Διαμόρφωση υποστρωμάτων στη μικροκαι νανο-κλίμακα για την δημιουργία πρωτεϊνικών μικροσυστοιχιών Επιστημονικοί Υπεύθυνοι έργου: A. Τσερέπη Ινστιτούτο Μικροηλεκτρονικής Π. Σ. Πέτρου Ινστιτούτο Ραδιοϊσοτόπων & Ραδιοδιαγνωστικών Προϊόντων «Αποτελέσματα Δημοέρευνας», 1η Δεκεμβρίου 2009
Αντικείμενο & Στόχοι Ανάπτυξη καινοτόμου μεθόδου για την κατασκευή πρωτεϊνικών μικροσυστοιχιών μέσω διαμόρφωσης υποστρωμάτων με μικρο-σχηματοποίηση και επιλεκτική κατεργασία περιοχών υποστρωμάτων σε πλάσμα Στόχοι Μεγάλη πυκνότητα συστοιχιών (μικρο-κηλίδες διαμέτρου 1 μm) Δημιουργία μικροσυστοιχιών πάνω σε Si και φθηνότερα υποστρώματα Διερεύνηση επίδρασης της νανοτραχύτητας της επιφάνειας μικροκηλίδων στην προσρόφηση πρωτεϊνών (αύξηση ευαισθησίας ανίχνευσης) «Αποτελέσματα Δημοέρευνας», 1η Δεκεμβρίου 2009
Εισαγωγή Πρωτεϊνικές μικροσυστοιχίες Μικροσυστοιχίες: πρωτεϊνικές κηλίδες ακινητοποιημένεςσε σε συγκεκριμένες περιοχές πάνωσε σε υποστρώματα γρήγορη, εύκοληκαι και ταυτόχρονη ανίχνευση χιλιάδων στοιχείωνμε με ένα ένα μόνο πείραμα με με ελάχιστο όγκο δείγματος Βιοαναλυτικές εφαρμογές: βασική έρευνα, διαγνωστική, έρευνα και ανακάλυψη φαρμάκων Βιοαναλυτικές εφαρμογές: βασική έρευνα, διαγνωστική, έρευνα και ανακάλυψη φαρμάκων Απαιτήσεις: Πυκνή, Πυκνή, ισχυρή, και και ομοιόμορφη πρόσδεση Μηδαμινή πρόσδεσησε σεμη μη επιθυμητές περιοχέςγια γιαμεγάλο μεγάλολόγο λόγο σήματος/θόρυβο Τεχνολογικές προσεγγίσεις: μ-contact printing photolithography spotting (contact) hydrophobic/hydrophilic patterning «Αποτελέσματα Δημοέρευνας», 1η Δεκεμβρίου 2009
Υδροφιλική/Υδροφοβική διαμόρφωση υποστρωμάτων Si SiO 2 υπόστρωμα SiO 2 } Fluorocarbon plasmas: etching through thin FC layer hydrophilicity Si : deposition of FC layer hydrophobicity θ < 90 θ > 90
Διεργασίες AZ SiO 2 Si conventional photolithography etching of deposition of selective & hydrophilic SiO 2 hydrophobic FC on Si fluorocarbon film SiO 2 etching appropriate c-c 4 F 8 plasma treatment photoresist removal
Προσρόφηση πρωτεϊνών SiO 2 /Si 3 N 4 FC on Si Protein adsorbed on on hydrophilicsio 2 2 Fluorocarbon coated Si Sifree of of protein protein microarray no further modification immersion in rabbit IgG H 2 O washing, BSA blocking solutions immersion in AlexaFluor 488 labeled fluorescent microscope imaging anti-rabbit IgG antibody
Αποτελέσματα Water Contact Angle θ (deg) 100 80 60 40 20 0 0 50 100 150 200 250 300 θ (Si) θ (SiO 2 ) θ (Si - SiO 2 ) SiO 2 Etching Rate (nm/min) high E.R. FC deposition on Si vs. etching of SiO 2 hydrophilic/hydrophobic patterning
Αποτελέσματα adsorbed IgG (2 mg/ml) on SiO 2 (θ = 57 ο ) protein free FC coated Si (θ = 90 ο ) 10 10 μm μmwidth protein protein lines lines on onsio 2 2 5 μm μmwidth protein protein lines lines on onsio 2 2 3 μm μmwidth protein protein lines lines on onsio 2 2 1 mm mmdiam. protein protein spots spots on on SiO SiO 2 2 single single 1 mm mmdiam. protein protein spot spoton on SiO SiO 2 2 after after deposition of of single single protein protein drop drop
Αποτελέσματα XPS analysis of plasma-treated samples «Αποτελέσματα Δημοέρευνας», 1η Δεκεμβρίου 2009 Si Reference C: 1 m onolayers F: < 0.1 m onolayers Si Plasm a C: 5-6 m onolayers F: 3-4 m onolayers SiO 2 Reference C: <0.3 m onolayers F: <0.1 m onolayers SiO 2 P lasm a C : 2-3 m onolayers F: 0.5 m onolayers F 2.4x10 5 2.0x10 5 C Intensity 1.6x10 5 1.2x10 5 8.0x10 4 276 280 284 288 292 680 684 688 692 696 Binding Energy (ev)
Αποτελέσματα Ομοιομορφία και Εκλεκτικότητα προσρόφησης «Αποτελέσματα Δημοέρευνας», 1η Δεκεμβρίου 2009 2.0 μg/ml IgG spot on 1 mm-wide SiO 2 pattern on Si untreated O 2 plasma-treated O 2 & c-c 4 F 8 plasma-treated Eκλεκτικότητα> 25:1 25:1 Εξαιρετική Ομοιογένεια (CV 10%) & μορφολογία κηλίδων
Αποτελέσματα: Διακριτική ικανότητα 2.0 μg/ml b-bsa spots on 20 μm-wide patterns at 500 μm distances 2.0 μg/ml b-bsa spots on 1 μm-wide patterns at 1 μm distances 1 mm-wide spots of IgG and BSA
Αποτελέσματα: Σταθερότητα και Κορεσμός προσροφημένης πρωτεϊνης Fluorescence Intensity (a.u.) 210 180 150 120 90 60 30 0 0 5 10 15 20 25 30 number of washes in phosphate buffer Πλακίδια PS Υποστρώματα SiO 2 /Si Fluorescence Intensity (a.u.) 140 120 100 80 60 40 20 1h SiO 2 (62 0 ) 24h SiO 2 (62 0 ) 1h Si 1h Si 1h SiO 2 (52 0 ) 0 0 20 40 60 80 100 concentration (μg/ml)
Αποτελέσματα Πρωτεϊνικές μικροσυστοιχίες σε άλλα υποστρώματα «Αποτελέσματα Δημοέρευνας», 1η Δεκεμβρίου 2009 Υψηλό κόστος Υπόστρωμα Si Μη συμβατό με εμπορικό μετρητικό εξοπλισμό (π.χ. scanners) Στόχος Ανάπτυξη νέων υποστρωμάτων με συμπεριφορά συγκρίσιμη με αυτή των SiO 2 / Si (χαμηλό κόστος, εμπορικά εφαρμόσιμα) Υπόστρωμα Υλικό μικροσχηματοποίησης Si wafer φωτοπολυμερή SiO 2 γυαλί AZ SU-8 AZ/ SiO 2 AZ/γυαλί μικροσκοπίου SU-8/γυαλί μικροσκοπίου
Αποτελέσματα: Πρωτεϊνικές μικροσυστοιχίες σε υποστρώματα ΑΖ/SiO 2 Control samples AZ/ SiO 2 Treated Samples Spot to background ratio > 100:1 SiO 2 AZ SiO 2 AZ Selective immobilization of b-bsa on c-c 4 F 8 plasma modified SiO 2 spots spot size 50 μm Σχηματοποιημένα υποστρώματα AZ/SiO 2 μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την κατασκευή πρωτεϊνικών μικροσυστοιχιών
Αποτελέσματα: Πρωτεϊνικές μικροσυστοιχίες σε υποστρώματα AZ/γυαλί «Αποτελέσματα Δημοέρευνας», 1η Δεκεμβρίου 2009 Control sample AZ Δείγμα μετά την κατεργασία σε πλάσμα C 4 F 8 AZ /γυαλί/ μικροσκοπίου λόγος σήματος/υπόβαθρο 1.5:1 Μη επαρκής εκλεκτικότητα στην προσρόφηση πρωτεϊνών
Αποτελέσματα: Πρωτεϊνικές μικροσυστοιχίες σε άλλα υποστρώματα glass untreated SU-8 Φωτοπολυμερές SU-8 /γυαλί Κατεργασία σε πλάσμα short treatment, selectivity: 30:1 Long treatment, selectivity > 60:1 Scanner photo: προσρόφηση δύο πρωτεϊνών Υποστρώματα SU-8/γυαλί μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη κατασκευή μικροσυστοιχιών για βιοαναλυτικές εφαρμογές με εμπορικό εξοπλισμό 16
Αποτελέσματα: Μορφολογική τροποποίηση υποστρωμάτων Adsorption of 25μg/ml b-bsa on SF 6 -treated PDMS surfaces 150 Fluorescence intensity 100 SF 6 treatment time 50 0 (untreated) 20 s 2 min 6 min 20 min 0 0 5 10 15 20 25 b-bsa concentration (μg/ml) Αύξηση προσρόφησης b-bsa (7-10)x σε υποστρώματα κατεργασμένα 6-12 min σε πλάσμα SF 6 (και γήρανση) Untreated PDMS surface 6 min SF 6 plasma treated 20 min SF 6 plasma treated Microspotting on 6 min plasma-treated surface Καλή ομοιομορφία κηλίδων με κατεργασία μέχρι 6 min στο πλάσμα
Συμπεράσματα Κατάλληληχημική χημικήκαι και τοπογραφική τροποποίηση υποστρωμάτωνσε σε συνδυασμόμε με μικροσχηματοποίηση οδήγησεστη στη δημιουργία υποστρωμάτων κατάλληλωνγια για πρωτεϊνικές μικροσυστοιχίες Επιλεκτική προσρόφηση >25:1 >25:1 σε σεsio 2 /Si, 2, 2 /Si, AZ/SiO 2, SU-8/γυαλί Μέγεθοςτων των κηλίδων περιορίζεταιαπό απότην λιθογραφική διεργασία (spots (spots <1 <1 μm) μm) Μεγάλη πυκνότητακαι και ομοιομορφία κηλίδων Η μέθοδος που αναπτύχθηκε σε συνδυασμό με αυτόματη απόθεση μικρο-κηλίδων αποφεύγει: χρονοβόρες χημικές τροποποιήσεις ανομοιομορφία των κηλίδων σε σχήμα και ένταση υψηλό θόρυβο υποβάθρου λόγω ανεπιθύμητης προσρόφησης σε περιοχές εκτός κηλίδων Μελλοντικοί στόχοι: περαιτέρω σμίκρυνση κηλίδων, βιοαναλυτικές εφαρμογές «Αποτελέσματα Δημοέρευνας», 1η Δεκεμβρίου 2009
«Αποτελέσματα Δημοέρευνας», 1η Δεκεμβρίου 2009 Αποτελέσματα του έργου με αριθμούς Παρουσιάσεις σε διεθνή συνέδρια: (3) 2007, (2) 2008, (1) 2009 Άρθρα σε διεθνή περιοδικά: High density protein patterning through selective plasma-induced fluorocarbon deposition on Si substrates P. Bayiati, A. Malainou, E. Matrozos, A. Tserepi, P.S. Petrou, S.E. Kakabakos, E. Gogolides, Biosensors & Bioelectronics 24 (2009) 2979-2984 High aspect-ratio plasma-induced nanotextured polydimethylsiloxane surfaces with enhanced protein adsorption capacity, M.E. Vlachopoulou, P.S. Petrou, S.E. Kakambakos, A. Tserepi, E. Gogolides, J. Vac. Sci. Technol. 26(6) 2543-2548 (2008) Δίπλωμα ευρεσιτεχνίας (1) ΟΒΙ 2007, PCT 2008 ΜΕΘΟΔΟΣ ΚΑΤΑΣΚΕΥΗΣ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΩΝ Α. Τσερέπη, Ε. Γογγολίδης, Π. Πέτρου, Σ. Κακαμπάκος, Π. Μπαγιάτη, Ε. Ματρώζος, (Αρ.Αιτ. 20070100394/20.06.2007) Method for making a microarray, PCT Request Filing No: PCT/GR08/00048
«Αποτελέσματα Δημοέρευνας», 1η Δεκεμβρίου 2009 Ευχαριστώ τους Γ. Πέτρου, Σ. Κακαμπάκο (ΙΡΡΠ) Β. Γογγολίδη (ΙΜΗΛ) Π. Μπαγιάτη, Ε. Ματρώζο Α. Μαλαίνου Μ. Βλαχοπούλου «ΔΗΜΟΕΡΕΥΝΑ» γιατηχρηματοδότηση