA και RNA µορίων είναι ορισµένες µόνο από τις εφαρµογές του ενζύµου σε ένα σύγχρονο εργαστήριο µοριακής βιολογίας. Αλκαλική φωσφατάση από το ανταρκτικό στέλεχος ΤΑΒ5. Γενικά, υψηλότερη καταλυτική ενεργότητα σε χαµηλές και µεσαίες θερµοκρασίες σε συνδυασµό µε αυξηµένη θερµοαστάθεια είναι χαρακτηριστικά ψυχρόφιλων ενζύµων. Είναι λογικό εποµένως ένζυµα από ψυχρόφιλους οργανισµούς που εµφανίζουν υψηλή δραστικότητα αφενός να παρουσιάζουν µεγάλο βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον και αφετέρου να αποτελούν πηγή πληροφοριών σχετικά µε τις προσαρµογές των ψυχρόφιλων πρωτεϊνών. Πρόσφατα κλωνοποιήθηκε από το ανταρκτικό στέλεχος ΤΑΒ5 ένα γονίδιο που κωδικοποιεί πρωτεΐνη µε ενεργότητα αλκαλικής φωσφατάσης. Η αλκαλική φωσφατάση ΤΑΒ5 εκφράστηκε σε βακτηριακά στελέχη E. coli. Η ανασυνδυασµένη πρωτεΐνη παρουσιάζει χαρακτηριστικά ψυχρόφιλου ενζύµου δηλαδή υψηλή καταλυτική ενεργότητα σε χαµηλές θερµοκρασίες και αξιοσηµείωτη θερµοευαισθησία. Το τρισδιάστατο µοντέλο του ενζύµου υποδηλώνει ότι η αλληλουχία διατηρεί όλες τις χαρακτηριστικές µορφές που εντοπίζονται στο πυρήνα και το ενεργό κέντρο διαφόρων µορίων µε ενεργότητα αλκαλικής φωσφατάσης.

3 Υπερέκφραση της ανασυνδυασµένης πρωτεϊνης ΤΑΒ5ΑΡ σε κύτταρα Ε. coli Πραγµατοποιείται µετασχηµατισµός σε Bl21 plys E. coli κύτταρα µε το κατάλληλο πλασµιδιακό φορέα (TAB5AP-peT26b). Από ένα φρέσκο πιάτο συλλέγεται µια µοναδική αποικία µε την οποία µολύνεται υγρή καλλιέργεια LB/αµπικιλίνη + χλωραµφενικόλη. Ακολουθεί ολονύκτια επώαση στους 30 0 C υπό ανάδευση. Την άλλη µέρα γίνεται προσθήκη 1ml της προκαλλιέργειας σε 50ml φρέσκου θρεπτικού µέσου LB/ αµπικιλίνη + χλωραµφενικόλη και επωάζεται στους 25 0 C έως ότου η οπτική απορρόφηση στα 600nm να είναι Ακολουθεί προσθήκη IPTG (IsoPropyl-beta-D- ThioGalactopyranoside) σε τελική συγκέντρωση 0.1mM και επώαση για άλλες 12 ώρες (είναι προτιµότερο αυτή η επώαση να γίνει στους 20 0 C). Έπεται εναπόθεση της καλλιέργειας σε πάγο (4 0 C) για 5 λεπτά, φυγοκέντρηση για 25 λεπτά στις 5.000rpm στους 4 0 C, συλλογή της βακτηριακής πελέτας και αποθήκευση στους C. Μετασχηµατισµός Ε. coli κυττάρων ΤΑΒ5ΑΡ pet26b Επαγωγή υπερέκφρασης µε προσθήκη IPTG Συλλογή της κυτταρικής πάστας Φυγοκέντρηση Αποθήκευση στους C

4 Πειραµατικό σκέλος 1 ου Εργαστηρίου ιάρρηξη των βακτηριακών κυττάρων µε λυσοζύµη. 1. H βακτηριακή πάστα οµογενοποιείται σε ίσο όγκο σε ml µε τα γραµµάρια της, διαλύµατος 50mM Tris-Cl ph7.6, 200mM NaCl, 1mM DTT. 2. Στη συνέχεια προστίθενται 300µg/ml λυσοζύµης (διαλυµένης σε 10mM Tris-Cl ph 8.0), η ίδια ποσότητα προστίθεται µετά από 45min ενώ η διαδικάσία διεξάγεται υπό ανάδευση στους 4 o C 3. Ταυτόχρονα µε τη λυσοζύµη προστίθεται στο αναδευόµενο για 90min διάλυµα και PMSF (σε τελική συγκέντρωση 1mM). Η προσθήκη PMSF επαναλαµβάνεται ανά 30min.(PMSF :Αναστολέας πρωτεασών) 4. Μετά την 90λεπτη επώαση προστίθενται 10mM MgCl2 και 10µg/ml DNaseI. Ακολούθησε επώαση 60min υπό ανάδευση. 5. Πραγµατοποιείται φυγοκέντρηση στις rpm, στους 4 ο C, για 60min. 6. Το υπερκείµενο συλλέγεται και αποθηκεύεται στους -20 o C. 7. Πραγµατοποίηση ενζυµικής δοκιµής (Assay) για ανίχνευση ενεργότητας αλκαλικής φωσφατάσης στο υπερκείµενο: π- νιτροφαίνυλο φωσφορικό Κίτρινη απόχρωση π-νιτροφαινόλη 5µl PNP (p-nitrophenylphosphate) 100µl AP Buffer (20mM γλυκίνη ph 10, 10mM MgCl 2, 10% γλυκερόλη) 5µl υπερκείµενο (Παρατήρηση εµφάνισης κίτρινου χρώµατος )

5 Στάδιο Υψηλού Καθαρισµού Αφού το ένζυµο έχει υποστεί την απαραίτητη προεπεξεργασία ακολουθεί ο καθαρισµός του µε τεχνικές υγρής χρωµατογραφίας στήλης. Η προεπεξεργασία είναι συνήθως τέτοια, ώστε το ενζυµικό διάλυµα: να µην περιέχει αδιάλυτα συστατικά, να έχει χαµηλό ιξώδες, να έχει κατάλληλα ρυθµισµένους τους παράγοντες ph, ιοντική ισχύ, θερµοκρασία, µεταλλοϊόντα και σταθεροποιητές της ενζυµικής δραστικότητας. Οι χρησιµοποιούµενες τεχνικές υγρής χρωµατογραφίας στήλης για τον καθαρισµό ενζύµων είναι κυρίως τρεις: χρωµατογραφία διαπερατότητας ή αποκλεισµού µεγέθους ή µοριακού ηθµού (gel permeation ή gel exclusion gel ή gel filtration chromatography) χρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής (ion exchange chromatography) χρωµατογραφία συγγένειας ή αγχιστείας (affinity chromatography) Xρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής Ο διαχωρισµός στην χρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής εξαρτάται από την αντιστρεπτή προσρόφηση των φορτισµένων διαλυτών µακροµορίων στις ακινητοποιηµένες ιοντοανταλλακτικές οµάδες αντίθετου φορτίου. Το πρώτο βήµα είναι η εξισορρόπηση της στατικής φάσης της στήλης στις επιθυµητές συνθήκες ιοντικής ισχύος, θερµοκρασίας και µεταλλοϊόντων (Σχήµα 1α).

6 Το δεύτερο βήµα είναι η χορήγηση του δείγµατος και η έκπλυση της στήλης. Σε αυτή την διαδικασία επιτυγχάνεται η προσρόφηση των πρωτεϊνών στις φορτισµένες οµάδες της στήλης και η αποµάκρυνση των µη δεσµευµένων µακροµορίων και άλλων ουσιών (Σχήµα 1β). Στο τελευταίο βήµα, την έκλουση, τα βιοµακροµόρια απελευθερώνονται από τον ιοντοανταλλάκτη µε χρήση ρυθµιστικού διαλύµατος διαφορετικής σύστασης (Σχήµα 1γ). Ένας σύνηθες τρόπος είναι η αύξηση της ιοντικής ισχύος µε προσθήκη NaCl. α β γ Σχήµα 1. Χρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής. α.)εξισορρόπηση, β.) χορήγηση του δείγµατος και έκπλυση, γ.) έκλουση.

7 Πειραµατικό σκέλος 2 ου Εργαστηρίου Αποµόνωση της Αλκαλικής φωσφατάσης µέσω χρωµατογραφίας Ιοντοανταλλαγής. Α.) Προετοιµασία στήλης Q Sepharose Fast flow 1. Kαθαρισµός της στήλης (όγκος υλικού στήλης: 4ml) µε 2-3 όγκους 1Μ ΝaOH (8-12ml). 2. Εξισορρόπηση στήλης στο buffer 1 µε 25 όγκους (100ml). B.) Αποµόνωση του ενζύµου στην στήλη Q Sepharose Fast flow 1. Ξεπάγωµα δείγµατος από -20 o C. 2. Αραίωση 1/3 στο buffer 1. Συλλογή 200µlt (crude) 3. Προσθήκη δείγµατος στην στήλη. Επώαση για 10min. Πρόσδεση ενζύµου στην στήλη. 4. Συλλογή δείγµατος που πέρασε από τη στήλη (void). 5. Ξέπλυµα στήλης µε 20 όγκους buffer 1 (80ml).Συλλογή δείγµατος (wash). Αποµάκρυνση µη ειδικά προσδεδεµένων πρωτεϊνών από τη στήλη. 6. Αποµάκρυνση ειδικά προσδεδεµένων πρωτεϊνών από τη στήλη: Α.) 3 όγκοι buffer 2. Συλλογή.(sample 1) Β.) 3 όγκοι buffer 3. Συλλογή.(sample 2) Γ.) 3 όγκοι buffer 4. Συλλογή.(sample 3).) 3 όγκοι buffer 5. Συλλογή.(sample 4) Ε.) 3 όγκοι buffer 6. Συλλογή.(sample 5) 7. Έλεγχος δειγµάτων για ενεργότητα αλκαλικής φωσφατάσης. (crude, void, wash, sample 1-5). 8.Αποθήκευση δειγµάτων στους -20 o C.

8 #Σύσταση ρυθµιστικών διαλυµάτων buffer 1: 20mM Tris ph 7.6, 10mM MgCl 2 buffer 2: buffer mM φωσφορικό κάλιο ph 6.0 buffer 3: buffer mM NaCl buffer 4: buffer mM NaCl buffer 5: buffer mM NaCl buffer 6: buffer mM NaCl

9 Πειραµατικό σκέλος 3 ου Εργαστηρίου Ταυτοποίηση καθαρισµού της αλκαλικής φωσφατάσης σε αποδιατακτικό πήκτωµα πολυακρυλαµίδης (SDS PAGE) 1. Προετοιµασία δειγµάτων : 32µlt δείγµα + 8µlt 5xSDS dye. 2. Επώαση των δειγµάτων στους 65 o C για 10min. 3. Στιγµιαία φυγοκέντρηση. 4. Σε SDS PAGE 10% φορτώνουµε τα δείγµατα µας. 5. Ακολουθεί ηλεκτροφόρηση των δειγµάτων (150 Volt) για περίπου 90min TAB5AP Ηλεκτροφορητική ανάλυση πρωτεϊνών σε SDS PAGE 10%. Λωρίδα 1: crude, Λωρίδα 2: void, Λωρίδα 3: wash, Λωρίδα 4: sample 1, Λωρίδα 5: sample 2, Λωρίδα 6: sample 3, Λωρίδα 7: sample 5, Λωρίδα 8: sample 4.

Σχετικά έγγραφα

EXPRESSION SYSTEMS. 1. Bacteria E.coli B. subtilis S. lividans. 2. Yeasts S. cerevisiae Pichia pastoris. 3. Fungi Trichoderma Aspergillus

EXPRESSION SYSTEMS. 1. Bacteria E.coli B. subtilis S. lividans. 2. Yeasts S. cerevisiae Pichia pastoris. 3. Fungi Trichoderma Aspergillus EXPRESSION SYSTEMS 1. Bacteria E.coli B. subtilis S. lividans 2. Yeasts S. cerevisiae Pichia pastoris 3. Fungi Trichoderma Aspergillus 4. Insect cells ΙΑΡΡΗΞΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Οι τεχνικές διάρρηξης κυττάρων διακρίνονται