Φωτοσύνθεση Η βιολογική λειτουργία «κλειδί» που διεξάγεται στον πλανήτη μας από τα φυτά είναι χωρίς αμφιβολία η φωτοσύνθεση. Η φωτοσύνθεση είναι η διαδικασία κατά την οποία η φωτεινή ενέργεια από τον ήλιο μετατρέπεται σε χημική. Η διαδικασία αυτή περιλαμβάνει πολύπλοκες αντιδράσεις οι οποίες επιτελούνται με την δέσμευση της φωτεινής ενέργειας από την χλωροφύλλη και από άλλες βοηθητικές χρωστικές με αποτέλεσμα το σχηματισμό οργανικών ενώσεων (σάκχαρα) από CO 2 και H 2 O και την ελευθέρωση οξυγόνου. Η γενική εξίσωση της φωτοσύνθεσης είναι : φωτεινή ενέργεια 6 CO 2 + 6 H 2 O C 6 H 12 O 6 + 6 O 2 Έχει υπολογιστεί ότι με την φωτοσύνθεση από το σύνολο των χλωροφυλλούχων φυτών δεσμεύονται κάθε χρόνο 128 δισεκατομμύρια τόνοι CO 2 και 52 δισεκατομμύρια τόνοι H 2 O και ελευθερώνονται στην ατμόσφαιρα 52 δισεκατομμύρια τόνοι O 2. Τα θαλάσσια φύκη συμμετέχουν κατά 45 έως 60% στην όλη παραγωγή της φωτοσύνθεσης. ενώ όλο το οξυγόνο της ατμόσφαιρας έχει παραχθεί με την φωτοσύνθεση των χλωροφυλλούχων φυτών. Αυτό είναι ζωτικής σημασίας για όλους τους αερόβιους οργανισμούς οι οποίοι χρειάζονται οξυγόνο για την αναπνοή. Η αερόβια αναπνοή και οι διάφορες μη βιολογικές οξειδώσεις θα εξαντλούσαν το οξυγόνο της ατμόσφαιρας, εάν αυτό δεν συμπληρωνόταν με την φωτοσύνθεση. Επειδή όλοι οι οργανισμοί για να επιβιώσουν δαπανούν συνεχώς την ενέργεια που προέρχεται από την διάσπαση των οργανικών ενώσεων οι οποίες παρήχθησαν με την φωτοσύνθεση, η ζωή στον πλανήτη μας σύντομα θα σταματούσε, εάν σταματούσε να γίνεται φωτοσύνθεση. Με άλλα λόγια χωρίς την ύπαρξη των φυτών δεν θα υπήρχαν ούτε ζώα.
Εικόνα Α1: Γενική απεικόνιση της φωτοσύνθεσης. Α.1.1 Γενικές αρχές της φωτοσύνθεσης Όπως προαναφέρθηκε με τη φωτοσύνθεση σχηματίζονται σάκχαρα ( CH 2 O ) n από το CO 2 και H 2 O. Είναι φανερό ότι το CO 2 βρίσκεται σε υψηλότερο επίπεδο οξείδωσης από τους υδατάνθρακες. Άρα για να μετατραπεί το CO 2 σε ( CH 2 O ) n, πρέπει να προσλάβει ένα πρωτόνιο ( Η + ) και ένα ηλεκτρόνιο e - ( αντίδραση 1 ). CO 2 + e - + ( H + ) ( CH 2 O ) n ( 1 ) Θα πρέπει όμως να υπάρχει ένα βιολογικό οξειδοαναγωγικό σύστημα, το οποίο να προμηθεύει το ηλεκτρόνιο για την αντίδραση (1). Το οξειδοαναγωγικό αυτό σύστημα θα πρέπει να έχει οξειδοαναγωγικό δυναμικό ( Ε 0 ) περισσότερο αρνητικό από -0,4 V, το οποίο κατά προσέγγιση είναι το οξειδοαναγωγικό δυναμικό του οξειδοαναγωγικού συστήματος CO 2 / ( CH 2 O ) n. Η αντίδραση της φωτοσύνθεσης μπορεί τώρα να γραφεί: CO 2 + XH ( CH 2 O ) n + X ( 2 ) Όπου το XH είναι η ανηγμένη μορφή του οξειδοαναγωγικού συστήματος X/XH, το οποίο έχει Ε 0 περισσότερο αρνητικό από -0,4V. Η ανηγμένη μορφή αυτού του συστήματος αποτελεί την αναγωγική δύναμη η οποία θα ανάγει το CO 2 στο επίπεδο των υδατανθράκων. Η πολύ υψηλή ηλεκτραρνητικότητα αυτού του συστήματος ( Ε 0 περισσότερο αρνητικό από -0,4V ) σημαίνει ότι το ηλεκτρόνιο το οποίο το ανάγει
προέρχεται από ένα οξειδοαναγωγικό σύστημα το οποίο είναι λιγότερο ηλεκτραρνητικό. Αυτό σημαίνει ότι ένα σύστημα με μεγαλύτερη τάση να δίνει ηλεκτρόνια, παίρνει ένα ηλεκτρόνιο από ένα σύστημα με μικρότερη τάση να δίνει ηλεκτρόνια, ή αντίστροφα, ένα ηλεκτρόνιο μετακινήθηκε δυναμικά αντίθετα σε μια ηλεκτροχημική διαβάθμιση. Για να γίνει αυτό πρέπει να δοθεί στο σύστημα ποσότητα ενέργειας. Με αυτό τον τρόπο η πρόσληψη ενέργειας απαιτείται για να παραχθεί ΧΗ με πρόσληψη ενός ηλεκτρονίου αντίθετα προς μια ηλεκτροχημική διαβάθμιση, από ένα οξειδοαναγωγικό σύστημα λιγότερο αρνητικό από το σύστημα Χ / ΧΗ. Πρέπει επίσης να λεχθεί ότι μέρος αυτής της ενέργειας χρησιμοποιήθηκε για να παραχθούν τα ενδιάμεσα φωσφορυλιωμένα παράγωγα τα οποία είναι γνωστό ότι συμμετέχουν στο μεταβολισμό των υδατανθράκων. Η παραγωγή των φωσφορυλιωμένων παραγώγων συνεπάγεται τη χρήση ATP σαν μέσο φωσφορυλίωσης. Αυτό σημαίνει ότι ενέργεια χρησιμοποιήθηκε για να παραχθεί ΑΤP η οποία είναι απαραίτητη για το σχηματισμό των φωσφορυλιωμένων παραγώγων των σακχάρων. Είναι εύκολο να υποτεθεί από που προέρχεται αυτή η ενέργεια, επειδή η φωτοσύνθεση γίνεται μόνο παρουσία φωτός. Η ενέργεια η οποία χρειάζεται κατά την φωτοσύνθεση είναι η φωτεινή ενέργεια. Αυτό σημαίνει ότι οι οργανισμοί που έχουν την ικανότητα να φωτοσυνθέτουν διαθέτουν κάποιο μηχανισμό για τη δέσμευση της φωτεινής ενέργειας. Αυτό το σύστημα είναι ένα σύστημα χρωστικών, το οποίο κυρίως αποτελείται από χλωροφύλλη. Η φωτοσύνθεση μπορεί να παρασταθεί με το παρακάτω σχήμα (Εικόνα Α2). Εικόνα Α2 : Τα στάδια της φωτοσύνθεσης.
Από το παραπάνω σχήμα φαίνεται ότι: 1) Η μετατροπή του CO 2 σε υδατάνθρακες απαιτεί : α) αναγωγική δύναμη και β) ΑΤΡ. 2) Το φως είναι απαραίτητο μόνο για την παραγωγή της αναγωγικής δύναμης και της ΑΤΡ. 3) Μετά το σχηματισμό της αναγωγικής δύναμης και της ΑΤΡ, το φως δεν είναι απαραίτητο για την μετατροπή του CO 2 σε υδατάνθρακες. Συμπερασματικά μπορούμε να πούμε ότι η φωτοσύνθεση περιλαμβάνει αντιδράσεις οι οποίες εξαρτούνται από το φως και αντιδράσεις οι οποίες είναι ανεξάρτητες του φωτός. Κατά την φωτεινή φάση γίνεται η παραγωγή της αναγωγικής δύναμης και της ΑΤΡ και κατά την σκοτεινή φάση χρησιμοποιείται η αναγωγική δύναμη και η ΑΤΡ για την μετατροπή του CO 2 σε υδατάνθρακες. Α.2 Δέσμευση και αναγωγή του CO2 Στο προηγούμενο κεφάλαιο παρουσιάστηκε η μετατροπή της φωτεινής ενέργειας σε χημική στις φωτοσυνθετικές μεμβράνες των χλωροπλαστών. Είδαμε ότι οι πρωταρχικές αυτές αντιδράσεις καταλήγουν στο σχηματισμό ΑΤΡ και στην αναγωγή NADP σε NADPΗ 2, με τον τρόπο δε αυτόν «αποθηκεύεται» προσωρινά χημική ενέργεια, που χρησιμοποιείται κατόπιν για την προώθηση ενδεργονικών συνθέσεων. Αυτό λοιπόν που απομένει να εξετάσουμε είναι τον τρόπο χρησιμοποιήσεως των δύο αυτών ενδιάμεσων φορέων ενέργειας για την δέσμευση του CO 2 και την αναγωγή του μέχρι του επιπέδου του υδατάνθρακα. Από θεωρητικής πλευράς είναι φανερό ότι χρειάζεται μία ουσία-δέκτης η οποία μπορεί να δεσμεύει το CO 2. Η διαδικασία αυτή παριστάνεται συνοπτικά με τις παρακάτω θεωρητικές αντιδράσεις : RH + CO 2 RCOOH RCOOH + 4 [H] RH + [CH 2 O] + H 2 O CO 2 + [H] [CH 2 O] + H 2 O
Στις εξισώσεις αυτές το RH παριστάνει την ουσία-δέκτη του CO 2, το [Η] αντιπροσωπεύει την απαιτούμενη αναγωγική δύναμη που χορηγείται από το ανηγμένο NADP και το [CH 2 O] είναι μια «υδατανθρακική μονάδα» που παράγεται από την κατανάλωση του CO 2. Στο θεωρητικό αυτό πρότυπο δεν εμφανίζεται η κατανάλωση ΑΤΡ, είναι όμως εύλογο να υποθέσουμε ότι μια τέτοια ενεργειακή ανάγκη προκύπτει για την προώθηση ορισμένων από τις επί μέρους αντιδράσεις που καλύπτονται κάτω από τη συνοπτική αυτή έκφραση μιας πολύπλοκης μεταβολικής οδού. Α.2.1 Τρόποι δέσμευσης και αναγωγής του CO 2 στα φυτά Αποδοτική έρευνα πάνω στην δέσμευση και αναγωγή του CO 2, έγινε δυνατή μόνο με τον 2 ο Παγκόσμιο Πόλεμο, με την ανάπτυξη μεθόδων παραγωγής και χρησιμοποιήσεως ραδιενεργού 14 CO 2 και ανιχνεύσεως των προϊόντων της δέσμευσης του. Έτσι, οι σχετικές γνώσεις έχουν αποκτηθεί την τελευταία 50ετία και συνεχώς εμπλουτίζονται. Γνωρίζουμε σήμερα μια βασική μεταβολική οδό για την δέσμευση και την αναγωγή του CO 2. Η διευκρίνηση της βασικής οδού οφείλεται στην ερευνητική ομάδα του Calvin, του πανεπιστήμιου της Καλιφόρνιας, που επιτεύχθηκε στην περίοδο 1945-1953, με κύρια πειραματόφυτα τα φύκη Chlorella pyrenoidosa και Scenedesmus obliquus. Κατά το χρονικό διάστημα που μεσολάβησε από τότε διαπιστώθηκε επανειλημμένως και σε διάφορα ερευνητικά κέντρα, ότι ο μεταβολικός αυτός μηχανισμός που καθιερώθηκε και ονομάζεται «κύκλος του Calvin» ή αναγωγικός κύκλος των φωσφοπεντοζών, λειτουργεί κατά τον ίδιο τρόπο στα ανώτερα φυτά. Έγινε όμως επιπλέον αντιληπτό ότι υπάρχουν 2 τουλάχιστον παραλλαγές στην δέσμευση του CO 2 που καθιστούν την όλη διεργασία περισσότερο αποτελεσματική, ιδίως κάτω από συνθήκες υψηλού φωτισμού και θερμοκρασίας ή ελλείψεως υγρασίας. Οι παραλλαγές αυτές είναι γνωστές με τα ονόματα «C 4 -οδός» και «μεταβολισμός τύπου Crassulaceae (CΑΜ)» και έχουν μεταξύ τους πολλά κοινά χαρακτηριστικά. Τέλος θα πρέπει να τονίσουμε ότι ο «κύκλος του Calvin» λειτουργεί σε όλα τα φυτά και μόνο σε μερικά συμπληρώνεται με τις οδούς C 4 ή CΑΜ.
Εικόνα Α3 : Ο κύκλος του Calvin.
Α.3 Η C4-οδός ( κύκλος των Hatch και Slack) Οι πρώτες ενδείξεις ότι σε ορισμένα είδη φυτών, η δέσμευση του CΟ 2 γίνεται με αντιδράσεις διαφορετικές από εκείνες που προβλέπει ο κύκλος του Calvin, ελήφθησαν κατά την περίοδο 1960-1965, από διάφορες ομάδες ερευνητών. Συγκεκριμένα, διαπιστώθηκε ότι τόσο στο ζαχαροκάλαμο όσο και στο καλαμπόκι τα πρώτα προϊόντα της φωτοσύνθεσης ήταν οργανικά οξέα με 4 άτομα άνθρακα και όχι το 3-φωσφολυκερινικό οξύ. Mια λεπτομερής μελέτη της κινητικής της δεσμεύσεως του CO 2 στο ζαχαροκάλαμο έγινε με μεθόδους ανάλογες προς εκείνες της ομάδας Calvin, από τον Kortschak και τους συνεργάτες του και δημοσιεύτηκε το 1965. Με τη μελέτη αυτή διαπιστώθηκε ότι η ραδιενέργεια από το 14 CO 2 εμφανίζεται αρχικά στο μηλικό και στο ασπαραγινικό και αργότερα στο 3-PGA και στις άλλες ενώσεις του κύκλου του Calvin. Οι Hatch και Slack, στην Αυστραλία, επιβεβαίωσαν τις παρατηρήσεις αυτές και με μια σειρά μελετών κατέληξαν το 1970 στη διαμόρφωση της λεπτομερούς εικόνας ενός μηχανισμού δέσμευσης του CΟ 2, διαφορετικού από εκείνον που ήταν γνωστός μέχρι τότε. Στη συνέχεια βρέθηκε ότι ο μηχανισμός αυτός λειτουργεί σε πολλά είδη φυτών, που ανήκουν σε πολλές οικογένειες των μονο- και δικοτυλήδονων. Σήμερα είναι γνωστά 1000 περίπου τέτοια είδη, συνεχώς δε ο κατάλογος τους εμπλουτίζεται και με άλλα. Τα είδη αυτά χαρακτηρίζονται ως C 4 φυτά, σε αντιδιαστολή προς τα C 3 φυτά, εκείνα δηλαδή που διαθέτουν μόνο το μηχανισμό του κύκλου του Calvin. Τα C 4 φυτά όχι μόνο διαθέτουν ειδικά βιοχημικά χαρακτηριστικά, αλλά εμφανίζουν και ιδιαίτερα ανατομικά γνωρίσματα στα φύλλα. Τα φωτοσυνθετικά κύτταρα είναι 2 ειδών και βρίσκονται διατεταγμένα σε 2 συγκεντρικά στρώματα γύρω από τις αγγειώδεις δέσμες των φύλλων. Το εσωτερικό ονομάζεται στρώμα του κολεού της δέσμης και αποτελείται από κύτταρα με παχιά τοιχώματα, που περιβάλλουν από όλες τις πλευρές τις αγγειώδεις δέσμες, σχηματίζοντας μια θήκη (κολεό). Το εξωτερικό στρώμα του μεσόφυλλου αποτελείται από κύτταρα χαλαρότερα συνδεδεμένα μεταξύ τους, περιλαμβάνει δε πολλούς μεσοκυττάριους χώρους, σε αντίθεση με το στρώμα του κολεού της δέσμης (Εικόνα Α4, Α5). Η ιδιαίτερη αυτή ανατομία στα φύλλα ορισμένων φυτικών ειδών είχε περιγραφεί από τις αρχές του αιώνα από Γερμανούς βοτανολόγους και είναι γνωστή ως ανατομία τύπου στεφάνης. Η φυσιολογική όμως σημασία της ανατομίας αυτής παρέμενε άγνωστη, όπως άγνωστο ήταν και το γεγονός ότι τα κύτταρα του μεσόφυλλου
διαφέρουν σαφώς, από πλευράς βιοχημικών δράσεων, από τα κύτταρα του κολεού της δέσμης. Οι χλωροπλάστες των κυττάρων του κάθε στρώματος διαφέρουν επίσης μεταξύ τους τόσο ως προς το μέγεθος, όσο και ως προς την εσωτερική δομή τους. Οι χλωροπλάστες των κυττάρων του κολεού της δέσμης είναι συνήθως μεγαλύτεροι και έχουν μόνο θυλακοειδή του στρώματος, grana είτε δεν σχηματίζονται καθόλου, είτε είναι λίγα και λιγότερο αναπτυγμένα από ότι στους συνήθεις χλωροπλάστες. Αντιθέτως, τα κύτταρα του μεσόφυλλου έχουν χλωροπλάστες μικρότερους, που περιέχουν καλά αναπτυγμένα grana. Ο παραπάνω διμορφισμός των χλωροπλαστών, ως προς το μέγεθος και ως προς την εσωτερική οργάνωση των φωτοσυνθετικών μεμβρανών, δεν είναι εξίσου έντονος σε όλα τα C 4 φυτά. Συνήθως ο έντονος διμορφισμός ως προς το μέγεθος συνδέεται με έλλειψη σαφούς διμορφισμού ως προς την εσωτερική δομή και αντιστρόφως. Μετά από τους Hatch και Slack, πολλές ερευνητικές ομάδες ασχολήθηκαν με την φωτοσύνθεση των C 4 φυτών και η έρευνα στον τομέα αυτό συνεχίζεται σήμερα με εντατικό ρυθμό. Από τη συνεχή μελέτη των φυτών αυτών διαπιστώθηκε ότι δεν αποτελούν ένα ομοιογενές άθροισμα από πλευράς βιοχημικών αντιδράσεων, αλλά υποδιαιρούνται σε τρεις υποομάδες. Οι υποομάδες αυτές διαφέρουν μεταξύ τους ως προς το μηχανισμό αποκαρβοξυλίωσης των C 4 οξέων στα κύτταρα της δέσμης, ενώ ο τρόπος της πρώτης δεσμεύσεως του CO 2 είναι κοινός. Εικόνα Α4, Α5 : Ανατομία των φύλλων στα C4 φυτά (κύτταρα κολεού της δέσμης = bundle sheath cells, κύτταρα του μεσόφυλλου = mesophyll cells).
Α.3.1 Αρχή και τέλος της C4-οδού στα κύτταρα του μεσόφυλλου Η δέσμευση του CO 2 στα κύτταρα του μεσόφυλλου επιτυγχάνεται με την αντίδραση (1) και καταλύεται από το ένζυμο καρβοξυλάση του φωσφοενολπυροσταφυλικού οξέος ( PEP-carboxylase ). Το ένζυμο αυτό βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων του μεσόφυλλου και όχι στους χλωροπλάστες. Η αντίδραση (1) είναι ισχυρά εξεργονική και επομένως πρακτικά μονόδρομη. Επιπροσθέτως, η PEP-καρβοξυλάση έχει μεγάλη συγγένεια προς το CO 2 ( Km της τάξεως του 0,6-0,7 μμ ) και ως εκ τούτου η ταχύτητα της αντιδράσεως είναι επαρκώς υψηλή ακόμη και σε χαμηλές συγκεντρώσεις CO 2. (1) Όπως θα δούμε παρακάτω, η ιδιότητα αυτή έχει μεγάλη σημασία για την προσαρμογή των φυτών σε ξηρό και θερμό περιβάλλον, γιατί τους επιτρέπει να φωτοσυνθέτουν με στόματα αρκετά κλειστά ( οικονομία νερού ). Το παραγόμενο οξαλοξικό οξύ δεν συσσωρεύεται, αλλά αμέσως μετατρέπεται σε μηλικό ή / και ασπαραγινικό ( αντιδράσεις 2 και 3).
(2) (3) Έτσι τα πρώτα προϊόντα της δεσμεύσεως του CO 2, που ανιχνεύονται με τη χρήση 14 CO 2 είναι τα δύο αυτά οξέα και όχι το οξαλοξικό. Το 3-φωσφογλυκερινικό οξύ είναι σαφώς μεταγενέστερο προϊόν. Η αντίδραση (2) λαμβάνει χώρα στους χλωροπλάστες των κυττάρων του μεσόφυλου και καταλύεται από το ένζυμο δευδρογονάση του μηλικού-nadp. Το απαιτούμενο NADPΗ 2 προέρχεται, προφανώς, από τη φωτοσυνθετική δραστηριότητα των χλωροπλαστών. Αντιθέτως, η αντίδραση (3), που είναι μια τρανσαμίνωση, γίνεται στο κυτταρόπλασμα και καταλύεται από το ένζυμο αμινοτρανσφεράση του ασπαραγινικού. Τα παραγόμενα με τις παραπάνω αντιδράσεις οξέα ( μηλικό ή/και ασπαραγινικό) μεταφέρονται στη συνέχεια στα κύτταρα του κολεού της δέσμης. Στο σημείο αυτό παρατηρείται η πρώτη διαφορά μεταξύ των C 4 -φυτών. Άλλα παράγουν και μεταφέρουν κυρίως μηλικό οξύ ( malate formers ), άλλα ασπαραγινικό οξύ ( aspartate formers ), και άλλα και τα δύο οξέα σε παρόμοιες ποσότητες.
Η δεύτερη κύρια λειτουργία των κυττάρων του μεσόφυλλου είναι η αναπαραγωγή του PEP από ενώσεις με 3 άτομα άνθρακα, που μεταφέρονται αντιστρόφως από τα κύτταρα του κολεού της δέσμης στα κύτταρα του μεσόφυλλου. Στα φυτά που μεταφέρουν μηλικό οξύ προς τα κύτταρα του κολεού της δέσμης η ένωση που επιστρέφει είναι το πυροσταφυλικό οξύ, ενώ εκείνα που στέλνουν ασπαραγινικό δέχονται πίσω αλανίνη. Τέλος, εκείνα που παράγουν και μεταφέρουν τόσο μηλικό οξύ, όσο και ασπαραγινικό οξύ, δέχονται από τα κύτταρα του κολεού της δέσμης φωσφοενολοπυροσταφυλικό οξύ και αλανίνη. Η αλανίνη μετατρέπεται σε πυροσταφυλικό οξύ με μια αμινοτρανσφεράση (αντίδραση 4). Έτσι, αναγεννάται και ο δότης της αμινοομάδας ( γλουταμινικό οξύ ) της αντιδράσεως (3) και διατηρείται η ισορροπία του αζώτου στους δύο τύπους φωτοσυνθετικών κυττάρων. Τέλος, το πυροσταφυλικό οξύ ( που είτε έχει μεταφερθεί κατευθείαν, είτε έχει παραχθεί από την αλανίνη ) μετατρέπεται μέσα στους χλωροπλάστες των κυττάρων του μεσόφυλλου σε φωσφοενολπυροσταφυλικό οξύ, με την συνδυασμένη δράση τριών ενζύμων, της δικινάσης του πυροσταφυλικού-φωσφορικού ( αντίδραση 5 ), της κινάσης του αδενυλικού (αντίδραση 6) και της αλκαλικής πυροφωσφατάσης (αντίδραση 7). Όπως είναι φανερό για την ανασύνθεση ενός μορίου φωσφοενολπυροσταφυλικού υδρολύονται 2 μόρια ATP προς ADP. Με την ανασύνθεση του PEP (δέκτου του CO 2 ) συμπληρώνεται η δράση των κυττάρων του μεσόφυλλου στην C4-οδό. Το καθαρό αποτέλεσμα της δράσεως αυτής μπορεί να παρασταθεί με τη γενική εξίσωση (8).
(4) (5) (6) (7) (8) Το C 4 -οξύ ( ένωση με 4 άτομα άνθρακα ) μεταφέρεται στα κύτταρα του κολεού της δέσμης, όπου το επιπλέον άτομο άνθρακα που δεσμεύθηκε πρέπει να αναχθεί μέχρι του επιπέδου του υδατάνθρακα και να αναπαραχθεί η C3 ένωση που θα επιστρέψει στα κύτταρα του μεσόφυλλου. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι από τα κύτταρα του μεσόφυλλου μεταφέρεται προς τα κύτταρα του κολεού της δέσμης και φωσφορική διυδροξυακετόνη, ενώ επιστρέφει στο μεσόφυλλο το φωσφογλυκερινικό οξύ. Μια τέτοια ανταλλαγή δεν φαίνεται απαραίτητη για τη λειτουργία της C4-οδού, αλλά χρησιμεύει προφανώς για τη μεταφορά ενέργειας από το μεσόφυλλο στον κολεό της δέσμης. Μεταφορά ενέργειας προκύπτει επίσης στην περίπτωση ανταλλαγής ενός μορίου μηλικού οξέος με ένα μόριο πυροσταφυλικού.
Εικόνα Α6, Α7: Αντιδράσεις δέσμευσης CO 2 και αναπαραγωγής του φωσφοενολοπυροσταφυλικού στα κύτταρα του μεσόφυλλου των C 4 -φυτών.
Α.3.2 Συνέχεια της C4-οδού στα κύτταρα του κολεού της δέσμης Η C 4 -ένωση ( μηλικό ή ασπαραγινικό ), που μεταφέρεται από το μεσόφυλλο στα κύτταρα του κολεού της δέσμης, υφίσταται εκεί αποκαρβοξυλίωση, μετατρεπόμενη σε C 3 -ένωση, ενώ ελευθερώνεται CO 2. Το CO 2 επαναδεσμεύεται και ανάγεται με τις αντιδράσεις του κύκλου του Calvin, που λειτουργεί στα κύτταρα του κολεού όπως και στα C 3 -φυτά. Σχετικά με τη λειτουργία του κύκλου του Calvin, θα πρέπει να σημειώσουμε ότι, σύμφωνα με την επικρατούσα άποψη, εντοπίζεται μόνο στους χλωροπλάστες του κολεού της δέσμης. Υπάρχει όμως και η αντίθετη γνώμη, ότι τα κύτταρα του κολεού όσο και εκείνα του μεσόφυλλου διαθέτουν τον ενζυμικό «εξοπλισμό» για τη λειτουργία αυτή. Εκείνο πάντως που έχει εξακριβωθεί είναι ότι στο μεσόφυλλο γίνεται αναγωγή του 3-PGA σε G-3-P και ο ισομερισμός της τελευταίας προς DHAP. Το 3-PGA προέρχεται πιθανότατα από τα κύτταρα του κολεού, όπου και επιστρέφει η DHAP, όπως αναφέραμε παραπάνω. Για την αποκαρβοξυλίωση του μηλικού ή του ασπαραγινικού υπάρχουν τρεις διαφορετικοί ενζυμικοί μηχανισμοί και με βάση αυτούς διακρίνουμε 3 υποομάδες των C 4 -φυτών, όπως δείχνει το παρακάτω διάγραμμα. Εικόνα Α8: Οι 3 υποομάδες των C 4 -φυτών.
Α.3.2.1 Υποομάδα NADP-ME Στην υποομάδα αυτή ανήκουν τα C 4 -φυτά που σχηματίζουν στο μεσόφυλλο και μεταφέρουν στα κύτταρα του κολεού μηλικό οξύ (malate formers). Στους χλωροπλάστες των κυττάρων του κολεού της δέσμης το μηλικό οξύ οξειδώνεται και αποκαρβοξυλιώνεται όπως δείχνει η εξίσωση (9). (9) Υπεύθυνο για την αντίδραση αυτή είναι το μηλικό ένζυμο που λειτουργεί με συνένζυμο το NADP (NADP- malic enzyme), από το οποίο και η ονομασία της υποομάδας. Το CO 2 που ελευθερώνεται, επαναδεσμεύεται με τη διαδικασία του κύκλου του Calvin, ενώ το πυροσταφυλικό επιστρέφει στα κύτταρα του μεσόφυλλου, για την ανασύνθεση του PEP ( αντιδράσεις 5, 6, 7). Παρατηρούμε ότι το NADPH 2 που είχε οξειδωθεί για τη μετατροπή του οξαλοξικού σε μηλικό ανάγεται και πάλι με την αντίδραση (9). Έτσι, οι επιπλέον ενεργειακές ανάγκες για τη λειτουργία της C 4 -οδού περιορίζονται σε 2 ATP, ενώ συγχρόνως έχουμε μεταφορά αναγωγικής δυνάμεως από το μεσόφυλλο στον κολεό της δέσμης. Οι βιοχημικές αντιδράσεις στα κύτταρα του κολεού στην υποομάδα αυτή δίνονται συνοπτικά στην εικόνα Α9.
Εικόνα Α9 : Αντιδράσεις παραγωγής και επαναδεσμεύσεως του CO 2 στα κύτταρα του κολεού της δέσμης, στην υποομάδα NADP-ME των C 4 -φυτών. Α.3.2.2 Υποομάδα NAD-ME Τα φυτά που ανήκουν στην υποομάδα αυτή παράγουν στο μεσόφυλλο και μεταφέρουν στον κολεό της δέσμης ασπαραγινικό οξύ. Το ασπαραγινικό οξύ με τρανσαμινώση μετατρέπεται σε οξαλοξικό, που με τη σειρά του ανάγεται σε μηλικό με μια αντίδραση που καταλύεται από το ένζυμο δεϋδρογονάση του μηλικού-nad. Πρόκειται για αντίδραση παρόμοια με τη (9), με τη διαφορά ότι ο δότης υδρογόνου είναι το NADH 2 και όχι το NADPH 2. Η διαφορά αυτή είναι ενδεικτική για τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό των αντίστοιχων ενζύμων. Ενώ η (9) γίνεται στους χλωροπλάστες του μεσόφυλλου, η αντίστοιχη αντίδραση στον κολεό της δέσμης (όπως και η τρανσαμινώση που προηγείται) γίνεται στα μιτοχόνδρια. Το παραγόμενο μηλικό αποκαρβοξυλιώνεται οξειδωτικά επίσης στα μιτοχόνδρια (αντίδραση όμοια με την (9), αλλά με NAD αντί NADP), με καταλύτη το μιτοχονδριακό μηλικό ένζυμο, που λειτουργεί με συνένζυμο το NAD (NAD-malic enzyme). Το παραγόμενο πυροσταφυλικό οξύ εξέρχεται στο κυτόπλασμα όπου με τρανσαμινώση (αντίδραση (4) κατά αντίστροφη φορά ) μετατρέπεται σε αλανίνη. Το αμινοξύ αυτό επιστρέφει στα κύτταρα του μεσόφυλλου, ενώ το CO 2 επαναδεσμεύεται στους χλωροπλάστες του κολεού κατά τα γνωστά (κύκλος Calvin).
Οι βιοχημικές αντιδράσεις στα κύτταρα του κολεού της δέσμης των φυτών της υποομάδας αυτής δίνονται συνοπτικά στην εικόνα Α10. Εικόνα Α10 : Αντιδράσεις παραγωγής και επαναδεσμεύσεως του CO 2 στα κύτταρα του κολεού της δέσμης, στην υποομάδα NAD-ME των C 4 -φυτών. Α.3.2.3 Υποομάδα PEP-CK Ένα μέρος των C 4 -φυτών, που σχηματίζουν στο μεσόφυλλο και μεταφέρουν στον κολεό της δέσμης τόσο ασπαραγινικό, όσο και μηλικό οξύ, ανήκουν στην υποομάδα αυτή, που έχει πάρει το όνομά της από το υπεύθυνο για την αποκαρβοξυλίωση ένζυμο, την καρβοξυκινάση του φωσφοενολπυροσταφυλικού ( PEP carboxy-kinase ή σε σύντμηση PEP-CK ). Το ασπαραγινικό οξύ μετατρέπεται με τρανσαμινώση σε οξαλοξικό (με δέκτη της αμινοομάδας το πυροσταφυλικό), το δε οξαλοξικό μετατρέπεται σε φωσφοενολπυροσταφυλικό + CO 2 με κατανάλωση ATP, όπως δείχνεται με την εξίσωση (10).
(10) Το ένζυμο που καταλύει την αντίδραση αυτή ( καρβοξυκινάση του PEP ) είναι, όπως εκθέσαμε παραπάνω, το χαρακτηριστικό της υποομάδας και εντοπίζεται στο κυτόπλασμα. Εξάλλου το μηλικό οξύ αποκαρβοξυλιώνεται οξειδωτικά στα μιτοχόνδρια των κυττάρων του κολεού της δέσμης ( όπως και στην ομάδα NAD-ME ) και το παραγόμενο πυροσταφυλικό μετατρέπεται στο κυτόπλασμα σε αλανίνη με τρανσαμινώση. Τέλος, η αλανίνη και το PEP μεταφέρονται προς τα κύτταρα του μεσόφυλλου, όπου το μεν PEP χρησιμοποιείται εκ νέου για τη δέσμευση CO 2 (αντίδραση 1), η δε αλανίνη μετατρέπεται επίσης σε PEP με τις αντιδράσεις 4, 5, 6, 7. Σημειώνεται ότι στα κύτταρα του κολεού της δέσμης υπάρχει η δυνατότητα αλληλομετατροπής οξαλοξικού-μηλικού, τελικά δε η ποσότητα της αλανίνης, που επιστρέφει στο μεσόφυλλο, αντιστοιχεί στην ποσότητα του ασπαραγινικού που μεταφέρεται προς τον κολεό, ώστε να διατηρείται η ισορροπία του αζώτου. Όπως και στις άλλες υποομάδες, το παραγόμενο CO 2 εισέρχεται στους χλωροπλάστες και επαναδεσμεύεται κατά τα γνωστά, με τις αντιδράσεις του κύκλου του Calvin. Οι βιοχημικές αντιδράσεις που αναφέραμε παραπάνω για την υποομάδα αυτή δίνονται συνοπτικά στην εικόνα Α11.
Εικόνα Α11 : Αντιδράσεις παραγωγής και επαναδεσμεύσεως του CO 2 στα κύτταρα του κολεού της δέσμης, στην υποομάδα PEP-CK των C 4 -φυτών.
Α.3.3 Φυσιολογική σημασία της C4-οδoύ Μια πρώτη εντύπωση, που μπορεί να σχηματισθεί από όσα εκθέσαμε παραπάνω, είναι ότι τα C 4 -φυτά επιδίδονται σε άσκοπους βιοχημικούς πλεονασμούς. Εφόσον τελικά η δέσμευση και η αναγωγή του άνθρακα γίνεται με τις αντιδράσεις του κύκλου Calvin, ποιος ο λόγος της πρώτης δεσμεύσεως και των λοιπών αντιδράσεων της C 4 - οδού, που έχουν και επιπλέον ενεργειακές απαιτήσεις; Πράγματι, ενώ στα C 3 -φυτά η σχέση CO 2 : ATP : NADPH 2 είναι 1:3:2 στα C 4 -φυτά είναι 1:5:2, χρειάζονται δηλαδή δύο μόρια ATP επιπλέον για κάθε μόριο CO 2 που ανάγεται. Γνωρίζουμε όμως ότι η πορεία της φυσικής επιλογής δεν επιτρέπει επικράτηση χαρακτήρων που δεν προσφέρουν ανταγωνιστικά πλεονεκτήματα. Θα πρέπει, επομένως, να προσπαθήσουμε να αντιληφθούμε ποια είναι τα πλεονεκτήματα αυτά. Βασικά η C 4 -οδός αποτελεί ένα μηχανισμό που αυξάνει τη συγκέντρωση του CO 2 στα κύτταρα του κολεού της δέσμης. Πράγματι, τα δεδομένα πειραμάτων με 14 CO 2 δείχνουν ότι στα κύτταρα αυτά σχηματίζεται ένα μεγάλο απόθεμα CO 2 με κινητικά χαρακτηριστικά ενός ενδιάμεσου μεταξύ των C 4 -οξέων και του 3-PGA. Το μέγεθος του αποθέματος αυτού είναι πολύ μεγαλύτερο από εκείνο που θα υπήρχε, αν η μετακίνηση του CO 2 από την ατμόσφαιρα στα κύτταρα του κολεού της δέσμης οφειλόταν απλώς στη διάχυση. Θα πρέπει να θυμηθούμε ότι η κλιμάκωση της συγκεντρώσεως ενός αερίου μεταξύ εσωτερικού του φύλλου και ατμόσφαιρας είναι ανάλογη προς το μέγεθος των αντιστάσεων που μεσολαβούν. Στα ξεροφυτικά είδη η στοματική αντίσταση είναι σχετικά μεγάλη και επομένως όταν τα φυτά φωτοσυνθέτουν, η συγκέντρωση του CO 2 στο εσωτερικό των φύλλων είναι πολύ μικρότερη σε σχέση με τα είδη με μικρή στοματική αντίσταση. Κάτω από τέτοιες συνθήκες η συγγένεια της Rubisco για το CO 2 καθώς και η δράση της ως οξυγενάσης, δεν επιτρέπουν υψηλές ταχύτητες φωτοσυνθέσεως. Αντιθέτως, η PEP-καρβοξυλάση, έχοντας μεγάλη δραστηριότητα και μικρό Km ( μεγάλη συγγένεια ) για το CO 2, το δεσμεύει πολύ πιο αποτελεσματικά. Η μεταφορά των C4-οξέων, που σχηματίζονται, προς τα κύτταρα του κολεού της δέσμης και η αποκαρβοξυλίωση τους εκεί, προκαλεί αύξηση της συγκεντρώσεως του CO 2. Έτσι, η Rubisco επαρκεί για την ταχεία επαναδέσμευση του, μια και η δράση της ως οξυγενάση εξαρτάται από το λόγο [CO 2 ]/[O 2 ]. Ο λόγος αυτός γίνεται μεγαλύτερος με την αύξηση της συγκεντρώσεως του CO 2, με αποτέλεσμα τη μείωση ή / και εκμηδένιση της φωτοαναπνοής. Η φωτοαναπνοή, που οφείλεται στη δράση της Rubisco ως οξυγενάσης, μειώνει την καθαρή αφομοίωση του CO 2 στα C 3 -φυτά κατά 30-40% και επομένως, κάθε
μηχανισμός που την παρεμποδίζει έχει ως αποτέλεσμα ένα σημαντικό κέρδος από πλευράς φωτοσυνθέσεως. Έτσι, το μέγεθος της καθαρής αφομοιώσεως του CO 2 γίνεται σημαντικά μεγαλύτερο. Τέλος, ένα άλλο χαρακτηριστικό των C 4 -φυτών, δηλαδή η αποδοτικότερη χρησιμοποίηση του διαθέσιμου νερού, μπορεί να εξηγηθεί με τη δράση της PEPκαρβοξυλάσης. Η μεγάλη δραστηριότητα και συγγένεια του ενζύμου αυτού για το CO 2 επιτρέπουν υψηλές ταχύτητες δεσμεύσεως του στα κύτταρα του μεσόφυλλου, ακόμη και από πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις. Έτσι τα C 4 -φυτά μπορούν να φωτοσυνθέτουν με σημαντική ταχύτητα ακόμη και όταν η στοματική αντίσταση είναι μεγάλη ( στόματα μισόκλειστα ). Με τον τρόπο αυτό μπορούν να συνδυάζουν έντονη φωτοσύνθεση με οικονομία νερού. Τα χαρακτηριστικά αυτά προσφέρουν μεγάλη ανταγωνιστική ικανότητα στα C 3 - φυτά σε περιβάλλοντα όπου το διαθέσιμο νερό είναι περιορισμένο, ο φωτισμός είναι έντονος και η θερμοκρασία υψηλή. Οι δύο τελευταίοι παράγοντες ευνοούν τη φωτοαναπνοή και περιορίζουν, στα C 3 -φυτά, την καθαρή αφομοίωση του άνθρακα. Αντιθέτως, στα C 4 -φυτά, η εξουδετέρωση της φωτοαναπνοής επιτρέπει την πιο αποδοτική εκμετάλλευση του έντονου φωτισμού και των υψηλών θερμοκρασιών. Με βάση τα παραπάνω μπορούμε να αντιληφθούμε το λόγο της επικρατήσεως των C 4 - φυτών σε ξεροθερμικά περιβάλλοντα με έντονο φωτισμό. Η ανομοιόμορφη διανομή των βροχοπτώσεων κατά τη διάρκεια του έτους ευνοεί επίσης τα C 4 - έναντι των C 3 -φυτών. Τα πρώτα, έχοντας την ικανότητα ταχείας αναπτύξεως, λόγω υψηλότερης φωτοσυνθετικής ταχύτητας, καταφέρνουν να συμπληρώνουν το βιολογικό τους κύκλο κατά τη σύντομη διάρκεια της βροχερής περιόδου και να περνούν τη μακρά περίοδο της ξηρασίας υπό μορφή σπερμάτων. Έτσι, μεγάλος αριθμός C 4 -ειδών απαντάται στις χλωρίδες των τροπικών και υποτροπικών σαβαννών. Η ικανότητα των C 4 -φυτών να εκμεταλλεύονται αποτελεσματικότερα το CO 2 από χαμηλές συγκεντρώσεις έχει οδηγήσει σε πολύ ενδιαφέρουσες υποθέσεις σχετικά με τη φυλογένεσή τους. Πράγματι, υπολογίζεται ότι κατά τη Λιθανθρακοφόρο περίοδο του Παλαιοζωικού αιώνα η σύνθεση της ατμόσφαιρας ήταν πολύ διαφορετική. Οι συγκεντρώσεις τόσο του CO 2, όσο και του O 2, ήταν γύρω στο 5% και, κάτω από αυτές τις ευνοϊκές για τη φωτοσύνθεση συνθήκες, η βλάστηση οργίαζε, με αποτέλεσμα τη βαθμιαία μείωση του CO 2 και την αύξηση του O 2 στα σημερινά επίπεδα. Η μεταβολή αυτή ήταν δυσμενής για τα φυτά και δημιούργησε μια
πίεση για εξελικτική προσαρμογή στις νέες συνθήκες. Η C 4 -οδός αναπτύχθηκε εξελικτικά, ακριβώς γιατί πρόσφερε πλεονεκτήματα στα φυτά, κάτω από τις νέες συνθήκες ( χαμηλό CO 2 -υψηλό O 2 ). Σύμφωνα με την εύλογη αυτή υπόθεση, πρέπει να θεωρήσουμε τα C 4 -είδη ως φυλογενετικά νεώτερα και να δεχθούμε ότι υπάρχει ακόμα και σήμερα η πίεση για παραγωγή C 4 -ειδών.
Α.4 Η καρβοξυλάση του φωσφοενολοπυροσταφυλικού (PEPcase) στη C4 φωτοσύνθεση Η μεγάλη σημασία και ο ρόλος της PEPCase στην φωτοσύνθεση και γενικότερα στην φυσιολογία φυτών φαίνεται από το ότι έχει χαρακτηριστεί από πολλούς ερευνητές ένζυμο κλειδί (Brulfert et al., 1983). Έχουν δημοσιευτεί πολλά σχετικά άρθρα και γενικά η μελέτη του έχει γίνει στόχος πολλών εργαστηρίων, παρόλα αυτά όμως ο μηχανισμός της λειτουργίας του παραμένει εν μέρει ασαφής. Το ένζυμο είναι διαδεδομένο σε όλους τους φυτικούς οργανισμούς με εξαίρεση ενδεχομένως τους μύκητες (Utter et al., 1972). Πέρα από το κεντρικό ρόλο του στην C 4 φωτοσύνθεση και στην CAM φωτοσυνθετική οδό, φαίνεται ότι παίζει σημαντικό ρόλο και σε επιμέρους φυσιολογικές διαδικασίες όπως στη λειτουργία των στομάτων (Wilmer, 1983), στη συμβιωτική δέσμευση του αζώτου στις ρίζες, στη διατήρηση του pη μέσα στο κύτταρο, στην αναπλήρωση οξέων στο κύκλο του Krebs, στην αναεροβίωση των ριζών και στην παραγωγή NADP από NAD σε συνεργασία με τη μηλική αφυδρογονάση στις ρίζες και τα σπέρματα (Utter et.al., 1972, Latzko et al., 1983). Για αυτό και η παρουσία του έχει διαπιστωθεί τόσο σε φωτοσυνθετικούς ιστούς όσο και σε μη φωτοσυνθετικούς οργανισμούς. Με βάση κυρίως τις διαφορές στο Vmax και το Km του ενζύμου διαφόρων κλασμάτων που λαμβάνονται από στήλες χρωματογραφίας με ιοντοανταλλάκτες διαμορφώθηκε η άποψη ότι υπάρχουν 3 ή 4 τύποι του ενζύμου (Ting et al., 1973) Όμως ενδεχομένως οι διαφορές αυτές μπορεί να μην αποδίδουν την πραγματική εικόνα του ενζύμου. Επίσης από τα μέχρι σήμερα δεδομένα έχει επικρατήσει η εκτίμηση ότι το ένζυμο είναι κυτταροπλασματικό (Gadal et al., 1983) αν και υπάρχουν ενδείξεις ότι μπορεί να είναι χαλαρά συνδεδεμένο με την εξωτερική μεμβράνη των χλωροπλαστών (Perrot et al., 1981). Έχει υπολογιστεί ότι η PEPCase των C 4 φυτών κυμαίνεται στο 15% της συνολικής διαλυτής πρωτεΐνης. Η ποσότητα του βέβαια εξαρτάται τόσο από τις συνθήκες ανάπτυξης του φυτού (φωτοπεριοδισμός, ένταση φωτισμού, διαθέσιμο άζωτο) όσο και από την ηλικία των φύλλων. Έχει διαπιστωθεί επιπλέον ότι η PEPCase αυξάνει κατά 5-20 φορές σαν αποτέλεσμα της de novo σύνθεση της όταν χλωρωτικά φυτά εκτεθούν στο φως. Για αυτή τη διαδικασία χρειάζονται περίπου 4 ώρες και παρεμβαίνει το φυτόχρωμα για την μεταφορά της πληροφορίας της ακτινοβολίας (Brulfert et al., 1985).
Α.5 Η δομή του ενζύμου Μελέτη του ενζύμου με μεθόδους υπερφυγοκέντρισης, χρωματογραφίας μοριακής διήθησης και ηλεκτροφόρησης έδειξε ότι έχει Μ.Β. γύρω στα 400.000 αν και υπάρχουν υπόνοιες ότι in vivo σχηματίζει συσσωματώματα μεγαλύτερου μοριακού βάρους. Ηλεκτροφόρηση μετά από αποδιάταξη των υπομονάδων έδειξε ότι το μόριο είναι ομοτετραμερές με υπομονάδες Μ. Β. 100.000 περίπου (O Leary et al., 1980). Η συγκριτική μελέτη της αμινοξικής αλυσίδας του ενζύμου PEPCase από διάφορους οργανισμούς όπως το καλαμπόκι και το βακτήριο E.coli έδειξε ότι τα μόρια των υπομονάδων αποτελούνται από ένα συντηρητικό τμήμα προς την πλευρά του καρβοξυλικού άκρου και ένα τμήμα με μεγαλύτερη σχετικά μεταβλητότητα ως προς τη θέση, τον αριθμό και το είδος των αμινοξέων στην πλευρά του αμινοξικού άκρου. Το μήκος της αμινοξικής αλυσίδας διαφέρει στα διάφορα είδη. Στο καλαμπόκι π.χ. υπολογίστηκαν 935 αμινοξέα και η σειρά τους μοιάζει με την αλυσίδα του E.coli σε ποσοστό 43%. Πιστεύεται ότι το συντηρητικό τμήμα του μορίου συμβάλει στη διαμόρφωση του καταλυτικού κέντρου ενώ αντίθετα στο μεταβλητό τμήμα ενδεχομένως να οφείλονται οι παρατηρούμενες διαφορές στις αλληλεπιδράσεις του ενζύμου με τους διάφορους μεταβολίτες (παρεμποδιστές ή ενεργοποιητές) (Izui et al., 1986, Ishijima et al., 1985). Στη συντηρητική περιοχή του μορίου υπάρχει ένα τμήμα (τα αμινοξέα 603-616) που παρουσιάζει σε πολλά είδη μεγάλη ομοιότητα ως προς τη σειρά και το είδος των αμινοξέων, έτσι που από πολλούς επιστήμονες θεωρήθηκε ως η περιοχή δέσμευσης του ΡΕΡ στο καταλυτικό κέντρο. Σε ουδέτερο pη τα υποστρώματα της PEPCase (ΡΕΡ, ΗCO - 3 ) βρίσκονται υπό την μορφή ανιόντων και για αυτό θεωρήθηκε πιθανό, θετικά φορτισμένες ομάδες του ενζυμικού μορίου να εμπλέκονται στη δέσμευση των υποστρωμάτων. Στην προσπάθεια διευκρίνησης των αμινοξέων που είναι απαραίτητα για την καταλυτική δράση του ενζύμου χρησιμοποιήθηκαν κινητικές μελέτες σε διαφορετικά pη και χημικοί τροποποιητές (φαινύλ-γλυοξάλη, διαιθύλπυροκαρβονικό, ισο-θειοκυανική εωσίνη), οι οποίοι αναγνωρίζουν συγκεκριμένα αμινοξέα και συγχρόνως προκαλούν αναστολή της δραστηριότητας της PEPCase. Τα πειράματα αυτά στο καλαμπόκι έδειξαν ότι δύο ομάδες αργινίνης, τέσσερεις κυστεΐνης και τέσσερεις λυσίνης ανά τετραμερές είναι απαραίτητες για την εμφάνιση της δραστηριότητας.
Η τεταρτοταγής δομή συνδέεται στενά με τις διαδικασίες ελέγχου και ρύθμισης του. Το ένζυμο απαντά in vivo σε διάφορες ολιγομερείς μορφές (τετραμερές, διμερές, μονομερές) και έχει διαπιστωθεί η υπόθεση ότι ο βαθμός πολυμερισμού πιθανόν αποτελεί μηχανισμό ρύθμισης της ενζυμικής δραστηριότητας (O Leary et al., 1980, Andreo et al., 1987) Ο Jones και οι συνεργάτες του (Jones et al., 1978) σε μελέτη τους με την PEPCase από το CAM φυτό Bryophyllum fedtschenkol, αναφέρουν ότι το ένζυμο στη φυσιολογική του κατάσταση βρίσκεται υπό μορφή τετραμερούς, αποπολυμερισμός του δε προς την ενενεργή διμερή μορφή ευνοείται από χαμηλή συγκέντρωση ενζύμου και υποστρώματος (ΡΕΡ) και χαμηλό pη. Προτείνουν ότι υπάρχει δυναμική ισορροπία διμερούς-τετραμερούς και η διμερής μορφή αποτελεί βασική μονάδα πολυμερισμού. Ο απολυμερισμός της PEPCase έχει παρατηρηθεί και στα C 4 φυτά, τουλάχιστον όσον αφορά το ένζυμο από το καλαμπόκι που έχει αποτελέσει το αντικείμενο των περισσοτέρων ερευνητικών ερευνών. Ο Walker και οι συνεργάτες του (Walker et al., 1986) διερεύνησαν της σχέση ενζυμικής δραστηριότητας και κατάστασης πολυμερισμού του ενζυμικού μορίου και διαπίστωσαν ότι μέγιστη δραστηριότητα παρουσιάζει το ένζυμο όταν βρίσκεται στην τετραμερή του μορφή, ενώ το διμερές ένζυμο εμφανίζει πολύ μικρή ή καθόλου δραστηριότητα και το μονομερές είναι τελείως ανενεργό. Στην διατήρηση της τεταρτοταγούς δομής συμμετέχουν τόσο ομάδες κυστεΐνης όσο και ομάδες ιστιδίνης. Συνοψίζοντας, υψηλό pη και χαμηλές θερμοκρασίες, η αράιωση του ενζύμου και η αυξημένη ιοντική ισχύ φαίνεται να ευνοούν την αποδιάταξη του ενζύμου, ενώ η παρουσία ΡΕΡ και ΜgCl 2 το προστατεύουν (Petropoulou, 1993). Σε επόμενο κεφάλαιο θα αναφερθούμε λεπτομερώς στα παραπάνω. Τέλος ο Andreo και οι συνεργάτες του προσδιόρισαν την υδροδυναμική δομή του ενζύμου μετά από τροποποίηση των ε-αμινομάδων με ισοθειοκυανική εοζίνη. Οι μετρήσεις έδειξαν ότι το ένζυμο έχει τετραεδρική διάταξη στο χώρο ενώ παρουσία Mg ή PEP και Mn μια στρεβλή τριγωνική διάταξη (Andreo et al., 1986). Οι Stiborova και Leblova έχουν προτείνει δομή με διάταξη των υπομονάδων στις κορυφές τετράπλευρου (Stiborova et al., 1986). Μια τέτοια τοπολογία του ενζύμου in vitro, δεν είναι απαραίτητο να υπάρχει και in vivo, δεδομένου ότι μέσα στο κύτταρο διαμορφώνονται διαφορετικές φυσικοχημικές συνθήκες.
Α.5.1 Επίδραση τροποποιητών και διαμόρφωση του ενεργού κέντρου Με τη μέθοδο της τροποποίησης των περιφερειακών ομάδων των αμινοξέων του μορίου έγινε προσπάθεια να προσδιοριστεί ο αριθμός και το είδος των αμινοξέων που συμβάλλουν στη δραστηριότητα του ενζύμου. Επώαση του ενζύμου από καλαμπόκι με διεθυλ-πυροκαρβονικό (diethylpyrocarbonate, DEPC), το οποίο υπό ορισμένες συνθήκες τροποποιεί ποσοτικά ομάδες ιμιδαζολίου (ιστιδίνης) είχε ως αποτέλεσμα αποδραστηριοποίηση του ενζύμου. Η αποδραστηριοποίηση οφείλεται στην τροποποίηση από το DEPC επτά ιστιδίνων για κάθε υπομονάδα. Οι τέσσερις από αυτές χαρακτηρίστηκαν ως απαραίτητες για την δραστηριότητα του ενζύμου και εντοπίζονται στην περιφέρεια του ενώ οι άλλες 3 καλύπτονται κατά τη διαμόρφωση του τεταμερούς. H παρουσία του MgCl 2 στην επώαση 10 mm PEP, έχει ως αποτέλεσμα την πλήρη προστασία του ενζύμου λόγω της προστασίας δύο εκ των τεσσάρων ιστιδινών. Αυτό το αποτέλεσμα σε συνδυασμό με το ότι α) δεν διαπιστώθηκε ανάλογη προστασία από τα G-6-P, μηλικό, οξαλοξεικό ή HCO - 3, β) ο λόγος Vmax / Km του ενζύμου μεταβάλλεται με το pη κατά τρόπο που δείχνει ισχυρό ιονισμό ομάδων ιμιδαζολίου, οδήγησε μια ομάδα Αργεντινών επιστημόνων στο συμπέρασμα ότι οι δύο ιστιδίνες συμμετέχουν στην διαμόρφωση του καταλυτικού κέντρου (Iglesias et al., 1983). Ακόμη διαπιστώθηκε η ύπαρξη σουλφυδριλικών ομάδων μετά από τροποποίηση τους από CuCl 2 (οξειδώνει σουλφυδρυλικές ομάδες), CdCl 2 (σχηματίζει σύμπλοκα), Ρ-χλωρομερκουριβενζοϊκου (PCMB), N-εθυλμαλεϊμίδης (ΜΕΝ), ιωδοοξικού, ιωδοβενζοϊκού και βρωμοπυροσταφυλικού. Επώαση του ενζύμου από καλαμπόκι με CuCl 2 έχει σαν αποτέλεσμα αποδραστηριοποίηση του ενζύμου που όμως αίρεται παρουσία 1 mm EDTA, ενώ προσθήκη στο ένζυμο 20 mm DTT επαναδραστηριοποιεί το ένζυμο. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα η ομάδα των Αργεντινών κατέληξε στο συμπέρασμα ότι το CuCl 2 οξειδώνει σουλφυδρυλικές ομάδες σχηματίζοντας δισουλφυλικές γέφυρες. Επίσης σε συνδυασμό με την προσθήκη ΝΕΜ, κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η αποδραστηριοποίηση του ενζύμου παρουσία CuCl 2 οφείλεται στο σχηματισμό τεσσάρων επιπλέον δισουλφυδικών δεσμών με την οξείδωση αντίστοιχα σουλφυδρυλικών ομάδων (Iglesias et al., 1984). Το EDTA προστατεύει το ένζυμο από το CdCl 2 ενώ στην περίπτωση αυτή το DTΤ δεν το επαναδραστηριοποιεί λόγω του σχηματισμού συμπλοκών. Το ΝΕΜ, υπό ορισμένες προϋποθέσεις, τροποποιεί ποσοτικά τις σουλφυδρυλικές ομάδες ενώ η
επώαση του ενζύμου με 1 mm ΝΕΜ έχει ως αποτέλεσμα την πλήρη αποδραστηριοποίηση του. Όταν στο διάλυμα επώασης υπάρχει ΡΕΡ ή μηλικό ή οξαλοξικό το ένζυμο προστατεύεται (Iglesias et al., 1984). Πλήρη αποδραστηριοποίηση του ενζύμου έχουμε με την τροποποίηση 8 απαραίτητων σουλφυδρυλικών ομάδων ανά τετραμερές, ενώ με την παρουσία ΡΕΡ κατά την επώαση τροποποιούνται μόνο οι 4 (Iglesias et al., 1984). Σύμφωνα λοιπόν με τα αποτελέσματα των Αργεντινών, θεωρήθηκε ότι υπάρχουν σουλφυδρυλικές ομάδες στο καταλυτικό κέντρο και ότι είναι αναγκαίες για την δραστηριότητα του ενζύμου. Ακόμη διαπιστώθηκε ότι το DTΤ ενεργοποιεί το ένζυμο που προέρχεται από φύλλα που διατηρήθηκαν στο σκοτάδι, ενώ το diamide αναστρέφει την ενεργοποίηση. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα η ομάδα των Αργεντινών κατέληξε και στο συμπέρασμα ότι η ενεργοποίηση του ενζύμου από το DTΤ γίνεται με αναγωγή 2 σουλφυδρυλικών δεσμών ( Iglesias et al., 1984). Ανάλογη αποδραστηριοποίηση παρατηρείται όταν το ένζυμο επωασθεί με PCMB. Το PEP, η G-6-P, το Ca 2+, το πυροσταφυλικό και η γλυκίνη το προστατεύουν (Manetas et al., 1982). Το βρωμοπυροσταφυλικό επειδή είναι ανταγωνιστικός παρεμποδιστής της PEPCase, την αποδραστηριοποιεί με επώαση λόγω τροποποίησης σουλφυδρυλικών ομάδων που ενδεχομένως βρίσκονται στο καταλυτικό κέντρο (Gonzalez et al., 1986). Κλιμακούμενες συγκεντρώσεις φαινυλγλυοξάλης αποδραστηριοποιούν το ένζυμο λόγω τροποποίησης ομάδων γουανίνης της αργινίνης. Το PEP, το οξαλοξικό και το μηλικό προστατεύουν το ένζυμο. Από αυτά τα πειραματικά δεδομένα βγήκε το συμπέρασμα ότι τροποποιούνται 4 αργινίνες εκ των οποίων 2 θεωρήθηκε ότι συμβάλλουν στην διαμόρφωση του καταλυτικού κέντρου (Iglesias et al., 1984). Επιπλέον παρατηρήθηκε αποδραστηριοποίηση του ενζύμου από φύλλα καλαμποκιού, που έχουν διατηρηθεί στο φως ή στο σκοτάδι όταν αυτό επωασθεί με φωσφορική πυριδοξάλη (5-Ρ-Pyridoxal) ως αποτέλεσμα τροποποίησης ε-αμινομάδων λυσίνης. Το ότι το ΡΕΡ, παρουσία Mg προστατεύει το ένζυμο οδήγησε στο συμπέρασμα ότι και το αμινοξύ λυσίνη συμμετέχει στη διαμόρφωση του καταλυτικού κέντρου (Podesta et al., 1986). Ανάλογα αποτελέσματα διαπιστώθηκαν μετά από τροποποίηση του ενζύμου με ισοθειοκυανική εοζίνη (Andreo et al., 1986). Με βάση τη συμπεριφορά του ενζύμου παρουσία των υποστρωμάτων του, την επίδραση ανταγωνιστικών παρεμποδιστών και τροποποιητών πλευρικών ομάδων αμινοξέων, η ομάδα των Αργεντινών πρότεινε ένα τελικό μοντέλο διαμόρφωσης του
καταλυτικού κέντρου. Ωστόσο θα πρέπει να πούμε ότι το μοντέλο αυτό στηρίχτηκε στην παρατήρηση ότι το ΡΕΡ παρουσία Mg προστατεύει το ένζυμο από την τροποποίηση των πλευρικών ομάδων των αμινοξέων. Μια τέτοια προστασία όμως του ενζύμου από το υπόστρωμα ενδέχεται να οφείλεται στο ότι αυτό διατηρεί την τετραμερή μορφή του κατά την επώαση, έτσι ώστε οι πλευρικές ομάδες ορισμένων αμινοξέων να μην είναι προσιτές στους τροποποιητές, έστω και αν δεν βρίσκονται στο δραστικό κέντρο. Δεν είναι τυχαία ότι ο Walker και οι συνεργάτες ου διαπίστωσαν ότι κατά τη επώαση του ενζύμου με PCMB και DΕPC το τετραμερές μετασχηματίζεται βαθμιαία σε μονομερές και ότι το ΡΕΡ παρουσία Mg διατηρεί το ένζυμο στην τετραμερή του μορφή. Τέλος ο O Leary πρότεινε ότι το ενεργό κέντρο μπορεί αν χωριστεί σε 6 περιοχές με βάση την ειδική αλληλεπίδραση του με τα υποστρώματα και του διάφορους παρεμποδιστές (O Leary, 1983).
Α.5.2 Καταλυτικές ιδιότητες και μηχανισμός αντίδρασης Όπως είναι γνωστό η PEPCase καταλύει την αντίδραση της β-καρβοξυλίωσης του ΡΕΡ προς οξαλοξικό και φωσφορικά: ΔGo = -7 Kcal / mole Η αντίδραση αυτή είναι έντονα εξεργονική και ως εκ τούτου μονόδρομη σε φυσιολογικές συνθήκες. Για την δραστηριότητα του ενζύμου είναι απαραίτητο κάποιο δισθενές μέταλλο. Σε φυσιολογικές συνθήκες θεωρείται ότι το ρόλο αυτόν τον παίζουν κυρίως τα ιόντα Mg 2+, ενώ in vitro έχει δραστηριότητα και με ιόντα Μn 2+ ή Co (O Leary, 1983, Ngyen et al., 1988) Τα ιόντα Μn 2+ σε υψηλές συγκεντρώσεις φαίνεται να δρουν ανασταλτικά όπως και άλλα δισθενή ιόντα όπως του χαλκού, του ασβεστίου και του καδμίου (Gavalas et al., 1980, Inglesias et al., 1984). Επιπλέον ως - υπόστρωμα, το ένζυμο χρησιμοποιεί το ανθρακικό ιόν HCO 3 και όχι το CO 2 όπως η Rubisco ενώ η PEPCase είναι η μόνη καρβοξυλάση που δεν χρησιμοποιεί βιοτίνη (O Leary, 1982). Αν και παλιότερα υπήρχε η άποψη ότι το ένζυμο αναγνωρίζει το σύμπλοκο Mg 2+ ΡΕΡ, με νεώτερες έρευνες με χημικούς τροποποιητές αμινοξέων διατυπώθηκε η άποψη ότι τα ιόντα Mg δεσμεύονται σε διαφορετική θέση από εκείνη του ΡΕΡ, αλλάζοντας τη διαμόρφωση του καταλυτικού κέντρου έτσι ώστε να αυξάνει η συγγένεια των υποστρωμάτων με το ένζυμο και να διευκολύνεται η διαδικασία της αντίδρασης (O Leary, 1982, Andreo et al., 1987). Ο λεπτομερής μηχανισμός της αντίδρασης, ιδιαίτερα όσον αφορά το ρόλο των αμινοξέων του ενεργού κέντρου παραμένει ακόμη αδιευκρίνιστος. Μελέτες με χρησιμοποίηση χημικών αναλόγων του υποστρώματος ενισχύουν την υπόθεση του O Leary κατά την οποία πιστεύεται ότι η αντίδραση γίνεται σε 2 στάδια. Στο πρώτο στάδιο έχουμε σχηματισμό καρβοξυφωσφορικού και της ενολικής μορφής του πυροσταφυλικού και στο δεύτερο στάδιο τη μεταφορά του ενεργού ανθρακικού προς σχηματισμό ΟΑΑ και ελευθέρωση φωσφορικών. Σύμφωνα με τον παραπάνω μηχανισμό, στο πρώτο στάδιο το ΡΕΡ δρα ως δότης του φωσφόρου στο δισσανθρακικό ιόν με αποτέλεσμα το σχηματισμό του καρβοξυφωσφορικού ανυδρίτη
και της ενολικης μορφής του πυροσταφυλικού ενώ στο δεύτερο στάδιο γίνεται προσβολή του άνθρακα του καρβοξυφωσφορικού ανυδρίτη από το πυροσταφυλικό και τελικά οδηγεί στο σχηματισμό του οξαλοξικού και Pi. Με τον τρόπο αυτό εξασφαλίζεται η χρησιμοποίηση της ενέργειας του δεσμού ενολικής ομάδας - φωσφόρου και η απαραίτητη δραστηριοποίηση του ατόμου του άνθρακα του HCO 3 για το σχηματισμό του δεσμού άνθρακα άνθρακα στο οξαλοξικό οξύ. Ο σχηματισμός του ενδιάμεσου καρβοξυφωσφορικού προσδιορίζει και την ταχύτητα της αντίδρασης (O Leary, 1983). Πέρα όμως από την β-καρβοξυλίωση του ΡΕΡ η PEPCase υδρολύει τη φωσφορική ομάδα από μια σειρά φωσφορυλιωμένα παράγωγα που δρουν είτε ως ενεργοποιητές, είτε ως παρεμποδιστές (Gonzalez et al., 1987). Είναι πιθανό ότι το ένζυμο κάτω από ορισμένες συνθήκες μπορεί να έχει δραστηριότητα φωσφατάσης ακόμη και με υπόστρωμα ΡΕΡ (Walker et al., 1988). Το Km για το Mg κυμαίνεται μεταξύ 0,1mM και πάνω από 1 mm. Για το ΡΕΡ το Km είναι γύρω στο 1 mm ή μεγαλύτερο αναλόγως το pη και με σιγμοειδή κινητική. Για τα ανθρακικά έχουν αναφερθεί Κm γύρω στα 20 mm με 100 mm ανάλογα πάντα με το pη (O Leary, 1982). Ωστόσο θα πρέπει να αναφέρουμε ότι το ένζυμο παρουσιάζει προβλήματα στο προσδιορισμό των κινητικών παραμέτρων του in vitro, έχουν δε εκφραστεί επιφυλάξεις για το αν το ένζυμο έχει αλλοστερικές ιδιότητες in vivo (Brulfert et al., 1985). Πιστεύεται ότι οι κινητικές παράμετροι του ενζύμου επηρεάζονται σε μεγάλο ποσοστό από τη συμπεριφορά του σε αραιά διαλύματα όπως εκείνα των ενζυμικών δοκιμών. Η συμπεριφορά αυτή σχετίζεται με την ιδιότητα του μορίου να αποσυνδέονται οι υπομονάδες του σε αραιά διαλύματα. Τα φαινόμενα αυτά είναι πιο έντονα σε χαμηλές συγκεντρώσεις ΡΕΡ για αυτό και σε αυτές τις συγκεντρώσεις η δραστηριότητα όχι μόνο είναι χαμηλότερη από τις πραγματικές αλλά και δεν είναι σταθερή κατά τη διάρκεια της δοκιμής με συνεπεία να χρειάζεται μαθηματικός υπολογισμός της αρχικής ταχύτητας (Gavalas et al., 1981).
Α.5.3 Τα υποστρώματα του ενζύμου Α.5.3.1 Φωσφοενόλοπυροσταφυλικό οξύ (ΡΕΡ) Τα δεδομένα της βιβλιογραφίας, όσον αφορά την συμπεριφορά της PEPCase σε σχέση με το ΡΕΡ, παρουσιάζουν μεγάλη ποικιλομορφία και σε πολλές περιπτώσεις είναι δύσκολο να γίνουν συγκρίσεις μεταξύ των διαφόρων μελετητών. Η μορφή της καμπύλης κορεσμού εξαρτάται από το είδος του φυτού αλλά και από πολλούς παράγοντες όπως το ph της ενζυμικής δοκιμής. Η C 3 -PEPCase και η CAM-PEPCase στα περισσότερα φυτά ακολουθούν συμπεριφορά Michaelis-Menten, όμως για την C 4 -PEPCase τα δεδομένα είναι πιο πολύπλοκα, άλλοτε αναφέρονται σε σιγμοειδείς καμπύλες κορεσμού και άλλοτε σε τυπικές Michaelis-Menten. Κατά μέσο όρο η χημική συγγένεια του ενζύμου ως προς το ΡΕΡ είναι 5 φορές μεγαλύτερη στα C 3 - από ότι στα C 4 -φυτά. Αντίθετα η μέγιστη δραστηριότητα είναι σαφώς μεγαλύτερη στα C 4 - φυτά (Petropoulou, 1993). Οι Ting και Osmond το 1973 (Petropoulou, 1993) μελέτησαν τις ιδιότητες του ενζύμου σε είδη με διαφορετικό τύπο δέσμευσης του CO 2, σε υψηλό ph ενζυμικής δοκιμής. Συνοψίζοντας τα αποτελέσματα τους, προτείνουν 4 λειτουργικές μορφές ενζύμου, οι οποίες μπορούν να διακριθούν σε στήλη DEAE κυτταρίνης : α) μια C 4 - φωτοσυνθετική μορφή με υψηλό Km και υψηλή Vmax, β) μια C 3 -φωτοσυνθετική μορφή (στα φύλλα) με χαμηλά Km και Vmax, γ) μια CAM-φωτοσυνθετική μορφή με χαμηλό Km και υψηλή Vmax και δ) μια μορφή που συναντάται σε μη φωτοσυνθετικούς ιστούς και παρουσιάζει χαμηλό Km και χαμηλή Vmax. Οι παράγοντες που επηρεάζουν τις κινητικές ιδιότητες του ενζύμου PEPCase είναι πολλοί όπως η θερμοκρασία, το ph, το φως, η σχέση των οποίων θα αναλυθεί σε επόμενο κεφάλαιο. Εξετάζοντας την πληθώρα των δεδομένων στη βιβλιογραφία σχετικά με τις ιδιότητες της PEPCase διαπιστώνουμε ότι συχνά υπάρχουν σοβαρές διαφορές μεταξύ των ερευνητών. Οι διαφορές αυτές κατά ένα μέρος μπορούν αν αποδοθούν στον τύπο του φυτού ή του ιστού που εξετάζεται, αφού το ένζυμο δεν έχει τον ίδιο φυσιολογικό ρόλο σε όλα τα φυτά. Οπωσδήποτε, ως ένα βαθμό οι παρατηρούμενες αποκλίσεις σχετίζονται με τη διαδικασία απομόνωσης του ενζύμου από τον ιστό καθώς και από τις συνθήκες στις οποίες γίνεται η μέτρηση της δραστηριότητας. Σύμφωνα με τα παραπάνω λοιπόν είναι δύσκολο να συγκρίνουμε τα αποτελέσματα μας με αντίστοιχα της βιβλιογραφίας.
Εικόνα Α12 : Η μοριακή δομή του ΡΕΡ. Α.5.3.2 Δισανθρακικό ανιόν (HCO3-) Οι ερευνητές προσπαθώντας να διευκρινίσουν πειραματικά το μηχανισμό της - αντίδρασης, έδειξαν ότι το δεύτερο υπόστρωμα για την PEPCase είναι το HCO 3 και όχι το CO 2 (Petropoulou, 1993). Όσον αφορά την χημική συγγένεια της PEPCase ως προς το HCO - 3, αυτή είναι γενικώς υψηλή και οι καμπύλες κορεσμού είναι ορθογώνιες υπερβολές. Οι αναφερόμενες τιμές Km για τα διάφορα είδη που έχουν εξεταστεί παρουσιάζουν σημαντική διακύμανση, από 0,02-0,4 mm. Σε ορισμένες περιπτώσεις έχουν αναφερθεί και υψηλότερες τιμές, 1-2 mm, ενώ αναστολή της δραστηριότητας παρατηρήθηκε σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες των 5 mm (Petropoulou, 1993).
Α.6 Ρύθμιση της δραστηριότητας του ενζύμου PEPcase Α.6.1 Παράγοντες που επηρεάζουν την δραστηριότητα του ενζύμου PEPcase Η δραστηριότητα του ενζύμου in vitro επηρεάζεται τόσο από παράγοντες του περιβάλλοντος ανάπτυξης του φυτού όπως η θερμοκρασία, η φωτοπεριοδικότητα, η ένταση του φωτός και η αλατότητα του εδάφους όσο και από παράγοντες του άμεσου περιβάλλοντος μέσα στο κύτταρο όπως το pη και οι διάφοροι μεταβολίτες. Μελέτη της κινητικής του ενζύμου με το ΡΕΡ σε διαφορετικές θερμοκρασίες έδειξε ότι τόσο το Vmax όσο και το S 0,5 μεταβάλλονται με τη θερμοκρασία. Αύξηση της θερμοκρασίας μεταξύ 10-45 ο C έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του Vmax του ενζύμου (Selinioti et al., 1986). Αντίθετα το S 0,5 του ενζύμου αρχικά μειώνεται με την αύξηση της θερμοκρασίας μέχρι ενός ελάχιστου και αυξάνει πάλι με περαιτέρω αύξηση της θερμοκρασίας. Η άριστη θερμοκρασία για την οποία έχουμε τη μεγαλύτερη συνάφεια του ενζύμου - υποστρώματος διαφέρει μεταξύ των ειδών ανάλογα με τις μεταβολικές απαιτήσεις και την προσαρμογή κάθε είδους σε διαφορετικά θερμοκρασιακά όρια ανάπτυξης. Επίσης οι καμπύλες Αrrhenius για το ένζυμο δεν είναι ευθείες γεγονός που δείχνει ότι κάτω από ορισμένες θερμοκρασίες η καταλυτική ικανότητα του ενζύμου μειώνεται δραστικά (μεγαλύτερες ενέργειες ενεργοποίησης) (Selinioti et al., 1986). Όσον αναφορά την ιοντική ισχύ έχει αναφερθεί ότι ουσίες που αυξάνουν την ιοντική ισχύ του διαλύματος (π.χ. 200-400 mm NaCl) προκαλούν αποσύνδεση των υπομονάδων του ενζύμου και ως εκ τούτου μειώνεται η δραστηριότητα του ενζύμου με την πάροδο του χρόνου, ιδιαίτερα σε χαμηλές συγκεντρώσεις ΡΕΡ (Manetas et al., 1986). Αντίθετα, έχει αναφερθεί ότι η παρουσία NaCl στο διάλυμα της ενζυμικής δοκιμής σε υψηλές συγκεντρώσεις ΡΕΡ προκαλεί αύξηση της δραστηριότητας του ενζύμου σε αλόφυτα (Shomer-Ilan et al., 1985). Επιπλέον, η δραστηριότητα του ενζύμου σε σταθερή συγκέντρωση ΡΕΡ εξαρτάται από το pη του διαλύματος της ενζυμικής δοκιμής. Αύξηση του pη από 6,5-8 έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της δραστηριότητας με μέγιστο γύρω στο 7. Προσδιορισμοί όμως της Vmax με κινητική μελέτη σε διαφορετικά pη έχουν δείξει ότι είναι ανεξάρτητη από το pη στην περιοχή 7-10 (O Leary, 1998). Η φαινομενική αυτή ασυμφωνία οφείλεται στη μεταβολή του Km με το pη (αύξηση του Km σε χαμηλότερα pη). Το pη όμως δεν επηρεάζει μόνο τις κινητικές ιδιότητες του ενζύμου αλλά και τις επιδράσεις των διαφόρων τροποποιητών. Δεν αποκλείεται το pη να αποτελεί έναν από τους ενδοκυτταρικούς παράγοντες που ρυθμίζουν φυσιολογικά την
ενζυμική δραστηριότητα της PEPCase. Ωστόσο κάτι τέτοιο προϋποθέτει ότι το κυττοπλασματικό pη του μεσόφυλλου μεταβάλλεται σημαντικά, αλλά πειραματικά δεδομένα που να ενισχύουν την παραπάνω πρόταση δεν υπάρχουν (Guern et al.,1986). Μια σειρά μεταβολίτες που συνδέονται με τη C 4 οδό ή που έχουν κάποιο μεταβολικό ρόλο, επηρεάζουν in vitro τη δραστηριότητα του ενζύμου. Το μηλικό θεωρείται ένας ισχυρός παρεμποδιστής της αντίδρασης. Ωστόσο, ο τύπος της παρεμπόδισης και το μέγεθος εξαρτάται από το pη της αντίδρασης. Η παρεμπόδιση σε χαμηλά pη είναι κυρίως ανταγωνιστική σε σχέση με το ΡΕΡ ενώ σε μεγαλύτερα pη είναι μη ανταγωνιστική. Η παρουσία στην ενζυμική δοκιμή του G-6-P μειώνει την ανταγωνιστική παρεμπόδιση ενώ δεν επηρεάζει τη μη ανταγωνιστική (Gonzalez et al., 1984). Το οξαλοξικό σε συγκεντρώσεις γύρω στο 1 mm είναι παρεμποδιστής του ενζύμου. Το ασπαραγινικό είναι μεν παρεμποδιστής, αλλά προστατεύει το ένζυμο από τη θερμική αποδραστηριοποίηση (O Leary, 1982). Επίσης παρεμποδιστική δράση έχουν τα οξέα κιτρικό και πυροσταφυλικό. Η γλυκίνη έχει βρεθεί ότι ενεργοποιεί την PEPCase από το καλαμπόκι και άλλα C 4 -φυτά όχι όμως και το ένζυμο των δικοτυλήδονων φυτών. Τα πυροφωσφορικά, τα φωσφορικά, τα νιτρικά και τα θειώδη ιόντα θεωρούνται ότι έχουν παρεμποδιστική δράση στο ένζυμο (O Leary, 1982). Από τα αδενυλικά νουκλεοτίδια το ΑΜΡ αυξάνει τη δραστηριότητα του ενζύμου σε pη γύρω στα 7,0 και σε συγκέντρωση 0,7-1 mm, ενώ αντίθετα παρεμποδιστικό ρόλο έχουν το ΑΤΡ και το ADP. Ακόμη η γλυκερόλη, η σορβιτόλη, η μπεταΐνη όπως και άλλοι ωσμωλύτες ελαττώνουν το Κm του ενζύμου για το ΡΕΡ (Stamatakis et al., 1988). Η παρουσία του DTT στο διάλυμα της ενζυμικής δοκιμής έχει ως αποτέλεσμα τη σταθεροποίηση της δραστηριότητας του ενζύμου (Gavalas et al., 1981) ή / και την αύξηση της δραστηριότητας του ενζύμου νύχτας κατά 50 % (Iglesias et al., 1983). Είναι φανερό ότι η δράση όλων των πιο πάνω παραγόντων εξαρτάται σε σημαντικό βαθμό από την κατάσταση που βρίσκεται το ένζυμο κατά την ενζυμική δοκιμή και τις συγκεντρώσεις των υποστρωμάτων. Ως εκ τούτου, η φυσιολογική σημασία τους είναι αμφισβητήσιμη.
Εικόνα Α13 : Οι μεταβολίτες G-6-P, γλυκίνη και μηλικό οξύ. Α.6.2 Έλεγχος και ρύθμιση της δραστηριότητας της PEPcase Η δράση της PEPCase κατέχει ιδιαίτερη θέση στη μεταβολική ροή του άνθρακα στα C 4 -φυτά και CAM φυτά στο σημείο που γίνεται η είσοδος νέου άνθρακα στο μεταβολισμό των φυτών. Από αυτήν την άποψη αποκτά ιδιαίτερη σημασία ο έλεγχος και η ρύθμιση της δραστηριότητας της γιατί αφορά γενικότερα τον έλεγχο και τη ρύθμιση της ροής του άνθρακα σε αυτά τα φυτά. Κρίνεται αναγκαίο για την PEPCase να διακρίνουμε τις έννοιες ρύθμιση (regulation) και έλεγχος (control) της δραστηριότητας με βάση τη θεωρητική προσέγγιση του Queiroz (Broda, 1975). Στην έννοια της ρύθμισης περιλαμβάνονται οι περιπτώσεις τροποποίησης της ενζυμικής δραστηριότητας από τις μεταβολές του χημικού δυναμικού μεταβολιτών που συνδέονται με τη λειτουργία της PEPCase, π.χ. η περίπτωση της ανασταλτικής επίδρασης του οξαλοξικού και του μηλικού. Η έννοια του ελέγχου συνδέεται με τις μεταβολές της ενεργότητας του ενζύμου (enzyme capacity) από παράγοντες του περιβάλλοντος, όπως το φως, η φωτοπεριοδικότητα, η αλατότητα ή από παράγοντες που σχετίζονται με άλλες μεταβολικές οδούς που αλληλεπιδρούν με τη C 4 -οδό. Η καρβοξυλάση του ΡΕΡ των C 4 και CΑM φυτών εμφανίζει in vitro ιδιότητες αλλοστερικού ενζύμου (Coombs et al., 1973). Μεταξύ των παραγόντων στους οποίους αποδίδεται ρυθμιστική ικανότητα στη δραστηριότητα του ενζύμου είναι η αλληλεπίδραση 2 φαινομένων : της ενεργοποίησης από την 6-φωσφορική γλυκόζη (G-6-P) και της αναστολής από το L-μηλικό οξύ. Η G6P, είναι τελικό προϊόν της δέσμευσης του CO 2 ή /και πρόδρομος του υποστρώματος PEP και μέσω της γλυκολυτικής οδού ενεργοποιεί την PEPCase των C 4 και CΑM φυτών, ενώ και άλλοι αλλοστερικοί τροποποιητές έχουν αναφερθεί με