Μελέτη της επίδρασης αντικαρκινικών χημειοθεραπευτικών φαρμάκων στη ρύθμιση του Cdt1

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών Εφαρμογές Στις Βασικές Επιστήμες Κατεύθυνση: Φαρμακοκινητική Τοξικολογία Διπλωματική Εργασία Μελέτη της επίδρασης αντικαρκινικών χημειοθεραπευτικών φαρμάκων στη ρύθμιση του Cdt1 Σταθοπούλου Αθανασία Μοριακή Βιολόγος και Γενετίστρια Επιβλέπων: Ταραβήρας Σταύρος, Επίκουρος καθηγητής Απρίλιος 2008 1

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Περίληψη... 1 Abstract... 2 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 3 1.1 Αντικαρκινική χημειοθεραπεία... 5 1.2 Ο κυτταρικός κύκλος και η ρύθμισή του... 9 1.2.1 Ο κυτταρικός κύκλος και η ρύθμισή του μέσω των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών... 9 1.2.2 Ο κυτταρικός κύκλος η ρύθμιση της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA... 12 1.3 Τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου... 15 1.4 Σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που ενεργοποιούνται από βλάβες στο DNA... 18 1.4.1 Αναγνώριση της βλάβης του DNA... 18 1.4.2 Μόρια διαμεσολαβητές... 20 1.4.3 Μόρια τελεστές... 21 1.4.4 G1 και G1/S checkpoint... 22 1.4.5 S-phase checkpoint... 22 1.4.6 G2 checkpoint... 23 1.4.7 Cdt1-dependent checkpoint... 24 2. ΣΤΟΧΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ... 26 3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ... 28 3.1 ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΕΣ ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ... 29 3.1.1 Καλλιέργεια ευκαρυωτικών καρκινικών κυττάρων... 29 3.1.2 Αραίωση κυττάρων (split)... 29 3.1.3 Ψύξη κυττάρων (stock )... 29 3.1.4 Απόψυξη κυττάρων... 29 3.1.5 Χορήγηση αντικαρκινικών χημειοθεραπευτικών φαρμάκων σε κύτταρα... 30 3.1.6 Συγχρονισμός κυττάρων... 30 3.2 ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ... 31 2

3.2.1 Παρασκευή ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων για ανάλυση κατά Western... 31 3.2.2 Ανοσοαποτύπωση κατά Western (Western blot)... 31 3.2.3 Ανοσοφθορισμός... 34 3.3 ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΜΕ RNAi... 36 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 42 4.1 Στόχευση της έκφρασης του Cdt1 από αντικαρκινικά χημειοθεραπευτικά φάρμακα που τροποποιούν το DNA (Cisplatin και MMS)... 43 4.2 Δράση αντικαρκινικών χημειοθεραπευτικών φαρμάκων που αναστέλλουν την DNA τοποϊσομεράσης II (Doxorubicin και Etoposide) στην αποικοδόμηση του Cdt1... 46 4.3 Επίδραση φαρμάκων που δεν προκαλούν πρωτογενώς βλάβες στο DNA ο αντιμεταβολίτης 5-Fluorouracil (5-FU)... 53 4.4 Ο ανταγωνιστής των οιστρογόνων Tamoxifen... 57 4.5 Διερεύνηση του μοριακού μηχανισμού δράσης των αντικαρκινικών χημειοθεραπευτικών φαρμάκων στη Cdt1 πρωτεΐνη... 58 5. ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 62 5.1 Γενικά... 63 5.2 Φάρμακα που ενεργοποιούν το σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που εξαρτάται από το Cdt1... 64 5.3 Φάρμακα που δεν ενεργοποιούν το σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που εξαρτάται από το Cdt1... 67 5.4 Μοριακός μηχανισμός ενεργοποίησης του checkpoint του κυτταρικού κύκλου που εξαρτάται από το Cdt1 ύστερα από επίδραση με αντικαρκινικά χημειοθεραπευτικά φαρμάκα... 68 5.5 Συμπέρασματα... 69 6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 70 3

Πρόλογος Όλα ξεκίνησαν όταν πέρασα στη Μοριακή Βιολογία & Γενετική, στην Αλεξανδρούπολη. Τα φοιτητικά χρόνια πέρασαν ευχάριστα, οι γνώσεις που πήρα χρήσιμες και οι καθηγητές μου πολύτιμοι συμβουλάτορες. Από τους πολυτιμότερους υπήρξαν ο κ. Γιώργος Σκάβδης και ο κ. Ραφαήλ Σανδαλτζόπουλος, λέκτορας και επίκουρος καθηγητής Μοριακής Βιολογίας αντίστοιχα. Οι συμβουλές τους ήταν καθοριστικές για το μέλλον που θα ακολουθούσα, καθώς μου συνέστησαν τον φίλο και συνεργάτη τους κ. Σταύρο Ταραβήρα, επίκουρο καθηγητή Φαρμακολογίας, στην Ιατρική σχολή, στο Πανεπιστήμιο της Πάτρας. Έτσι ξεκίνησε ένα νέο κεφάλαιο στη ζωή μου, το κεφάλαιο των μεταπτυχιακών σπουδών, με επιβλέποντα τον κ. Σταύρο Ταραβήρα, στον οποίο ανήκει το μεγαλύτερο ευχαριστώ για την πορεία μου τα τελευταία τρία χρόνια. Η συνεργασία μας υπήρξε άψογη, η καθοδήγησή του συνεχής, και τα σχόλιά του πάντα εύστοχα. Δε θα μπορούσα να παραβλέψω την πολύτιμη βοήθεια και συνεχή υποστήριξη της κ. Ζωής Λυγερού, επίκουρης καθηγήτριας Γενικής Βιολογίας, την ευχαριστώ θερμά. Ευχαριστώ ιδιαίτερα τα μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής, τον κ. Νικόλαο Τσοπάνογλου, επίκουρο καθηγητή Φαρμακολογίας, και τον κ. Ιωάννη Ζαρκάδη, αναπληρωτή καθηγητή Γενικής Βιολογίας, για τις πολύτιμες συμβουλές και την κατανόηση κατά τη διεξαγωγή και συγγραφή της διπλωματικής μου εργασίας. Σε αυτό το σημείο θα ήθελα να ευχαριστήσω τους συνεργάτες και φίλους μου μεταπτυχιακούς και προπτυχιακούς φοιτητές των εργαστηρίων Φαρμακολογίας και Γενικής Βιολογίας, για την άριστη συνεργασία και την υποστήριξη. Θα ήταν αγνωμοσύνη αν παρέλειπα να ευχαριστήσω τους αγαπημένους μου φίλους που βρίσκονται δίπλα μου τα τελευταία χρόνια, με στηρίζουν, με διασκεδάζουν και μερικοί έπαιξαν σημαντικό ρόλο στην έως τώρα πορεία μου, Κώστας, Όλγα, Ζωή, Γιάννης, Κατερίνα, Χαράλαμπος, Βαγγέλης, Κώστας Τ., Δημήτρης Ι, Last but not least ευχαριστώ θερμά την οικογένειά μου, τους γονείς μου και τον αδερφό μου, που με αγαπούν και με στηρίζουν σε κάθε βήμα. Για κάποιους το ταξίδι τελειώνει εδώ, για μένα τώρα αρχίζει. Η Ιθάκη είναι μακριά και έχω πολλά βήματα ακόμα να διανύσω 4

Περίληψη Η μεταβίβαση του γενετικού υλικού στα θυγατρικά κύτταρα απαιτεί αξιοπιστία στην αντιγραφή του DNA, ακρίβεια στην κατανομή των χρωμοσωμάτων και αποτελεσματικούς μηχανισμούς επιδιόρθωσης, ώστε να ελαχιστοποιούνται οι κληρονομήσιμες μεταλλαγές στο γενετικό υλικό. Τα ευκαρυωτικά κύτταρα, για να πετύχουν αυτή την πιστότητα έχουν αναπτύξει μηχανισμούς επιτήρησης που παρατηρούν τις βλάβες στο DNA, ώστε να τις επιδιορθώνουν και να συνεχίζουν τον κυτταρικό κύκλο. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η πρωτεΐνη Cdt1 είναι ένα κρίσιμο και εξελικτικά συντηρημένο μόριο-στόχος του DNA damage checkpoint, καθώς έκθεση σε ιονίζουσα ή UV ακτινοβολία στοχεύει το Cdt1 για πρωτεόλυση. Το Cdt1 είναι ένα απαραίτητο στοιχείο της αδειοδότησης του κυτταρικού κύκλου ( cell cycle licencing ), και είναι συντηρημένο από τη ζύμη μέχρι τα θηλαστικά. Σε αυτή την εργασία, μελετάμε την ικανότητα διαφορετικών αντικαρκινικών χημειοθεραπευτικών φαρμάκων να επάγουν το σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που εξαρτάται από το Cdt1. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι βλάβες στο DNA που έχουν προκληθεί από τα φάρμακα MMS, Cisplatin και Doxorubicin οδηγούν σε άμεση πρωτεολυτική καταστροφή του Cdt1, ενώ χορήγηση Tamoxifen δεν επηρεάζει τα επίπεδα της πρωτεΐνης Cdt1. Βλάβες στο DNA που έχουν προκληθεί από Etoposide έχουν διαφορετική επίδραση στα πρωτεϊνικά επίπεδα του Cdt1, ανάλογα με την κυτταρική σειρά. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία αλλαγή στα επίπεδα έκφρασης της Geminin, που είναι αναστολέας του Cdt1. Από τα αποτελέσματά μας προκύπτει ότι οι γενοτοξικές θεραπείες που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία του καρκίνου διαφέρουν ως προς την ικανότητά τους να ενεργοποιούν το σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που εξαρτάται από το Cdt1. 5

Abstract The faithful transmission of the genetic material to the daughter cells requires extreme accuracy in DNA replication, precision in chromosome distribution and effective repair mechanisms to minimize heritable mutations affecting the genetic material. To achieve this fidelity, cells have evolved surveillance mechanisms that monitor the structure of DNA and coordinate repair and cell cycle progression. Recent studies revealed that Cdt1 is a critical and evolutionarily conserved target of the DNA damage checkpoint, since exposure to ionizing or UV radiation targets Cdt1 for degradation. Cdt1 is an essential component of the cell cycle licensing machinery that is conserved from yeasts to mammals. We have examined the ability of several anticancer drugs to act through the Cdt1 dependent cell cycle checkpoint. Our findings indicate that DNA damage induced by MMS, Cisplatin and Doxorubicin leads to rapid proteolytic destruction of Cdt1, whereas treatment with Tamoxifen does not affect Cdt1 protein levels. DNA damage induced by Etoposide has differential effect on Cdt1 protein levels, depending on the cell line. There is no change on Geminin expression levels, the protein inhibitor of Cdt1. Our results suggest that genotoxic therapies used against cancer differ in respect to Cdt1 dependent checkpoint. 6

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 7

Ο καρκίνος είναι ένα από τα πλέον κοινά και σοβαρά προβλήματα που έχει να αντιμετωπίσει η Ιατρική. Σύμφωνα με τις στατιστικές, ο καρκίνος προσβάλει περισσότερο από το 1/3 του πληθυσμού και είναι η δεύτερη αιτία θανάτου μετά τις καρδιαγγειακές παθήσεις, καθώς ευθύνεται για το 20% των θανάτων. Ο καρκίνος δεν είναι μια μόνο ασθένεια, αλλά αποτελεί συλλογική ονομασία 100 περίπου διαφορετικών ασθενειών. Πρόκειται για μια περίπλοκη ασθένεια που είναι το αποτέλεσμα της συσσώρευσης γενετικών ανωμαλιών που επιτρέπουν στα κύτταρα να ξεφύγουν από το φυσιολογικό έλεγχο (Weinberg, 1996). Στο παρελθόν, οι περισσότερες μορφές καρκίνου είχαν αποδοθεί σε ιούς και σε έκθεση σε περιβαλλοντικούς παράγοντες (πχ. στην ιονίζουσα ακτινοβολία). Σήμερα πλέον πιστεύεται ότι η βασική αιτία είναι οι μεταλλάξεις γονιδίων που ενέχονται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, στην κυτταρική αύξηση και σε άλλες θεμελιώδεις κυτταρικές λειτουργίες. Τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να έχουν πολλαπλές γενετικές ανωμαλίες, όπως ανευπλοειδίες, χρωμοσωμικές αναδιατάξεις, διπλασιασμούς ή ελλείψεις. Πρόσφατες μελέτες αναφέρονται στις επιγενετικές αλλαγές ορισμένων γονιδίων που οδηγούν σε καταστολή της δράσης τους και επακόλουθο καρκίνο. Οι μεταλλάξεις που οδηγούν σε καρκίνο μπορεί να είναι είτε ενεργοποιητικές (gain-offunction) όπως στην περίπτωση των ογκογονιδίων, είτε αδρανοποιητικές (loss-of-function) όπως στην περίπτωση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Όλες οι παραπάνω ανωμαλίες οδηγούν τα νεοπλαστικά κύτταρα σε ανεξέλεγκτη αύξηση που οδηγεί στη δημιουργία ενός όγκου (ή νεόπλασμα) (Thompson, McInnes and Willard, Ιατρική Γενετική; Gelehrter, Collins, Ginsburg, Αρχές Ιατρικής Γενετικής). Ο όγκος αποτελείται από ένα παρέγχυμα πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων, με ένα στρώμα συνδετικού ιστού και αιμοφόρων αγγείων. Υπάρχουν τρεις βασικές μορφές όγκων: - Τα σαρκώματα (sarcomas), στα οποία ο όγκος αποτελείται από μεσεγχυματικό ιστό, - Τα καρκινώματα (carcinomas), που προέρχονται από επιθηλιακό ιστό, και - Οι αιμοποιητικές (hematopoietic) και λεμφοειδείς κακοήθειες (lymphoid malignancies), όπως οι λευχαιμίες και τα λεμφώματα. Σε κάθε μια από αυτές τις μορφές οι όγκοι ταξινομούνται σύμφωνα με τη θέση που εμφανίζονται, τον τύπο του ιστού και το βαθμό κακοήθειας. Στις ανεπτυγμένες χώρες, τουλάχιστον το 10% των συνολικών δαπανών απορροφάται για την ιατρική περίθαλψη των καρκινοπαθών. Ο σκοπός της αντικαρκινικής θεραπείας είναι 8

η αφαίρεση του όγκου και η παρεμπόδιση την επανεμφάνισης ή της διασποράς του πρωτογενούς όγκου. Όταν ο όγκος είναι πολύ επιθετικός και δεν μπορεί να καταστραφεί, τότε ο στόχος της θεραπείας είναι η ανακούφιση από τα συμπτώματα και η παράταση του χρόνου ζωής του ασθενούς (παρηγορητική θεραπεία). Υπάρχουν διαφορετικές μορφές θεραπείας, ωστόσο αυτή που θα επιλεχθεί εξαρτάται από τον τύπο και τη θέση του καρκίνου, το βαθμό κακοήθειας, την ηλικία, το φύλο, τη γενική φυσική κατάσταση και τις προτιμήσεις του ασθενούς. Οι πιο κοινές θεραπείες είναι η χειρουργική επέμβαση, η τοπική ακτινοθεραπεία και η χημειοθεραπεία. Ένα μικρό ποσοστό των καρκινοπαθών θα θεραπευτούν μόνο με χειρουργική επέμβαση ή και ακτινοθεραπεία. Σχεδόν όλοι οι υπόλοιποι κάποια στιγμή κατά τη διάρκεια της νόσου θα λάβουν χημειοθεραπεία. Από αυτούς, ένα μικρό ποσοστό που πάσχει από συγκεκριμένες νεοπλασίες θα οδηγηθεί σε ίαση ή παρατεταμένη ύφεση. Ωστόσο, η χημειοθεραπεία μπορεί να προκαλέσει μεν μια ύφεση της νόσου αλλά οι ανεπιθύμητες ενέργειες ενδεχομένως να οδηγήσουν τον ασθενή στο θάνατο (Mycek, Harvey and Champe, Φαρμακολογία). 1.1 Αντικαρκινική χημειοθεραπεία Ο στόχος της αντικαρκινικής χημειοθεραπείας είναι η εκλεκτική καταστροφή των κυττάρων του όγκου. Τα χημειοθεραπευτικά φάρμακα είναι κυτταροτοξικές κυτταροστατικές ουσίες που αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, παρεμβαίνοντας σε σημεία του μεταβολισμού που είναι ζωτικής σημασίας για την επιβίωσή τους, με αποτέλεσμα να επιβραδύνουν την ανάπτυξή τους και να επάγουν τις αποπτωτικές διαδικασίες (Kim, 2005). Τα περισσότερα φάρμακα που χρησιμοποιούνται στην κλινική πράξη για την αντικαρκινική θεραπεία είναι μη εξειδικευμένα κυτταροτοξικά φάρμακα (Workman, 2001), και δε μπορούν να διακρίνουν τα νεοπλασματικά από τα φυσιολογικά κύτταρα. Ωστόσο, τα ταχέως διαιρούμενα κακοήθη κύτταρα είναι αυτά που επηρεάζονται περισσότερο. Τα κυτταροτοξικά φάρμακα διακρίνονται σε αυτά που δρουν ανεξάρτητα από τον κυτταρικό κύκλο και σε αυτά που είναι εξειδικευμένα για τον κυτταρικό κύκλο. Τα αντικαρκινικά χημειοθεραπευτικά φάρμακα διαχωρίζονται ανάλογα με το μηχανισμό δράση τους - Φάρμακα που τροποποιούν απευθείας το DNA (πχ. Cisplatin, MMS) 9

- Αναστολείς της DNA τοποϊσομεράσης (πχ. Doxorubicin, Etoposide) - Αντιμεταβολίτες (πχ. 5-Fluorouracil, 6-Thioguanine) - Στεροειδείς ορμόνες ή αναστολείς στεροειδών ορμονών (πχ. Οιστρογόνα, Tamoxifen) - Αντιμιτωτικά (πχ. Taxol, Vincristine) - Αναστολείς κινασών (πχ. Imatibin (ή Gleevec), αναστολέας της κινάσης BCR-ABL, Flavopiridol, γενικός αναστολέας των CDKs) - Βιολογικές θεραπείες (πχ. Μονοκλωνικά αντισώματα εναντίον αντιγόνων των όγκων, Χορήγηση κυτταροκινών για την ενίσχυση της ανοσογονικότητας των όγκων) Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν αντικαρκινικά χημειοθεραπευτικά φάρμακα με διαφορετικό μηχανισμό δράσης. Επιλέχθηκαν φάρμακα που δρουν απευθείας στο DNA είτε παρεμβαλλόμενα στη δίκλωνη έλικα του DNA (Cisplatin) είτε μεθυλιώνοντας συγκεκριμένες βάσεις (MMS), φάρμακα που αναστέλουν τη δράση του ενζύμου DNA τοποϊσομεράση ΙΙ (Doxorubicin, Etoposide), ένα ανάλογο πυριμιδίνης (5-Fluorouracil) και ο αναστολέας των οιστρογόνων Tamoxifen. Cisplatin (cis-diamminedichloroplatinum II) Η Cisplatin (σισπλατίνη) είναι ένα αντικαρκινικό χημειοθεραπευτικό φάρμακο που ανήκει στην τάξη των ρυθμιστικών συμπλόκων του λευκόχρυσου. Έχει μηχανισμό δράσης παρόμοιο με των αλκυλιωτικών παραγόντων. Η Cisplatin (εικόνα 1.1Α) εισέρχεται στα κύτταρα με διάχυση, αλληλεπιδρά με το DNA (συνδέεται κυρίως με το Ν7 γειτονικών G) και σχηματίζει γέφυρες εντός και μεταξύ των ελικών του, προκαλώντας έτσι βλάβες στο DNA και αναστέλλοντας τη σύνθεση DNA και RNA. Η Cisplatin μπορεί επίσης να σχηματίζει γέφυρες μεταξύ του DNA και ορισμένων πρωτεϊνών (κυρίως αυτών που περιέχουν ομάδες SH) (Gonzalez et al., 2001). MMS (Methyl Methane Sulfonate) Το MMS (εικόνα 1.1Β) είναι ένας DNA αλκυλιωτικός παράγοντας που τροποποιεί τη Guanine σε 7-Methylguanine και την Adenine σε 7-Methyladenine, προκαλώντας έτσι λανθασμένο ζευγάρωμα των βάσεων του DNA και μπλοκάρισμα της αντιγραφής του (Beranek, 1990). 10

Etoposide Το Etoposide (ετοποσίδη) είναι ένα ημισυνθετικό παράγωγο της ποδοφυλλοτοξίνης και ως κύριο στόχο έχει την τοποϊσομεράση ΙΙ. Το Etoposide (εικόνα 1.1Γ) συνδέεται με το σύμπλοκο topoii/dna και το διατηρεί στη διασπάσιμη μορφή, καθιστώντας το έτσι ευπαθές σε ρήξεις της διπλής έλικας του DNA και αναστέλλοντας την αντιγραφή του DNA (Burden et al., 1996; Robinson and Osheroff, 1991; Sehested and Jensen, 1996) Doxorubicin Η Doxorubicin (δοξορουβικίνη) είναι ένα αντιβιοτικό τύπου ανθρακυκλίνης. Η Doxorubicin (εικόνα 1.1Δ), που αναφέρεται συχνά με το εμπορικό της όνομα andriamycin, όπως και το Etoposide αλληλεπιδρά με την αντίδραση ρήξης-επανένωσης της τοποϊσομεράσης ΙΙ. Εκτός από αυτή την ιδιότητα, έχουν αναφερθεί αρκετοί διαφορετικοί μηχανισμοί που ευθύνονται για την κυτταροστατική και κυτταροτοξική της δράση (Gewirtz, 1999). Έτσι, η Doxorubicin παρεμβάλλεται στο DNA σε γειτονικά ζεύγη βάσεων και συνδέεται με το σακχαροφωσφορικό σκελετό του DNA προκαλώντας τοπική έκπτυξη της δίκλωνης έλικας και αναστολή της σύνθεσης των μακρομορίων, προσδένεται σε κυτταρικές μεμβράνες και διαταράσσει τη λειτουργία των μεταφορικών διαδικασιών. Επίσης μπορεί να αλληλεπιδρά με το μοριακό οξυγόνο και έτσι να παράγονται υπεροξειδικά ανιόντα και υπεροξείδιο του υδρογόνου, τα οποία στη συνέχεια προκαλούν βλάβες στη μια έλικα του DNA. 5-FU (5-Fluorouracil) Το αντικαρκινικό φάρμακο 5-Fluorouracil (5-Φθοριοουρακίλη) είναι ένα πυριμιδινικό ανάλογο, που έχει ένα σταθερό άτομο φθορίου αντί του ατόμου του υδρογόνου στη θέση 5 του ουρακιλικού δακτυλίου. Η 5-FU (εικόνα 1.1Ε) δεν είναι ενεργή από μόνη της, αλλά παράγει ενεργούς μεταβολίτες που έχουν ιδαίτερα σημαντικές φαρμακολογικές δράσεις. Αυτοί οι μεταβολίτες περιλαμβάνουν τα νουκλεοτίδια 5-Fluorouridine triphosphate (FUTP), 5-Fluorodeoxyuridine monophosphate (FdUMP) και 5-Fluorodeoxyuridine triphosphate (FdUTP). Το FUTP ενσωματώνεται στο RNA και παρεμποδίζει τις δράσεις του. Το FdUMP αναστέλλει τη δράση της θυμιδιλικής συνθετάσης (TS, Thymidilate Synthetase), με αποτέλεσμα να ελαττώνονται τα ενδοκυττάρια επίπεδα θυμιδίνης, και έτσι να αναστέλλεται η σύνθεση του DNA (Bunz et al., 1999; Parker and Cheng, 1990; Valeriote and Santelli, 1984). 11

Tamoxifen Η Tamoxifen (ταμοξιφαίνη) (εικόνα 1.1ΣΤ) είναι ένας ανταγωνιστής των οιστρογόνων. Συνδέεται με τον οιστρογονικό υποδοχέα αλλά το σύμπλεγμα που προκύπτει δεν είναι παραγωγικό, συνεπώς δεν ενεργοποιούνται τα γονίδια που ανταποκρίνονται στα οιστρογόνα (Gold et al., 1994). Εικόνα 1.1: Αντικαρκινικά χημειοθεραπευτικά φάρμακα. (Α) Cisplatin, (B) Methyl Methane Sulfonate (MMS), (Γ) Etoposide, (Δ) Doxorubicin, (Ε) 5-Fluorouracil (5-FU), (ΣΤ) Tamoxifen Τα περισσότερα αντικαρκινικά χημειοθεραπευτικά φάρμακα προκαλούν βλάβες στο γενετικό υλικό των κυττάρων. Ο κυτταρικός κύκλος ελέγχεται αυστηρά από περίπλοκες διαδικασίες ώστε να εξασφαλίζεται η μεταβίβαση ολόκληρης της γενετικής πληροφορίας από κύτταρο σε κύτταρο και από γενιά σε γενιά. Όταν η φυσιολογική πορεία των κυττάρων διαταραχθεί (πχ. όταν προκληθούν βλάβες στο DNA) ενεργοποιούν τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου (cell cycle checkpoints), με αποτέλεσμα η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου να σταματά και τα κύτταρα να ενεργοποιούν κατάλληλα σηματοδοτικά μονοπάτια ώστε είτε να επιδιορθωθούν οι βλάβες που έχουν προκληθεί είτε να ξεκινήσει ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος (απόπτωση). 12

1.2 Ο κυτταρικός κύκλος και η ρύθμισή του Ο κύκλος ζωής του κυττάρου, δηλαδή η χρονική περίοδος ανάμεσα σε δυο διαδοχικές κυτταρικές διαιρέσεις, καλείται κυτταρικός κύκλος. Ο κυτταρικός κύκλος είναι μια πολύ καλά ελεγχόμενη διεργασία και διακρίνεται στις εξής φάσεις (εικόνα 1.2): - Μεσόφαση (interphase), που αποτελείται από τις περιόδους G1 (Gap 1), S (DNA Synthesis), και G2 (Gap 2), και είναι ο χρόνος που μεσολαβεί από το τέλος μιας μίτωσης μέχρι την αρχή της επόμενης. - Μίτωση ή φάση Μ (M phase), που είναι η περίοδος της κυτταρικής διαίρεσης. Εικόνα 1.2: Ο κυτταρικός κύκλος περιλαμβάνει τις φάσεις G1, S, G2 και M. Τα κύτταρα μπορεί να αποσυρθούν από τον κυτταρικό κύκλο στη φάση G0 (φάση ηρεμίας) ή να εισέλθουν ξανά σε αυτόν. (Lewin, Genes VIII) 1.2.1 Ο κυτταρικός κύκλος και η ρύθμισή του μέσω των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών Η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου ελέγχεται αυστηρά από κυκλίνες (Cyclins), κυκλινοεξαρτώμενες κινάσες (Cyclin-Dependent Kinases, CDKs) και αναστολείς των CDKs (CDK Inhibitors, CDKIs), που ρυθμίζονται όλα από φωσφωρυλιώσεις και αποφωσφωρυλιώσεις. Η πρόοδος από τη μια φάση του κυτταρικού κύκλου στην επόμενη ρυθμίζεται από μια κινάση, που αποτελείται από μια καταλυτική υπομονάδα (μια CDK) και ένα ρυθμιστικό μόριο διμερισμού (μια κυκλίνη). Οι CDKs είναι μόρια που παραμένουν ανενεργά από μόνα τους και η ενεργοποίηση τους επιτυγχάνεται μόνο ύστερα από τη σύνδεσή τους με τις κυκλίνες. Τα επίπεδα των κυκλινών εμφανίζουν περιοδική διακύμανση 13

κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, και συνεπώς η ενεργοποίηση των CDKs γίνεται μόνο όταν τα επίπεδα της αντίστοιχης κυκλίνης είναι υψηλά. Η ενεργότητα των CDKs, εκτός από τη ρύθμιση μέσω των επιπέδων της κυκλίνης, ρυθμίζεται αρνητικά από τις ανασταλτικές πρωτεΐνες CDKIs. Υπάρχουν δύο οικογένειες CDKIs, η οικογένεια INK4 (Inhibitor of Cdk4) και η οικογένεια CIP / KIP (Cdk-Interacting protein / Kinase Inhibitor Proteins). Η οικογένεια INK4 αποτελείται από τις πρωτεΐνες p14, p15, p16, p18 και p19, που αναστέλουν τα σύμπλοκα CyclinD/CDKs κατά τη G1 φάση. Η οικογένεια CIP/KIP περιλαμβάνει τις πρωτεΐνες Cip1/p21, Kip1/p27 και Kip2/p57 και φαίνεται να έχει μια ευρύτερη δράση, καθώς τα μέλη της αλληλεπιδρούν και αναστέλουν τα σύμπλοκα CyclinΕ/CDK2, CyclinD/CDK4 (CDK6), CyclinA/CDK2, και CyclinB/CDK1 (Meeran and Katiyar, 2008; Pavletich, 1999). Στις διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου δρουν συγκεκριμένα σύμπλοκα Cyclin/CDKs. Κατά τη G1 φάση είναι ενεργά τα σύμπλοκα Cyclin D/CDK4 (CDK6) και Cyclin Ε/CDK2 1 και ευθύνονται για την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου από τη φάση G1 στην S (εικόνα 1.3). Μια από τις σημαντικότερες πρωτεΐνες κατά τη G1 φάση είναι η πρωτεΐνη Rb. Η κατάσταση φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης Rb ελέγχει την ενεργότητα των μεταγραφικών παραγόντων της οικογένειας E2F, η ενεργοποίηση των οποίων είναι απαραίτητη για την είσοδο στη φάση S. Όταν η πρωτεΐνη Rb είναι υποφωσφορυλιωμένη προσδένεται και καταστέλει τον παράγοντα E2F. Αντιθέτως, η υπερφωσφορυλίωση της prb από τα σύμπλοκα Cyclin D/CDK4 (CDK6) και Cyclin E/CDK2 προκαλεί την αποδέσμευσή της από το E2F, το οποίο ενεργοποιείται, και συνεπώς την είσοδο των κυττάρων στη φάση S. (Stewart et al., 2003). Η δημιουργία των συμπλόκων Cyclin D/CDK4 (CDK6) και Cyclin Ε/CDK2 εξαρτάται από τις CDKIs p21 και p27 (Cheng et al., 1999; Sherr and Roberts, 1999; Stewart et al., 2003). Η G1/S μετάβαση ελέγχεται από το σύμπλοκο Cyclin E/CDK2, το οποίο φαίνεται επίσης να είναι απαραίτητο για την έναρξη της αντιγραφής. του DNA (Resnitzky et al., 1994; Tsai et al., 1993). Η είσοδος των κυττάρων στη φάση S σηματοδοτείται από τη δημιουργία του συμπλόκου Cyclin Α/CDK2 (Resnitzky et al., 1995). 1 Το σύμπλοκο Cyclin E/CDK2 δημιουργείται λίγο πριν το τέλος της G1 φάσης και διατηρείται και στην αρχή της φάσης S. 14

Εικόνα 1.3: Η ρύθμιση της φάσης G1 και η μετάβαση G1/S (Stewart et al., 2003) Μετά το τέλος της αντιγραφής του DNA και την έναρξη της φάσης G2 δημιουργείται το σύμπλοκο Cyclin Α/CDC2 (γνωστό και ως Cdk1), το οποίο ενεργοποιεί το σχηματισμό του συμπλόκου Cyclin Β/CDC2. Το σύμπλοκο Cyclin Β/CDC2 2 ανακαλύφθηκε αρχικά σε ωοκύτταρα του Xenopus και χαρακτηρίστηκε ως παράγοντας ωρίμανσης ή παράγοντας προώθησης της φάσης Μ (Maturation Promoting Factor M-phase Promoting Factor, MPF), καθώς ήταν ικανός να προκαλέσει μίτωση σε ανώριμα ωοκύτταρα (Dunphy et al., 1988; Gautier et al., 1988; Masui and Markert, 1971). Το σύμπλοκο Cyclin Β/CDC2 ρυθμίζεται τόσο αρνητικά όσο και θετικά από φωσφορυλιώσεις (εικόνα 1.4). Μια ενεργοποιητική φωσφορυλίωση στη θέση Thr161 πραγματοποιείται από τη CAK (CDK Activating Kinase) 3. Κατά τη διάρκεια της G2 φάσης το σύμπλοκο Cyclin Β/CDC2 παραμένει ανενεργό μέσω δυο φωσφορυλιώσεων στις θέσεις Thr14 και Thr15 (παρεμποδίζεται η πρόσδεση του ATP) που γίνονται από τις κινάσες Wee1 και Myt1. Το σύμπλοκο ενεργοποιείται πλήρως όταν αποφωσφορυλιωθούν αυτά τα δυο κατάλοιπα από τη φωσφατάση CDC25C, και τότε το 2 Στα κύτταρα των θηλαστικών υπάρχουν 2 ισομορφές της Cyclin B, η Cyclin B1 και η Cyclin B2. 3 Υπάρχουν ενδείξεις ότι η CDKI p21 μπορεί να αναστείλει τη δράση της CAK. 15

κύτταρο εισέρχεται στη μίτωση (Smits and Medema, 2001). Όταν το κύτταρο εισέρχεται στη μίτωση έχει ενεργοποιημένα τα σύμπλοκα Cyclin Α/CDC2 και Cyclin Β/CDC2. Η εξέλιξη της μίτωσης όμως απαιτεί την αποικοδόμηση των κυκλινών. Πρώτο αποικοδομείται το σύμπλοκο CyclinΑ/CDC2. Στη συνέχεια, μετά τη μετάφαση, αποικοδομείται και το σύμπλοκο Cyclin Β/CDC2 από το σύμπλοκο APC (Anaphase Promoting Complex) (Smits and Medema, 2001). Εικόνα 1.4: Η ρύθμιση του συμπλόκου της κινάσης της φάσης Μ Cyclin/Cdc2 γίνεται μέσω φωσφορυλιώσεων και αποφωσφορυλιώσεων (Lewin, Genes VIII) 1.2.2 Ο κυτταρικός κύκλος και η ρύθμιση της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA Τα κύτταρα σε κάθε κυτταρικό κύκλο κατά τη φάση S δημιουργούν ένα πιστό και ακριβές αντίγραφο της γενετικής τους πληροφορίας, το οποίο και μεταβιβάζουν στα θυγατρικά κύτταρα. Για να διαφυλάξουν την ακεραιότητα της γενετικής τους πληροφορίας πραγματοποιούν το διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων τους κατά τη μίτωση, και αφού βεβαιωθούν ότι έχει ολοκληρωθεί η αντιγραφή του γενετικού τους υλικού. Η αντιγραφή του DNA γίνεται κατά τη φάση S και είναι ιδιαιτέρα σημαντικό ολόκληρο το DNA να αντιγραφεί μια και μοναδική φορά. Η μη αντιγραφή ή η δημιουργία περισσότερων αντιγράφων έστω και ενός μικρού τμήματος DNA μπορεί να οδηγήσει σε γενετική αστάθεια, που αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους παράγοντες προδιάθεσης για καρκινογένεση. 16

Προκειμένου να αποφευχθούν όλες αυτές οι δυσάρεστες συνέπειες, η έναρξη της αντιγραφής του DNA και η μη επανέναρξή της ρυθμίζονται από μια διαδικασία που ονομάζεται αδειοδότηση της αντιγραφής (origin licensing) και απαιτεί το σχηματισμό του προαντιγραφικού συμπλόκου (pre-rc, pre-replicative complex). Ο κυτταρικός κύκλος των ευκαρυωτών ρυθμίζεται μέσω της ενεργοποίησης και απενεργοποίησης των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών. Ο σχηματισμός του pre-rc είναι εφικτός μόνο όταν τα επίπεδα των CDKs είναι χαμηλά, δηλαδή στο τέλος της φάσης της μίτωσης και κατά τη φάση G1. Όταν προς το τέλος της φάσης G1 υπάρχουν υψηλότερα επίπεδα ενεργότητας των CDKs επιτρέπεται η έναρξη της αντιγραφής (ενεργοποίηση των ήδη σχηματισμένων pre- RCs), ενώ τα ακόμα υψηλότερα επίπεδα κατά τη φάση G2 δρουν ανασταλτικά αποτρέποντας της επανέναρξη της αντιγραφής. Το pre-rc αποτελείται από το σύμπλοκο ORC (Origin Recognition Complex) που προσδένεται στα σημεία έναρξης της αντιγραφή, τις πρωτεΐνες Cdc6 και Cdt1 (Cdc10- dependent transcript) που είναι υπεύθυνες για το φόρτωμα του τελευταίου συστατικού του pre-rc, τις πρωτεΐνες MCM 2-7 (Mini-Chromosome-Maintenance proteins) (Blow and Hodgson, 2002; Maiorano et al., 2000). Το Cdt1, όπως και τα υπόλοιπα μέλη του pre-rc, είναι ένας παράγοντας συντηρημένος σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Η ρύθμιση της ενεργότητας του Cdt1 κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου είναι ένας πολύ σημαντικός μηχανισμός για τη ρύθμιση της αδειοδότησης της αντιγραφής, έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι έχει δράση μόνο κατά τη G1 φάση όπου γίνεται δημιουργία του pre-rc συμπλόκου και η αδειοδότηση για αντιγραφή του DNA. Η υπερέκφραση αυτού του παράγοντα μπορεί να προκαλέσει επανέναρξη της αντιγραφής του DNA, βλάβες στο DNA και γενομική αστάθεια (Liontos et al., 2007; Vaziri et al., 2003). Η ρύθμιση του Cdt1 στα ανθρώπινα κύτταρα γίνεται μέσω δύο μηχανισμών που δρουν ανεξάρτητα ο ένας από τον άλλο: μέσω της ρυθμιζόμενης έκφρασης της πρωτεΐνηςαναστολέα Geminin και μέσω πρωτεόλυσης. Η Geminin είναι μια πρωτεΐνη που εκφράζεται μόνο στα μετάζωα και συσσωρεύεται από τη φάση S του κυτταρικού κύκλου έως και τη μίτωση. Η Geminin προσδένεται στο Cdt1, εμποδίζει την αλληλεπίδρασή του με το σύμπλοκο MCM και έτσι αναστέλλει την έναρξη της αντιγραφής (εικόνα 1.5) (McGarry and Kirschner, 1998; Nishitani et al., 2006). 17

Εικόνα 1.5: Ο ρόλος της Geminin στη ρύθμιση του Cdt1 κατά τις διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου (Luo and Kessel, 2004) Εκτός από τη Geminin, το Cdt1 ρυθμίζεται αυστηρά μέσω ουβικουτινο-εξαρτώμενης πρωτεόλυσης. Έτσι δυο διαφορετικά σύμπλοκα E3 ubiquitin ligases στοχεύουν το Cdt1 για πρωτεόλυση. Αυτά τα δύο σύμπλοκα αναγνωρίζουν διαφορετικά τμήματα στο αμινοτελικό άκρο του Cdt1 (εικόνα 1.6). Το ένα σύμπλοκο είναι το SCF-Skp2 και το άλλο το Cul4- DDB1-Cdt2. - Το Cdt1 φωσφορυλιώνεται στο Cy motif από σύμπλοκα Cyclin A/CDK (Cyclin A/Cdk1 και Cyclin A/Cdk2). Αυτή η φωσφωρυλίωση έχει σαν αποτέλεσμα η πρωτεΐνη Skp2 του συμπλόκου SCF (Skp1-Cullin 1-F-box protein) να προσδεθεί στο Cdt1 και αυτό επακόλουθα να αποικοδομηθεί. - Κατά τη διάρκεια της αντιγραφής του DNA, το PCNA είναι προσδεδεμένο στη χρωματίνη. Το Cdt1 προσδένεται στο PCNA μέσω ενός PIP motif (PCNA-interaction protein box) που βρίσκεται στην αμινοτελική του πλευρά και στη συνέχεια στρατολογείται το 18

σύμπλοκο Cul4-DDB1-Cdt2 που ουβικουιτινιώνει το Cdt1 αποικοδόμησή του στο πρωτεάσωμα (Jin et al., 2006; Nishitani et al., 2006). με αποτέλεσμα την Εικόνα 1.6: Μοντέλο για τη ρύθμιση της δραστικότητας του Cdt1 κατά τον κυτταρικό κύκλο. Από την έναρξη της φάσης S έως τη μίτωση η Geminin προσδένεται στο Cdt1 και εμποδίζει την αλληλεπίδρασή του με το σύμπλοκο MCM. Ύστερα από τη φωσφορυλίωσή του Cdt1 στο Cy motif το σύμπλοκο SCF- Skp2 προσδένεται στο Cdt1 και το ουβικουιτνιώνει. Το PIP motif του Cdt1 αλληλεπιδρά με το PCNA που βρίσκεται στη χρωματίνη και στη συνέχεια το σύμπλοκο Cul4-DDB1-Cdt2 στοχεύει το Cdt1 για πρωτεολυτική αποικοδόμηση (Nishitani et al., 2006). 1.3 Τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου Τα ευκαρυωτικά κύτταρα έχουν αναπτύξει ένα περίπλοκο σύστημα σημείων ελέγχου (cell cycle checkpoints), ώστε να εξασφαλίζουν τη σωστή πορεία του κυτταρικού κύκλου. Αυτά τα σημεία ελέγχου «επιβλέπουν» την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου ύστερα από έκθεση σε περιβαλλοντικά στρες ή ύστερα από τυχαίες διαταραχές, όπως πιθανές βλάβες στο DNA ή λάθη κατά την αντιγραφή του (Osborn et al., 2002; Zou and Elledge, 2003). Αυτοί οι μηχανισμοί επιτήρησης είναι εξελικτικά συντηρημένοι (εικόνα 1.7) και εξασφαλίζουν τη μεταβίβαση του σωστού γενετικού υλικού από κύτταρο σε κύτταρο (Melo and Toczyski, 2002). Ο όρος σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου ( cell cycle checkpoint ) αναφέρεται στους μηχανισμούς με τους οποίους τα κύτταρα ενεργά σταματούν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου ώστε να έχουν χρόνο μέχρι να διορθωθούν τυχόν βλάβες που έχουν υποστεί ή αλλιώς να οδηγηθούν σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (Hartwell and 19

Weinert, 1989). Συνεπώς, στα σημεία ελέγχου πιστοποιείται η ομαλή διαδοχή των φάσεων του κυτταρικού κύκλου και παρεμποδίζεται η μετάβαση στην επόμενη φάση του κύκλου, εάν δεν έχουν ολοκληρωθεί με επιτυχία όλα τα προηγούμενα στάδια. Εικόνα 1.7: Τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου είναι συντηρημένα σε όλους τους ευκαρυώτες. (a) Σύγκριση των μονοπατιών που ενεργοποιούνται μετά από διαφορετικές βλάβες στο DNA και τα μόρια που ενεργοποιούνται κάθε φορά στους οργανισμούς S.cerevisiae, S.pombe, Xenopus, και στα θηλαστικά. (b) Τα ομόλογα γονίδια που λαμβάνουν μέρος ύστερα από την ενεργοποίηση των checkpoints (Melo and Toczyski, 2002). Αρκετοί περιβαλλοντικοί παράγοντες, όπως η υπεριώδης ακτινοβολία του ηλίου, η υπέρυθρη ακτινοβολία, καθώς και διάφορες μεταλλαξιγόνες χημικές ουσίες προκαλούν βλάβες στο DNA, οι οποίες πρέπει να επιδιορθωθούν γιατί σε αντίθετη περίπτωση μπορεί να οδηγήσουν στη δημιουργία καρκίνου. Επίσης, παραπροϊόντα του φυσιολογικού κυτταρικού 20

μεταβολισμού, όπως πχ. τα υπεροξειδικά ανιόντα και το υπεροξείδιο του υδρογόνου, μπορούν να βλάψουν το γονιδίωμα ενός οργανισμού. Τέλος, η πρωτοταγής δομή του DNA μπορεί να υποστεί διάφορες αλλαγές, όπως για παράδειγμα μερικοί χημικοί δεσμοί στο DNA μπορεί τυχαία και υπό φυσιολογικές συνθήκες να διασπώνται, ή κάποιες βάσεις να απαμινωθούν με αποτέλεσμα τη συσσώρευση λαθών στο DNA. Όλες οι παραπάνω βλάβες φαίνονται συγκεντρωτικά στην εικόνα 1.8, όπου φαίνονται και οι συνήθεις μηχανισμοί επιδιόρθωσης αυτών, καθώς και όλες οι συνέπειές τους για το κύτταρο. Εικόνα 1.8: Οι βλάβες του DNA, οι μηχανισμοί επιδιόρθωσης και οι συνέπειες τους. (a) Στην κορυφή φαίνονται οι πιο κοινοί παράγοντες που εισάγουν βλάβες στο DNA, στο κέντρο παραδείγματα τέτοιων βλαβών, και κάτω φαίνονται οι συνήθεις μηχανισμοί επιδιόρθωσης σε κάθε περίπτωση. (b) Τα βραχυπρόθεσμα αποτελέσματα των βλαβών του DNA είναι η στάση του κυτταρικού κύκλου, ενώ τα μακροπρόθεσμα περιλαμβάνουν μόνιμες βλάβες στο DNA που μπορούν να οδηγήσουν μέχρι και στην καρκινογένεση (Hoeijmakers, 2001). Όπως γίνεται κατανοητό από τα παραπάνω, οι αποκρίσεις των κυττάρων στις βλάβες του DNA έχουν ιδαίτερη σημασία στην καρκινογένεση. Οι βλάβες στο DNA μπορεί να συμβάλλουν στην πρόκληση καρκίνου. Ωστόσο, η πρόκληση βλάβης στο DNA χρησιμοποιείται για τη θεραπεία του καρκίνου, καθώς αρκετές αντικαρκινικές θεραπείες (ακτινοθεραπεία και αρκετά χημειοθεραπευτικά φάρμακα) στοχεύουν το DNA. Παρόλα 21

αυτά, αρκετές από τις παρενέργειες της αντικαρκινικής θεραπείας οφείλονται σε βλάβες του DNA. Άρα, σε σχέση με τον καρκίνο θα μπορούσαμε απλοϊκά να πούμε ότι οι βλάβες στο DNA προκαλούν τον καρκίνο, χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία του, και ευθύνονται για την τοξικότητα της θεραπείας (Kastan and Bartek, 2004) 1.4 Σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που ενεργοποιούνται από βλάβες στο DNA Οι αποκρίσεις των κυττάρων στις βλάβες του DNA είναι αρκετά περίπλοκες, καθώς ενεργοποιούνται μονοπάτια με πολλά διαφορετικά μόρια, όπως αισθητήρες της βλάβης (DNA damage sensors), μόρια διαμεσολαβητές (mediators), μόρια μεταβιβαστές σημάτων (signal transducers) και τέλος τα μόρια τελεστές (effectors) (εικόνα 1.9) που ευθύνονται για τη στάση του κυτταρικού κύκλου σε διαφορετικές φάσεις. Εικόνα 1.9: Σχηματική απεικόνιση της μεταγωγής σήματος ύστερα από πρόκληση βλάβης στο DNA. Οι πρωτεΐνες sensors αναγνωρίζουν τη βλάβη, το σήμα μεταβιβάζεται στους mediators και τους transducers και αυτοί δίνουν τη σκυτάλη στους effectors που σταματούν τον κυτταρικό κύκλο ώστε να επιδιορθωθούν οι βλάβες ή τα κύτταρα να καταλήξουν σε απόπτωση (Niida and Nakanishi, 2006). 1.4.1 Αναγνώριση της βλάβης του DNA Το πρώτο βήμα κατά την απόκριση του κυττάρου σε βλάβες του DNA είναι η αναγνώριση της βλάβης (εικόνα 1.9). Τα μόρια που αναγνωρίζουν τις βλάβες διαφέρουν ανάλογα με το είδος της βλάβης, δηλαδή διαφορετικά μόρια αντιλαμβάνονται την ύπαρξη βλάβης όταν πρόκειται για βλάβες μονόκλωνου DNA (ssdna), και διαφορετικά όταν πρόκειται για δίκλωνες βλάβες στο DNA (DSB, DNA double strand breaks). 22

ssdna Βλάβες μονόκλωνου DNA (ssdna) μπορούν να προκύψουν είτε από διάφορες χημικές ουσίες, είτε από την επίδραση UV ακτινοβολίας, είτε από βλάβες κατά τη διάρκεια της αντιγραφής (DNA replication forks stalling). Μελέτες που έχουν γίνει σε θηλαστικά και στη ζύμη δείχνουν ότι οι παράγοντες Rad9, Rad1, Hus1 (Parrilla-Castellar et al., 2004) και Rad17 είναι απαραίτητοι για την ενεργοποίηση του μονοπατιού απόκρισης στις μονόκλωνες βλάβες του DNA (ssdna). Στους ανθρώπους και στη ζύμη, οι Rad9, Rad1, Hus1 σχηματίζουν ένα ετεροτριμερές σύμπλοκο, το σύμπλοκο 9-1-1 (Griffith et al., 2002; Kondo et al., 2001). Tο Rad17 αλληλεπιδρά με 4 υπομονάδες του παράγοντα RFC (Replication Factor C), τις Rfc2, Rfc3, Rfc4 και Rfc5 για τη δημιουργία ενός RFC-related complex, το οποίο έχει δομή παρόμοια με το PCNA (Proliferating Cell Nucleus Antigen) και δρα σαν συσφικτικός δακτύλιος (clamp-loading complex). Έτσι, όταν προκληθεί βλάβη στο DNA, το σύμπλοκο 9-1-1 στρατολογείται στην περιοχή της βλάβης, υπό τον έλεγχο του συμπλόκου Rad17 (Green et al., 2000; Kondo et al., 2001). Το σύμπλοκο 9-1-1 που είναι προσδεδεμένο στη χρωματίνη διευκολύνει την ενεργοποίηση των ATR και ATM και τη φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων τους. Το παραπάνω μονοπάτι μπορεί να ξεκινήσει και από το πρωτεϊνικό σύμπλοκο RPA, όπως γίνεται στην περίπτωση που περιγράφεται στη συνέχεια. Όταν κατά την αντιγραφή του DNA η DNA πολυμεράση μπλοκάρει (DNA replication fork stalling), το σύμπλοκο MCM συνεχίζει να ξεδιπλώνει τη διπλή έλικα του DNA κατά την πορεία της αντιγραφικής διχάλας. Έτσι δημιουργείται μονόκλωνο DNA, στο οποίο προσδένεται το πρωτεϊνικό σύμπλοκο RPA (Replication Protein A) και δημιουργείται το σύμπλοκο ssdna-rpa (Byun et al., 2005). Το σύμπλοκο ssdna-rpa i) στρατολογεί την κινάση ATR, μέσω της υπομονάδας ATRIP (Zou and Elledge, 2003) και ii) στρατολογεί και ενεργοποιεί το Rad17, που στη συνέχεια φορτώνει το σύμπλοκο 9-1-1 (Rad9-Hus1- Rad1) στο DNA(Yang and Zou, 2006). Αυτά τα δύο σύμπλοκα (ATR-ATRIP και 9-1-1) όταν φορτωθούν στο DNA μπορούν να αλληλεπιδράσουν και μεταξύ τους. Η κινάση ATR φωσφορυλιώνει το Rad17 και το 9-1-1. Κατά τη διαδικασία αυτή, η ATR αυτοφωσφορυλιώνεται και ενεργοποιείται. Στο μονοπάτι αυτό υπάρχει ένας ακόμα σημαντικός παράγοντας, η πρωτεΐνη TopBP1, η οποία προσδένεται στο σύμπλοκο 9-1-1 και στο ATRIP, ενισχύοντας έτσι τη δράση της κινάσης ATR (Kumagai et al., 2006). 23

DSBs Στην περίπτωση που υπάρχουν βλάβες στο δίκλωνο DNA (DSB, DNA double strand breaks) ενεργοποιούνται διαφορετικά μόρια για την αναγνώριση της βλάβης. Οι βλάβες τύπου DSB αναγνωρίζονται από το σύμπλοκο Mre11-Rad50-Nbs1 (MRN) (Bartek and Lukas, 2007; Tsai et al., 1993). Η αλληλεπίδραση του συμπλόκου MRN με το DNA που έχει υποστεί βλάβη είναι επαρκής για την ενεργοποίηση της κινάσης ATM, η οποία αυτοφοσφωρυλιώνεται σε διάφορα κατάλοιπα σερίνης. Το σύμπλοκο MRN-ATM ξεκινά δύο μονοπάτια με αποκορύφωμα την τοπική αναδιάταξη του DNA και της γειτονική χρωματίνης (local rearrangements of DNA and neighbouring chromatin), γεγονότα που είναι απαραίτητα για την επιδιόρθωση της βλάβης και για την έναρξη του μονοπατιού απόκρισης σε DSB. Στη συνέχεια το ATM φωσφορυλιώνει την καρβοξυτελική περιοχή της ιστόνης H2AX, η οποία χρησιμεύει ως μόριο συναρμογής (docking platform) για την πρωτεΐνη Mdc1 (Mediator of DNA damage checkpoint protein 1). Το Mdc1 προσδένεται τόσο στην ιστόνη H2AX, όσο και στο σύμπλοκο MRN (Stucki et al., 2005). Εκτός από το Mdc1 υπάρχουν και άλλες πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με τη χρωματίνη γύρω από τη βλάβη, όπως οι πρωτεΐνες 53BP1 (p53 binding protein), BRCA1 (Breast Cancer 1) η κινάση ATM, η οποία μπορεί να αλληλεπιδράσει και απευθείας (Bekker-Jensen et al., 2006). 1.4.2 Μόρια διαμεσολαβητές Μετά την αναγνώριση της βλάβης στο DNA αναλαμβάνουν τα μόρια διαμεσολαβητές, και αυτοί δεν είναι άλλοι από τις πρωτεΐνες PI(3)K (phosphatidylinositol- 3-OH kinase)-like kinases (PIKKs) ΑΤΜ (Ataxia Telangectasia Mutated) και ATR (ATMand Rad3-related). Οι κινάσες ATM και ATR είναι πρωτεΐνες μεγάλες σε μέγεθος και φωσφορυλιώνουν αρκετά υποστρώματα που διαμεσολαβούν τη στάση του κυτταρικού κύκλου στις φάσεις G1, S, ή G2. Η κινάση ATM φαίνεται πρωταρχικά να ενεργοποιείται ύστερα από δίκλωνες βλάβες στο DNA (DSB), ενώ η κινάση ATR ύστερα από μονόκλωνες βλάβες στο DNA (ssdna) (Yang et al., 2003). Το ενεργοποιημένο ΑΤΜ φωσφορυλιώνει αρκετές πρωτεΐνες, όπως τις BRCA1 (Cortez et al., 1999), NBS (Lim et al., 2000), Chk2, p53 (Banin et al., 1998; Canman et al., 1998), και τον εαυτό του (Bakkenist and Kastan, 2003). Το ενεργοποιημένο ATR ενεργοποιεί κι 24

αυτό τον εαυτό του, όπως και το ΑΤΜ, ενεργοποιεί επίσης την κινάση Chk1 (πιθανότατα μέσω της ενεργοποίησης της πρωτεΐνης Clapsin (Jin et al., 2006). 1.4.3 Μόρια τελεστές Τέλος, ανάλογα με τα μόρια τελεστές που ενεργοποιούνται από τους διαμεσολαβητές, ο κυτταρικός κύκλος σταματάει σε διαφορετικές φάσεις (εικόνα 1.10). Στη συνέχεια θα αναλυθούν ξεχωριστά τα διαφορετικά σημεία ελέγχου και τα μόρια που ενεργοποιούνται σε κάθε περίπτωση. Εικόνα 1.10: Σχηματική αναπαράσταση των μονοπατιών ενεργοποίησης ύστερα από βλάβες στο DNA. ανάλογα με τα σύμπλοκα Cyclin/Cdk που στοχεύονται κάθε φορά ο κυτταρικός κύκλος σταματάει σε διαφορετική φάση (Niida and Nakanishi, 2006). 1.4.4 G1 και G1/S checkpoint Όταν ένα κύτταρο έχει βλάβες στο DNA, το σημείο ελέγχου κατά τη G1 φάση παρεμποδίζει την αντιγραφή του κατεστραμμένου DNA μέσω διαφορετικών μονοπατιών. 25

Το πρώτο μονοπάτι, είναι πολύ γρήγορο και δεν απαιτεί ούτε μεταγραφή ούτε πρωτεϊνοσύνθεση. Ύστερα από βλάβες στο DNA, η ενεργοποιημένη Chk1 φωσφορυλιώνει το Cdc25A και επάγει την πρωτεολυτική του αποικοδόμησή (Mailand et al., 2000). Η γενικευμένη αποικοδόμηση του Cdc25A έχει ως αποτέλεσμα η Cdk2 να μην ενεργοποιείται και έτσι να παρεμποδίζεται το φόρτωμα της Cdc45 στη χρωματίνη. Η πρωτεΐνη Cdc45 είναι απαραίτητη για τη στρατολόγηση της DNA polymerase α στα σχηματισμένα προαντιγραφικά σύμπλοκα (pre-rcs), συνεπώς χωρίς αυτή δεν ξεκινά η αντιγραφή. Το δεύτερο μονοπάτι εμπλέκει τις ογκοκατασταλτικές πρωτεΐνες prb και p53. Η p53 είναι η πιο σημαντική ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη, χαρακτηρίζεται ως ο φύλακας του γονιδιώματος (the guardian of the genome) και χάνεται ή απενεργοποιείται στο 50% των περιπτώσεων καρκίνου του ανθρώπου. Σε φυσιολογικά κύτταρα, τα επίπεδα της p53 είναι χαμηλά καθώς η MDM2 ουβικουιτινιώνει και στοχεύει την p53 για πρωτεόλυση. Η MDM2 ρυθμίζει επίσης την ενεργότητα της p53 διευκολύνοντας την έξοδό της από τον πυρήνα (Appella and Anderson, 2001; Liang and Clarke, 2001). Οι βλάβες του DNA επάγουν τη φωσφορυλίωση του p53 στη Ser 15 από τις κινάσες ATM ή ATR και στη Ser 20 από την Chk1 καθως και την αδρανοποιητική φωσφορυλίωση της MDM2. Η φωσφορυλιωμένη p53 δε μπορεί να βγει εκτός πυρήνα ή να αποικοδομηθεί, και έτσι συσσωρεύεται στον πυρήνα. Στη συνέχεια η p53, ως μεταγραφικός παράγοντας ενεργοποιεί τη μεταγραφή του καταστολέα του κυτταρικού κύκλου p21, το οποίο απενεργοποιεί το σύμπλοκο Cyclin E/CDK2 (εικόνα 13) που είναι απαραίτητο για τη μετάβαση G1/S (Jin et al., 2006; Wahl and Carr, 2001). Έτσι, το κύτταρο δεν προχωράει στην S φάση και έχει χρόνο για την επιδιόρθωση του DNA, ενώ ταυτόχρονα επάγονται διάφοροι προαποπτωτικοί παράγοντες. Ένα παράλληλο μονοπάτι ξεκινά από το p53 και το ενεργοποιημένο p21, το οποίο προσδένεται στο σύμπλοκο Cyclin D-CDΚ4 και παρεμποδίζει τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης Rb καταστέλλοντας έτσι το μονοπάτι Rb/E2F. 1.4.5 S-phase checkpoint Κατά τη φάση S λειτουργούν σημεία ελέγχου για να αποτραπεί η συνέχιση της αντιγραφής σε περίπτωση που διαπιστωθούν προβλήματα στην ακεραιότητα του DNA. Αυτό το σημείο ελέγχου, που διασφαλίζει την αντιγραφή ολόκληρου του DNA, ρυθμίζεται από 26

δύο διαφορετικά μονοπάτια, το ATM/ATR-Chk1-Cdc25A και το ATM-Nbs1-SMC1 (Falck et al., 2002). Ανάλογα με το είδος της βλάβης, το ATM ή το ATR φωσφορυλιώνει το Chk1, το οποίο φωσφορυλιώνει στη συνέχεια το Cdc25A επάγοντας την πρωτεόλυσή του. Τα μειωμένα επίπεδα Cdc25A καταστέλλουν την ενεργότητα του συμπλόκου Cyclin E/Cdk2 (εικόνα 1.10, 1.11). Το δεύτερο μονοπάτι περιλαμβάνει την κινάση ATM που φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη Nbs1 σε κατάλληλες θέσεις και έτσι ενεργοποιείται το συμπλόκο MRN. Η κινάση ΑΤΜ φωσφορυλιώνει επίσης την κοχεσίνη SMC1 (Structural Maintenance of Chromosome 1) 4, και έτσι το κύτταρο δε μπορεί να εισέλθει στη μίτωση. Επίσης στο σημείο ελέγχου της φάσης S ενέχονται και οι πρωτεΐνες 53BP1, BRCA1 FANCD2 και MDC1 (Falck et al., 2002; Lim et al., 2000). 1.4.6 G2 checkpoint Το σημείο ελέγχου κατά τη φάση G2 (αναφέρεται και ως G2/M checkpoint) διασφαλίζει ότι τα κύτταρα δε θα εισέλθουν στη μίτωση εάν υποστούν βλάβες στο DNA κατά τη G2 φάση, ή εάν έχουν μη επιδιορθωμένες βλάβες από τις φάσεις G1 ή S. Η κινάση Chk1 φωσφωρυλιώνει το Cdc25C στη Ser216 δημιουργώντας έτσι θέση πρόσδεσης για την πρωτεΐνη 14-3-3, με αποτέλεσμα να εμποδίζεται η ενεργοποιητική αποφωσφωρυλίωση του Cdc25C και το ίδιο να εξέρχεται στο κυτταρόπλασμα. Αυτά τα δύο γεγονότα παρεμποδίζουν την ενεργοποίηση του συμπλόκου Cyclin B/Cdc2 kinase, το οποίο ευθύνεται για τη μετάβαση από τη φάση G2 στη μίτωση (εικόνα 1.10, 1.11). Η πρωτεΐνη 14-3-3 έχει βρεθεί ότι ευθύνεται για την έξοδο του συμπλόκου Cyclin B/ Cdk1 στο κυτταρόπλασμα (Smits and Medema, 2001; Xu et al., 2002). Εκτός από το παραπάνω μονοπάτι, έχει βρεθεί ότι και η πρωτεΐνη p53 ενέχεται στο G2 checkpoint, ενεργοποιώντας τις πρωτεΐνες p21 και GADD45 που αναστέλλουν τη δημιουργία και ενεργοποίηση του συμπλόκου Cyclin B/ Cdk1 (Taylor and Stark, 2001). 4 Οι κοχεσίνες (cohesins) διασφαλίζουν τη σύνδεση των χρωματίδων στην αρχή της μίτωσης και την αποσύνδεσή τους κατά τη διάρκειά της 27

Εικόνα 1.11: Τα checkpoints που ενεργοποιούνται ύστερα από βλάβες στο DNA και το σταμάτημα της πορείας του κυτταρικού κύκλου σε διαφορετικές φάσεις ανάλογα με τα μόρια τελεστές που ενεργοποιούνται κάθε φορά. Τα checkpoints φαίνονται σαν κόκκινα σήματα STOP (Meeran and Katiyar, 2008). 1.4.7 Cdt1-dependent checkpoint Πρόσφατες μελέτες έχουν αναδείξει ένα καινούργιο σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που είναι ανεξάρτητο από τα σημεία ελέγχου που αναφέρθηκαν παραπάνω και απαιτούν τα ATM/ATR, και εξαρτάται από την πρωτεΐνη του κυτταρικού κύκλου Cdt1. Πρόκειται για ένα μονοπάτι που ενεργοποιείται στα κύτταρα των θηλαστικών ύστερα από βλάβες του DNA που προκαλούνται από UV ή γ-ακτινοβολία (Brandt et al., 2004; Higa et al., 2003; Zhong et al., 2003). Το Cdt1 είναι παρόν μόνο κατά τη G1 φάση του κυτταρικού κύκλου, όπου συμμετέχει στη δημιουργία του προ-αντιγραφικού συμπλόκου (Pre-RC). Έχει δειχτεί ότι σε κύτταρα 28

κατά την G1 φάση που έχει προκληθεί βλάβη στο DNA, ενεργοποιείται το σημείο ελέγχου που εξαρτάται από το Cdt1. Στην περιοχή της βλάβης προσδένεται το PCNA και στη συνέχεια το σύμπλοκο της λιγάσης της ουμπικουιτίνης Cul4-Ddb1 Cdt2 υβικουιτινυλιώνει την πρωτεΐνη Cdt1, η οποία ακολούθως αποικοδομείται από το πρωτεάσωμα (Arias and Walter, 2006; Jin et al., 2006; Nishitani et al., 2006). Έτσι τα προαντιγραφικά σύμπλοκα δεν ενεργοποιούνται και η DNA πολυμεράση δεν ξεκινά την αντιγραφή του DNA που περιέχει βλάβες, προλαμβάνοντας τη δημιουργία περαιτέρω γονιδιακής αστάθειας (genomic instability). 29

2. ΣΤΟΧΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 30

Η πλειοψηφία των αντικαρκινικών χημειοθεραπευτικών φαρμάκων δημιουργεί βλάβες στο DNA, επάγει την ενεργοποίηση των σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου με αποτέλεσμα τη διακοπή της προόδου του κυτταρικού κύκλου και την επιδιόρθωση των βλαβών ή την απόπτωση των κυττάρων. Τα τελευταία χρόνια ταυτοποιήθηκε ένα καινούργιο σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που ενεργοποιείται ύστερα από βλάβες του DNA, είναι ανεξάρτητο από τα σημεία ελέγχου που απαιτούν τις κινάσες ATM/ATR και στοχεύει την πρωτεΐνη του κυτταρικού κύκλου Cdt1 (Brandt et al., 2004; Higa et al., 2003; Zhong et al., 2003). Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι να ταυτοποιήσουμε αντικαρκινικά φάρμακα τα οποία εξασκούν τουλάχιστον εν μέρει την αντικαρκινική τους δράση μέσω του καινούργιου σημείου ελέγχου που εξαρτάται από το Cdt1 και να μελετήσουμε το μοριακό μηχανισμό που χρησιμοποιούν τα συγκεκριμένα αντικαρκινικά φάρμακα. Χρησιμοποιήθηκαν χημειοθεραπευτικά φάρμακα που έχουν διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης: φάρμακα που στοχεύουν και τροποποιούν άμεσα το DNA (Cisplatin και MMS), αναστολείς της DNA τοποϊσομεράσης ΙΙ (Doxorubicin και Etoposide), ένας αντιμεταβολίτης (5-Fluorouracil), και ένας ανταγωνιστής των οιστρογόνων (Tamoxifen). 31

3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 32

3.1 ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΕΣ ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ 3.1.1 Καλλιέργεια ευκαρυωτικών καρκινικών κυττάρων Καρκινικά κύτταρα HeLa και HepG2 καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό μέσο DMEM, 10% (v/v) FBS και 1% (v/v) αντιβιοτικά πενικιλίνη/στρεπτομυκίνη (πίνακας 1). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ειδικό επωαστή στους 37 C και σε ατμόσφαιρα 5% CO 2. 3.1.2 Αραίωση κυττάρων (split) Σε κύτταρα που κάλυπταν το 70-90% της επιφάνειας των τρυβλίων, πραγματοποιείτο αραίωση των κυττάρων με τρυψίνη, όπως περιγράφεται παρακάτω: 1. Αφαίρεση του θρεπτικού μέσου και 2 φορές πλύσεις με PBS (πίνακας 2) 2. Προσθήκη κατάλληλης ποσότητας τρυψίνης 1x και επώαση στους 37 C. Η τρυψίνη 1x παρασκευάζεται από τρυψίνη 10x (Gibco, Cat. No. 15400) με αραίωση σε 1xPBS 3. Προσθήκη του ανάλογου όγκου θρεπτικού μέσου και διαχωρισμός των κυττάρων ανάλογα με το πείραμα. 3.1.3 Ψύξη κυττάρων (stock ) Για τη ψύξη των κυττάρων, ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία: 1. Αφαίρεση του θρεπτικού μέσου των κυττάρων (από φλάσκα Τ75 ή τρυβλίο 100mm) 2. Πλύσεις των κυττάρων 2 φορές με 1xPBS (πίνακας 2) 3. Προσθήκη κατάλληλης ποσότητας τρυψίνης 1x και επώαση στους 37 C 4. Προσθήκη θρεπτικού μέσου, ανάμιξη και μεταφορά των κυττάρων σε ένα falcon 5. Φυγοκέντρηση κυττάρων στα 800rpm για 5 λεπτά 6. Αφαίρεση του υπερκείμενου και επαναδιάλυση του ίζηματος 7. Προσθήκη 1xPBS και εκ νέου φυγοκέντρηση στα 800rpm για 5 λεπτά 8. Προσθήκη στο ίζημα των κυττάρων 1ml ορού FBS, 10%DMSO σε 1xPBS παγωμένο και μεταφορά αυτών σε κατάλληλα σωληνάρια (cryovials). Τα σωληνάρια διατηρούνται στους -80 C ή σε υγρό άζωτο για μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα. 33

3.1.4 Απόψυξη κυττάρων Τα cryovials των κυττάρων από τους 80 C ή από το υγρό άζωτο επωάζονται σε υδατόλουτρο των 37 C υπό συνεχή ανάδευση. Εν συνεχεία, τα κύτταρα καλλιεργούνται σε μια φλάσκα Τ75 ή τρυβλίο διαμέτρου 100mm όπου περιείχε ήδη θρεπτικό μέσο. 3.1.5 Χορήγηση αντικαρκινικών χημειοθεραπευτικών φαρμάκων σε κύτταρα Σε HeLa και HepG2 κύτταρα που κάλυπταν περίπου το 70% του τρυβλίου (με διάμετρο 35 mm) χορηγήθηκαν τα χημειοθεραπευτικά αντικαρκινικά φάρμακα που φαίνονται στον πίνακα 3. Σε κάποια πειράματα, ταυτόχρονα με την χορήγηση των φαρμάκων που φαίνονται στον πίνακα 3, χρησιμοποιήθηκε και ο αναστολέας του πρωτεασώματος MG-132 (Calbiochem, Cat. No. 474790) σε συγκέντρωση 20μΜ για 3h πριν τη λήξη της επώασης με τα φάρμακα. 3.1.6 Συγχρονισμός κυττάρων Για το συγχρονισμό HeLa και HepG2 κυττάρων στη G1 φάση του κυτταρικού κύκλου αρχικά χρησιμοποιήθηκε ένα δημοσιευμένο πρωτόκολλο (Gasnereau et al., 2007) για το συγχρονισμό κυττάρων στη μίτωση με χρήση Nocodazole και στη συνέχεια τα μιτωτικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν μερικές ώρες μέχρι να εισέλθουν στη φάση G1. Πρωτόκολλο συγχρονισμού 1. Σε φλάσκα Τ75 (για HeLa κύτταρα) ή τρυβλίο 100mm (για HepG2 ), όπου τα κύτταρα καταλαμβάνουν περίπου το 70%, προστίθενται 50ng/ml Nocodazole (Sigma, Cat. No. Μ1404) και ακολουθεί επώαση για 16h 2. Πλύσεις 2 φορές με παγωμένο 1xPBS 3. Προσθήκη 10ml 1xPBS και ελαφρά χτυπήματα στη φλάσκα ώστε να αποκολληθούν τα μιτωτικά κύτταρα. 4. Μεταφορά των μιτωτικών κυττάρων σε falcon και φυγοκέντρηση στα 800rpm για 5 λεπτά 5. Το υπερκείμενο αφαιρείται, το ίζημα με τα κύτταρα επαναδιαλύεται σε φρέσκο θρεπτικό μέσο και τα ακολουθεί καλλιέργεια των κυττάρων σε τρυβλία 35mm για 2.30-3 ώρες μέχρι να τελειώσουν τη μίτωση και εισέλθουν στη G1φάση. 34

3.2 ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 3.2.1 Παρασκευή ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων για ανοσοαποτύπωση western Τα κύτταρα αναπτύσσονται σε τρυβλία διαμέτρου 35mm μέχρι η επιφάνειας των τρυβλίων να καλυφθεί σε ποσοστό 80-90%. 1. Τα τρυβλία τοποθετούνται σε πάγο, αφαιρείται το θρεπτικού μέσο και γίνονται πλύσεις των κυττάρων με κρύο 1xPBS (2 φορές). 2. Προστίθεται 1,5ml 1xPBS και τα κύτταρα απομακρύνονται από την επιφάνεια του τρυβλίου με μηχανικό τρόπο (χρήση scraper) 3. Το δείγμα φυγοκεντρείται στις 10.000 στροφές, στους 4ºC για 5 λεπτά 4. Το ίζημα επαναδιαλύεται σε 100-150μl διαλύματος 1xFSB (πίνακας 4) στο ίζημα των κυττάρων. 5. Το δείγμα βράζει στους 95ºC για 5 λεπτά. 3.2.2 Ανοσοαποτύπωση western (Western blot) Τα ολικά κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάζονται όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα εκχυλίσματα αυτά διαχωρίζονται σε πήκτωμα SDS-πολυακρυλαμιδίου, όπου υπό την επίδραση ηλεκτρικού ρεύματος γίνεται ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών κυρίως με βάση το μοριακό τους βάρος. Στη συνέχεια, οι πρωτεΐνες μεταφέρονται σε ειδικές μεμβράνες και ακολουθεί η δέσμευση των ειδικών αντισωμάτων στο αντιγόνο. Μετά τη μεταφορά των πρωτεϊνών, πάνω στις μεμβράνες δημιουργείται ένα αποτύπωμα του πηκτώματος πάνω στο οποίο εντοπίζεται, με τη χρήση αντισωμάτων, το υπό μελέτη αντιγόνο (γι αυτό και ονομάζεται ανοσοαποτύπωμα). Η εμφάνιση του συμπλόκου αντιγόνου-αντισώματος γίνεται με τη χρήση ενζυμικών ιχνηθετών, και συγκεκριμένα με χρήση αντιδραστηρίου ECL (Εnchanced ChemioLuminescence Substrate, Amersham), που βασίζεται στο φαινόμενο της ενισχυμένης χημειοφωταύγειας. SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση (Sodium Dodecyl Sulphate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis): 1. Παρασκευάζεται η πηκτή πολυακρυλαμιδίου 35