Structural heterogeneity and dynamics in protein evolution and design Kristoffer E Johansson and Kresten Lindorff-Larsen The Linderstrøm-Lang Centre for Protein Science, Department of Biology, University of Copenhagen, Ole Maaløes Vej 5, DK-2200 Copenhagen, Denmark Abstract Recent years have witnessed substantial progress in our ability to design proteins with specific structures and to introduce new functionalities into existing protein scaffolds. Such protein design efforts test our understanding of the biophysical and functional mechanisms of naturally evolved proteins. At the same time, we also know that proteins are dynamical entities, and that many proteins rely on detailed dynamical mechanisms for regulation and function. Thus, the success of design methods, especially in relation to functional proteins, might benefit from explicit considerations of conformational heterogeneity and dynamics. In this review, we compare results from the field of protein design with laboratory protein evolution with a focus on dynamics. Recent studies show that structural dynamics is altered during evolutionary trajectories, and that allosteric effects are pronounced. Interaction networks and the resulting coupling of structure and dynamics are suggested to facilitate these effects. Εισαγωγή Η συγκεκριμένη ανασκόπηση άπτεται των εξελίξεων που αφορούν το πεδίο του σχεδιασμού πρωτεϊνών, δίνοντας έμφαση στη δομική ετερογένεια και τη δυναμική τους. Αποτελεί μία συγκριτική μελέτη πρόσφατων εργασιών που εμπίπτουν στο πεδίο του de novo σχεδιασμού πρωτεϊνών με συγκεκριμένες δομές ή την κατάλληλη τροποποίηση υπαρχόντων πρωτεϊνικών ικριωμάτων για την απόκτηση νέων λειτουργιών. Τα αποτελέσματα τέτοιων εργασιών είναι ιδιαίτερα σημαντικά, καθώς συμβάλουν στην κατανόηση των βιοφυσικών και λειτουργικών μηχανισμών που ελέγχουν τη φυσική εξέλιξη των πρωτεϊνών, έτσι ώστε να βελτιώσουμε τις μεθόδους σχεδιασμού που μέχρι σήμερα χρησιμοποιούνται. Η ικανότητα de novo σχεδιασμού πρωτεϊνών είναι σημαντική όχι μόνο γιατί μπορεί να αποτελέσει βασικό εργαλείο σε βιοτεχνολογικές και βιοϊατρικές εφαρμογές, αλλά επιπλέον διότι βοηθά στην κατανόηση των βασικών αρχών που διέπουν την εξέλιξη, την αναδίπλωση και τη σταθερότητα των πρωτεϊνών. Άλλωστε η δυναμική των πρωτεϊνών, δηλαδή η ικανότητα μεταβολής σχήματος είναι γνωστό ότι διαδραματίζει βασικό ρόλο στην πρωτεϊνική λειτουργία, κάτι που για παράδειγμα φαίνεται στη ρύθμιση των πρωτεϊνών-τελεστών, και είναι επομένως μια εξελισσόμενη ιδιότητα και μια πιθανή αιτία ασθένειας. Επιπλέον, ερχόμαστε σε μία βαθύτερη κατανόηση των ιδιοτήτων μίας πρωτεΐνης γνωρίζοντας τις ιδιότητες της αρχικής της εξελικτικά μορφής. Μεθοδολογικές προσεγγίσεις Η μεθολογική προσέγγιση που χρησιμοποιείται για το σχεδιασμό πρωτεϊνών de novo είναι κατά βάση ο υπολογιστικός πρωτεϊνικός σχεδιασμός με την αξιοποίηση των κατάλληλων βιοπληροφορικών εργαλείων. Η προσέγγιση αυτή αναπτύσσεται ραγδαία τα τελευταία χρόνια καθώς είναι πλέον δυνατός ο σχεδιασμός ολόκληρων αμινοξικών αλληλουχιών από τις οποίες μπορούν να προκύψουν μεσαίου μεγέθους σφαιρικές α ή β πρωτεΐνες με ήδη γνωστές ή νέες αναδιπλώσεις, κάτι που μπορεί να ρίξει αρκετό φως στις βασικές αρχές που διέπουν την πρωτεϊνική δομή. Οι μέθοδοι υπολογιστικού σχεδιασμού βασίζονται γενικά στην πρόβλεψη στατικών διαμορφώσεων, έτσι ώστε να μπορέσουν να διαχειριστούν την τεράστια πολυπλοκότητα του χώρου αλληλουχίας, ενώ η αλληλουχία και η δομή συνήθως βελτιστοποιούνται επαναληπτικά σε ανεξάρτητα βήματα. Κατά συνέπεια, η ακρίβεια αυτών των μεθόδων έχει παρατηρηθεί ότι συσχετίζεται με τη δομική ακαμψία και ότι παρουσιάζει υπερευαισθησία στις μικρές μεταβολές της διαμόρφωσης στις συντεταγμένες του σκελετού. Οι μέθοδοι που εξετάζουν ταυτόχρονα τη μεταβλητότητα τόσο της αλληλουχίας όσο και της δομής είναι λιγότερο συχνές και τυπικά δε χρησιμοποιούνται στο σχεδιασμό πλήρους ακολουθίας. Οι μέθοδοι [1]
μηχανικής μάθησης από την άλλη, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διερεύνηση της σχέσης μεταξύ του δομικού περιβάλλοντος και της αλληλουχίας, ώστε να είναι σε θέση να προτείνουν αντικαταστάσεις αμινοξέων χωρίς a priori παραδοχές σχετικά με τη διαμόρφωση της πλευρικής αλυσίδας. Επιπροσθέτως, μια ελπιδοφόρα προσέγγιση στον υπολογιστικό σχεδιασμό της δομικής μεταβλητότητας είναι η πολυεπίπεδη προσέγγιση, στην οποία η αλληλουχία των αμινοξέων βελτιστοποιείται ταυτοχρόνως σε πολλαπλές διαμορφώσεις σκελετού. Σημαντική πρόοδος έχει καταγραφεί επίσης στη χρήση υπολογιστικών μεθόδων για το σχεδιασμό πρωτεϊνών με ενζυμική λειτουργία. Συγκεκριμένα, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι υπάρχει μεγάλη βελτίωση στην εκτίμηση της τοποθέτησης των καταλυτικών πλευρικών αλυσίδων που είναι απαραίτητες για την ενζυμική κατάλυση. Ένα παράδειγμα υπολογιστικά σχεδιασμένου ενζύμου είναι να τοποθετηθεί μια ποσότητα καταλοίπων στο διάστημα για να σταθεροποιήσει ένα θεωρητικό σύμπλοκο μεταβατικής κατάστασης, ένα θειοένζυμο, και στη συνέχεια να αναζητηθεί μια φυσική πρωτεΐνη για να φιλοξενήσει αυτό τον ενεργό κέντρο που κατασκευάστηκε. Το συγκεκριμένο βήμα της βελτιστοποίησης ακολουθίας γενικά βασίζεται σε στατικές διαμορφώσεις και μόνο στα επόμενα βήματα διαλογής ή βελτιστοποίησης έχουν εφαρμοστεί μέθοδοι όπως προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής. Έτσι, οποιαδήποτε δυναμική της δομής ή ετερογένεια που σχετίζεται με την αποτελεσματικότητα του συνολικού καταλυτικού κύκλου προέρχεται από την φυσική πρωτεΐνη ξενιστή ή την επακόλουθη βελτιστοποίηση της κατάλυσης είτε με υπολογιστικές είτε με πειραματικές μεθόδους. Ο συνδυασμός του υπολογιστικού σχεδιασμού για τη δημιουργία νέων δραστικότητες με επακόλουθη βελτιστοποίηση μέσω κατευθυνόμενης εξέλιξης έχει αποδειχθεί ως μια ιδιαίτερα επιτυχημένη προσέγγιση. Η κατευθυνόμενη εξέλιξη είναι μια ισχυρή στρατηγική για τη βελτίωση της λειτουργίας των πρωτεϊνών, αλλά γενικά απαιτεί ότι το σημείο εκκίνησης έχει ένα μετρήσιμο ποσό της στοχοθετημένης δραστηριότητας. Η χαμηλότερη δραστηριότητα των αρχικά σχεδιασμένων ενζύμων έχει προταθεί ότι προέρχεται από τον πληθυσμό των μη λειτουργικών διαμορφωτικών καταστάσεων. Υπό το πρίσμα αυτό, έχουν αναφερθεί εντυπωσιακά λίγες βιοφυσικές μελέτες των δυναμικών πλευρών των υπολογιστικά σχεδιασμένων ενζύμων. Έχει προταθεί ότι ο υπολογιστικός σχεδιασμός μπορεί να εισάγει μία σειρά δομικών παραλλαγών που επιτρέπουν κατευθυνόμενη εξέλιξη για βελτιωμένη λειτουργία. Η ταυτόχρονη εξέλιξη της ακολουθίας πρωτεϊνών, της δομής, της δυναμικής και της λειτουργίας μπορεί επομένως να μελετηθεί ευεργετικά σε πορείες από φυσική ή κατευθυνόμενη εξέλιξη. Είναι σαφές ότι τα βιομόρια υιοθετούν ένα δυναμικό σύνολο διαμορφώσεων, το καθένα από τα οποία μπορεί να αλληλεπιδράσει με μόρια και υποδοχείς πρόσδεσης ή να εκτελέσει τις χημικές αντιδράσεις που απαιτούνται για ένα πλήθος κυτταρικών λειτουργιών. Τα διάφορα τμήματα βιομορίων εναλλάσσονται μεταξύ λειτουργικών ενδιάμεσων, σε καταστάσεις συντονισμού. Σε ατομική κλίμακα, υπάρχει αυξανόμενο συνεργιστικό δυναμικό μεταξύ κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ, NMR και υπολογιστικών προσομοιώσεων για να αποκαλυφθεί μια δομική βάση για τη δυναμική διαμόρφωσης των πρωτεϊνών σε υψηλή ανάλυση, το οποίο ενισχύεται μέσω συμπληρωματικών πειραματικών μελετών που περιλαμβάνουν κρυο-ηλεκτρονική μικροσκοπία. Η φασματοσκοπία NMR του διαλύματος προέκυψε ως μια ισχυρή τεχνική για τη μελέτη της δομής και της δυναμικής των πρωτεϊνών, παρέχοντας λεπτομερή στοιχεία για τη λειτουργία των βιομορίων. Αποτελέσματα 1. Η τελειοποίηση της δομής και της δυναμικής μιας πρωτεΐνης μπορεί να είναι μία από τις σημαντικότερες συνέπειες της κατευθυνόμενης εξέλιξης. Οι Campbell et al. μελέτησαν τη σύγχρονη εξέλιξη της αλληλουχίας, δομής, δυναμικής και λειτουργίας σε μια φωσφο-τριεστεράση (PTE) η οποία εξελίχθηκε για να αποκτήσει σε υψηλό επίπεδο λειτουργία αρυλεστεράσης (ΑΕ). Κρυσταλλικές δομές κατά τη διάρκεια της μελέτης έδειξαν ένα μέγιστο ζευγάρωμα Ca-RMSD 0,4Å εκτός από μικρές αλλαγές στους ευέλικτους βρόγχους που περιβάλλουν το ενεργό κέντρο, οι οποίοι αναμενόταν να εμπλέκονται στην ενεργότητα PTE ή AE. Ο πρώτος γύρος της κατευθυνόμενης εξέλιξης εισήγαγε μια [2]
μετάλλαξη στο ενεργό κέντρο, την H254R, και μεταλλάξεις από αρκετούς επακόλουθους γύρους βρέθηκαν να ρυθμίζουν τη διαμόρφωση της πλευρικής αλυσίδας του εν λόγω καταλοίπου αργινίνης με την εισαγωγή αντικαταστάσεων σε αυξανόμενη απόσταση από το ενεργό κέντρο. Λόγω των σημειακών μεταλλαγών στους βρόγχους παρεμποδίζονται οι αλληλεπιδράσεις στοιχείων/πρωτεϊνών με τμήματά τους και η διαμορφωτική ετερογένεια των βρόγχων αυτών, ως αποτέλεσμα μεταβάλλεται. Εικόνα 1. Με μπλε εμφανίζονται οι μεταλλαγές κατά την εξέλιξη της φωσφοτριεστεράσης (PTE) για την αύξηση της ενεργότητας αρυλεστεράσης (ΑΕ). Οι γκρίζες σφαίρες δείχνουν την κατά προσέγγιση θέση του προσδέτη και ο σκελετός έχει κλιμακωθεί και χρωματιστεί σύμφωνα με τους Β-factors της αλυσίδας Α στις κρυσταλλικές δομές (από λευκό σε κίτρινο έως κόκκινο). Το γράφημα στο κάτω μέρος δείχνει τη μεταβολή στην ενζυμική ενεργότητα κατά μήκος της κατευθυνόμενης εξέλιξης, αποκαλύπτοντας μια μείωση της ενεργότητας ΡΤΕ και ταυτόχρονη αύξηση της ενεργότητας ΑΕ. Η ανάλυση της δομής και δυναμικής φυσικών και σχεδιασμένων παραλλαγών της πρωτεΐνης αποκαλύπτει κύκλους δομικής αποσταθεροποίησης και επιδιόρθωσης, εξελικτική πίεση «παγώματος» μη παραγωγικών τμημάτων και κινήσεων και δοκιμή διακριτών διαμορφώσεων με ειδικές καταλυτικές ιδιότητες σε δι-λειτουργικά ενδιάμεσα προϊόντα. Καταδεικνύεται ότι οι μεταβολές τη διαμόρφωση των πρωτεϊνών είναι μια βασική πτυχή της μοριακής εξέλιξης και ότι η αλλαγή στη λειτουργία μπορεί να επιτευχθεί μέσω της τροποποίησης των προϋπαρχουσών διαμορφωτικών καταστάσεων. Οι βιοφυσικές αρχές που καθορίζουν πώς εξελίσσεται η συγκεκριμένη δυναμική της πρωτεΐνης και πώς οι απομακρυσμένες μεταλλαγές επηρεάζουν την καταλυτική ενεργότητα δεν έχουν αποσαφηνιστεί ακόμα. 2. Η κατευθυνόμενη εξέλιξη μπορεί να αλλάξει τα χρονοδιαγράμματα της δυναμικής. Οι Gonzalez et al. χρησιμοποίησαν NMR φασματοσκοπία για να χαρακτηρίσουν τη δυναμική των πρωτεϊνών υπό το πρίσμα της μεταλλο-β-λακταμάσης που εξελίχθηκε για να αναγνωρίζει ένα μεγαλύτερο εύρος υποστρωμάτων. Η μεταλλαγή N70S μειώνει τα slow-time scale dynamics και ελαττώνει την ενεργότητα του ενζύμου, ενώ σε συνδυασμό με τη μεταλλαγή G262S, τα αποτελέσματα αντιστρέφονταν, δηλαδή, αυξανόταν το εύρος των πιθανών υποστρωμάτων και αύξανε τις slow-time scale dynamics. Από αυτή την έρευνα οδηγούμαστε στο συμπέρασμα ότι οι δύο μεταλλαγές βρίσκονται σε μια σχέση επίστασης μεταξύ τους, με τη G262S να υποβοηθά την N70S για να έχει το [3]
επιθυμητό αποτέλεσμα. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι η δυναμική της διαμόρφωσης είναι ένα εξελικτικό χαρακτηριστικό και ότι οι πρωτεΐνες που είναι «προικισμένες» με πιο δυναμικά ενεργά κέντρα παρουσιάζουν μεγαλύτερες δυνατότητες για την προώθηση της εξέλιξης. 3. Οι στρατηγικές για την κατευθυνόμενη εξέλιξη περιλαμβάνουν εντοπισμένη μεταλλαξιγένεση σε επιλεγμένες θέσεις (site directed mutagenesis) της αλληλουχίας και τυχαίες μεταλλαγές καθ όλο το μήκος της αλληλουχίας. Η site directed mutagenesis προϋποθέτει γνώση της ιδιότητας προς τροποποίηση, αλλά επιτρέπει τη μεταλλαξιγένεση κορεσμού (saturation mutagenesis) και την ενδελεχή ανάλυση πολλών συνδυασμών νουκλεοτιδίων σε επιλεγμένες θέσεις. Οι Podgornaia και Laub ανέλυσαν τέσσερις θέσεις και εξέτασαν τις 160.000 πιθανές μεταλλαγές 4 νουκλεοτιδίων (ΝΝΝΝ) για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Βρήκαν ευρεία επίσταση, υποδηλώνοντας ότι τη δυνατότητα εισαγωγής πολλαπλών αντικαταστάσεων για την αξιολόγηση του προσαρμοστικού αποτελέσματος μπορεί να είναι μία ιδιαιτέρως «ισχυρή» προσέγγιση για την εξέλιξη των πρωτεϊνών. 4. Οι τυχαίες μεταλλαγές συνήθως αφορούν σε αντικατάσταση 1 ή μερικών νουκλεοτιδίων σε τυχαίες θέσεις και οι τεχνικές ανίχνευσης περιορίζονται μόνο στον αριθμό των μεταλλαγών που μπορούν να ελεγχθούν, επομένως στηρίζονται σε αυτοματοποιημένες μεθόδους ανίχνευσης με ρομπότ. Οι Obexer et al. πραγματοποίησαν αυτοματοποιημένη ανάλυση τυχαίων μεταλλαγών με ρομπότ για τη μέτρηση της ενζυμικής ενεργότητας. Ήταν σε θέση να ενισχύσουν την καταλυτική ενεργότητα και αποτελεσματικότητα της ρετρο-αλδολάσης, η οποία είχε σχεδιαστεί ηλεκτρονικά, πέρα από το πλατώ βέλτιστης ενεργότητας του ενζύμου. Σε τυχαία μεταλλαξιγένεση σε όλη την αλληλουχία από έρευνες συνήθως διαπιστώνεται ότι οι αντικαταστάσεις εντοπίζονται σε διάφορα τμήματα της πρωτεϊνικής δομής, γεγονός που καταδεικνύει ότι οι αλλοστερικές αλληλεπιδράσεις είναι καθοριστικές στη βελτιστοποίηση του ενζύμου. Δεν είναι ακόμα γνωστό κατά πόσο το αποτέλεσμα της εκάστοτε μεταλλαγής προκαλείται μέσω του πρίσματος της δομής, της σταθερότητας ή της δυναμικής. 5. Έχει προταθεί ότι η εξελικτική προσαρμογή στις διαφορετικές ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις υποστρώματος προκαλούνται από την αλλαγή της δυναμικής διαμόρφωσης κατά τη διάρκεια του καταλυτικού κύκλου. Η ομάδα Schmidt et al.ανέλυσε τη δομή και τη δυναμική των αντισωμάτων κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης συγγένειας / εξειδίκευσης (affinity maturation). Βρέθηκε ότι πρώιμα, πιο γενικά ως προς την εξειδίκευση αντισώματα είχαν ιδιαίτερα δυναμικούς αντιγονικούς επιτόπους, λόγω της ανάγκης για πρόσδεση σε πολλαπλά και περισσότερα είδη αντιγόνων. Καθώς τα αντισώματα ωρίμαζαν κι εξειδικεύονταν ως προς ένα συγκεκριμένο αντιγόνο, η θέση πρόσδεσης των αντιγόνων τους απώλεσε την αρχική ευρεία δυναμικότητά της και έκλινε πλέον προς το επιθυμητό αντιγόνο. Επομένως, παρατηρείται αύξηση της συγγένειας ως προς ένα υπόστρωμα μέσω της μείωσης της απώλειας εντροπίας που συνοδεύει την πρόσδεση του προσδέτη. 6. Οι Bhowmick et al. μελέτησαν τη διαμόρφωση της εντροπίας των πλευρικών αλυσίδων σε υπολογιστικά μοντέλα Kemp ελιμινασών και πειραματικά βελτιστοποιημένες μορφές αυτών. Διαπίστωσαν ότι η εντροπία της πλευρικής αλυσίδας μεταβλήθηκε σημαντικά κατά την κατευθυνόμενη εξέλιξη, και επιπλέον ότι οι θέσεις με υψηλό βαθμό και αριθμό συζεύξεων διαμόρφωσης δυναμικής τείνουν να τροποποιούνται κατά τη διαδικασία της κατευθυνόμενης εξέλιξης. Οι συγγραφείς καταδεικνύουν ότι προκαλώντας μεταλλαγές σε θέσεις στο δίκτυο σύζευξης, ήταν σε θέση να ελαττώσουν ή και να απαλείψουν την ενεργότητα του ενζύμου παρόλο που οι θέσεις αυτές ήταν απομακρυσμένες από το ενεργό κέντρο. Η δυνατότητα συντονισμού και κατανόησης της εντροπίας των πλευρικών αλυσίδων παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον κατά το σχεδιασμό λειτουργιών και αλληλεπιδράσεων που περιλαμβάνουν την πρόσδεση άλλων μορίων, επειδή η ενθαλπία πρόσδεσης εξισορροπείται από οποιαδήποτε απώλεια της εντροπίας διαμόρφωσης. 7. Οι Campbell et al. ανέλυσαν τις αλληλεπιδράσεις στην εξελικτική πορεία όπως περιγράφηκαν από τους Bhowmick et al.. Αποδείχθηκε ότι εξελικτικά οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ μορίων μεταβάλλονταν σημαντικά ακόμα και με ελάχιστη τροποποίηση των αποστάσεων μεταξύ ατόμων. Συγκεκριμένα, σε ένα βρόγχο η απόκτηση περισσότερων αλληλεπιδράσεων είχε ως αποτέλεσμα την απώλεια [4]
κινητικότητας και η ελάττωση των αλληλεπιδράσεων σε έναν άλλο βρόγχο προκάλεσε αυξημένη κινητικότητα. Εφορμόμενοι από αυτά τα βήματα, γίνονται προσπάθειες να εφαρμοστεί η θεωρία των ελαστικο-μηχανικών δικτύων σε πρωτεΐνες, μια θεωρία πολλά υποσχόμενη όσον αφορά στο σχεδιασμό δυναμικών πρωτεϊνών. Συγκεκριμένα, οι αλλοστερικές αλληλεπιδράσεις μπορούν να μεταδοθούν μέσω ενός δικτύου αλληλεπίδρασης στο χώρο, πέρα από την πρότερη γνώση μας για τους δεσμούς και μεταβολές στην πρωτεϊνική δομή. Τέτοιες θεωρίες μπορούν να προσφέρουν ένα μέσο για να συμπεριληφθούν οι μηχανικές πτυχές στις μεθόδους ηλεκτρονικού σχεδιασμού πρωτεϊνών κατά την εξέταση αλλοστερικών αλληλεπιδράσεων. Προοπτικές Έχει πλέον φανερό πως τα τελευταία χρόνια, έχει σημειωθεί τεράστια πρόοδος στον σχεδιασμό πρωτεϊνών που διπλώνουν σε συγκεκριμένες δομές, έτσι ώστε σήμερα να υπάρχουν πλέον πολλές περιπτώσεις όπου παρατηρείται συμφωνία σε ατομικό επίπεδο μεταξύ της σχεδιαζόμενης και της πειραματικά προκύψασας δομής. Για πρώτη φορά, η δυναμική φύση των πρωτεϊνών έχει σαφώς συσχετιστεί με τη δομή τους, για παράδειγμα, οι βρόγχοι και τα επιφανειακά εκτεθειμένα κατάλοιπα είναι συχνά τα πιο δυναμικά. Από την άλλη πλευρά, όπως αποδεικνύεται από τα παραδείγματα που περιγράφηκαν παραπάνω, οι πρωτεΐνες μπορεί να έχουν επιπρόσθετες δυναμικές καταστάσεις, οι οποίες φαίνεται να προκύπτουν από την επιλογή για συγκεκριμένη λειτουργία. Έτσι, χρησιμοποιώντας την επιτυχία για τον σχεδιασμό της δομής ως αρχή, θα μπορούσε η δυναμική να συμπεριληφθεί πιο συστηματικά ως πρόσθετος στόχος κατά το σχεδιασμό (λειτουργικών) πρωτεϊνών. Απαιτούνται, λοιπόν, νέες προσεγγίσεις για να συνδυάσουμε τη «χημική ακρίβεια» της δομής με πρόσθετους δυναμικούς τρόπους λειτουργίας. Οι πρόσφατες εξελίξεις στις υπολογιστικές μεθόδους για το σχεδιασμό πρωτεϊνών δείχνουν αρκετά υποσχόμενες για τον συνυπολογισμό της δομικής δυναμικής στο σχεδιασμό πρωτεϊνών. Για παράδειγμα, μολονότι οι προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής δεν είναι ακόμη έτοιμες για μεγάλη εξερεύνηση του χώρου αλληλουχίας, έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι ενισχυμένες προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής μπορούν να «αντιληφθούν» πολύ μικρές επιδράσεις όπου οι μεταλλάξεις μπορούν να επηρεάσουν καθοριστικά πληθυσμούς μεταβατικών καταστάσεων. Από την άλλη πλευρά, οι εξελίξεις στην ανάλυση πολλαπλών στοιχίσεων αλληλουχιών επιτρέπουν μία πολύ πιο γρήγορη εξερεύνηση του χώρου αλληλουχίας. Τα πρόσφατα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι αυτές οι αναλύσεις μπορούν να βοηθήσουν τόσο στην εύρεση αλληλουχιών που διπλώνουν σε μια συγκεκριμένη δομή, όσο και στην εύρεση ομάδων καταλοίπων που λειτουργούν ως λειτουργικές και δυναμικές επικράτειες. Έτσι, τέτοιες μέθοδοι που βασίζονται στην ακολουθία μπορεί να είναι χρήσιμες στο σχεδιασμό πρωτεϊνών με συγκεκριμένη δυναμική. Παρ όλα αυτά, αν η χρησιμοποίηση του επιτυχούς σχεδιασμού πρωτεϊνών αναδειχθεί σε σημείο αναφοράς για την κατανόηση της βιολογίας, της χημείας και της βιοφυσικής των φυσικών πρωτεϊνών, θα πρέπει επίσης να είμαστε σε θέση να σχεδιάζουμε πρωτεΐνες που θα έχουν τις ίδιες βασικές ιδιότητες με τις φυσικά εξελιγμένες πρωτεΐνες. Ένα βήμα προς αυτή την κατεύθυνση θα μπορούσε να είναι η εστίαση στην προσπάθεια να δειχθεί ότι οι σχεδιασμένες πρωτεΐνες είναι επιτυχείς για τους επιδιωκόμενους λόγους. Η δομική σταθερότητα εκ σχεδιασμού είναι η κεντρική ιδεολογική δομή του υπολογιστικού σχεδιασμού πρωτεϊνών, καθώς οι αρχές σχετικά με την αναδίπλωση και τη διαλυτότητα πρωτεϊνών εφαρμόζονται σε εικονικές καταστάσεις ή χειροκίνητα βήματα πριν ή μετά το βήμα που πραγματοποιεί τη βελτιστοποίηση της ακολουθίας. Η επιλογή για βελτιωμένη λειτουργία μπορεί να επιτευχθεί με το κόστος της μειωμένης σταθερότητας και έτσι ήταν ευεργετικό το γεγονός ότι τα αρχικά σχέδια ήταν πολύ σταθερά έτσι ώστε μια απώλεια σταθερότητας να μπορεί να γίνει ανεκτή κατά τη διάρκεια της επακόλουθης βελτιστοποίησης. Ωστόσο, δεν είναι σαφές εάν η αναζήτηση αλληλουχιών που δημιουργούν πολύ σταθερές πρωτεΐνες είναι μια ιδανική στρατηγική για τη βελτιστοποίηση μιας ιδιότητας που βασίζεται στη δομική ετερογένεια. Από τη μία πλευρά, η υψηλή σταθερότητα επιτρέπει την εισαγωγή ενδεχομένως αποσταθεροποιητικών μεταλλάξεων που θα [5]
μπορούσαν να είναι σημαντικές για τη λειτουργία. Από την άλλη πλευρά, πολύ σταθερές πρωτεΐνες μπορεί να παρεμποδιστούν στη δυναμική διαμόρφωσης που υποκρύπτει μεγάλο μέρος της πρωτεϊνικής λειτουργίας. Στο μέλλον, αναμένουμε ότι θα είναι δυνατό να συμπεριληφθούν πρόσθετα βιοφυσικά χαρακτηριστικά, όπως για παράδειγμα η δυναμική των πρωτεϊνών, απευθείας εκ σχεδιασμού. Σύνοψη Οι πρωτεΐνες είναι δυναμικά μόρια, γεγονός που σημαίνει πως εξελίσσονται στη διάρκεια του χρόνου μεταβάλλοντας τη δομική τους διαμόρφωση και κατ επέκταση τη λειτουργία τους. Η πρωτεϊνική εξέλιξη επηρεάζεται από ένα αριθμό πολλών διαφορετικών βιολογικών παραγόντων. Γενικά, οι πρωτεΐνες επιλέγονται με γνώμονα τη συμβολή τους στην αρμοστικότητα του οργανισμού. Όμως, η σχέση που συνδέει την αλληλουχία, τη λειτουργία και την αρμοστικότητα των πρωτεϊνών στους οργανισμούς είναι ιδιαίτερα περίπλοκη. Προσπάθειες για την κατανόηση αυτής της σχέσης μπορούν να γίνουν μέσω του σχεδιασμού πρωτεϊνών με βάση υπολογιστικά σχεδιαστικά μοντέλα. Αυτή η διαδικασία περιλαμβάνει τη μελέτη της δυναμικής διαμόρφωσης, της εντοπισμένης και τυχαίας μεταλλαξιγένεσης, των βιοφυσικών χαρακτηριστικών των πρωτεϊνών και των πρωτεϊνικών και μη αλληλεπιδράσεων μέσω ποικίλων μεθοδολογικών προσεγγίσεων. Βιβλιογραφία Orr HA. Fitness and its role in evolutionary genetics. Nature reviews Genetics. 2009;10(8):531-539. doi:10.1038/nrg2603 Campbell E, Kaltenbach M, Correy GJ, Carr PD, Porebski BT, Livingstone EK, Afriat-Jurnou L, Buckle AM, Weik M, Hollfelder F et al.: The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function. Nat Chem Biol 2016, 12:944-950 González MM, Abriata LA, Tomatis PE, Vila AJ: Optimization of conformational dynamics in an epistatic evolutionary trajectory. Mol Biol Evol 2016, 33:1768-1776 Wikipedia contributors. (2017, August 4). Directed evolution. In Wikipedia, The Free Encyclopedia. Retrieved 18:14, March 8, 2018, from https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=directed_evolution&oldid=793816044 Συγγραφική επιμέλεια: Γεωργακόπουλος Νικόλαος Α.Μ. 1113201300020 Τζεπαπαδάκη Αφροδίτη-Αδαμαντία Α.Μ. 1113201400106 [6]