Αλληλεπιδράσεις µεταξύ βιοµορίων

4-1 Κεφάλαιο 4 Αλληλεπιδράσεις µεταξύ βιοµορίων 4.1.Εισαγωγή Το αντικείµενο των αλληλεπιδράσεων µεταξύ των βιοµορίων καλύπτει ένα τεράστιο σύνολο περιπτώσεων µε αποτελέσµατα από βιολογικές, βιοχηµικές και βιοφυσικές µελέτες που δεν είναι δυνατόν να καλυφθεί πλήρως. Έτσι το κεφάλαιο που ακολουθεί θα εστιαστεί σε µερικές περιπτώσεις αλληλεπιδράσεων µεταξύ πρωτεϊνών και µεταξύ πρωτεϊνών και νουκλεϊνικών οξέων. Αρχικά θα αναπτυχθούν µερικές κατηγορίες αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών και οι δοµικές ενότητες που συµµετέχουν σε αυτές, κυρίως όµο- και έτερο- ολιγοµερή. Κατόπιν θα συζητηθούν οι δοµικές ενότητες που συµµετέχουν στην αλληλεπίδραση πρωτεϊνών και νουκλεϊνικών οξέων. Οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ των πρωτεϊνών συµβαίνουν σε κάθε επίπεδο λειτουργίας του κυττάρου, των ενδοκυττάριων οργανιδίων, τον µεταφορικό µηχανισµό διαφόρων βιολογικών µεµβρανών, την οργάνωση της χρωµατίνης, τα µυϊκά κύτταρα, την µεταβίβαση σήµατος, την ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης, και άλλα. Οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ πρωτεϊνών εµπλέκονται σε νευρολογικές ανωµαλίες όπως η ασθένειες Creutzfeld-Jacob και Alzheimer. Σε αυτό το κεφάλαιο κυρίως θα µελετηθούν τα µοριακά βιοχηµικά χαρακτηριστικά εξειδικευµένων αλληλεπιδράσεων µεταξύ πρωτεϊνών που εµπλέκονται στην ρύθµιση της λειτουργίας των κυττάρων, δηλαδή πρωτείνες που συµµετέχουν στην µεταβίβαση σήµατος και ρύθµιση της µεταγραφής των νουκλεϊνικών οξέων. Τα συστήµατα αυτά, εξ αιτίας της σηµαντικότητας τους για την ανάπτυξη και τις ασθένειες, µελετούνται εντατικά για πολλά χρόνια. Από τις µελέτες αυτές προκύπτει το συµπέρασµα, ότι η φύση πολλές φορές αναµιγνύει και ταιριάζει δοµικές ενότητες που χαρακτηρίζουν συγκεκριµένες κατηγορίες πρωτεϊνών τροποποιώντας την αµινοξική ακολουθία για να πετύχει επιλεκτικότητα για συγκεκριµένες πρωτείνες στόχους. Η ρύθµιση της κυτταρικής λειτουργίας από τις πρωτείνες που αλληλεπιδρούν εξισορροπείται από την µεταξύ τους σχετική συνάφεια και την ρύθµιση της τελευταίας µε την δέσµευση υποστρωµάτων, που µπορεί να είναι µικρά βιοµόρια, άλλες πρωτείνες, πυρηνικά οξέα, ιόντα (όπως ασβεστίου, καλίου) και οµοιπολική τροποποίηση όπως επιλεκτική φωσφορυλίωση και ακετυλίωση.

4-2 Η επιλεκτικότητα και η ενίσχυση της µεταβίβασης σήµατος εξαρτάται από την ακριβή αµινοξική ακολουθία των δοµικών ενοτήτων που συµµετέχουν στην αλληλεπίδραση, και ο κύριος στόχος µελέτης είναι η σχέση µεταξύ ακολουθίας, στερεοδοµής, δυναµικής ενέργειας του συστήµατος και λειτουργίας. Για να επιτευχθεί αυτός ο στόχος απαιτείται ο δοµικός χαρακτηρισµός των ενοτήτων, η θέση τους στην πρωτείνη που ανήκουν και στα σύµπλοκα των πρωτεϊνών που δηµιουργούνται από την αλληλεπίδραση. Η κατανόηση της επιλεκτικότητας σε αυτά τα συστήµατα απαιτεί πολλές και προσεκτικές συγκριτικές µελέτες συγγενών συστηµάτων ή ενοτήτων µε µεταλλάξεις για να διερευνηθούν οι ενεργειακές ιδιότητες που συνδέονται µε την συγκεκριµένη πρωτεϊνική ακολουθία και στερεοδοµή. Αλλαγές της τάξης του 1kcal/mol στην ενέργεια αλληλεπίδρασης µεταξύ των πρωτεϊνών µπορούν να οδηγήσουν σε σηµαντικές διαφορές στην λειτουργικότητα του συµπλόκου. 4.2. Κατηγορίες αλληλεπιδράσεων µεταξύ πρωτεϊνών 4.2.1. Οµο-ολιγοµερισµός Ένας µεγάλος αριθµός ενζύµων, πρωτεϊνών µεταφοράς, παραγόντων ρύθµισης της µεταγραφής κλπ. δρουν ως οµο-ολιγοµερή, δηλαδή η τεταρτοταγής δοµή της πρωτείνης αποτελείται από δύο ή περισσότερες οµόλογες (ή όµοιες) αλυσίδες. Η ενσωµάτωση µη οµοιοπολικών αλληλεπιδράσεων στο επίπεδο της τεταρτοταγούς δοµής προσφέρει πλεονεκτήµατα, σε σχέση µε λειτουργικές µονάδες που αποτελούνται από µία πολυπεπτιδική αλυσίδα, όσον αφορά τις πιθανότητες ρύθµισης. Κατ αρχήν µπορεί να αποθηκεύεται ενέργεια στην περιοχή αλληλεπίδρασης που να χρησιµοποιείται στην δέσµευση υποστρώµατος ή να τροποποιεί την πρωτεϊνική στερεοδοµή µε ερέθισµα από ρυθµιστικά υποστρώµατα. Με αυτόν τον τρόπο η διαµόρφωση της συνάφειας των υποµονάδων δεν επηρεάζει την τριτοταγή δοµή της πρωτείνης, αν και προσφέρει ενεργειακές δυνατότητες για την διαµόρφωση της ικανότητας δράσης. Ένα άλλο πλεονέκτηµα της σύνδεσης ρυθµιστικών ιδιοτήτων και αλληλεπίδρασης πρωτεϊνικών υποµονάδων είναι ότι η δραστικότητα της πρωτείνης εξαρτάται από την συγκέντρωση της. Μία τέτοια ρύθµιση µπορεί να επηρεάζει την λειτουργία θετικά ή αρνητικά, µε τα ολιγοµερή ή τα µονοµερή να επιδεικνύουν την µεγίστη δραστικότητα. Έτσι η λειτουργικότητα των ολιγοµερών µπορεί να ρυθµίζεται επακριβώς µε την συγκέντρωση υποστρωµάτων (συµπεριλαµβανοµένων ιόντων, υποστρωµάτων αλλοστερικών υποστρωµάτων, πρωτονίων, κλπ.) και την συγκέντρωση της πρωτείνης (ρυθµός έκφρασης ή αποικοδόµησης). Το τετραµερές της αιµοσφαιρίνης που αποτελείται από 2 άλφα και 2 βήτα υποµονάδες (εικόνα 4.1), που επιδεικνύουν υψηλή οµολογία στις αµινοξικές τους ακολουθίες, είναι το κλασσικό παράδειγµα αλλοστερισµού και συνεργασίας στην δέσµευση υποστρώµατος από ολιγοµερείς πρωτείνες. Η εικόνα 4.2 αναπαριστά την καµπύλη πρόσδεσης του οξυγόνου της µονοµερούς αιµοσφαιρίνης και της τετραµερούς αιµοσφαιρίνης σε ουδέτερο και όξινο ph. Αυτό που είναι φανερό από αυτές τις καµπύλες είναι ότι η συγγένεια της µυοσφαιρίνης για το οξυγόνο είναι σηµαντικά υψηλότερη από αυτή της αιµοσφαιρίνης ανεξαρτήτως ph. Επιπλέον η καµπύλη πρόσδεσης του οξυγόνου στην µυοσφαιρίνη είναι µία απλή υπερβολική καµπύλη ενώ της αιµοσφαιρίνης σιγµοειδής (εικόνα 4.2). Είναι επίσης γνωστό ότι η δέσµευση οξυγόνου από την αιµοσφαιρίνη έχει ως αποτέλεσµα την µείωση της συγγένειας µεταξύ των δύο αβ διµερών.

4-3 Εικόνα 4.1. ιάγραµµα των ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων (γεφυρών αλάτων) στις επιφάνειες διεπαφής των υποµονάδων του τετραµερούς της αιµοσφαιρίνης. Εκτός από τις ιδιότητες συνέργιας που περιγράφονται στην προηγούµενη παράγραφο η δέσµευση του οξυγόνου από την αιµοσφαιρίνη βρίσκεται και κάτω από τον αλλοστερικό έλεγχο των πρωτονίων και των οργανικών φωσφορικών ενώσεων (όπως διφωσφορογλυκερόλη DPG και άλλα). Η δέσµευση πρωτονίων σε συγκεκριµένα σηµεία της επιφάνειας διεπαφής µεταξύ υποµονάδων οδηγεί σε µία αύξηση των περιορισµών της δέσµευσης οξυγόνου. Αυτό το φαινόµενο Bohr είναι σηµαντικό για την φυσιολογία της λειτουργίας της µεταφοράς του οξυγόνου επειδή επιτρέπει την απελευθέρωση του οξυγόνου από την αιµοσφαιρίνη προς την µυοσφαιρίνη στο όξινο περιβάλλον των µυϊκών ιστών όπου η παρουσία γαλακτικού οξέως και διοξειδίου του άνθρακα µειώνει το ph. Η µετακίνηση σε µεγάλα ύψη (δηλ. χαµηλή ατµοσφαιρική πίεση) έχει ως επακόλουθο την αύξηση της παραγωγής DPG που δεσµεύεται σε ένα άλλο σηµείο της επιφάνειας διεπαφής µεταξύ Εικόνα 4.2 Αναπαράσταση των καµπυλών δέσµευσης οξυγόνου για την αιµοσφαιρίνη (ΗΒ) και την µυοσφαιρίνη (ΜΒ). των δύο β-υποµονάδων (εικόνα 4.1) και ελαττώνει την συγγένεια της αιµοσφαιρίνης για οξυγόνο µε αποτέλεσµα µία περισσότερο αποτελεσµατική απελευθέρωση οξυγόνου στους ιστούς. Έτσι η συγκεκριµένη αµινοξική ακολουθία δεν κωδικοποιεί µόνο την στερεοδοµή των υποµονάδων της πρωτείνης αλλά και τις αλληλεπιδράσεις

4-4 µεταξύ των, που προσφέρουν τους ενεργειακούς συνδέσµους µεταξύ συγγένειας των υποµονάδων και δέσµευσης του υποστρώµατος. 4.2.2. Αλληλεπιδράσεις µεταξύ ετερόλογων πρωτεϊνών Η επικοινωνία σε επίπεδο οργανισµού ή κυττάρου απαιτεί την αποκωδικοποίηση φυσικών ή χηµικών σηµάτων πληροφορίας, όπως η παρουσία συγκεκριµένων χηµικών παραγόντων, η αλλαγή φωτισµού, η χηµική τροποποίηση υπαρχόντων ουσιών, αλλαγή σε ph ή συγκέντρωση ιόντων από µία περιοχή σε άλλη. Κατά ένα µεγάλο µέρος η επικοινωνία βασίζεται σε εξειδικευµένες αλληλεπιδράσεις µεταξύ ετερόλογων πρωτεϊνών, µε ερέθισµα συγκεκριµένα χηµικά ή φυσικά σήµατα. Ένα µικρό ποσοστό των µηχανισµών που ρυθµίζουν την επιλεκτικότητα των αλληλεπιδράσεων µεταξύ της πληθώρας των πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν και ρυθµίζουν τις κυτταρικές λειτουργίες έχει γίνει κατανοητό. Σε αυτό το κεφάλαιο περιγράφονται µερικές πρωτεϊνικές δοµικές ενότητες που εµπλέκονται σε ετερόλογα πρωτεϊνικά σύµπλοκα. Ιδιαίτερη έµφαση δίνεται σε παραδείγµατα από τρεις κατηγορίες αλληλεπιδράσεων µεταξύ των επιφανειών πρωτεϊνών: αυτών που εµπλέκονται στην µεταβίβαση σήµατος, την ρύθµιση κυτταρικών λειτουργιών και µεταξύ των παραγόντων µεταγραφής.

4-5 4.2.2.1. Πρωτεϊνικές ενότητες που συµµετέχουν στην µεταβίβαση σήµατος Οι οµόλογες του Src δοµικές ενότητες 2 και 3 που συνήθως αναφέρονται ως SH2 και SH3 συναντώνται σε πρωτείνες που εµπλέκονται σε µεταβίβαση σήµατος. Οι SH2 αναγνωρίζουν πρωτείνες µε φωσφορυλιωµένη τυροσίνη και Εικόνα 4.3. Η SH2 δοµική ενότητα (Src homology domain). ειδικότερα αυτοφωσφορυλιωµένους παράγοντες ανάπτυξης (growth factors). Βρίσκονται σε πρωτείνες που δεσµεύουν παράγοντες ανάπτυξης και εµπλέκονται στην µεταβίβαση σήµατος µετά την ενεργοποίηση του υποδοχέα (βλ. Κεφ. 5). από µία β-πτυχωτή επιφάνεια µε τρεις κλώνους ανάµεσα από δύο α-έλικες. Η SH2 δοµική ενότητα έχει µία βαθιά κοιλότητα δέσµευσης µε υψηλή συγγένεια για φωσφοτυροσίνη αλλά όχι και για φωσφοσερίνη ή φωσφοθρεονίνη. Η επιλεκτικότητα της αλληλεπίδρασης οφείλεται στα αµινοξέα που προσδένονται στο καρβοξυλοτελικό άκρο της φωσφοτυροσίνης. ιαφορετικές κατηγορίες SH2 δοµικών ενοτήτων αναγνωρίζουν διαφορετικές ακολουθίες καρβοξυλοτελικών τριπεπτιδίων. Η κατηγορία Ι SH2 αναγνωρίζει ακολουθίες του τύπου Π-Π-Φ όπου Π σηµαίνει πολικό και Φ υδρόφοβο. Η κατηγορία ΙΙΙ SH2 αναγνωρίζει ακολουθίες του τύπου Φ-Χ-Φ όπου Χ οτιδήποτε. Οι SH3 δοµικές ενότητες δεσµεύονται σε πλούσιες σε προλίνη ακολουθίες στην πρωτείνη στόχο τους. Και οι SH3 συναντώνται σε πρωτείνες που εµπλέκονται σε µεταβίβαση σήµατος όπως οι κινάσες της τυροσίνης. Αναγνωρίζουν έλικες πολυπρολίνης του τύπου Πρ-Χ-Χ-Πρ σε πρωτείνες κυτταρικών σηµάτων. Η γενική αρχιτεκτονική των SH3 δοµικών ενοτήτων αποτελείται από ένα β-κύλινδρο που σχηµατίζεται από δύο ορθογώνιες β-αντπαράλληλες πτυχωτές επιφάνειες µε τρεις κλώνους. Οι περιοχές πολυπρολίνης της πρωτείνης στόχος αλληλεπιδρούν µε τα αρωµατικά αµινοξέα της SH3 δοµικής ενότητας.

4-6 Εικόνα 4.4. Η SH3 δοµική ενότητα Μία άλλη κατηγορία δοµικών ενοτήτων που εµπλέκονται µε τα µονοπάτια κυτταρικού σήµατος είναι η PDZ. Οι PDZ αναγνωρίζουν καρβοξυλοτελικά τριπεπτίδια του τύπου Σερίνη ή Θρεονίνη Οτιδήποτε Βαλίνη (S/T-X-V), άλλες PDZ δοµικές ενότητες ή και LIM δοµικές ενότητες. Η γενική αρχιτεκτονική των PDZ δοµικών ενοτήτων µοιάζει µε αυτή των SH2 και περιέχει ένα β-κύλινδρο ή δύο ορθογώνιες β-πτυχωτές επιφάνειες ανάµεσα σε δύο α- έλικες. Εικόνα 4.5. Η PDZ δοµική ενότητα (από τις PSD-95, DlgA, ZO-1 πρωτείνες) Οι LIM είναι δοµικές ενότητες µε δακτύλους ψευδαργύρου µε υψηλή περιεκτικότητα σε αµινοξικά κατάλοιπα κυστεΐνης. Βρίσκονται σε πρωτείνες που εµπλέκονται στην

4-7 κυτταρική ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση όπως και σε αλληλεπιδράσεις µε τον κυτταροσκελετό. Αυτές αλληλεπιδρούν µε PDZ δοµικές ενότητες, άλλες LIM δοµικές ενότητες, παράγοντες µεταγραφής bhlh και έτσι ρυθµίζουν πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις σε σηµαντικές κυτταρικές λειτουργίες. Η συνήθης ακολουθία είναι: CX 2 CX 16-23 HX 2 CX 2 CX 2 CX 16-21 CX 2 C/H/D (όπου C κυστεΐνη, Η ιστιδίνη, D ασπαρτικό οξύ και Χ οτιδήποτε) και έχει παρατηρηθεί σε περισσότερες από 35 πρωτείνες. Εικόνα 4.6. Η LIM δοµική ενότητα (από τους παράγοντες µεταγραφής (Lin11, is11, και mec3) Ο κατάλογος των αναγνωρίσιµων πρωτεϊνικών δοµικών ενοτήτων αυξάνει συνεχώς και όσων η στερεοδοµή τους είναι γνωστή χρησιµεύει ως οδηγός για την αναγνώριση και επεξήγηση των εξειδικευµένων λειτουργιών των συστηµάτων που συµµετέχουν. Η κατανόηση αυτών των λειτουργιών οδηγεί στην κατανόηση της ανάπτυξης και διαφοροποίησης των κυττάρων και θα χρησιµεύσει στον σχεδιασµό θεραπευτικών στρατηγικών για ασθένειες όπου αυτές οι πρωτείνες εµπλέκονται.

4-8 4.3. Κατηγορίες αλληλεπιδράσεων µεταξύ πρωτεϊνών και νουκλεϊνικών οξέων 4.3.1. Μηχανισµοί αλληλεπίδρασης νουκλεϊνικών οξέων και πρωτεϊνών. Πως ένα µεγάλο και εύκαµπτο µόριο αλληλεπιδρά µε µια πρωτείνη; Αν αυτό γινόταν µε δοκιµή όλων των δυνατών στερεοδοµών θα έπρεπε να διερευνηθούν δισεκατοµµύρια δισεκατοµµυρίων δυνατές στερεοδοµές και τρόποι προσέγγισης. Αυτό όµως που συµβαίνει είναι το κατευθυνόµενο ταίριασµα (induced fit). Κάποια οµάδα αλληλεπιδρά πρώτη. Η ενέργεια αλληλεπίδρασης θα είναι βέβαια µικρή (π.χ. 1 Kcal/mole) και το σύµπλοκο µη σταθερό ( περίπου 10-7 δευτερόλεπτα). Όµως οι περιστροφές γύρω από ένα απλό δεσµό είναι της τάξεως του 10-10 δευτερόλεπτα αφήνοντας στις γειτονικές οµάδες αρκετό χρόνο να επαναπροσανατολιστούν προς την σωστή στερεοδοµή αλληλεπίδρασης (εικόνα 4.7, 4.8). Εικόνα 4.7. Η δέσµευση του µοτίφ α-έλικα στροφή α-έλικα της πρωτείνης λάµδα Cro από το DNA. A. Οι περιοχές αναγνώρισης του διµερούς στις κύριες εσοχές του DNA. Β. Το διµερές που σχηµατίζεται µε την δηµιουργία µίας αντιπαράλληλης β- πτυχωτής επιφάνειας. Γ. Η παραµόρφωση του DNA µετά από την δέσµευση του διµερούς.

4-9 Εικόνα 4.8. Οι αλλαγές που παρατηρούνται στην δοµή του DNA κατά την δέσµευση ενός καταστολέα. Α. Η κανονική δοµή του DNA. Β. Η δοµή µετά την δέσµευση του 434Cro και του 434 καταστολέα. Εικόνα 4.9. Η δέσµευση του µοτίφ α-έλικα στροφή α-έλικα του καταστολέα 434 από το DNA. A. Το διµερές σχηµατίζεται µε την αλληλεπίδραση δύο α-ελίκων. Τέτοιοι µηχανισµοί παρατηρούνται στις πρωτείνες που αλληλεπιδρούν µε τα νουκλεϊνικά οξέα και υποβοηθούνται από δοµικές ενότητες σχεδιασµένες να ταιριάζουν γεωµετρικά µε τα χαρακτηριστικά των νουκλεοτιδικών αλυσίδων. Τέτοιες δοµικές ενότητες είναι οι δάκτυλοι ψευδαργύρου (zinc fingers) και τα αυτόκλειστα λευκίνης (leucine zippers).

4-10 4.3.1.1. άκτυλοι ψευδαργύρου (Zinc fingers) Περισσότεροι από χίλιοι διαφορετικοί παράγοντες µεταγραφής περιέχουν ψευδάργυρο σαν ένα βασικό στοιχείο των δοµικών ενοτήτων τους που δεσµεύουν DNA (εικόνα 4.10). Εικόνα 4.10. Σχηµατικό διάγραµµα της δέσµευσης του DNA από δακτύλους ψευδαργύρου στις κύριες εσοχές του DNA. Το µήκος της πολυπεπτιδικής αλυσίδας αυτών των δοµικών ενοτήτων που περιέχουν τον ψευδάργυρο είναι περίπου 30-50 αµινοξικά κατάλοιπα µε κανονική επανάληψη κυστεϊνών και / ή ιστιδινών κατά µήκος της αλυσίδας. Αυτά τα αµινοξέα συνδέονται οµοιοπολικά µε τον ψευδάργυρο δηµιουργώντας µία συµπαγή δοµική ενότητα που ονοµάζεται δάκτυλος ψευδαργύρου (zinc finger) Εικόνες 4.11, 4.12α,β. Η εξειδίκευση της αναγνώρισης των νουκλεϊνικών οξέων επιτυγχάνεται µε τις περιοχές της πολυπεπτιδικής αλυσίδας που συνδέουν τις κυστεΐνες και τις ιστιδίνες. Εικόνα 4.11. Σχηµατικό διάγραµµα δύο δακτύλων ψευδαργύρου µε τα σηµεία αλληλεπίδρασης µε το DNA να υποδεικνύονται µε µαύρους κλειστούς κύκλους.

4-11 Εικόνα 4.12α. Η κλασσική µορφή του δάκτυλου ψευδαργύρου αποτελείται από 30 αµινοξέα µε δύο κυστείνες και δύο ιστιδίνες που δεσµεύονται στον τετραεδρικό ψευδάργυρο. Εικόνα 4.12β. Το µοτίφ του δακτύλου ψευδαργύρου και οι θέσεις των κυστεϊνών και ιστιδινών στην αµινοξική ακολουθία. Παρά τα κοινά χαρακτηριστικά τους όπως η έλικα αναγνώρισης και ο τετραεδρικός ψευδάργυρος οι δάκτυλοι ψευδαργύρου παρουσιάζονται µε διαφορετικές τοπολογίες όπως α-έλικα στροφή β-κλώνος, α-έλικα στροφή εκτεταµένη µη κανονική στερεοδοµή και β-κλώνος στροφή β-κλώνος. Στην εικόνα 4.13 παρουσιάζονται µερικές τοπολογίες δακτύλων ψευδαργύρου.

4-12 Εικόνα 4.13. Οι διαφορετικές τοπολογίες των δακτύλων ψευδαργύρου όπως παρουσιάζονται σε διαφορετικές οικογένειες πρωτεϊνών. Στις Α,Β,C και D η α-έλικα αναγνώρισης αλληλεπιδρά µε την κύρια εσοχή (major groove) του DNA. Στην περίπτωση Ε ο β-κλώνος δεν αλληλεπιδρά απ ευθείας µε το DNA. Εικόνα 4.14. Στην τοπολογία δακτύλων ψευδαργύρου 2cys-2cys, των πρωτεϊνών που δεσµεύουν DNA, τα άτοµα ψευδαργύρου συνδέονται µε τέσσερις κυστείνες. Η περιοχή αλληλεπίδρασης/αναγνώρισης του DNA βρίσκεται εκτός των δοµικών ενοτήτων των δακτύλων ψευδαργύρου.

4-13 Εικόνα 4.15. Στην τοπολογία δακτύλων ψευδαργύρου 2cys-2his, των πρωτεϊνών που δεσµεύουν DNA, τα άτοµα ψευδαργύρου συνδέονται µε δύο κυστείνες και δύο ιστιδίνες και ο κάθε δάκτυλος έχει περίπου 30 αµινοξέα. Η περιοχή αλληλεπίδρασης/αναγνώρισης του DNA βρίσκεται στην στροφή των περιοχών των δακτύλων ψευδαργύρου. Σε αντίθεση µε τους δακτύλους ψευδαργύρου που συζητήθηκαν µε ένα άτοµο ψευδαργύρου, υπάρχει µία οικογένεια παραγόντων µεταγραφής η GAL4 όπου η ενότητα αλληλεπίδρασης µε το DNA περιέχει 2 άτοµα ψευδαργύρου που συνδέονται οµοιοπολικά µε έξη κατάλοιπα κυστείνης. Το ιδιαίτερα ενδιαφέρον είναι ότι δύο από τις κυστείνες συνδέονται και µε τα δύο άτοµα ψευδαργύρου σχηµατίζοντας δύο γέφυρες µεταξύ τους. Ο σκοπός των δύο µετάλλων είναι η δηµιουργία της σωστής στερεοδοµής της περιοχής επαφής µε το DNA. Εικόνα 4.16. Σχηµατικό διάγραµµα της δοµικής ενότητας των GAL4 µεταγραφικών παραγόντων που αλληλεπιδρά µε το DNA και περιέχει δύο άτοµα ψευδαργύρου.

4-14 4.3.1.2. Αυτόκλειστα λευκίνης (Leucine zippers) Η δοµική ενότητα που ονοµάζεται αυτόκλειστο λευκίνης αποτελείται από δύο παράλληλες ή αντιπαράλληλες α-έλικες µε την ιδιαιτερότητα να έχουν το αµινοξύ λευκίνη στην ν+3 ή ν+4 θέση σε κάθε στροφή της α-έλικας (εικόνα 4.17α,β). Εικόνα 4.17α. Σχηµατική αναπαράσταση των αυτόκλειστων λευκίνης. Α. Αντιπαράλληλα Β. Παράλληλα. Εικόνα 4.17β. Προβολή της δοµικής ενότητας του GCN4 που σχηµατίζει αυτόκλειστο λευκίνης. Με τονισµένες γραµµές αναπαρίστανται οι πλευρικές αλυσίδες των λευκινών. Όταν οι αµινοξικές ακολουθίες τοποθετηθούν σε κύκλο µε περίοδο 3.5 αµινοξέα ανά στροφή (αυτή δηλαδή της περιόδου της α-έλικας) τότε οι λευκίνες τοποθετούνται στην ίδια πλευρά των οµόκεντρων κύκλων µε περιοδικότητα 7. (εικόνα 4.18α,β).

4-15 Εικόνα 4.18α. Η αµινοξική ακολουθία των δύο ελίκων της GCN4 που σχηµατίζουν αυτόκλειστο λευκίνης. Εικόνα 4.18β. Αµινοξικές ακολουθίες δοµικών ενοτήτων που δεσµεύουν DNA σε αναπαράσταση τροχών α-έλικας. Κάθε οµοκεντρικός κύκλος αναπαριστά µία στροφή α-έλικας. Έτσι δηµιουργείται από µία υδρόφοβη επιφάνεια στις δύο γειτονικές α-έλικες µε εσοχές και εξογκώµατα (τις πλευρικές αλυσίδες της λευκίνης) που «κλειδώνουν» η µία δίπλα στην άλλη όπως τα αυτόκλειστα ή φερµουάρ (zippers). Στην περίπτωση των πρωτεϊνών που δεσµεύουν DNA το µοτίφ των αυτόκλειστων λευκίνης είναι υπεύθυνο για των διµερισµό αυτών των πρωτεϊνών.

4-16 Εικόνα 4.19. Η απ ευθείας αλληλεπίδραση των α-ελίκων µε το DNA. Οι α-έλικες που σχηµατίζουν το αυτόκλειστο µπορούν να συµµετέχουν απευθείας στην αλληλεπίδραση µε το DNA (εικόνα 4.19,4.23) είτε να συγκρατούν τα στοιχεία δευτεροταγούς δοµής που αλληλεπιδρούν µε το DNA (εικόνα 4.20, 4.23, 4.21,). Στην δεύτερη περίπτωση µία γειτονική θετικά φορτισµένη α-έλικα αλληλεπιδρά µε το DNA (εικόνα 4.20). Εικόνα 4.20. Το αυτόκλειστο λευκίνης συγκρατεί τα στοιχεία δευτεροταγούς δοµής που αλληλεπιδρούν µε το DNA. Η δυνατότητα των πρωτεϊνών που έχουν αυτόκλειστα λευκίνης να σχηµατίζουν οµοδιµερή αλλά και ετεροδιµερή επεκτείνει την ποικιλοµορφία της εξειδίκευσης της δέσµευσης διαφορετικών ακολουθιών του DNA.

4-17 Εικόνα 4.21. Η δηµιουργία οµοδιµερών και ετεροδιµερών αυξάνει την δυνατότητα αναγνώρισης πολλών νουκλεοτιδικών ακολουθιών. Η αλλαγή της διεύθυνσης της φορτισµένης α-έλικας που αλληλεπιδρά µε το DNA κάνει το διµερές να αναγνωρίζει παλίνδροµες ακολουθίες νουκλεοτιδικών βάσεων. 4.3.2. Πρωτεϊνικές ενότητες που συµµετέχουν στην ρύθµιση της µεταγραφής νουκλεϊνικών οξέων. Ένα σηµαντικό ρόλο στον έλεγχο της διαφοροποίησης και της αύξησης παίζει η µεταγραφή του DNA σε mrna. Η διεργασία αυτή ρυθµίζεται από µία πληθώρα συµπλόκων πρωτεϊνών µε πρωτείνες και πρωτεϊνών µε DNA πέρα από την αλληλεπίδραση της πολυµεράσης του RNA µε το γονίδιο και το προϊόν της µεταγραφής. Οι πρωτείνες που ρυθµίζουν την µεταγραφή των γονιδίων λέγονται παράγοντες µεταγραφής και εµπίπτουν σε τρεις µεγάλες οµάδες. Τους γενικούς παράγοντες µεταγραφής, αυτούς που εµπλέκονται απευθείας στην µεταγραφή και τους παράγοντες που αναγνωρίζουν ακολουθίες ελέγχου (ρυθµιστικές ακολουθίες) του DNA. Η ρύθµιση της έκφρασης των γονιδίων επιτυγχάνεται µε την ικανότητα των παραγόντων µεταγραφής να ενεργοποιούν ή απενεργοποιούν τις πρωτείνες που εµπλέκονται στην µεταγραφή. Ήδη έχουν αναγνωριστεί πολλοί προκαρυωτικοί και ευκαρυωτικοί παράγοντες µεταγραφής και κατηγοριοποιούνται ανάλογα µε την λειτουργία ή την αµινοξική τους ακολουθία. Μία σηµαντική οικογένεια παραγόντων µεταγραφής είναι αυτή των bhlh που περιέχουν ένα µοτίφ του τύπου α-έλικα στροφή α-έλικα που συµµετέχει στον διµερισµό των. Έτσι σχηµατίζεται µία δέσµη τεσσάρων ελίκων µε δύο από κάθε µονοµερές (εικόνα 4.22).

4-18 Εικόνα 4.22. Ο καταστολέας-ενεργοποιητής της τρυπτοφάνης που χρησιµοποιεί το µοτίφ έλικα-στροφή-έλικα (HLH) για την αλληλεπίδραση µε το DNA. Η διµερική πρωτεΐνη δεσµεύεται σε παλίνδροµη ακολουθία νουκλεοτιδίων. Μία άλλη πολύ σηµαντική κατηγορία περιέχει παράγοντες µεταγραφής µε αυτόκλειστα λευκίνης (εικόνα 4.23 ). Σε αυτές αµινοξικά κατάλοιπα λευκίνης που βρίσκονται σε κάθε στροφή της α-έλικας σχηµατίζουν µία υδρόφοβη επιφάνεια διεπαφής για την αλληλεπίδραση µεταξύ των πρωτεϊνών. Στο αµινοτελικό άκρο του αυτόκλειστου λευκίνης βρίσκεται µία βασική περιοχή υπεύθυνη για την αναγνώριση και την δέσµευση σε συγκεκριµένες ακολουθίες DNA. Αυτοί οι παράγοντες µπορούν και σχηµατίζουν όµο- και ετεροδιµερή τροποποιώντας έτσι την εξειδίκευση και την ικανότητα ενεργοποίησης. Εικόνα 4.23. Η απ ευθείας αλληλεπίδραση αυτόκλειστου λευκίνης µε την διπλή έλικα του DNA.

4-19 Η κατηγορία RHR εµπλέκεται στους µηχανισµούς άµυνας των κυττάρων ρυθµίζοντας την έκφραση πληθώρας γονιδίων που εκφράζουν πρωτείνες κυτταρικών αντιδράσεων σε λοιµώξεις. Είναι όµο- ή ετεροδιµερή και δοµικά µοιάζουν µε τις ανοσοσφαιρίνες έχοντας δύο δοµικές ενότητες µε κάθε µία να αποτελείται από µία β- πιεσµένη (sandwich) πτυχωτή επιφάνεια όπως αυτή των ανοσοσφαιρινών των οποίων ρυθµίζουν την µεταγραφή. Η κατηγορία παραγόντων µεταγραφής που ονοµάστηκε επανάληψη αγκυρίνης παρατηρείται σε τουλάχιστον 100 διαφορετικές πρωτείνες µε πολύ διαφορετικές λειτουργίες όπως ένζυµα, αναστολείς ενζύµων, παράγοντες µεταγραφής, και αναστολείς παραγόντων µεταγραφής. Οι επαναλήψεις αγκυρίνης είναι αµινοξικές ακολουθίες 32-33 αµινοξέων, που αρχικά εντοπίστηκαν στην πρωτείνη αγκυρίνη και εµπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις µεταξύ πρωτεϊνών. Ο αριθµός των επαναλήψεων είναι τουλάχιστον τέσσερις. Κάθε ακολουθία δοµικά αποτελείται από ένα β-κλώνο, ένα µοτίφ α-έλικα - στροφή α-έλικα, µία εκτεταµένη δοµή και άλλο ένα β-κλώνο. Οι έλικες και οι β-κλώνοι είναι αντιπαράλληλοι µεταξύ των και το επίπεδο των β-κλώνων κάθετο στον άξονα των α-ελίκων. Η αµινοξική ακολουθία είναι της µορφής: 1 2 3 12345678901234567890123456789012345 -G-TPLHLAAR-GHVEVEVVKLLLD-GADVNA-TK A I SQ NNLD I AEV K NPD D V K T M R Q S I N E Οι γλυκίνες στις θέσεις 2, 13 και 25 βρίσκονται σε απότοµες στροφές της πολυπεπτιδικής αλυσίδας ενώ τα διατηρητέα υδρόφοβα αµινοξέα στις θέσεις 5,10,17,20 και 21 εµπλέκονται σε αλληλεπiδράσεις µεταξύ των επαναλήψεων. Μία µεγάλη οικογένεια παραγόντων µεταγραφής που ενεργοποιούνται από µικρούς υποκαταστάτες (ligands) είναι αυτή των στεροειδών /πυρηνικών υποδοχέων. Στην οικογένεια αυτή ανήκουν οι υποδοχείς στεροειδών ορµονών, ο γλυκοκορτικοειδής υποδοχέας (εικόνα 4.24), οι υποδοχείς ανδρογόνων, λιπόφιλων ορµονών, βιταµίνης D, ρετινοϊκού οξέος και θυροειδών ορµονών. Όλοι αυτοί οι υποδοχείς έχουν µία οµόλογη αρχιτεκτονική στις δοµικές τους ενότητες µε την αµινοτελική περιοχή να ποικίλλει ανάλογα µε τον ιστό και την λειτουργία και να περιέχει περιοχές διµερισµού και πρόσδεσης στο DNA και την καρβοξυλοτελική περιοχή να περιέχει την περιοχή πρόσδεσης του υποκαταστάτη και ρύθµισης της ενεργοποίησης µεταγραφής.

4-20 Εικόνα 4.24. Η περιοχή δέσµευσης του DNA στον γλυκοκορτικοειδή υποδοχέα. Η περιοχή πρόσδεσης στο DNA αποτελείται από δύο πολύ καλά συντηρηµένους δακτύλους ψευδαργύρου όπου ο ένας οριοθετεί την έλικα αναγνώρισης του DNA και ο άλλος συµµετέχει στον διµερισµό. Η περιοχή πρόσδεσης του υποκαταστάτη είναι διµερή µε ελικοειδείς δοµές και µία µεγάλη κοιλότητα όπου γίνεται η επιλεκτική πρόσδεση του υποστρώµατος.