Μελέτη της έκφρασης του ογκοκατασταλτικού γονιδίου Cyld στον καρκίνο του μαστού

Σχολή Θετικών Επιστημών Τμήμα Βιολογίας Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών Κατεύθυνση: Εφαρμοσμένη γενετική και βιοτεχνολογία ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Μελέτη της έκφρασης του ογκοκατασταλτικού γονιδίου Cyld στον καρκίνο του μαστού ΤΡΙΑΝΤΑΦΥΛΛΙΔΟΥ ΕΥΘΥΜΙΑ Βιολόγος ΑΠΘ Επιβλέπων: Γ. Μόσιαλος, αναπληρωτής καθηγητής τομέας γενετικής ανάπτυξης και μοριακής βιολογίας, τμήματος βιολογίας ΑΠΘ Συνεπιβλέπων : Κ. Παπαζήσης, επιμελητής β ΑΝΘ Θεαγένειο Θεσσαλονίκη, Δεκέμβρης 2009 1

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η συγκεκριμένη διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Εφαρμοσμένης Μοριακής Ογκολογίας του ΑΝΘ Θεαγένειο. Για την πραγματοποίηση καθώς και για την συγγραφή της παρούσας εργασίας, είχα την τιμή να έχω την βοήθεια πολλών ατόμων, τα οποία θα ήθελα να ευχαριστήσω. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Γ. Μόσιαλο για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε με την ανάθεση της συγκεκριμένης εργασίας και για τις σημαντικές γνώσεις που μου μετέφερε. Τον ευχαριστώ επίσης για την προσεκτική εξέταση του κειμένου, για τις συμβουλές και τις υποδείξεις του, κύρια όμως για την καθοδήγηση και την συμπαράσταση που μου έδειξε σε όλη διάρκεια της μεταπτυχιακής μου εργασίας. Ευχαριστώ ιδιαίτερα τον κ. Κ. Παπαζήση επιμελητή Β στο ΑΝΘ Θεαγένειο, που ως συνεπιβλέπων στην εργασία μου με βοήθησε με την συνεχή επίβλεψη, καθοδήγησή και υπομονή του στην πραγματοποίησή της. Ένα μεγάλο ευχαριστώ οφείλω στην υποψήφια διδάκτωρα του τμήματος Ιατρικής Τουπλικιώτη Παναγιώτα για την πολύπλευρη βοήθεια της, τις χρήσιμες επιστημονικές της επισημάνσεις και την σημαντική συμβολή της κατά τη διάρκεια εκτέλεσης της διπλωματικής μου εργασίας. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω όλους τους συναδέλφους στο εργαστήριο του κ. Μόσιαλου για την υποστήριξή τους σε όποιο πρόβλημα προέκυπτε. Τέλος νιώθω την ανάγκη να ευχαριστήσω τον φίλο μου Γκιάλη Στέλιο για την βοήθεια του στην συγγραφή της συγκεκριμένης εργασίας, κύρια όμως για την υποστήριξη, την συμπαράσταση και την εμπιστοσύνη μου έδειχνε όλο αυτό το διάστημα. 1

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 3 SUMMARY... 4 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 5 1.1 Παθογένεια του Cyld... 5 1.2 Δομή και λειτουργία της CYLD... 9 1.3 Σηματοδοτικά μονοπάτια και CYLD... 15 1.3.1 Η πρωτεΐνη CYLD είναι αρνητικός ρυθμιστής του NF-κB... 15 1.3.2 CYLD και JNK σηματοδοτικό μονοπάτι... 17 1.3.3 CYLD-Snail σηματοδοτικό μονοπάτι... 19 1.4 Φυσιολογικές λειτουργίες της πρωτεΐνης CYLD... 20 1.4.1 Ανοσοαπάντηση και φλεγμονή... 20 1.4.2 Απόπτωση γαμετών και σπερματογένεση... 22 1.4.3 Οστεογένεση και ομοιόσταση οστών... 23 1.4.4 Κυτταρικός κύκλος... 24 1.4.5 Κυτταρική μετανάστευση... 24 1.5 CYLD και καρκίνος του μαστού... 25 2. ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΜΑΣΤΟΥ... 28 2.1 Παράγοντες κινδύνου... 28 2.2 Ανατομία του μαστού... 30 2.3 Ιστολογική ταξινόμηση του καρκίνου του μαστού... 31 2.4 Μορφολογική ταξινόμηση του καρκίνου του μαστού.... 32 2.5 Μοριακή ταξινόμηση του καρκίνου του μαστού (expression microarrays)... 33 3. ΣΚΟΠΟΣ... 35 4. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ... 36 4.1 Υλικά... 36 4.2 Μέθοδοι... 40 4.2.1 Πείραμα 1 0 : Mέτρηση της έκφρασης του γονιδίου Cyld σε δείγματαιστούς με καρκίνο του μαστού.... 40 4.2.2 Αναλυτική περιγραφή σταδίων 1 ου Πειράματος... 40 4.2.3 Πείραμα 2 0 : Μέτρηση της έκφρασης του γονιδίου Cyld σε ορμονοεξαρτώμενη καρκινική σειρά μαστού... 52 5. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 56 5.1 Μέτρηση της έκφρασης του γονιδίου Cyld σε δείγματα ιστών με SYBR Green... 56 5.2 Μέτρηση της έκφρασης του γονιδίου Cyld σε δείγματα ιστών με Taqman... 58 5.3 Μέτρηση της έκφρασης του γονιδίου Cyld στην MCF7... 60 6. ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 63 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 67 2

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το ογκοκατασταλτικό γονιδίο Cyld αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά σε έναν κληρονομικό τύπο καρκίνο του δέρματος, την οικογενή κυλινδρωμάτωση. Πολλές μελέτες ανέδειξαν τον ρόλο του γονιδίου στην αρνητική ρύθμιση σημαντικών σηματοδοτικών μονοπατιών, όπως του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB και της JNK κινάσης. Η ενεργοποίηση του NF-κB έχει διαπιστωθεί σε πολλές περιπτώσεις ογκογένεσης. Τα τελευταία χρόνια έχουν γίνει εντατικές μελέτες για το ρόλο του ογκοκατασταλτικού γονιδίου Cyld στην καρκινογένεση και έχουν παρατηρηθεί χαμηλά επίπεδα έκφρασης του σε περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου, πνεύμονα, ήπατος κ.α. Στόχος της συγκεκριμένης μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας ήταν η μελέτη της έκφρασης του γονιδίου Cyld σε ιστούς με καρκίνο του μαστού. Ο καρκίνος του μαστού είναι ο πιο συχνός καρκίνος στις γυναίκες των αναπτυγμένων χωρών. Είναι μια ετερογενής ομάδα που διακρίνεται μορφολογικά από την ύπαρξη ορμονικών υποδοχέων και του ογκογονιδίου Her2/Neu. Κατά τη διάρκεια της παρούσας έρευνας, η έκφραση του Cyld μετρήθηκε σε ιστούς που ανήκαν σε διαφορετικές ομάδες καρκίνου του μαστού με την τεχνική της real-time PCR. Διαπιστώθηκαν πολύ υψηλά επίπεδα έκφρασης του Cyld στους ιστούς με θετικούς ορμονικούς υποδοχείς. Οι καρκίνοι μαστού τέτοιου τύπου έχουν καλύτερη πρόγνωση και περισσότερες θεραπευτικές επιλογές σε σχέση με τους υπόλοιπους. Στη συνέχεια μελετήθηκε ο ρόλος των ορμονών στην επαγωγή της έκφρασης του Cyld. Στην κυτταρική σειρά MCF7 έγινε επεξεργασία με ταμοξιφένη και με οιστραδιόλη, μετρήθηκαν τα επίπεδα του Cyld και προέκυψε ότι τα οιστρογόνα επάγουν την ενεργοποίηση της μεταγραφής και την έκφραση του Cyld. 3

SUMMARY Cyld was originally identified since 2000 as a tumor suppressor gene that is mutated in familial cylindromatosis, an inherited type of skin cancer. Several studies revealed the role of Cyld as a negative regulator of important signalling pathways, such as the transcriptional factor NF-κB as well as JNK kinase. It should be noticed that NF-κB s activation has been identified as a contributing factor in many cases of oncogenesis. Recently, many studies attempted to investigate the connection of tumor suppressor Cyld to carcinogenesis while low expression of the gene has been observed in cases of lung or colon cancer, hepatocellular carcinoma and other types of malignancies. The goal of this thesis was to investigate the expression of Cyld in breast cancer, the most dispersed one among female population of the advanced world. This type of cancer is clinically heterogeneous disease while on a morphology level, it is classified according to the absence and/or presence of estrogen receptors and oncogene Her2/Neu. During the research, the levels of Cyld s expression found on tissues of different subtypes of breast cancer were measured by using real-time PCR. As an outcome, high levels of Cyld s expression in tissues with positive hormone receptors, were identified. The latter type of cancer has better prognosis and more therapeutical prospects, as compared to other types. Furthermore, the study investigated the possible role of hormones in the induction of Cyld s expression. For this, cell line MCF7 was treated with tamoxifen and estradiol while the levels of Cyld were measured by using real-time PCR. As found, the estrogene induces the activation of transcription and the expression of Cyld. 4

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Παθογένεια του Cyld Η οικογενής κυλινδρωμάτωση είναι ένας σπάνιος κληρονομούμενος τύπος καρκίνου, ο οποίος χαρακτηρίζεται από το σχηματισμό καλοήθων όγκων, τα κυλινδρώματα, στα τριχωτά μέρη του σώματος και κυρίως στο κρανίο. Τα κυλινδρώματα είναι μαλακά ή σκληρά δερματικά οζίδια χρώματος ροδαλού προς ερυθρωπού, τα οποία αναπτύσσονται συνήθως ως μεμονωμένες αλλοιώσεις στο κεφάλι, στο λαιμό και στο τριχωτό της κεφαλής. Αντιπροσωπεύουν έναν από τους πιο κοινούς όγκους που ξεκινούν από δερματικά εξαρτήματα και εμφανίζονται κυρίως σε γυναίκες της μεσαίας ή τρίτης ηλικίας (Massoumi & Paus, 2007). Αν και είναι καλοήθεις όγκοι μπορούν να υποστούν κακοήθη μετασχηματισμό σε κυλινδροκαρκινώματα και να παρουσιάσουν μεταστατική νόσο. Τα κυλινδρώματα αναπτύσσονται πιο συχνά στο χόριο του τριχωτού της κεφαλής και του προσώπου και αποτελούνται από ακανόνιστου σχήματος κύτταρα που διατάσσονται σε νησίδες και περιβάλλονται από ένα εωσινόφιλο υαλοειδές έλυτρο. Οι νησίδες αυτές αποτελούνται τυπικά από δυο ομάδες κυττάρων : περιφερικά κύτταρα με μικρό βαθυχρωματικό πυρήνα που αντιπροσωπεύουν τα σχετικά αδιαφοροποίητα επιθηλιακά νεοπλασματικά κύτταρα και τα πιο διαφοροποιημένα κύτταρα τα οποία εντοπίζονται κεντρικά με μεγάλο ωχρό πυρήνα που ομοιάζουν με κύτταρα των πόρων ή εκκριτικά κύτταρα (εικόνα 1). Τα κυλινδρώματα παρατηρούνται επίσης σε μια κυρίαρχη αυτοσωμική κληρονομική ασθένεια, το σύνδρομο Brooke-Spiegler και στο πολλαπλό τριχοεπιθηλίωμα. Και στις τρεις αυτές ξεχωριστές ασθένειες έχουν αναγνωριστεί μεταλλάξεις σε ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο, το Cyld, με συνέπεια την απώλεια της ενεργότητάς του (Bignell et al., 2000). 5

Εικόνα 1: Μακροσκοπικές φωτογραφίες δυο ασθενών με κυλινδρωμάτωση (Massoumi 2007:1204). Το γονίδιο Cyld και ο ρόλος του στην καρκινογένεση άρχισαν να αποτελούν αντικείμενο έρευνας σχετικά πρόσφατα, ενώ το 2002 περιγράφτηκε ένα περιστατικό ασθενούς με καρκίνο στο νεφρό που παρουσίαζε ελαττωμένη έκφραση του γονιδίου (Ströbel et al, 2002). Συγκεκριμένα ο ασθενής εμφάνισε όγκο στο τοίχωμα της νεφρικής κύστης με μορφολογία παρόμοια αυτών των κυλινδρωμάτων (σπειροαδενοκυλίνδρωμα). Η μόνη γονιδιακή ανωμαλία που παρουσίασε ήταν η απώλεια του μεγάλου βραχίονα του χρωμοσώματος 16 και η ταυτόχρονη προσθήκη γενετικού υλικού στο μικρό βραχίονα του εν λόγω χρωμοσώματος (ισοχρωμοσωμία). Το φαινόμενο αυτό είναι μοναδικό στα νεφρικά καρκινώματα. Επίσης υπήρχε απώλεια της ετεροζυγωτίας για το γονίδιο Cyld, που βρίσκεται στη θέση 16q12-13, με συνέπεια ελάττωση στην έκφραση του. Από το παραπάνω προέκυψε ότι, το ογκοκατασταλτικό γονίδιο Cyld και οι σωματικές μεταλλάξεις του παίζουν σημαντικό ρόλο όχι μόνο στην ογκογένεση στο δέρμα αλλά και στην ανάπτυξη όγκων εκτός δέρματος με κυλινδρωματώδη χαρακτηριστικά. Στη συνέχεια σε μελέτη πάνω σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκινώματος από υαλοειδή κύτταρα του τραχήλου της μήτρας, παρατηρήθηκε μεταξύ άλλων και χαμηλή έκφραση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου Cyld (Hiray et al, 2004). Ταυτόχρονα, διαπιστώθηκε ελαττωμένη έκφραση του γονιδίου ΑΤΜ 11q22.3 και απώλεια της θέσης 9q. Και οι τρεις παραπάνω γενετικοί τόποι έχουν ογκοκατασταλτική δράση και φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση του συγκεκριμένου τύπου καρκίνου. Σημαντικές ήταν οι μελέτες που ακολούθησαν σε ασθενείς με πολλαπλό μυέλωμα (Jenner et al, 2007; Keats et al, 2007) σε σχέση με το ρόλο του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB στην ανάπτυξη του μυελώματος. Ο 6

μεταγραφικός παράγοντας NF-κB ελέγχει πολλές κυτταρικές διεργασίες, περιλαμβανομένων της ανοσίας, της φλεγμονής, της απόπτωσης και άλλων γενετικών προγραμμάτων που είναι βασικά για την κυτταρική αύξηση και επιβίωση. Υπάρχουν δυο μονοπάτια ενεργοποίησης του NF-κB, το κανονικό και μη κανονικό μονοπάτι. Το τελευταίο λειτουργεί κυρίως στα Β κύτταρα και φαίνεται ότι η συνεχής ενεργοποίηση του συμβάλλει καθοριστικά στην παθογένεια του πολλαπλού μυελώματος αλλά και την πρόγνωση της νόσου. Πολλές μεταλλάξεις σε διάφορα γονίδια θετικούς ρυθμιστές της μεταγωγής σήματος συμβάλλουν στην συνεχή ενεργοποίηση του NF-κB. Επίσης διαπιστώθηκαν μεταλλάξεις και σε αρνητικούς ρυθμιστές του NF-κB μονοπατιού, όπως στα γονίδια Traf3, Traf2 και Cyld. Συνολικά ο ρόλος του Cyld ως ογκοκατασταλτικού γονιδίου και τα χαμηλά επίπεδα έκφρασης του φαίνεται να είναι σημαντικός στην ανάπτυξη του πολλαπλού μυελώματος. Η έρευνα συνεχίστηκε σε κυτταρικές σειρές και ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (Hellerbrand et al, 2007). Τα αποτελέσματα έδειξαν χαμηλά επίπεδα έκφρασης του γονιδίου Cyld σε σχέση με τις φυσιολογικές κυτταρικές σειρές και φυσιολογικά δείγματα και στις δυο περιπτώσεις καρκίνου. Διαπιστώθηκε ότι η αναστολή της έκφρασης του Cyld προάγει την συνεχή ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB και συνακόλουθα την ογκογένεση στον καρκίνου του παχέος εντέρου και στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. Σε κυτταρικές σειρές και σε ιστούς με καρκίνο του πνεύμονα μελετήθηκαν πάνω από 200 επιγενετικά ρυθμιστικά γονίδια (Zhong et al, 2007). Χρησιμοποιήθηκαν φαρμακευτικοί αναστολείς της μεθυλίωσης του DNA και της αποακετυλίωσης των ιστονών και παράλληλα μελετήθηκε η γονιδιακή έκφραση με μικροσυστοιχίες. Βρέθηκε ότι υπήρχαν γονίδια η έκφραση των οποίων ρυθμιζόταν από την μεθυλίωση του DNA, ενώ υπήρχαν γονίδια η έκφραση των οποίων καθοριζόταν από την από-ακετυλίωση των ιστονών. Στα τελευταία ανήκε και το Cyld, η έκφραση του οποίου ήταν ελαττωμένη στα καρκινικά δείγματα. Συμπερασματικά, διαπιστώθηκε ότι το ογκοκατασταλτικό γονίδιο Cyld παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη αυτού του τύπου καρκίνου. Μια πολύ πρόσφατη μελέτη in vitro σε κυτταρικές σειρές με κακόηθες μελάνωμα και in vivo σε μοντέλα ποντικιών εξέτασε τον ρόλο του Cyld στην 7

εξέλιξη και πρόγνωση του μελανώματος, της πιο επιθετικής μορφής καρκίνου του δέρματος (Massoumi et al, 2009). Παρατηρήθηκαν πολύ χαμηλά επίπεδα έκφρασης του Cyld ή ακόμη και απουσία έκφρασης του σε όλα τα μελανοκύτταρα τόσο in vitro όσο και in vivo. Δεν βρέθηκαν μεταλλάξεις στο γονίδιο, αλλά αναστολή του υποκινητή του από έναν μεταγραφικό παράγοντα, τον Snail1. Βρέθηκε ότι ο Snail1 αθροίζεται στον υποκινητή του Cyld εμποδίζοντας την μεταγραφή του. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του Bcl-3, την μετατόπισή του στον πυρήνα και την διέγερση της κυκλίνης-d και της Ν-καδερίνης. Οι δυο τελευταίες πρωτεΐνες ενισχύουν τον πολλαπλασιασμό, την μετανάστευση και την διεισδυτικότητα των μελανοκυττάρων in vitro και in vivo. Στην εργασία αυτή προτείνεται ένα νέο σηματοδοτικό μονοπάτι που είναι υπεύθυνο για την ανάπτυξη του μελανώματος, την εξέλιξη του αλλά και την επιβίωση των ασθενών με μελάνωμα. Αυτός ο νέος μοριακός μηχανισμός στηρίζεται στην καταστολή της έκφρασης του Cyld σε επίπεδο μεταγραφής μέσω του Snail1. 8

1.2 Δομή και λειτουργία της CYLD Το γονίδιο Cyld βρίσκεται στο χρωμόσωμα 16 και συγκεκριμένα στη θέση 16q12-q13. Στον άνθρωπο αποτελείται από 20 εξόνια, τα οποία διανέμονται σε περίπου 56kb γενωμικού DNA. Έχουν βρεθεί οκτώ διαφορετικά μετάγραφα του Cyld μέχρι τώρα (alternative splicing), το πλήρες όμως cdna κωδικοποιεί για μια πρωτεΐνη 956 αμινοξέων και 120kDa. Η πρωτεΐνη CYLD περιέχει δυο σημαντικές περιοχές, την περιοχή με τις τρεις CAP-GLY (Cytoskeletal-Associated Protein-Glycine-conserved domains) υποπεριοχές και μια καταλυτική περιοχή UCH (Ubiquitin Carboxy-terminal Hydrolases). Οι CAP-GLY περιοχές μεσολαβούν στη σύνδεση των πρωτεϊνών με την α-τομπουλίνη και τους μικροσωληνίσκους. Η πρωτεΐνη CYLD έχει πράγματι μια λειτουργία που σχετίζεται με τους μικροσωλινίσκους, και πιθανόν να εμπλέκεται στην ρύθμιση της συγκρότησης των μικροσωλινίσκων και της κυτταρικής μετανάστευσης. Η λειτουργία της αυτή καθορίζεται από την πρώτη συγκεκριμένα CAP-GLY περιοχή (Sun S-C,2009). Η περιοχή UCH βρίσκεται στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης CYLD και είναι υπεύθυνη για την απομάκρυνση των αλυσίδων ουβικιτίνης από διαφορετικά πρωτεϊνικά υποστρώματα. Η προσθήκη μορίων ουβικιτίνης είναι ένας εξελικτικά συντηρημένος μηχανισμός μετα-μεταφραστικής τροποποίησης, ο οποίος επηρεάζει χιλιάδες πρωτεΐνες του κυττάρου, ελέγχοντας την δραστηριότητα τους και τον χρόνο ημίσειας ζωής τους. Είναι μια διαδικασία η οποία απαιτεί την συνεργασία τριών διαφορετικών ενζύμων Ε1, Ε2 και Ε3 και περιλαμβάνει την ομοιοπολική σύνδεση ενός πολυπεπτιδίου 76 αμινοξέων, της ουβικιτίνης, με τις πρωτεΐνες-στόχους. Αρχικά, η ουβικιτίνη συντίθεται ως ανενεργή πρόδρομη πρωτεΐνη, επεξεργάζεται από μια ειδική πρωτεάση ώστε να αποκτήσει στο καρβοξυτελικό της άκρο μοτίβο διγλυκίνης, απαραίτητο για την σύνδεση της με τις πρωτεΐνες. Στη συνέχεια, το ένζυμο Ε1(ubiquitin-activating enzyme) σχηματίζει έναν θειοεστερικό δεσμό ανάμεσα στην ενεργό κυστεΐνη του και την καρβοξυτελική γλυκίνη της ουβικιτίνης. Το στάδιο αυτό απαιτεί κατανάλωση ενέργειας υπό μορφή ΑΤΡ και έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της ουβικιτίνης. Η ενεργοποιημένη ουβικιτίνη 9

μεταφέρεται σε ένα άλλο ένζυμο, το Ε2 (ubiquitin-conjucating enzyme), σχηματίζοντας έναν Ε2-θειοεστέρα ουβικιτίνης. Παρουσία της Ε3 λιγάσης (ubiquitin-protein ligase) η ουβικιτίνη προσαρτάται τελικά στην πρωτεΐνηστόχο, σχηματίζοντας ισοπεπτιδικό δεσμό μεταξύ του καρβοξυτελικού της άκρου και της ε-αμινο ομάδας ενός υπολείμματος λυσίνης της πρωτεΐνηςστόχο. Ο ρόλος της Ε3 λιγάσης είναι να επιταχύνει την μεταφορά της ουβικιτίνης στην πρωτεΐνη-στόχο (εικόνα 2). Εικόνα 2: Το μονοπάτι της ουβικουϊτινιλίωσης (Massoumi and Paus, 2007:1207). Η ουβικιτινίωση μπορεί να τροποποιήσει μια πρωτεΐνη με την προσθήκη είτε ενός μορίου ουβικιτίνης (monoubiquitination) είτε μιας αλυσίδας πολυ-ουβικιτίνης (polyubiquitination) είτε πολλαπλής προσθήκης απλών μορίων ουβικιτίνης σε αρκετά αμινοξέα λυσίνης (multiubiquitination). Η πολυ-ουβικιτινίωση είναι δυνατή επειδή η ουβικιτίνη περιέχει πολλά υπολείμματα λυσίνης (Κ6, Κ11, Κ27, Κ29, Κ33, Κ48, Κ63) τα οποία χρησιμοποιούνται για να επιμηκύνουν τις αλυσίδες ουβικιτίνης. Η πολυουβικιτινίωση ελέγχει την ημίσεια ζωή μιας πρωτεΐνης και κατά συνέπεια διασφαλίζει την περιοδική ρύθμιση ενός μεγάλου αριθμού διαδικασιών μέσα στο κύτταρο. Σύνδεση μιας πρωτεΐνης με ουβικιτίνη μέσω της λιγάσης Κ48 10

δίνει σήμα για αποδόμηση της πρωτεΐνης στα πρωτεοσώματα. Αντίθετα, σήμανση της μέσω της λιγάσης Κ63 οδηγεί σε μια ποικιλία γεγονότων όπως, την εσωτερικοποίησή της μεσω ενδοκύτωσης, τον σχηματισμό πρωτεϊνικών συμπλόκων, την επιδιόρθωση του DNA, την ενεργοποίηση των κινασών κ.α. Η πρωτεΐνη CYLD έχει την ικανότητα να αφαιρεί εκλεκτικά αλυσίδες ουβικιτίνης συνδεδεμένες με λυσίνες Κ63 από διάφορα υποστρώματα. Τα πρώτα υποστρώματα στόχοι της CYLD βρέθηκαν ότι ήταν οι πρωτεΐνες TRAF-2 και TRAF-6 (tumor necrosis factor-tnf receptor associated factors). Η αφαίρεση αλυσίδων ουβικιτίνης από τις TRAF-2 και TRAF-6 εξασθενίζει την επαγωγή από τον TNF-a του NF-κB μονοπατιού μεταγωγής σήματος και μπορεί να οδηγήσει σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο. Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί αρκετές πρωτεΐνες στόχοι της CYLD, η από-ουβικιτινίωση των οποίων έχει ως αποτέλεσμα τη ρύθμιση της μεταγωγής σήματος μέσω διαφόρων μονοπατιών και τον έλεγχο πολλών σημαντικών βιολογικών φαινομένων μέσα στο κύτταρο (Sun SC, 2009)(πίνακας 1). Ο τρόπος με τον οποίο η πρωτεΐνη CYLD αναγνωρίζει και συνδέεται με πολλαπλά υποστρώματα δεν είναι γνωστός. Έχει προταθεί ότι η σύνδεση της με κάποια από αυτά γίνεται έμμεσα μέσω προσαρμοστών (adaptors). Δυο πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η πρωτεΐνη ρ62, η οποία λέγεται και sequestosome 1, συνδέεται στη CYLD και τη στρατολογεί στην TRAF6. Αν η ρ62 στρατολογεί τη CYLD και σε άλλα υποστρώματα δεν έχει μελετηθεί. Πάντως έχει βρεθεί ότι το συστατικό ΝΕΜΟ συνδέεται άμεσα με την πρωτεΐνη CYLD και τη συνδέει με μια ποικιλία ρυθμιστών της ΙΚΚ όπως η RIP1 και η TRAF2. Θα ήταν ενδιαφέρον να μελετηθεί το κατά πόσο η σύνδεση της CYLD με τα συστατικά του ΙΚΚ είναι ανεξάρτητη από το ΝΕΜΟ. Είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι το ΝΕΜΟ και η πρωτεΐνη ρ62 έχουν περιοχές σύνδεσης με ουβικιτίνη (Jin et al, 2008; Wooten et al, 2008). 11

Πρωτεΐνες- Μονοπάτι μεταγωγής Βιολογικές διαδικασίες Στόχοι σήματος TRAF2 NF-kB,JNK Απόπτωση TRAF6 NF-kB, JNK,p38 Απόπτωση, φλεγμονή TRAF7 NF-kB,p38 Φλεγμονή ΝΕΜΟ NF-kB Απόπτωση TRIP NF-kB Απόπτωση Bcl3 NF-kB Πολλαπλασιασμός, ογκογένεση Tak1 NF-kB, JNK, p38 Ενεργοποίηση Τ-λεμφοκυττάρων? NF-kB Ενεργοποίηση Β-λεμφοκυττάρων Lck TCR Ανάπτυξη θυμοκυττάρων RIP NF-kB Σπερματογέννεση RIG-I IKKi/TBK-1 Αντιϊκή απάντηση Plk Κυτταρικός κύκλος Είσοδος στην μίτωση TRPA1 ασβέστιο Λειτουργία καναλιού Πίνακας 1: Οι πρωτεΐνες στόχοι του γονιδίου Cyld, τα μονοπάτια μεταγωγής σήματος που ενεργοποιούνται και οι βιολογικές διαδικασίες στις οποίες συμμετέχουν. Επίσης η πρωτεΐνη CYLD περιέχει δυο συντηρημένες περιοχές πλούσιες σε προλίνη, οι οποίες θα ήταν δυνατόν να μεσολαβούν στην αλληλεπίδραση με πρωτεΐνες που περιέχουν περιοχές SH3ή WW. Αν η πρωτεΐνη CYLD αλληλεπιδρά με παρόμοιες πρωτεΐνες δεν είναι γνωστό. Παρόλα αυτά, η τριτοταγής δομή της τρίτης CAP-GLY περιοχής είναι παρόμοια με αυτήν μιας SH3 περιοχής και είναι υπεύθυνη για την σύνδεση της CYLD με την πλούσια σε προλίνη περιοχή της πρωτεΐνης ΝΕΜΟ (Saito et al, 2004). Είναι ενδιαφέρον ότι η πρωτεΐνη CYLD περιέχει και τις δυο αυτές περιοχές καθώς θα μπορούσε να αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες-στόχους που περιέχουν είτε SH3 περιοχές είτε μοτίβα πλούσια σε προλίνη (εικόνα 3)(Massoumi & Paus, 2007; Courtois G. 2008). 12

Εικόνα 3: Η δομή της πρωτεΐνης CYLD. Το καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης αποτελείται από ένα καταλυτικό κέντρο αποουβικιτινάσης με μια εσωτερική περιοχή Β-κουτιού με μορφή δακτύλων ψευδαργύρου. Το αμινοτελικό άκρο έχει τρεις CAP- Gly περιοχές, η τρίτη εκ των οποίων περιέχει την περιοχή σύνδεσης με τη πρωτεΐνη ΝΕΜΟ, και δυο περιοχές πλούσιες σε προλίνη. Η CYLD περιέχει επίσης μια περιοχή σύνδεσης με την TRAF2 και μια θέση φωσφορυλίωσης. (Sun SC, 2009:7) Οι πιο συχνές μεταλλάξεις, (αντιστοιχούν περίπου στο 60%), έχουν βρεθεί μεταξύ των εξονίων 16-18 και στο εξόνιο 20, ενώ μεταλλάξεις δεν έχουν διαπιστωθεί στην αμινο-τελική περιοχή του γονιδίου που κωδικοποιεί τις δυο πρώτες CAP-GLY περιοχές.. Η εμφάνιση μεταλλάξεων κυρίως στην καρβοξυτελική περιοχή φανερώνει την σπουδαιότητα των UCH περιοχών στην ογκοκατασταλτική δράση του γονιδίου και την εμφάνιση όγκων σε απώλεια της. Το γονίδιο Cyld κωδικοποιεί για πρωτεΐνη με πιθανή ή τεκμηριωμένη δράση αποουβικιτινάσης και σε άλλα είδη πέρα από τον άνθρωπο, όπως στους ποντικούς, στις μύγες (Drosophila melanogaster) και στους νηματώδεις σκώληκες (Caenorhabditis elegans). Το γονίδιο παρουσιάζει 95% ομολογία ανάμεσα στον άνθρωπο και στον ποντικό, ενώ στο C.elegans εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε όλα τα στάδια της ανάπτυξης και έχουν βρεθεί δυο διαφορετικά mrna εξαιτίας διαφορετικού ματίσματος (Kamath et al, 2003; Sönnichsen et al, 2005). Στην D.melanogaster το γονίδιο Cyld παρουσιάζει περίπου 50% ομολογία με αυτό του ανθρώπου καθώς και παρόμοια δομή οργάνωσης. Έχουν εντοπιστεί πέντε διαφορετικά μετάγραφα του Cyld σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια και σε όλα τα μέρη του σώματος στην ενήλικη δροσόφιλα. Απάλειψη του γονιδίου Cyld στην δροσόφιλα έχει ως αποτέλεσμα αύξηση στα επιπέδα των τριγλυκεριδίων, αλλαγή της κατανομής λίπους στο σώμα και επιβίωση κάτω από συνθήκες ασιτίας. Επίσης χαμηλά επίπεδα 13

στην έκφραση του Cyld οδηγούν σε μειωμένη αντίσταση στις βακτηριακές λοιμώξεις (Tsichritzis et al, 2007) 14

1.3 Σηματοδοτικά μονοπάτια και CYLD 1.3.1 Η πρωτεΐνη CYLD είναι αρνητικός ρυθμιστής του NF-κB Ο μεταγραφικός παράγοντας NF-κB (nuclear factor kappa enhancher binding protein) ελέγχει πολλές κυτταρικές διεργασίες, περιλαμβανομένων της ανοσίας, της φλεγμονής και της απόπτωσης καθώς επίσης και άλλων γενετικών προγραμμάτων που είναι βασικά για την κυτταρική αύξηση και επιβίωση. Είναι ένας διμερής μεταγραφικός παράγοντας που βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα και έχει μια συντηρημένη περιοχή RHD (REL-homology domain), η οποία είναι υπεύθυνη για τη σύνδεση στο DNA, το διμερισμό, τη μετατόπιση στον πυρήνα και την αλληλεπίδραση με τις πρωτεΐνες ΙκΒ. Οι πρωτεΐνες ΙκΒ, περιλαμβανομένων των ΙκΒα, β και ε, συνδέονται στο NF-κB μέσω επαναλήψεων αγκυρίνης, παρεμποδίζουν την μετατόπισή του στον πυρήνα και συνεπώς παρεμποδίζουν τη μεταγραφική δράση του. Υπάρχουν πέντε γονίδια της οικογένειας NF-κB/REL, που δημιουργούν επτά πρωτεΐνες, τις ρ105, ρ100, ρ50, ρ52, REL-A, c-rel και REL-B. Το πρωτότυπο μέλος της οικογένειας, το σύμπλοκο NF-κB, αποτελείται από τις πρωτεΐνες ρ52 και REL-A. Στο κανονικό μονοπάτι μεταγωγής σήματος, που είναι και το κυρίαρχο, τα διεγερμένα κύτταρα από τον νεκρωτικό παράγοντα όγκων, TNF-α (tumor necrosis factor) ή την ιντερλευκίνη-1β (IL-1β), ενεργοποιούν το σύμπλοκο κινάσης σερίνης/θρεονίνης ΙΚΚ. Το σύμπλοκο αυτό αποτελείται από τις υπομονάδες ΙΚΚα και ΙΚΚβ και τη ρυθμιστική υπομονάδα ΝΕΜΟ. Πιο συγκεκριμένα ενεργοποιούνται οι TRAF2 και TRAF6 αντίστοιχα, υφίστανται προσθήκη μορίων ουβικιτίνης, ενεργοποιούν στη συνέχεια την κινάση ΤΑΚ1, η οποία φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί την ΙΚΚβ. Η ΙΚΚβ φωσφορυλιώνει τις πρωτεΐνες ΙκΒ επιτρέποντας έτσι την προσθήκη μορίων ουβικιτίνης σε αυτές και την μετέπειτα αποικοδόμησή τους στα πρωτεοσώματα. Με την αποικοδόμηση της ΙκΒ απελευθερώνεται ο NF-κB, που ήταν συνδεδεμένος με αυτήν, μετατοπίζεται στον πυρήνα και ενεργοποιεί τα γονίδια-στόχους. 15

Το μη κανονικό μονοπάτι λειτουργεί κυρίως στα Β κύτταρα, ως απόκριση στη διέγερση μιας υποομάδας υποδοχέων TNFRs, από διάφορα μόρια όπως BAFF και CD40. Η διέγερση των TNFRs ενεργοποιεί μια κινάση, την ΝΙΚ (NF-kB-inducing kinase), η οποία ενεργοποιεί με τη σειρά της την ΙΚΚα. Η τελευταία φωσφορυλιώνει την πρόδρομη μορφή ρ100 του NF-κB σε δυο καρβοξυτελικά αμινοξέα σερίνης επιτρέποντας την προσθήκη μορίων ουβικιτίντης. Οδηγείται στο πρωτεάσωμα, όπου πρωτεολύεται μερικώς με αποτέλεσμα την δημιουργία της ρ52. Το σύμπλοκο NF-κB, που αποτελείται από τις υπομονάδες ρ52 και REL-B, μετατοπίζεται στον πυρήνα και ενεργοποιεί γονίδια-στόχους (εικόνα 4) (Θωμόπουλος, 2006:594-596). Εικόνα 4: Ρύθμιση της ενεργοποίησης του NF-κB μέσω κανονικού και μη κανονικού μονοπατιού από το Cyld (Sun SC, 2009:3). Σε πάρα πολλές μελέτες έχει αποδειχτεί ο ρόλος του Cyld ως αρνητικού ρυθμιστή του NF-κB, καθώς αναστολή του Cyld είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων του NF-κB και αντίστροφα υπερέκφραση του Cyld την μειωμένη ενεργοποίηση του NF-κB. Η πρωτεΐνη CYLD έχει την ικανότητα να απο-ουβικιτινιώνει τις περισσότερες από τις 16

πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην ενεργοποίηση του NF-κB, όπως το ΝΕΜΟ, τις πρωτεΐνες TRAF2, TRAF6, Tak1 και RIP1. Η αφαίρεση αλυσίδων ουβικιτίνης από τα παραπάνω υποστρώματα έχει ως αποτέλεσμα είτε την μη ενεργοποίηση των πρωτεϊνών είτε την αποδόμηση τους στα πρωτεοσώματα, παρεμποδίζοντας τελείως την ενεργοποίηση του NF-κB, ανοδικά της ΙΚΚ. Συμπεραίνεται λοιπόν, ότι η πρωτεΐνη CYLD είναι σημαντικός ρυθμιστής του μονοπατιού μεταγωγής σήματος του NF-κB (Brummelkamp et al,2003; Kovalenko et al, 2003). 1.3.2 CYLD και JNK σηματοδοτικό μονοπάτι Οι κινάσες ΜΑΡΚ αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/θρεονίνης με σημαντική λειτουργία ως διαμεσολαβητές σε κυτταρικές αποκρίσεις μετά από την επίδραση διαφόρων εξωκυτταρικών διεγέρσεων. Χωρίζονται σε δυο ομάδες, αυτές (ERKs) που ενεργοποιούνται από αναπτυξιακούς παράγοντες και αυτές που ενεργοποιούνται από κυτταρικό πλήγμα. Οι δεύτερες ονομάζονται SAPKs (stress-activated protein kinases) και περιλαμβάνουν τις κινάσες JNK1-3 (c-jun aminoterminal kinases), γνωστές και ως SAPK1a, b, c και τις ισομορφές της ρ38 ΜΑΡΚ. Το μονοπάτι μεταγωγής σήματος JNK περιλαμβάνει μια σειρά από κινάσες, οι οποίες φωσφορυλιώνονται διαδοχικά με αποτέλεσμα την μετατόπιση τελικά της JNK στον πυρήνα και την ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων. Είναι υπεύθυνο για μια σειρά διεργασίες του κυττάρου όπως ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση, η απόπτωση, η ανοσιακή απάντηση και αντιφλεγμονώδης απόκριση. Κατάλληλοι υποδοχείς του κυττάρου διεγείρονται κάτω από συνθήκες οξειδωτικού στρες, φλεγμονή κ.α ερεθισμάτων και ενεργοποιούν τις κινάσες ΜΑΡ4, οι οποίες ενεργοποιούν τις ΜΑΡ3 κινάσες, όπως τις ASK1, MLKs (MLK1, MLK2, MLK3), MEKK1, MEKK4 και TAK1. Αυτές στη συνέχεια ενεργοποιούν τις ΜΑΡ2 κινάσες(μκκ-4, ΜΚΚ-5, ΜΚΚ-6) με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της JNK και την μεταφορά της στον πυρήνα (εικόνα 5). 17

Εικόνα 5: Σηματοδοτικό μονοπάτι SAPK/JNK. (διαθέσιμο στο www.cellsignal.com/reference/pathway/sapk_jnk.html, 10/2009) Το γονίδιο Cyld έχει βρεθεί ότι ρυθμίζει αρνητικά το μονοπάτι μεταγωγής σήματος της JNK (Reiley et al, 2004). Καταστολή της έκφρασης του Cyld είχε σαν αποτέλεσμα την αυξημένη ενεργοποίηση του JNK μονοπατιού, μέσω της διέγερσης από διαφορετικούς υποδοχείς της ανοσίας όπως ο TNF-a, η ιντερλευκίνη IL-1, λιποπολυσακχαρίτες και έναν ανταγωνιστή του CD40. Η αυξημένη ενεργοποίηση του JNK μονοπατιού παρατηρήθηκε ειδικά στους υποδοχείς της ανοσίας (immune receptors) και όχι στους υποδοχείς του στρες, υποδηλώνοντας τον ρόλο του Cyld στη διέγερση της JNK μέσω ανοσίας. Το Cyld ρυθμίζει αρνητικά την ενεργοποίηση της κινάσης ΜΚΚ7. Η ΜΚΚ7 διεγείρεται από κυτοκίνες που παράγονται σε φλεγμονές και μεσολαβεί στην ενεργοποίηση της JNK. Επίσης έχει βρεθεί ότι η προσθήκη αλυσίδων ουβικιτίνης στην TRAF2 έχει σαν αποτέλεσμα την 18

διέγερση του TNF-a και την ενεργοποίηση του μονοπατιού JNK. Είναι επίσης γνωστό ότι η πρωτεΐνη CYLD συνδέεται με την TRAF2 και αφαιρεί αλυσίδες ουβικιτίνης, εμποδίζοντας έμμεσα την ενεργοποίηση της JNK. Παρόμοια η TRAF6 με την προσθήκη μορίων ουβικιτίνης στο μόριο της ενεργοποιεί την μεταγωγή σήματος μέσω των υποδοχέων ιντερλευκίνης IL-1 και των υποδοχέων για τους λιποπολυσακχαρίτες (toll-like receptor 4, LPS). Η TRAF6 αποτελεί υπόστρωμα για τη CYLD με αποτέλεσμα την μη ενεργοποίησή της και κατά συνέπεια την αρνητική ρύθμιση του JNK μονοπατιού. 1.3.3 CYLD-Snail σηματοδοτικό μονοπάτι Σε μια πρόσφατη εργασία για το κακόηθες μελάνομα προτάθηκε ένα νέο σηματοδοτικό μονοπάτι που συνδέει το Cyld με έναν μεταγραφικό παράγοντα, τον Snail. Συγκεκριμένα στα κύτταρα με κακόηθες μελάνωμα, βρέθηκε ότι ο μεταγραφικός παράγοντας Snail, αθροίζεται στον υποκινητή του Cyld, εμποδίζοντας την μεταγραφή του. Η πρωτεΐνη CYLD φυσιολογικά αφαιρεί αλυσίδες ουβικιτίνης από το ογκογονίδιο Bcl-3, εμποδίζοντας την μετατόπισή του στον πυρήνα και την σύνδεσή του με τις υπομονάδες του NF-κB ρ50 και ρ52 και τον υποκινητή της κυκλίνης-d και της Ν-κατιερίνης. Με την αναστολή της έκφρασης του Cyld, η Bbl-3 ενεργοποιείται, δίνοντας το σήμα για έναρξη μεταγραφής των παραπάνω γονιδίων στόχων (Massoumi et al, 2009). Σημαντικό στάδιο στην συνεχή έκφραση του Snail, αποτελεί η ενεργοποίηση της ERK κινάσης από τις κινάσες Raf και Ras. Στα κύτταρα με μελάνομα υπάρχει συνεχής ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού Ras-Raf-MEK-ERK (ΜΑΡΚ), με συνέπεια αυξημένα επίπεδα του μεταγραφικού παράγοντα Snail, ο οποίος επάγει τον συνεχή πολλαπλασιασμό και μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, μέσω της καταστολής του Cyld (εικόνα 6). 19

Εικόνα 6: Ρύθμιση πολλαπλασιασμού από το Snail, καταστολή του Cyld (Massoumi et al, 2009;229). 1.4 Φυσιολογικές λειτουργίες της πρωτεΐνης CYLD Ο ιδιαίτερος ρόλος της CYLD στην ρύθμιση του μεταγραφικού παράγοντα NFκB υποδηλώνει την συμμετοχή της συγκεκριμένης από-ουβικιτινάσης σε σημαντικές βιολογικές διεργασίες. Αυτή η παραδοχή μελετήθηκε χρησιμοποιώντας ζωικά μοντέλα. Πολλές ερευνητικές ομάδες δημιούργησαν ποντίκια με απώλεια του γονιδίου Cyld και ποντίκια με μια παραλλαγή του γονιδίου στην οποία έλειπαν τα εξόνια 7 και 8, τα οποία κωδικοποιούν για την καταλυτική περιοχή, με συνέπεια την απώλεια της από-ουβικουϊτινίωσης. 1.4.1 Ανοσοαπάντηση και φλεγμονή Μια από τις χαρακτηριστικές λειτουργίες της CYLD είναι η ρύθμιση της ανοσιακής απάντησης και η φλεγμονή (Sun SC, 2008). Σε ποντίκια με απουσία του γονιδίου Cyld παρατηρήθηκαν ανωμαλίες στην ανάπτυξη των θυμοκυττάρων και στην ενεργοποίηση των Τ-λεμφοκυττάρων. Ως αποτέλεσμα παρουσίασαν φλεγμονή στο παχύ έντερο και συμπτώματα αυτοανοσίας (Zhang et al, 2006; Reiley et al, 2006; 2007). Παρόμοια, σε ποντίκια με 20

έλλειψη του Cyld και ποντίκια με παραλλαγή του γονιδίου στην οποία έλειπαν τα εξόνια 7 και 8, παρατηρήθηκε αυτόματη ενεργοποίηση των Β- λεμφοκυττάρων και υπερπλασία (Ηövelmeyer et al, 2007). Σημαντικός είναι ο ρόλος της CYLD στην ρύθμιση της έμφυτης ανοσίας. Ο στρεπτόκοκκο S.pneumoniae είναι ένα παθογόνο βακτήριο που εποικίζει το ανώτερο αναπνευστικό σύστημα προκαλώντας σοβαρές ασθένειες όπως μηνιγγίτιδα, πνευμονία κ.α. Λίγα πράγματα είναι γνωστά για το μοριακό μηχανισμό με τον οποίο επάγει την φλεγμονή, βρέθηκε όμως ότι ενεργοποιεί το σηματοδοτικό μονοπάτι του πυρηνικού παράγοντα NFAT (nuclear factor of activated T cells) και επάγει τους φλεγμονώσεις διαμεσολαβητές. Η επαγωγή του NFAT σηματοδοτικού μονοπατιού επιτυγχάνεται μέσω του Ca ++ -καλσινευρίνη και της κινάσης ΤΑΚ1. Διαπιστώθηκε ότι η πρωτεΐνη CYLD απομακρύνει αλυσίδες από την κινάση ΤΑΚ1 ρυθμίζοντας αρνητικά την επαγωγή του NFAT σηματοδοτικού μηχανισμού (Koga et al, 2008). Η απορρύθμιση της κινάσης ΤΑΚ1 απουσία λειτουργικής CYLD έχει σαν αποτέλεσμα την υπερενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB και του JNK στα Τ-λεμφοκύτταρα (εικόνα 7). Συμπερασματικά, προκύπτει ότι η ΤΑΚ1 κινάση είναι κοινός στόχος της CYLD στην έμφυτη και προσαρμοστική ανοσιακή απάντηση. Ένας γνωστός στόχος της ΤΑΚ1 κινάσης, η πρωτεΐνη ρ38, επίσης ρυθμίζεται αρνητικά από την πρωτεΐνη CYLD κατά τη μόλυνση με στρεπτόκοκκο, προκαλώντας την θνησιμότητα από το μικρόβιο (Lim et al, 2007). Δυο πρόσφατες μελέτες, έδειξαν ότι η πρωτεΐνη CYLD ρυθμίζει αρνητικά την παραγωγή ιντερφερόνης τύπου Ι, η οποία επάγεται από ιούς. Αυτή η λειτουργία της CYLD σχετίζεται με την φυσιολογική αλληλεπίδρασή της με έναν ενδοκυτταρικό RNA ανιχνευτή, τον RIG-I (retinoic acid-induced gene) και την αρνητική ρύθμιση των σχετιζόμενων με την ΙΚΚ κινασών, ΙΚΚε και ΤΒΚ1 (Friedman et al, 2008; Zhang et al, 2008). 21

Εικόνα 7: Σχηματική απεικόνιση του μηχανισμού δράσης της CYLD στην αρνητική ρύθμιση της επαγωγής του NFAT από τον S.pneumoniae (Koga et al, 2008;12552). 1.4.2 Απόπτωση γαμετών και σπερματογένεση Η σπερματογένεση είναι μια αυστηρά ελεγχόμενη βιολογική διαδικασία, η οποία περιλαμβάνει διαδοχικές διαφοροποιήσεις των αρσενικών γεννητικών βλαστικών κυττάρων σε ώριμα τελικά σπερματοζωάρια. Ένα ιδιαίτερα χαρακτηριστικό στάδιο στην σπερματογένεση είναι μια πρώιμη απόπτωση των αρσενικών γαμετών, απαραίτητη για την διατήρηση της ισορροπίας στον αριθμό των γεννητικών κυττάρων και των υποστηρικτικών κυττάρων Sertoli (Rodriguez et al, 1997). Στα αρσενικά ποντίκια με καταστολή του γονιδίου Cyld διαπιστώθηκε ότι το στάδιο της πρώιμης απόπτωσης των γαμετών ελαττώθηκε σημαντικά με αποτέλεσμα να διακοπεί η σπερματογένεση σε ένα ώψιμο στάδιο (Wright et al, 2007). Τα γαμετικά κύτταρα φαίνεται ότι διεγείρονται συνεχώς από τον μεταγραφικό παράγοντα NF-κB, η ενεργοποίηση του οποίου ρυθμίζεται από την πρωτεΐνη CYLD. Έτσι, σε κάποιο αρχικό στάδιο η CYLD ρυθμίζει αρνητικά τον NF-κB, σταματά η διέγερση των γαμετών και τα κύτταρα οδηγούνται στην απόπτωση. Στα συγκεκριμένα πειραματόζωα διαπιστώθηκε 22

η συνεχής ενεργοποίηση του NF-κB εξαιτίας της απουσίας της CYLD, καθώς και υψηλά επίπεδα αντι-αποπτωτικών γονιδίων, όπως το Bcl-2. Στα γεννητικά κύτταρα ένας από τους σημαντικούς στόχους της CYLD είναι η RIP1. Η ουβικουϊτινίωση της RIP1 προάγει την ενεργοποίηση του NF-κB, αλλά επίσης εμποδίζει την πρωτεΐνη να συνδεθεί με την κασπάση 8 και να ξεκινήσει την απόπτωση. Παρατηρήθηκε, ότι σε ποντίκια με έλλειψη του Cyld, η πρωτεΐνη RIP1 ουβικουϊτινώνεται συνεχώς, με αποτέλεσμα να αναστέλλει την απόπτωση των γαμετικών κυττάρων με την συνεχή ενεργοποίηση του NF-κB, αλλά και με την αναστολή του σηματοδοτικού μονοπατιού των κασπασών. 1.4.3 Οστεογένεση και ομοιόσταση οστών Η ομοιόσταση των οστών ελέγχεται αυστηρά από την ισορροπία μεταξύ της δημιουργίας οστίτη ιστού από τους οστεοβλάστες και την καταστροφή του από τους οστεοκλάστες. Η κύρια αιτία για μια σειρά παθήσεις με εκφυλιστικές αλλοιώσεις των οστών, όπως η οστεοπόρωση, η ρευματοειδής αρθρίτιδα και η ασθένεια Paget στα οστά, είναι η μη σωστή ρύθμιση της δραστηριότητας των οστεοκλαστών. Η διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών κυττάρων και η ανάπτυξη των οστεοκλαστών καθορίζεται από την μεταγωγή σήματος μέσω μιας πρωτεΐνης της οικογένειας των TNFR, της RANK. Η δέσμευση της RANK από τον συνδέτη της ενεργοποιεί μια Κ63 ειδική Ε3 λιγάση ουβικιτίνης, την TRAF6, η οποία αυτό-ουβικιτινώνεται και στη συνέχεια μεσολαβεί στην ουβικιτινίωση πρωτεϊνών στόχων όπως το συστατικό ΝΕΜΟ. Αυτά τα γεγονότα είναι σημαντικά για την ενεργοποίηση των ΙΚΚ και του μεταγραφικού παράγοντα NF-kB. Η πρωτεΐνη CYLD εμπλέκεται στην αναδραστική αναστολή του RANK μονοπατιού. Η δημιουργία των οστεοκλαστών, η οποία όπως αναφέρθηκε προκαλείται από την ενεργοποίηση του RANΚ, επάγει δραστικά την έκφραση της CYLD, η οποία αθροίζεται, συνδέεται με μια πρωτεΐνηπροσαρμοστή, την ρ62 και μέσω αυτής τελικά με την TRAF6. Η τελευταία απο-ουβικιτινώνεται αναστέλλοντας το σηματοδοτικό μονοπάτι της RANK και την ενεργοποίηση του NF-κB. Συνεπώς, απώλεια της πρωτεΐνης CYLD έχει ως αποτέλεσμα την υπερπαραγωγή οστεοκλαστών και την σοβαρή απώλεια οστικής μάζας ή ακόμη και οστεοπόρωσης (Jin et al, 2008; Sun SC, 2009). 23

1.4.4 Κυτταρικός κύκλος Σε μελέτες που έγιναν σε κυτταροκαλλιέργειες (Stegmeier et al, 2007) αποκαλύφθηκε ένας πιθανός ρόλος του γονιδίου Cyld στην πορεία του κυτταρικού κύκλου. Διαπιστώθηκε ότι τα κύτταρα που εμφάνιζαν μειωμένη έκφραση του Cyld καθυστερούσαν την είσοδο τους στη μίτωση. Συγκεκριμένα παρατηρήθηκε μια μικρή καθυστέρηση κατά την μετάβαση από την φάση G1 στη S φάση, κανονική διάρκεια της S φάσης αλλά καθυστέρηση στην άθροιση της φωσφο-ιστόνης ΡΗ3 και στην φωσφορυλίωση της Cdc25c φωσφατάσης, θετικού ρυθμιστή της μίτωσης. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης CYLD ήταν ελαττωμένα καθώς τα κύτταρα έβγαιναν από την μίτωση, παρέμεναν χαμηλά κατά την φάση G1 της μεσόφασης, ενώ αυξάνονταν στην φάση S. Η σημασία της CYLD στην είσοδο των κυττάρων στην μίτωση εξαρτάται από την ικανότητα του για ουβικιτινίωση αλλά είναι ανεξάρτητη από την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB. Παρόμοια καθυστέρηση στην φωσφορυλίωση της Cdc25c και στην αποδόμηση της Emi1 εμφάνισαν κύτταρα με ελαττωμένη την Plk1, μια κινάση σερίνης/θρεονίνης με ιδιαίτερη σημασία για την μιτωτική διαίρεση του κυττάρου. Βρέθηκε ότι η CYLD αλληλεπιδρά με την Plk1 και πιθανά να ρυθμίζει θετικά την λειτουργία της, απομακρύνοντας αλυσίδες ουβικιτίνης συνδεμένες με την Κ63 λιγάση από την ίδια καθώς και από θετικούς ρυθμιστές της. Παρόλα αυτά, χρειάζεται να διερευνηθεί περαιτέρω ο ρόλος της ουβικιτινίωσης Κ63 της Plk1 και ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο η πρωτεΐνη CYLD ρυθμίζει την μίτωση. 1.4.5 Κυτταρική μετανάστευση Σε πειράματα που έγιναν προτάθηκε μια ακόμη λειτουργία της CYLD στην ρύθμιση της δυναμικής των μικροσωληνίσκων και της κυτταρικής μετανάστευσης (Gao et al, 2008). Ο κυτοσκελετός των μικροσωλινίσκων παίζει σημαντικό ρόλο σε πολλές κυτταρικές λειτουργίες όπως το σχήμα του κυττάρου, η ενδοκυτταρική κυκλοφορία, η κυτταρική διαίρεση και η κυτταρική κινητικότητα. Η δομή και λειτουργία των μικροσωλινίσκων ρυθμίζονται εξαίσια από πολλές πρωτεΐνες που συνδέονται μαζί τους. Σε αυτές περιλαμβάνονται πρωτεΐνες που ρυθμίζουν την συγκρότηση και την οργάνωση των 24

μικροσωληνίσκων και κινητικές πρωτεΐνες (motor proteins) που μεσολαβούν στη μεταφορά οργανιδίων και κυστιδίων. Οι πρωτεΐνες αυτές συνδέονται με τους μικροσωληνίσκους είτε στο τέλος τους είτε έξω από το τοίχωμά τους είτε με την διαλυτή τομπουλίνη. Για τη σύνδεση αυτή οι αντίστοιχες πρωτεΐνες έχουν διάφορα δομικά μοτίβα όπως περιοχή ομόλογη με την καλπονίνη ή CAP-Gly περιοχές. Οι CAP-Gly περιοχές διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην δυναμική των μικροσωληνίσκων. Η πρωτεΐνη CYLD είναι η μόνη πρωτεΐνη που έχει βρεθεί ως τώρα, η οποία περιέχει τρεις τέτοιες περιοχές καθώς οι περισσότερες CAP-Gly πρωτεΐνες περιέχουν μία ή δυο. Στην συγκεκριμένη έρευνα διαπιστώθηκε ότι η CYLD συνδέεται με τους μικροσωληνίσκους και με την α-τουμπουλίνη στα κύτταρα και in vitro. Βρέθηκε μάλιστα ότι κυρίως η πρώτη CAP-Gly περιοχή είναι υπεύθυνη για την σύνδεση. Επίσης φαίνεται ότι προάγει την συγκρότηση και την σταθερότητα τους καθώς σε καλλιέργεια κυττάρων όπου έγινε καταστολή της CYLD με επίδραση με nocodazole διαπιστώθηκε καθυστέρηση στην επαναδημιουργία των μικροσωληνίσκων. Επιπλέον, η CYLD προάγει τον πολυμερισμό της τομπουλίνης στους μικροσωληνίσκους καθιερώνοντας το σε έναν καινούργιο ρυθμιστή της δυναμικής των μικροσωληνίσκων. Με την δοκιμασία επούλωσης πληγής (wound healing assay) μελετήθηκε ο ρόλος της CYLD στην κυτταρική μετανάστευση. Σε κύτταρα με πολύ χαμηλή έκφραση της CYLD παρατηρήθηκε καθυστέρηση στην επούλωση του κενού και μάλιστα στα κύτταρα όπου έλλειπε η πρώτη CAP- Gly περιοχή. Διαπιστώθηκε λοιπόν, ότι η πρωτεΐνη CYLD διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική μετανάστευση και ότι η πρώτη CAP-Gly περιοχή του είναι κύρια υπεύθυνη για την συγκεκριμένη λειτουργία. 1.5 CYLD και καρκίνος του μαστού Η σχέση του γονιδίου Cyld με τον καρκίνο του μαστού μελετήθηκε σε δυο εργασίες που έγιναν σε κυτταρικές σειρές, επιβεβαιώνοντας τον ρόλο του σαν ογκοκατασταλτικό γονίδιο αλλά και δίνοντας νέα στοιχεία για τον μηχανισμό ρύθμισής της δράσης αποουβικιτινάσης. 25

Πιο συγκεκριμένα σε μια καρκινική σειρά μαστού μελετήθηκε ο ρόλος του Cyld σε σχέση με το σύμπλοκο SWI/SNF, ένα πολυμερές σύμπλοκο που ρυθμίζει την γονιδιακή έκφραση με αναδιάταξη της δομής των νουκλεοσωμάτων (Wang et al, 2005). Το σύμπλοκο αποτελείται από μια BRG1 ή hbrm DNA εξαρτώμενη ΑΤΡάση και τους παράγοντες BAF250, 170, 155, 60, 57, 53 και BAF45. Ο ακριβής ρόλος των παραγόντων BAF δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως αλλά έχει βρεθεί ότι οι BAF60 και BAF57 μεσολαβούν στις αλληλεπιδράσεις με μεταγραφικούς ενεργοποιητές και καταστολείς. Μάλιστα μελέτες έχουν αποδείξει ότι o BAF57 μπορεί να μεσολαβήσει σε αλληλεπιδράσεις με ενεργοποιητές της μεταγραφής όπως c-myc και τους υποδοχείς οιστρογόνων αλλά και με καταστολής όπως οι msin3a/b και PRMT5 (Belandia et al, 2002; Pal et al, 2003). Στην κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού του επιθηλίου των πόρων ΒΤ549 η οποία είναι τριπλά αρνητική και δεν εκφράζει τον παράγοντα BAF57, έγινε επιμόλυνση με πλασμίδια που εκφράζουν τον παράγοντα ΒAF57 και μελετήθηκε στη συνέχεια η κυτταρική ανάπτυξη. Διαπιστώθηκε ομαλή μορφολογία των κυττάρων, διακοπή του κυτταρικού κύκλου και επαγωγή της απόπτωσης. Ο παράγων BAF57 επάγει την έκφραση του Cyld και μάλιστα συνδέεται άμεσα με την μεταγραφή του. Βρέθηκε ότι οι ΑΤΡάσες BRG1 και hbrm στρατολογούνται στην περιοχή του προαγωγέα του Cyld και πιθανόν η πρώτη να επάγει την μεταγραφή του και η δεύτερη την αποσιώπιση του. Η επαγωγή του Cyld έχει σαν αποτέλεσμα την αύξηση του ρυθμού απόπτωσης των κυττάρων. Η USP domain στο καρβοξυτελικό άκρο του Cyld που είναι υπεύθυνη για την δράση από-ουβικιτινάσης είναι υπεύθυνη και για την επαγωγή της απόπτωσης. Πολύ συχνά τα σηματοδοτικά μόρια υπόκεινται σε έλεγχο κατά την μεταγραφή και μετα-μεταφραστικό έλεγχο. Μέχρι τώρα πολύ λίγα είναι γνωστά για τον μηχανισμό ρύθμισης της αφαίρεσης αλυσίδων ουβικιτίνης τη CYLD. Μια πολύ πρόσφατη μελέτη (Hutti et al, 2009) αναδεικνύει την φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης CYLD από την κινάση ΙΚΚε ως μηχανισμό ρύθμισης της δράσης αποουβικιτινάσης της. Η κινάση ΙΚΚε είναι μια κινάση σερίνης/θρεονίνης, ανήκει στην οικογένεια των ΙΚΚ κινασών και συμμετέχει στα μονοπάτια μεταγωγής σήματος των ιντερφερόνών. Ειδικοί υποδοχείς (toll- 26

like receptors) συνδεδεμένοι με την κυτταρική μεμβράνη και ενδοκυτταρικοί υποδοχείς αναγνωρίζουν ιϊκά νουκλεϊκά οξέα, όπως dsrna, και ενεργοποιούν την ΙΚΚε κινάση. Στη συνέχεια η ΙΚΚε φωσφορυλιώνει τους παράγοντες IRF3 και IRF7 (interpheron response factors) επιτρέποντας την μετατόπισή τους στον πυρήνα και την πυροδότηση της μεταγραφής γονιδίων ειδικών με την απάντηση στην ιντερφερόνη τύπου Ι. Η κινάση ΙΚΚε ενεργοποιεί επίσης τον μεταγραφικό παράγοντα NF-κB. Είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι η ΙΚΚε έχει χαρακτηριστεί ως ογκοπρωτεϊνη καθώς έχει διαπιστωθεί υπερέκφρασή της σε καρκινώματα του μαστού και σε καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού (Boehm et al, 2007). Η ΙΚΚε βρέθηκε ότι φωσφορυλιώνει τη CYLD στη θέση Ser418 ελαττώνοντας την ικανότητά της πρωτεΐνης για απο-ουβικιτινίωση με συνέπεια την αύξηση της ενεργοποίησης του NF-κB. Επειδή όμως η CYLD συμμετέχει και σε άλλα σηματοδοτικά μονοπάτια ανεξάρτητα του NF-κB είναι πιθανόν να τα επηρεάζει και αυτά. Οι κινάσες IKKα και ΙΚΚβ επίσης φωσφορυλιώνουν την πρωτεΐνη CYLD (Reiley et al, 2005) στην ίδια θέση Ser418 ελαττώνοντας την ικανότητα για αποουβικιτινίωση, η ΙΚΚε όμως είναι πιο αποτελεσματική από τις παραπάνω κινάσες. Αν και χρειάζεται περαιτέρω μελέτη για τον πλήρη μηχανισμό με τον οποίο η ΙΚΚε και η πρωτεΐνη CYLD συμβάλλουν στον κυτταρικό μετασχηματισμό, οι παρατηρήσεις αυτές συνδέουν ένα ογκογονίδιο και ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο στην ρύθμιση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB. Χρειάζεται επίσης να μελετηθεί η κινάση ΙΚΚε και η ικανότητά της να φωσφορυλιώνει και άλλα υποστρώματα που εμπλέκονται στον κυτταρικό μετασχηματισμό. 27

2. ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΜΑΣΤΟΥ Ο καρκίνος του μαστού είναι ο πιο συχνός καρκίνος και η πρώτη αιτία θανάτου στις γυναίκες των αναπτυγμένων χωρών. Κάθε χρόνο πάνω από 1,200,000 γυναίκες νοσούν παγκοσμίως από καρκίνο του μαστού, αντιπροσωπεύοντας το 10-12 % του γυναικείου πληθυσμού και περίπου 500,000 είναι αυτές που καταλήγουν. Παρά τα αυξημένα ποσοστά του στις βιομηχανικές χώρες (1 στις 9 γυναίκες του Δυτικού ημισφαιρίου στη διάρκεια της ζωής της θα αναπτύξει καρκίνο μαστού) και στις λιγότερες αναπτυγμένες χώρες αρχίζουν να αυξάνονται τα περιστατικά γυναικών με τον συγκεκριμένο καρκίνο. Σε έρευνες μεταναστών γυναικών που μετακινήθηκαν από χώρες χαμηλού σε χώρες υψηλού κινδύνου διαπιστώθηκαν τα ίδια ποσοστά καρκίνου μαστού με την αντίστοιχη χώρα υποδοχής μετά από δυο γενιές. Τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν ότι οι διεθνείς διαφοροποιήσεις οφείλονται σε διαφορές του μακρο- και μικροπεριβάλλοντος και όχι σε γενετικούς παράγοντες (Tominaga S,1985; Ziegler et al, 1993; Benson et al, 2009). 2.1 Παράγοντες κινδύνου Υπάρχουν αρκετές πληροφορίες σχετικά με τους γενετικούς παράγοντες και τους παράγοντες που αφορούν στον τρόπο ζωής και επηρεάζουν τον κίνδυνο για καρκίνο του μαστού. Το οικογενειακό ιστορικό σε συγγενή πρώτου βαθμού αποτελεί έναν τεκμηριωμένο παράγοντα κινδύνου. Γυναίκες των οποίων η μητέρα ή η αδερφή είχε καρκίνο του μαστού έχουν έναν αυξημένο κίνδυνο της σε σχέση με αυτές των οποίων οι συγγενείς δεν έπασχαν από τη νόσο. Περίπου το 5-10% όλων των καρκίνων του μαστού μπορεί να αποδοθεί σε μεταλλάξεις υψηλής διαπεραστικότητας. Το ποσοστό αυτό μεταβάλλεται με την ηλικία και σε γυναίκες κάτω των 30 ετών φτάνει περίπου στο 1/3 των περιπτώσεων. Τα γονίδια BRAC1 και BRAC2 καθώς και μεταλλαγές υψηλής διαπεραστικότητας όπως αυτές των p53, CHEK2 και PTEN/MMAC1 ευθύνονται για σημαντικό ποσοστό του οικογενούς καρκίνου 28

του μαστού αλλά για μικρό ποσοστό του συνόλου των περιπτώσεων της νόσου (Baynes et al, 2007). Επίσης η πρώιμη εμμηναρχή κάτω των 12 ετών όπως και η καθυστερημένη εμμηνόπαυση άνω των 55 ετών αποτελούν παράγοντες αυξημένου κινδύνου. Μια κύηση σε μικρή ηλικία κάτω των 20 ετών παρέχει μια παρατεταμένη μακροχρόνια προστασία. Μια κύηση αυξάνει βραχυπρόθεσμα τον κίνδυνο αλλά τον μειώνει σημαντικά μακροπρόθεσμα, πιθανόν γιατί τα κύτταρα του μαστού γίνονται λιγότερο ευάλωτα στην διαδικασία καρκινογένεσης μετά από την τελική ιστολογική διαφοροποίηση που προκαλείται μετά από μία ή περισσότερες τελειόμηνες κυήσεις. Έτσι, όσο μικρότερη είναι η ηλικία της πρώτης κύησης τόσο πιο έντονη είναι η παρεχόμενη προστασία, ενώ αν η πρώτη εγκυμοσύνη γίνει σε ηλικία άνω των 35 ετών αυξάνει τον κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του μαστού επειδή η βραχυπρόθεσμη αύξηση του κινδύνου στην ηλικία αυτή υπερκαλύπτει την μετέπειτα μείωσή του. Οι αποβολές ή οι εκτρώσεις δεν φαίνεται να έχουν κάποια επίδραση στην εμφάνιση της νόσου, ενώ η ατεκνία αποτελεί σημαντικό παράγοντα κινδύνου. Ο θηλασμός παρέχει περιορισμένο βαθμό προστασίας κυρίως πριν την εμμηνόπαυση (Hankinson et al, 2004;Petrek et al, 1991; Brind et al, 1996). Όλες οι ενδογενείς ορμόνες που έχουν μελετηθεί σε μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες όπως η ολική και η ελεύθερη οιστραδιόλη, η οιστρόνη, ανδοστενεδιόνη, η δεϋδροεπιανδροστερόνη, η τεστοστερόνη και η προλακτίνη έχουν σχετιστεί με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του μαστού. Στις προεμμηνοπαυσιακές γυναίκες τα περιορισμένα δεδομένα λόγω της δυσκολίας εναρμονισμού των δειγματοληψιών με τον καταμήνιο κύκλο υποδεικνύουν αύξηση του κινδύνου σε αυξημένες τιμές οιστρογόνων και ινσουλινοειδούς αυξητικού παράγοντα 1(IGF-1) (Onland-Morek et al, 2003). Επίσης το μεγαλύτερο ύψος, η παχυσαρκία μετά την εμμηνόπαυση, η υψηλής πυκνότητα μαστογραφία αποτελούν παράγοντες κινδύνου καρκίνου του μαστού ενώ η ιονίζουσα ακτινοβολία και η κατανάλωση οινοπνεύματος συμβάλλουν στην ανάπτυξη του αλλά σε μικρότερο μέγεθος. Η πρόσφατη λήψη αντισυλληπτικών αυξάνει οριακά τον κίνδυνο ενώ αντίθετα η μακροχρόνια χρήση μετεμμηνοπαυσιακών οιστρογόνων κυρίως σε 29

συνδυασμό με προγεστερόνα συνεπάγεται σημαντική αύξηση του κινδύνου (Benson et al, 2009). Ένα προτεινόμενο αιτιολογικό πρότυπο του καρκίνου του μαστού παρουσίασαν η ερευνητική ομάδα των πανεπιστημίων Harvard και Karolinska το οποίο βασίζεται σε τρεις αρχές. Σύμφωνα με αυτό τα αυξημένα επίπεδα οιστρογόνων και ορμονών του συστήματος IGF κατά την περιγεννητική περίοδο προάγουν τον πολλαπλασιασμό των ειδικών μαζικού αδένα βλαστοκυττάρων του. Ο αριθμός των κυττάρων αυτών έχει σχέση με τη μάζα του μαζικού αδένα και αποτελεί σημαντικό προσδιοριστικό παράγοντα του κινδύνου ανάπτυξης καρκίνου του μαστού στην ενήλικη ζωή (Trichopoulos et al, 2005). 2.2 Ανατομία του μαστού Ο μαστός αποτελείται από λοβούς και πόρους. Κάθε μαστός έχει περίπου 15-20 λοβούς, που διακρίνονται σε πολλά μικρότερα τμήματα που ονομάζονται λόβια (εικόνα 8). Οι λοβοί και τα λόβια συνδέονται με λεπτούς αγωγούς, που ονομάζονται πόροι. Κάθε λόβιο διαθέτει έναν εκφορητικό πόρο. Όλοι οι εκφορητικοί πόροι δυγκεντρώνονται και εκβάλλουν στη θηλή. Γύρω από τη θηλή υπάρχει η θηλαία άλως, που έχει πολλούς σμηγματογόνους αδένες (Τσακρακλίδης, 1999). Κάθε μαστός διαθέτει επίσης αιμοφόρα αγγεία και λεμφαγγεία. Τα λεμφαγγεία μεταφέρουν τη λέμφο, ένα γαλακτώδες υγρό με λεμφοκύτταρα, πρωτεΐνες και λίπη, στους λεμφαδένες. Οι λεμφαδένες βρίσκονται διάσπαρτοι σε όλο το σώμα, συμβάλλουν στην αντιμετώπιση των λοιμώξεων και άλλων νοσημάτων. Ομάδες λεμφαδένων βρίσκονται στην μασχάλη, πάνω από την κλείδα, στο θωρακικό τοίχωμα και εντός του μαστού. 30

Εικόνα 8: Ανατομία του μαστού (διαθέσιμο στο www.mastology.gr/gr/anatomy.asp). 2.3 Ιστολογική ταξινόμηση του καρκίνου του μαστού Οι κύριες κατηγορίες του μαστού είναι δυο : α) το λοβιακό, που αναπτύσσεται στα λόβια β) το πορογενές, που αναπτύσσεται στους πόρους. Και οι δύο αυτές κατηγορίες διακρίνονται στο διηθητικό και μη διηθητικό (in situ) καρκίνωμα. Ο όρος μη διηθητικό ή προδιηθητικό καρκίνωμα αναφέρεται σε κακόηθες επιθηλιακό νεόπλασμα, τα κυτταρικά στοιχεία του οποίου δεν έχουν διασπάσει την κυτταρική μεμβράνη και κατά συνέπεια στερείται διηθητικής ανάπτυξης. Αναπτύσσεται στην τελική πορολοβιακή μονάδα, δηλαδή στο σημείο όπου οι μικροί πόροι επικοινωνούν με τις σωληναριακές δομές των λοβίων. Αν τα επιθηλιακά στοιχεία παρουσιάζουν μορφολογία πορογενή, ο ιστολογικός τύπος ονομάζεται ενδοπορικός, ενώ αν τα αντίστοιχα κύτταρα προέρχονται από τα λόβια, ο τύπος ονομάζεται ενδολοβιακός. Το πορογενές καρκίνωμα του μαζικού αδένα in situ είναι μια προκαρκινική κατάσταση, συνήθως ψηλαφητή, η οποία μερικές φορές εξελίσσεται σε διηθητικό καρκίνο του μαστού. Αντίθετα, το λοβιακό καρκίνωμα in situ δεν αποτελεί προστάδιο εξέλιξης σε διηθητικό λοβιακό καρκίνο, αλλά 31