ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ & ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ & ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΣΤΙΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ «Επίδραση της φύσης της πηγής άνθρακα και του διαλυμένου οξυγόνου στο διμορφισμό της ζύμης Yarrowia lipolytica» Αικατερίνη Αλεξοπούλου Βιολόγος ΠΑΤΡΑ, Ιούλιος 2013

Τα μέλη της Τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Γεώργιος Αγγελής Καθηγητής Π.Π. Χρήστος Γεωργίου Καθηγητής Π.Π. Νικόλαος Δημόπουλος Ομότιμος Καθηγητής Π.Π. Ο Επιβλέπων Καθηγητής Γεώργιος Αγγελής Καθηγητής Π.Π.

Η έγκριση της διατριβής για την απόκτηση Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης από το Τμήμα Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα. Ν.5343/1932, άρθρο 202

Εικόνα εξωφύλλου: Typical mycelium morphology of Yarrowia lipolytica cultivated on stearin used as the sole carbon source. Magnification x100. (Πηγή: Papanikolaou et al.: Industrial derivative of tallow: a promising renewable substrate for microbial lipid, single-cell protein and lipase production by Yarrowia lipolytica. Electron J Biotechnol, 2007, vol. 10:425-435)

ΠΡΟΛΟΓΟΣ - ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών στα πλαίσια του Διατμηματικού Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών «Περιβαλλοντικές Επιστήμες». Για την αίσια ολοκλήρωσή της νιώθω την ανάγκη να απευθύνω τις ευχαριστίες μου σε όσους με στήριξαν και με καθοδήγησαν στην πορεία μου. Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Γεώργιο Αγγελή, Καθηγητή του Πανεπιστημίου Πατρών, για τη στήριξη, την κατανόηση και τις πολύτιμες υποδείξεις του, που κατέστησαν δυνατή την πραγματοποίηση αυτής της εργασίας. Για τη συμμετοχή τους στην τριμελή εξεταστική επιτροπή, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Χρήστο Γεωργίου, Καθηγητή του Πανεπιστημίου Πατρών και τον κ. Νικόλαο Δημόπουλο, Ομότιμο Καθηγητή του Πανεπιστημίου Πατρών. Ένα ιδιαίτερο ευχαριστώ στέλνω στην Άννα Μακρή, διδάκτορα του Πανεπιστημίου Πατρών, που τόσο πρόωρα κι αναπάντεχα ταξίδεψε μακριά μας. Η καθοδήγηση και οι συμβουλές της αποτέλεσαν σημαντική βοήθεια στην προσπάθειά μου. Θερμές ευχαριστίες θα ήθελα να απευθύνω στα μέλη του εργαστηρίου κ. Σταματία Μπέλλου, υποψήφια διδάκτορα και κ. Άννα Μουστόγιαννη, μεταπτυχιακή φοιτήτρια, για την υποστήριξη και την αρμονική συνεργασία. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω το Πρόγραμμα με τίτλο «MicroOil- Έρευνα σε ελαιογόνους μικροοργανισμούς και ανάπτυξη νέων βιοτεχνολογικών διεργασιών», που υπάγεται στα πλαίσια της δράσης «ΑΡΙΣΤΕΙΑ» και χρηματοδοτείται από τη ΓΓΕΤ και την Ευρωπαική ένωση και υλοποιείται από το Εργαστήριο Μικροβιολογίας του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών σε συνεργασία με το Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Tροφίμων του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών και Επιστημονικό υπεύθυνο τον Καθηγητή κ. Γεώργιο Αγγελή, για την εξασφάλιση χρηματοδότησης της ερευνητικής μου εργασίας.

Τέλος, μα πάνω απ όλα ευχαριστώ την οικογένειά μου, τη μητέρα μου Μαρία και την αδελφή μου Κωνσταντίνα, που πάντα είναι κοντά μου με αγάπη και αμέριστη συμπαράσταση στις αποφάσεις μου, στα δύσκολα και στα ευχάριστα και τον αγαπημένο μου πατέρα Γιάννη που δοκιμάστηκε σκληρά, κι εμείς μαζί του, αλλά άφησε παρακαταθήκη πολύτιμη το ήθος και το μεγαλείο της ψυχής του να μας συντροφεύει.

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ...1 ABSTRACT...2 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ...3 1.1 Γενικά...3 1.2 Διμορφισμός.4 1.3 Αφομοίωση πηγών άνθρακα 6 1.3.1 Χρησιμοποίηση υδρογονανθράκων ως πηγής άνθρακα.6 1.3.2 Βιοσύνθεση και αποικοδόμηση λιπαρών οξέων 7 1.3.3 Αφομοίωση αλκοολών...7 1.3.4 Αφομοίωση οξικών αλάτων...7 1.4 Περιβαλλοντικές και βιομηχανικές εφαρμογές 8 1.4.1 Παραγωγή οργανικών οξέων, λιπιδίων, πρωτεϊνών...8 1.4.2 Αποδόμηση υδρογονανθράκων, βιοαποκατάσταση και αναβάθμιση αποβλήτων...10 1.4.3 Αλληλεπίδραση της Y. lipolytica με μέταλλα, βιομετατροπές..12 1.5 Σκοπός της μελέτης 13 2. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ 14 2.1 Βιολογικό υλικό.14 2.2 Θρεπτικά υλικά..14 2.3 Συνθήκες καλλιέργειας..15 2.4 Προσδιορισμός αριθμού κυττάρων και μικροσκοπική παρατήρηση.16 2.5 Προσδιορισμός διαλυμένου οξυγόνου και ειδικού ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου..16 2.6 Ηλεκτρονική μικροσκοπία.19 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ.20 3.1 Καλλιέργεια Yarrowia lipolytica με πηγή άνθρακα τη γλυκόζη και ρυθμό ανάδευσης 180 rpm..20

3.2 Καλλιέργεια Yarrowia lipolytica με πηγή άνθρακα τη γλυκόζη και ρυθμό ανάδευσης 50 rpm 23 3.3 Καλλιέργεια Yarrowia lipolytica με πηγή άνθρακα το ελαιόλαδο και ρυθμό ανάδευσης 180 rpm...26 3.4 Καλλιέργεια Yarrowia lipolytica με πηγή άνθρακα το ελαιόλαδο και ρυθμό ανάδευσης 50 rpm.29 3.5 Εικόνες της Yarrowia lipolytica από το Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης...32 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ.36 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ.38

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα ερευνητική εργασία μελετήθηκε η επίδραση της φύσης της πηγής άνθρακα και του διαλυμένου οξυγόνου στο διμορφισμό της ζύμης Yarrowia lipolytica. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικά υποστρώματα, ένα υδρόφιλο (γλυκόζη) και ένα υδρόφοβο (ελαιόλαδο) και δύο διαφορετικοί ρυθμοί ανάδευσης (180 και 50 rpm) της καλλιέργειας για την εξασφάλιση διαφορετικών ποσοτήτων διαλυμένου οξυγόνου. Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε το στέλεχος Yarrowia lipolytica ACA-DC 50109, η καλλιέργεια του οποίου έγινε σε κωνικές φιάλες με ημισυνθετικό θρεπτικό υλικό, περιοριστικό σε άζωτο, ph 6±0,5 και θερμοκρασία 28±1 o C, σε ανακινούμενο επωαστικό θάλαμο. Κατά τη διάρκεια της αύξησης του μικροοργανισμού και ανά τακτά χρονικά διαστήματα γινόταν καταμέτρηση της περιεκτικότητας της καλλιέργειας σε κύτταρα, παρατήρηση της μορφολογίας τους στο οπτικό μικροσκόπιο και υπολογισμός του ειδικού ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου σε αυτή. Η πειραματική διαδικασία ολοκληρώθηκε με τη λήψη εικόνων των διαφορετικών μορφών της Y. lipolytica από το Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης. Το φαινόμενο του διμορφισμού, δηλαδή η ικανότητα του μικροοργανισμού να αναπτύσσεται είτε ως μεμονωμένα κύτταρα ζύμης είτε ως μυκήλιο, παρατηρήθηκε και με τη γλυκόζη και με το ελαιόλαδο ως πηγή άνθρακα, αλλά μόνο σε χαμηλό ρυθμό ανάδευσης της καλλιέργειας, όπου οι συνθήκες ήταν πρακτικά αναερόβιες. Η μορφολογία της Y. lipolytica ήταν παρόμοια και επί των δύο υποστρωμάτων, με τον αριθμό των ψευδομυκηλίων και αληθών μυκηλίων να είναι μεγαλύτερος στην περίπτωση του ελαιόλαδου. Γενικά, ο διμορφισμός ελέγχεται από το συνδυασμό διαφόρων περιβαλλοντικών παραγόντων, εκ των οποίων το διαλυμένο οξυγόνο φαίνεται να έχει ισχυρότερη επίδραση από αυτή της φύσης της πηγής άνθρακα, όπως συνάγεται από την παρούσα μελέτη. [1]

ABSTRACT In this MSc thesis, the effect of the nature of the carbon source and the concentration of dissolved oxygen on the dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica, was studied. For this purpose, a hydrophilic (glucose) and a hydrophobic (olive oil) substrate were used as well as two different shaking speeds (180 and 50 rpm) of the cultivation. Yarrowia lipolytica ACA-DC 50109 strain was cultivated in conical flasks, using semi-synthetic, nitrogen limited medium, at ph 6±0.5 and a temperature of 28±1 o C, in a shaking incubator. During growth cycle and at regular intervals, cell count, observation in an optical microscope and calculation of the specific oxygen uptake rate, were performed. Scanning Electron Microscopy (SEM) was also used to provide pictures of the different morphological forms of Y. lipolytica. Dimorphism, which refers to the ability of this microorganism to develop distinct cellular forms (yeast-like cells, mycelium), was observed in both glucose- and olive oil-based cultures but only at a low shaking speed, where practically anaerobic conditions prevailed. The morphology of Y. lipolytica was similar upon both substrates whereas more and larger true mycelia and pseudomycelia were noticed in the case of olive oil carbon source. Generally, dimorphism is influenced by the interplay of a variety of environmental stimuli, from which dissolved oxygen seems to have a stronger effect than the carbon source nature, as it is indicated in the present study. [2]

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Γενικά Η ζύμη Yarrowia lipolytica παλαιότερα αναφερόταν ως Candida lipolytica και περιλαμβανόταν στην ομάδα των δευτερομυκήτων, μέχρι που περιγράφηκε το στάδιο αναπαραγωγής της. Μετά την παρατήρηση ασκοσπορίων, ο μύκητας (ζυμοειδές) επαναταξινομήθηκε και μετονομάστηκε σε Endomycopsis lipolytica, Saccharomycopsis lipolytica και τελικά, Yarrowia lipolytica (Yarrow, 1972; van der Walt and von Arx, 1980). Το όνομα του είδους αναφέρεται στην ικανότητα αυτού του μύκητα να καταβολίζει σε μεγάλο βαθμό υδρόφοβα υποστρώματα, όπως n-παραφίνες και έλαια. Η Y. lipolytica είναι ένας διμορφικός ημιασκομύκητας, που ανήκει στην τάξη Saccharomycetales. Τα φυσικά ενδιαιτήματά του είναι ρυπασμένα από έλαια περιβάλλοντα και λιπαρές τροφές, όπως το τυρί, το γιαούρτι, το kefir, το shoyu, το κρέας και τα προϊόντα πουλερικών (Barth and Gaillardin, 1997; Fickers et al., 2005). Η γονιδιακή αλληλουχία του μύκητα έχει αποκαλύψει, ότι ο οργανισμός έχει μακρινή σχέση με τη συμβατική ζύμη Saccharomyces cerevisiae, δεδομένου ότι οι υποκείμενοι γενετικοί μηχανισμοί φαίνεται να διαφέρουν σημαντικά. Συγκεκριμένα, το γονιδίωμα της ζύμης κωδικοποιεί μια πληθώρα οικογενειών πρωτεϊνών, που εμπλέκονται στο μεταβολισμό υδρόφοβων υποστρωμάτων (Wang et al., 1999; Thevenieau et al., 2008). Νέα γενετικά εργαλεία και η ανάπτυξη των συστημάτων έκφρασης ετερόλογων πρωτεϊνών έχουν ανοίξει νέους ορίζοντες στην έρευνα αυτής της μη-συμβατικής ζύμης (Juretzek et al., 2001; Fickers et al., 2003; Madzak et al., 2004; Bordes et al., 2007). Η ζύμη Y. lipolytica έχει προσελκύσει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, λόγω της βιοτεχνολογικής δυναμικής της. Πράγματι, ο μικροοργανισμός αυτός έχει την ικανότητα να μεταβολίζει αρκετά από τα σημαντικά βιομηχανικά και αγροβιομηχανικά παραπροϊόντα (π.χ. κορεσμένα ελεύθερα λιπαρά οξέα, ακατέργαστη γλυκερόλη) και να παράγει μεγάλες ποσότητες λιπιδίων και οργανικών οξέων (Papanikolaou and Aggelis, 2002; Papanikolaou et al., 2003; Finogenova et al., 2005; Rymowicz et al., 2007; Rywińska et al., 2009). Πρόσφατα, έγινε ανασκόπηση από [3]

τους Fakas et al. (2009) των βιοχημικών οδών, που χρησιμοποιούνται για τη μετατροπή των διαφόρων υποστρωμάτων βιοτεχνολογικής σημασίας σε αποθηκευτικά λιπίδια. Επιπρόσθετα, εξαιτίας της ιδιότητας του διμορφισμού και της ικανότητάς της να εκφράζει διάφορες ετερόλογες πρωτεΐνες (Barth and Gaillardin, 1997; Cervantes-Chávez et al., 2009), η Y. lipolytica έχει καθιερωθεί ως μικροοργανισμός-μοντέλο σε μελέτες φυσιολογίας, γενετικής, διμορφισμού, χειρισμού γονιδίων και συσσώρευσης λιπιδίων (Barth and Gaillardin, 1997; Beckerich et al., 1998; Dominguez et al., 2000; Madzak et al., 2004; Fickers et al., 2005; Beopoulos et al., 2009). Κι ενώ οι μελέτες αυτές έχουν αναλύσει διαφορετικές όψεις της Y. lipolytica, τα τελευταία χρόνια έχει σημειωθεί σημαντική πρόοδος σε τομείς που σχετίζονται με τις περιβαλλοντικές και βιομηχανικές εφαρμογές αυτής της μη-συμβατικής ζύμης. 1.2 Διμορφισμός Ο διμορφισμός αναφέρεται στην ικανότητα διαφόρων μυκήτων να αναπτύσσονται σε δύο διακριτές μορφές, ως μονήρη ωοειδή κύτταρα ή ως νηματόμορφος (μυκηλιακός) μύκητας και να εναλλάσσονται μεταξύ των δύο. Το σχήμα των κυττάρων ελέγχεται από περιβαλλοντικούς παράγοντες (Kron, 1997; Szabo, 2001). Το φαινόμενο του διμορφισμού είναι ιδιαίτερα σημαντικό, καθώς σε έναν αριθμό μυκήτων παθογόνων για τον άνθρωπο ή τα φυτά, η ικανότητα του διμορφισμού συνδέεται άμεσα με την τοξικότητά τους (Klein and Tebbets, 2007; Nadal et al., 2008). Πρόκειται για ένα περίπλοκο φαινόμενο, που περιλαμβάνει εκτεταμένη τροποποίηση του κυτταρικού μηχανισμού ως απόκριση στα περιβαλλοντικά σήματα (Morin et al., 2007). Οι συνθήκες που υποκινούν τη μετάβαση της ζύμης σε μυκήλιο ή το αντίστροφο, διαφοροποιούνται σε μεγάλο βαθμό. Μεταξύ αυτών, αναφέρονται αλλαγές στη θερμοκρασία, το ph, την αέρια ατμόσφαιρα ανάπτυξης ή η παρουσία συγκεκριμένων συστατικών στο μέσο καλλιέργειας (Ruiz-Herrera and Sentandreu, 2002; Kawasse et al., 2003; Lobão et al., 2007). Η Y. lipolytica θεωρείται ως ικανοποιητικό μοντέλο για τη μελέτη του διμορφισμού στις ζύμες, καθώς διαθέτει ένα επαρκές σύστημα για μετασχηματισμούς γενετικής μηχανικής και είναι εύκολη η διάκριση μεταξύ των μορφολογικών της [4]

τύπων, σε αντίθεση με το S. cerevisiae, που δεν σχηματίζει αληθείς υφές και εμφανίζει ανάπτυξη ψευδοϋφών υπό συνθήκες περιοριστικές σε άζωτο. Η μετάβαση από τη μορφή της ζύμης στη μυκηλιακή συνδέεται με μονοπολική αύξηση, ασύμμετρη διαίρεση, μεγάλα χυμοτόπια που εντοπίζονται στους πόλους και καταστολή του κυτταρικού διαχωρισμού μετά τη διαίρεση (Cruz et al., 2000). Στα συνήθη μέσα καλλιέργειας η Y. lipolytica αναπτύσσεται ως μίγμα μεμονωμένων κυττάρων ζύμης και μικρών μυκηλιακών κυττάρων. Είναι σημαντικό να σημειωθεί, ότι οι συνθήκες που επηρεάζουν το διμορφισμό σε αυτόν τον οργανισμό, είναι διαφορετικές μεταξύ στερεών και υγρών μέσων καλλιέργειας και εξαρτώνται από το στέλεχος που χρησιμοποιείται (Barth and Gaillardin, 1996). Το ph έχει επιβεβαιωθεί ως ο πιο σημαντικός ρυθμιστικός παράγοντας της διμορφικής μετάβασης. Ο σχηματισμός μυκηλίου έχει βρεθεί να είναι μέγιστος σε σχεδόν ουδέτερο ph και να μειώνεται καθώς το ph υποχωρεί σε τιμές κοντά στο 3. Αξίζει να αναφερθεί, ότι μάλλον η αρχική παρά η τελική τιμή ph του μέσου καλλιέργειας είναι περισσότερο σημαντική για το διμορφισμό (Ruiz-Herrera and Sentandreu, 2002). Οι πηγές άνθρακα και αζώτου, όπως η γλυκόζη και το αμμώνιο, φαίνεται να είναι εξίσου σημαντικές για το σχηματισμό μυκηλίου. Έχει αναφερθεί (Dominguez et al., 2000; Perez-Campo and Dominguez, 2001), ότι η μυκηλιακή ανάπτυξη στην Y. lipolytica ευνοήθηκε με τη χρήση ζωικού ορού. Επίσης, το αναερόβιο stress επηρεάζει το διμορφισμό στην Y. lipolytica. Καθώς ο μύκητας αυτός έχει αερόβιο μεταβολισμό και είναι ανίκανος να αναπτυχθεί υπό αυστηρά ανοξικές συνθήκες, όταν δημιουργούνται ημι-ανοξικές συνθήκες σε στερεό ή υγρό μέσο καλλιέργειας, παρατηρείται ο σχηματισμός ιδιαίτερα επιμήκων υφών (Ruiz-Herrera and Sentandreu, 2002). Οι υφές της Y. lipolytica έχουν διάμετρο που αντιστοιχεί στο 60-100% του απλού κυττάρου (Herrero et al., 1999; Szabo, 2001). Το μυκήλιο αποτελείται από διαμερισματοποιημένες υφές διαμέτρου 3-5 μm και μήκους αρκετών χιλιοστών. Τα κορυφαία κύτταρα συχνά ξεπερνούν τα 100 μm, ενώ τα επιμέρους τμήματα μετρούνται στα 50-70 μm (Barth and Gaillardin, 1997). Η διασταύρωση μεταξύ στελεχών αντίθετου συζευκτικού τύπου περιορίζεται από διπολικό ετεροπολισμό (Herreo et al., 1999). Πιστεύεται, ότι ο διμορφισμός στις ζύμες έχει σχέση με ένα μηχανισμό άμυνας έναντι αντίξοων συνθηκών, όπως οι θερμοκρασιακές και διατροφικές μεταβολές (O Sshea and Walsh, 2000). Στα άγρια στελέχη η ικανότητα ανάπτυξης [5]

υφών παρέχει ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα σε περίπτωση αντιμετώπισης συνθηκών καταπόνησης (Hurtado et al., 2000; Gancedo, 2001). Είναι γνωστό, ιδιαίτερα στην Y. lipolytica, ότι η πηγή άνθρακα δεν επηρεάζει τη μορφολογία του κυττάρου σε ουδέτερα ph. Ωστόσο, θεωρείται ότι η μορφολογία της επηρεάζεται ισχυρά από την πηγή αζώτου και, σε περίπτωση παρεμπόδισης της αερόβιας μιτοχονδριακής λειτουργίας, δεν επιτυγχάνεται σχηματισμός υφών (Barth and Gaillardin, 1997; Hurtado et al., 2000). Γενικά, ο διμορφισμός στους μύκητες χαρακτηρίζεται από την παρουσία πολλών ενδιάμεσων μορφολογικών δομών, επιδεικνύοντας ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών μεγεθών και σχημάτων. Παρόλα αυτά, υπό ορισμένες συνθήκες είναι δυνατό να επικρατήσει μια συγκεκριμένη μορφολογία (McCarthy et al., 1998). Όταν η ζύμη χρησιμοποιείται σε βιοτεχνολογικές εφαρμογές, αυτό το ευρύ μορφολογικό φάσμα επηρεάζει σε μεγάλο βαθμό τη διεργασία της ζύμωσης, καθώς επιφέρει ρεολογικές αλλαγές στο μέσο της καλλιέργειας και συνεπώς, οδηγεί σε μεταβολές της μεταφοράς μάζας και στην ταχύτητα της ζύμωσης. Ως εκ τούτου, η κατανόηση του διμορφισμού είναι εξαιρετικά σημαντική για τη βελτιστοποίηση της αύξησης και της παραγωγικότητας των διεργασιών, στις οποίες χρησιμοποιείται η Y. lipolytica (O Shea and Walsh, 2000), ενώ το ενδιαφέρον για το διμορφισμό επεκτείνεται και λόγω του γεγονότος, ότι πολλοί παθογόνοι για τον άνθρωπο μύκητες εμφανίζουν διαφορετική μορφολογία στις σαπροφυτικές και παρασιτικές φάσεις της ανάπτυξής τους (Staniszlo, 1985; Vanden Bossche et al., 1993). Με την πρόσφατη ανάπτυξη νέων αναλυτικών μεθόδων, που βασίζονται στην ανάλυση εικόνων (Nielsen, 1996; O Shea and Walsh, 1996; Pons and Vivier, 1998; O Shea and Walsh, 2000) για το χαρακτηρισμό των μορφολογικών αλλαγών, είναι πλέον δυνατό να συσχετιστούν οι περιβαλλοντικές συνθήκες με τη μορφολογία και την κινητική αύξησης. 1.3 Αφομοίωση πηγών άνθρακα 1.3.1 Χρησιμοποίηση υδρογονανθράκων ως πηγής άνθρακα Η Y. lipolytica μπορεί να χρησιμοποιήσει n-αλκάνια και l-αλκάνια ως πηγές άνθρακα (Bruyn, 1954; Ishikura and Forster, 1961; Klug and Markovetz,1967; Nyns [6]

et al., 1967). Πολυμεθυλιωμένα και χλωριωμένα αλκάνια αφομοιώνονται, επίσης, από αυτόν το μύκητα (Hagihara et al., 1977; Murphy and Perry, 1984). Το πρώτο βήμα της αφομοίωσης είναι πιθανότατα μια γαλακτωματοποίηση στην επιφάνεια του κυττάρου προς σχηματισμό μικρών σταγονιδίων, που μπορούν να εισέλθουν στο κύτταρο (Barth and Gaillardin, 1997). 1.3.2 Βιοσύνθεση και αποικοδόμηση λιπαρών οξέων Η βιοσύνθεση και η αποικοδόμηση των λιπαρών οξέων ερευνήθηκαν αρχικά από τους Kamiryo et al. (1979). Οι Kohlwein και Paltauf (1983) ανίχνευσαν τουλάχιστον δύο συστήματα μεταφοράς στην Y. lipolytica, ένα ειδικό για λιπαρά οξέα C 12 ή C 14 και το άλλο για λιπαρά οξέα C 16 και C 18, κορεσμένα ή ακόρεστα. Το οκτανοϊκό και το δεκανοϊκό οξύ δεν χρησιμοποιούνται από αυτή τη ζύμη. 1.3.3 Αφομοίωση αλκοολών Η Y. lipolytica δεν παράγει αιθανόλη, όμως χρησιμοποιεί την αιθανόλη ως πηγή άνθρακα σε συγκεντρώσεις μέχρι 3%. Υψηλότερες συγκεντρώσεις αιθανόλης είναι τοξικές για τον οργανισμό (Barth and Künkel, 1979). 1.3.4 Αφομοίωση οξικών αλάτων Τα περισσότερα στελέχη της Y. lipolytica αναπτύσσονται ικανοποιητικά σε οξικό άλας ως μοναδική πηγή άνθρακα. Συγκεντρώσεις οξικού νατρίου έως 0,4% είναι καλά ανεκτές, υψηλότερες συγκεντρώσεις μειώνουν το ρυθμό αύξησης και συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από 1,0% αναστέλλουν την ανάπτυξη. Αρκετά μεταλλάγματα έχουν απομονωθεί και εξεταστεί (Matsuoka et al., 1980; Bassel and Mortimer, 1982; Matsuoka et al., 1984; Barth and Weber, 1985; Barth and Weber, 1987; Kujau et al., 1992). [7]

1.4 Περιβαλλοντικές και βιομηχανικές εφαρμογές 1.4.1 Παραγωγή οργανικών οξέων, λιπιδίων, πρωτεϊνών Η μη-συμβατική διμορφική ζύμη Y. lipolytica έχει καλλιεργηθεί επαρκώς σε διάφορα υδρόφοβα υποστρώματα, παράγοντας πολλούς εξω- και ενδο-κυτταρικούς μεταβολίτες βιομηχανικού ενδιαφέροντος (Fickers et al., 2005; Finogenova et al., 2005). Παραδοσιακά, η πιο διαδεδομένη βιοτεχνολογική εφαρμογή στελεχών αυτού του είδους έχει επικεντρωθεί στην παραγωγή μονοκυτταρικών πρωτεϊνών (μικροβιακή βιομάζα) (Barth and Gaillardin, 1996; Musial et al., 2004). Παρά το γεγονός, ότι είδη της Y. lipolytica θεωρούνταν καλοί υποψήφιοι για παραγωγή μονοκυτταρικών ελαίων ή λιπασών (Hadeball, 1991; Ratledge, 1994), η παραγωγή αυτών των μεταβολιτών από στελέχη Y. lipolytica, μόλις πρόσφατα έχει μελετηθεί λεπτομερώς. Άγρια ή γενετικά τροποποιημένα στελέχη, έχει αναφερθεί ότι είναι ικανά να αποθηκεύουν τεράστιες ποσότητες ενδοκυτταρικών λιπιδίων, που εντοπίζονται στα λιπαρά σωμάτια, κατά την ανάπτυξή τους σε διάφορα υδρόφοβα υποστρώματα (Papanikolaou et al., 2001; Papanikolaou and Aggelis, 2003; Mličková et al., 2004). Η σημασία της Y. lipolytica στην παραγωγή σχετικών με τη βιομηχανία ενζύμων, όπως λιπάσες, πρωτεάσες, φωσφατάσες κ.ά., που εμπλέκονται στη χρησιμοποίηση των υδρόφοβων υποστρωμάτων, είναι καλά μελετημένη (Barth and Gaillardin, 1997; Fickers et al., 2005). Τα τελευταία χρόνια, όμως, υπάρχουν αναφορές σε νεότερα ένζυμα με καινοτόμες εφαρμογές, τα οποία παράγονται είτε ανεξάρτητα από την Y. lipolytica (ινουλινάσες, α-μανοσιδάση, εστεράσες και ειδικές λιπάσες) είτε ως ετερόλογες πρωτεΐνες, που εκφράζονται σε αυτόν το μύκητα (λακάσες, β-γλυκάνη, πρωτεάσες, λυάση του αλγινικού οξέος και εποξειδικές υδρολάσες) (Guieysse et al, 2004; Gao et al., 2007; Kim et al., 2007; Vega and Dominguez, 2008). Διάφορες μελέτες υποδεικνύουν, ότι σε στελέχη Y. lipolytica η παραγωγή συνδεδεμένων με το κύτταρο ή εξωκυτταρικών λιπασών ενεργοποιείται από την παρουσία στο μέσο καλλιέργειας λιπαρών οξέων μακριάς αλυσίδας, από τριγλυκερίδια και οργανικό άζωτο (π.χ. ουρία, πεπτόνη ή εκχύλισμα ζύμης) (Adamczak and Bednarski, 1996; Pereira-Meirelles et al., 1997; Pereira-Meirelles et al., 2000; Dominguez et al., 2003; Fickers et al., 2004; Fickers et al., 2005). Η [8]

παραγωγή λιπασών επηρεάζεται σημαντικά, επίσης, από την παρουσία επιφανειοδραστικών μορίων, τον αερισμό και την ανακίνηση του μέσου καλλιέργειας (Dominguez et al., 2003; Alonso et al., 2005; Kamzolova et al., 2005). Επιπλέον, η γενετική μηχανική ή η μεταλλαξιγένεση έχουν επιστρατευθεί προκειμένου να βελτιωθεί η παραγωγή λιπασών και μετά την εκτεταμένη επιλογή νέων υπερπαραγωγικών γενετικά τροποποιημένων παραγώγων και τη βελτιστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας, οι ανάλογες συγκεντρώσεις έχουν αυξηθεί αξιοσημείωτα (Nicaud et al., 2002; Fickers et al., 2004; Fickers et al., 2005). Σε πρόσφατες έρευνες, το στέλεχος ACA-DC 50109 της Y. lipolytica έχει καλλιεργηθεί σε βιομηχανικά ελεύθερα λιπαρά οξέα και έχει παράξει αξιόλογες ποσότητες αποθηκευτικών λιπιδίων, τα οποία είχαν σύνθεση παρόμοια με αυτή του cocoa-butter (Papanikolaou et al., 2001). Ένας μεγάλος τομέας της λιπιδικής βιοτεχνολογίας επικεντρώνεται στην ικανότητα των μικροοργανισμών να μετατρέπουν διάφορες φυσικές ουσίες σε αποθηκευτικά λιπίδια. Αυτά τα λιπίδια, που ονομάζονται έλαια μονοκύτταρου οργανισμού (SCO, Single-cell Oil) και παράγονται από τους ονομαζόμενους ελαιογόνους μικροοργανισμούς, συνίστανται κυρίως από ουδέτερα τμήματα (Ratledge, 1994; Wynn and Ratledge, 2006; Papanikolaou and Aggelis, 2009). Η παραγωγή SCO σε μεγάλη κλίμακα προσελκύει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, εξαιτίας της ικανότητας δαιφόρων μικροοργανισμών να συνθέτουν λιπίδια, που περιέχουν ιατρικά και διατροφικά σημαντικά πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (PUFA, Poly-unsaturated Fatty Acids), όπως το το γ-λινολενικό, το αραχιδονικό και το εικοσιπεντανοϊκό οξύ (Ratledge, 1994; Čertik and Shimizu, 1999; Wynn and Ratledge, 2006; Sakuradani and Shimizu, 2009). Επίσης, η συνεχώς αυξανόμενη απαίτηση και χρήση βιοντίζελ πρώτης γενιάς (μεθυλεστέρες λιπαρών οξέων, που προέρχονται κυρίως από την τρανσεστεροποίηση φυτικών ελαίων) έχει αυξήσει το κόστος των διαφόρων τροφίμων και το γεγονός αυτό έχει οδηγήσει στην ανάγκη ανακάλυψης «καινοτόμων/μη-συμβατικών» πηγών ελαίων, που θα μπορούσαν στη συνέχεια να μετατραπούν σε βιοντίζελ. Οι ελαιογόνοι μικροοργανισμοί θεωρούνται ως υποψήφιοι για τη μαζική παραγωγή τέτοιων τύπων λιπιδίων (Li et al., 2007; Ratledge and Cohen, 2008; Zhao et al, 2008; Papanikolaou and Aggelis, 2009). Μια πληθώρα από (καθαρά ή ακατέργαστα αγρο-βιομηχανικά) υποστρώματα έχουν χρησιμοποιηθεί ως πηγές άνθρακα για τους ελαιογόνους μικροοργανισμούς, όπως καθαρά σάκχαρα, ανανεώσιμα υλικά με βάση τα σάκχαρα ή εμπλουτισμένα σε [9]

σάκχαρα απόβλητα (Moreton, 1985; Ykema et al., 1988; Yjema et al., 1989; Davies et al., 1990; Ykema et al., 1990; Aggelis et al., 1996; Papanikolaou et al., 2004; Ahmed et al., 2006; Fakas et al., 2006; Fakas et al., 2007; Li et al., 2007; Fakas et al., 2008; Zhao et al., 2008; Ahmed et al., 2009; Fakas et al., 2009), φυτικά έλαια (Bati et al., 1984; Aggelis et al., 1995; Aggelis et al., 1997; Aggelis and Sourdis, 1997), ακατέργαστα βιομηχανικά λιπαρά οξέα ή αποθέματα σαπουνιού (Montet et al., 1985; Papanikolaou et al., 2001; Papanikolaou et al., 2002; Papanikolaou and Aggelis, 2003; Papanikolaou et al., 2007), καθαρά λιπαρά οξέα (Gierhart, 1982; Mličková et al., 2004), γλυκερόλη (Meestres et al., 1996; Papanikolaou and Aggelis, 2002; Papanikolaou et al., 2008; Makri et al., 2010) και μίγματα υδρόφιλων υποστρωμάτων με λίπη ή έλαια (Gierhart, 1982; Papanikolaou et al., 2003; Mantzouridou et al., 2006; Papanikolaou et al., 2006; Mantzouridou and Tsimidou, 2007). Σε πολλές περιπτώσεις, παράλληλα με τα SCO και άλλοι μεταβολίτες βιομηχανικού και οικονομικού ενδιαφέροντος έχουν συντεθεί (Papanikolaou et al., 2003; Mantzouridou et al., 2006; Papanikolaou et al., 2006; Szczęsna-Antczak et al., 2006; Mantzouridou and Tsimidou, 2007; Papanikolaou et al., 2007; Makri et al., 2010). Όταν σάκχαρα ή γλυκερόλη χρησιμοποιούνται ως υποστρώματα, η παραγωγή κιτρικού οξέος υποκινείται από την εξάντληση της πηγής αζώτου από το μέσο καλλιέργειας (Ratledge and Wynn, 2002; Papanikolaou et al., 2008). 1.4.2 Αποδόμηση υδρογονανθράκων, βιοαποκατάσταση και αναβάθμιση αποβλήτων Η ρύπανση από πετρέλαιο αποτελεί κυρίαρχο αίτιο οικολογικών και περιβαλλοντικών καταστροφών (Van Hamme et al., 2003). Αυτή μπορεί να συμβεί σε χερσαία, θαλάσσια και υδάτινα οικοσυστήματα. Στελέχη Y. lipolytica έχουν απομονωθεί και χρησιμοποιηθεί για τη βιοαποκατάσταση προσβεβλημένων από πετρέλαιο εδαφών (Margesin and Schinner, 1997; Alkasrawi et al., 1999; Margesin et al., 2003). Το μεγαλύτερο μέρος της έρευνας πάνω στη διάσπαση των υδρογονανθράκων από την Y. lipolytica βρίσκεται σε εργαστηριακό στάδιο, αν και κάποιες μελέτες πεδίου έχουν πραγματοποιηθεί (Zogala et al., 2005). Στο θαλάσσιο περιβάλλον διάφοροι παράγοντες, όπως οι ναυτιλιακές δραστηριότητες, η μεταφορά πετρελαίου με δεξαμενόπλοια και το νερό του έρματος προκαλούν χρόνια ρύπανση. Από την άλλη πλευρά, τα ατυχήματα σε πετρελαιοφόρα ή σε παράκτιες πλατφόρμες πετρελαίου αποτελούν σημαντικά αίτια οξείας ρύπανσης [10]

(Zinjarde and Pant, 2002). Ανθεκτικά στην αλατότητα στελέχη Y. lipolytica έχουν απομονωθεί από υπεράλμυρες και θαλάσσιες τοποθεσίες, γεγονός που υποδεικνύει ότι αυτός ο μύκητας μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο σε τέτοια περιβάλλοντα (Butinar et al., 2005; Kim et al., 2007; Zinjarde et al., 2008). Επιπλέον, συνδυασμός αυτής της ζύμης με βακτήρια έχει αποδειχθεί πολύ αποτελεσματικός στην αποικοδόμηση του πετρελαίου. Για παράδειγμα, αυτή η ζύμη επέδειξε σημαντική θετική επίδραση στη διαδικασία αποικοδόμησης του αργού πετρελαίου, όταν χρησιμοποιήθηκε μαζί με Pseudomonas sp. ή Bacillus subtilis (Horakova and Nemec, 2000; Kaczorek et al., 2008). Στη βιβλιογραφία υπάρχουν, επίσης, αναφορές στη συμμετοχή ενδογενών ζυμών στη διαδικασία της φυσικής αποτοξίνωσης μιας ποικιλίας ρυπαντών. Ιδιαίτερη έμφαση έχει δοθεί στην απομόνωση τέτοιων ζυμών από βαριά ρυπασμένα περιβάλλοντα. Η ενδογενής μικροχλωρίδα σε τέτοια περιβάλλοντα αντιμετωπίζει ένα μόνιμο κίνδυνο από τους ρυπαντές και γι αυτό το λόγο, έχει αναπτύξει τον απαραίτητο ενζυμικό μηχανισμό για την αποτοξίνωσή τους. Σχετικές μελέτες έχουν τονίσει τη σπουδαιότητα των στελεχών Y. lipolytica και άλλων ζυμών στην αποικοδόμηση αρωματικών οργανικών ρυπαντών (Romero et al., 2001; Romero et al., 2002; Fickers et al., 2005). Λίγες αναφορές υπάρχουν σχετικά με τη σημασία της μορφολογίας αυτών των μυκήτων κατά την αποικοδόμηση των υδρογονανθράκων. Παρόλο που ο μύκητας είναι διμορφικός και υφίσταται είτε στη μορφή ζύμης είτε στη μυκηλιακή μορφή, έχει αποδειχθεί ότι η μορφή της ζύμης παίζει ρόλο στην αποικοδόμηση (Zinjarde et al., 1998, 2008). Ακόμα ένα σημαντικό εύρημα σε σχέση με τη σπουδαιότητα της μορφολογίας, είναι η πρόσφατη αναφορά της ικανότητας της Y. lipolytica να σχηματίζει βιοφίλμ παρουσία διαφορετικών πηγών άνθρακα, συμπεριλαμβανομένων των αλκανίων (Dusane et al., 2008). Διαφορετικά στελέχη Y. lipolytica έχουν χρησιμοποιηθεί για τη διαχείριση ή την αναβάθμιση διαφόρων ειδών αποβλήτων. Συγκεκριμένα, έχουν αποδειχθεί αποτελεσματικά στη διαχείριση των υγρών αποβλήτων ελαιοτριβείων (olive mill wastewater- OMW) και των αποβλήτων μονάδων παραγωγής φοινικέλαιου (palm oil mill effluents- POME). Τα OMW προκαλούν σοβαρή ρύπανση, ιδιαίτερα στην περιοχή της Μεσογείου και χαρακτηρίζονται από υψηλές τιμές χημικά απαιτούμενου οξυγόνου (De Felice et al., 1997). [11]

Η Y. lipolytica έχει χρησιμοποιηθεί στην αναβάθμιση των ιχθυάλευρων. Τα εμπορικά ιχθυάλευρα που προέρχονται από τα απόβλητα της αλιείας, θεωρούνται χαμηλής ποιότητας, λόγω της υψηλής περιεκτικότητάς τους σε λιπίδια. Οι Yano et al. (2008) έχουν μελετήσει τη μικροβιακή μείωση των ακατέργαστων λιπιδίων σε δείγματα τεμαχισμένων ψαριών και, μεταξύ άλλων μικροοργανισμών, βρήκαν ότι ένα στέλεχος Y. lipolytica επέδειξε τη μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα, μειώνοντας τα λιπίδια κατά 46% σε 96 ώρες. Μια πληθώρα αποβλήτων έχουν χρησιμοποιηθεί ως εναλλακτικά οικονομικά υποστρώματα για την παραγωγή ενζύμων, οργανικών οξέων και γαλακτωματοποιητών. Αυτή η προσέγγιση προσφέρει ένα διπλό πλεονέκτημα: α) ένα μέσο διάθεσης των αποβλήτων και β) τη σύνθεση προϊόντων προστιθέμενης αξίας. Οι βιοεπιφανειοδραστικές ουσίες και οι βιογαλακτωματοποιητές είναι αμφίφιλα μόρια, που χρησιμοποιούνται στην κατασκευή υφασμάτων, δερμάτινων ειδών, στη βιοαποκατάσταση, στη γεωργία και στη βιομηχανία τροφίμων και ποτών (Banan et al., 2000). 1.4.3 Αλληλεπίδραση της Y. lipolytica με μέταλλα, βιομετατροπές Τα βαρέα μέταλλα αποτελούν ρυπαντές, οι οποίοι απελευθερώνονται τακτικά στα χερσαία και στα υδάτινα οικοσυστήματα, ως αποτέλεσμα της βιομηχανικής διαδικασίας και των ανθρώπινων δραστηριοτήτων. Πολλά από αυτά είναι τοξικά για τον άνθρωπο και επίσης, συνιστούν σοβαρή απειλή για το περιβάλλον (Järup, 2003). Η Y. lipolytica έχει απομονωθεί από ποικίλα τέτοια ρυπασμένα περιβάλλοντα. Ο μύκητας αυτός έχει την έμφυτη ικανότητα να ανθίσταται όχι μόνο στα βαρέα μέταλλα (Golubev and Golubev, 2002; Ito et al., 2007), αλλά και στο αλάτι (Butinar et al., 2005; Kim et al., 2007; Zinjarde et al., 2008) και άλλους ρυπαντές (Zinjarde and Pant, 2002; Jain et al., 2004). Η Y. lipolytica είναι αποτελεσματική στην υδροξυλίωση διαφορετικών χημικών ενώσεων. Η ιδιότητα αυτή έχει αξιοποιηθεί σε διαφορετικές διαδικασίες βιομετατροπής. Εναντιοϊσομερή β-υδροξυ-καρβοξυλικά οξέα χρησιμοποιούνται ως ενδιάμεσα για τη σύνθεση οπτικά ενεργών φαρμακευτικών ουσιών (Kyong and Shin, 2000). Το L-dopa (3,4-διυδροξυ-φαινυλ-L-αλανίνη) είναι ένα κοινό φάρμακο για την ασθένεια Parkinson (Haq et al., 2002; Koyanagi et al., 2005). [12]

1.5 Σκοπός της μελέτης Η ζύμη Yarrowia lipolytica αποτελεί ένα μικροοργανισμό ιδιαίτερου ερευνητικού ενδιαφέροντος τα τελευταία χρόνια, καθώς επιδεικνύει αρκετά σημαντικές φυσιολογικές και μορφολογικές ιδιότητες, που δίνουν τη δυνατότητα για χρησιμοποίησή της σε πληθώρα βιομηχανικών και περιβαλλοντικών εφαρμογών. Η εμφάνιση του μικροοργανισμού αυτού σε δύο διακριτές μορφές, αυτές των μεμονωμένων κυττάρων και των επιμήκων υφών (μυκήλιο), έχει γίνει αντικείμενο αρκετών μελετών για τη διερεύνηση των βιοχημικών οδών και των συνθηκών, που εμπλέκονται στη λειτουργία του διμορφισμού. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να μελετηθεί η επίδραση της φύσης της πηγής άνθρακα και του διαλυμένου οξυγόνου στο διμορφισμό της Y. lipolytica, με τη χρησιμοποίηση δύο διαφορετικών υποστρωμάτων στο μέσο καλλιέργειας, ενός υδρόφιλου (γλυκόζη) και ενός υδρόφοβου (ελαιόλαδο), μέσω της μικροσκοπικής παρατήρησης και της καταγραφής του διαλυμένου οξυγόνου στις διάφορες φάσεις ανάπτυξης της ζύμης. [13]

2. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Βιολογικό υλικό Για τη διεξαγωγή της παρούσας ερευνητικής εργασίας χρησιμοποιήθηκε το στέλεχος Yarrowia lipolytica ACA-DC 50109. Ο μικροοργανισμός διατηρείτο σε κεκλιμένους σωλήνες καλλιέργειας επί θρεπτικού υλικού PDA (Potato Dextrose Agar, Conda, Madrid, Spain) σε θερμοκρασία 7±1 o C και ανανεωνόταν κάθε μήνα. 2.2 Θρεπτικά υλικά Για την καλλιέργεια της ζύμης Y. lipolytica χρησιμοποιήθηκε ημι-συνθετικό θρεπτικό υλικό, που περιείχε μακροστοιχεία υπό μορφή φωσφορικών (Fluka, Steinheim, Germany) και θειικών αλάτων (Merck, Darmstadt, Germany), εκχύλισμα ζύμης ως πηγή αυξητικών παραγόντων και διάφορα ιχνοστοιχεία (Fluka, Merck & Carlo Erba, Rodano, Italy) σε συγκεντρώσεις που δίνονται στον Πίνακα 2.2.1 (Fakas et al., 2007) σε τελικό όγκο καλλιέργειας 50 ml. Ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε γλυκόζη και ελαιόλαδο. [14]

Πίνακας 2.2.1: Σύσταση του θρεπτικού υλικού, που χρησιμοποιήθηκε για την καλλιέργεια της ζύμης Yarrowia lipolytica. Πηγή άνθρακα (g/l) Glucose/ 10/ Olive oil 5,2 Πηγή αυξητικών παραγόντων (g/l) Μακροστοιχεία (g/l) Μικροστοιχεία (g/l) Yeast 0,5 (NH 4 ) 2 SO 4 2 CuSO 4 5H 2 O 0,0001 extract KH 2 PO 4 7 Co(NO 3 ) 2 3H 2 O 0,0001 Na 2 HPO 4 2 MnSO 4 5H 2 O 0,0001 MgSO 4 6H 2 O 1,5 ZnSO 4 7H 2 O 0,001 CaCl 2 0,1 2.3 Συνθήκες καλλιέργειας Οι καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν σε κωνικές φιάλες Erlenmeyer των 250 cc, οι οποίες περιείχαν 50 ml θρεπτικού υλικού. Οι φιάλες με το υπόστρωμα, αφού αποστειρώνονταν σε θερμοκρασία 121 o C για 20 min, εμβολιάζονταν με 1ml προκαλλιέργειας ηλικίας 24h, και στη συνέχεια επωάζονταν σε ανακινούμενο επωαστικό θάλαμο (ZHICHENG ZHWY 211C, Shanghai, China) σε θερμοκρασία 28±1 o C και με ρυθμό ανάδευσης 180 και 50 rpm (rotations per min- στροφές ανά λεπτό). Το ph της καλλιέργειας, όταν ήταν απαραίτητο, ρυθμιζόταν στο 6±0,5 με προσθήκη υπό ασηπτικές συνθήκες κατάλληλης ποσότητας διαλύματος NaOH 1Μ. [15]

2.4 Προσδιορισμός αριθμού κυττάρων και μικροσκοπική παρατήρηση Η μέτρηση της περιεκτικότητας της καλλιέργειας σε κύτταρα σε διαφορετικές χρονικές στιγμές έγινε με τη χρήση αιματοκυττόμετρου τύπου Neubauer (Poly-Optic, Bad Blankenburg, Germany), σύμφωνα με τον τύπο: Cells/ml= (No of cells counted/no of squares) 10 4 dilution factor (2.4.1) και με τη βοήθεια οπτικού μικροσκοπίου. Το τελευταίο χρησιμοποιήθηκε και για τη μελέτη της μορφολογίας των κυττάρων, μέσω και της συνδεδεμένης σε αυτό κάμερας. 2.5 Προσδιορισμός διαλυμένου οξυγόνου (DO) και ειδικού ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου Στις αερόβιες ζυμώσεις οι μικροοργανισμοί προσλαμβάνουν το οξυγόνο από την υγρή φάση υπό μορφή διαλυμένου οξυγόνου (dissolved oxygen- DO) και το χρησιμοποιούν τόσο για τις ανάγκες της αύξησης όσο και για την ενεργειακή συντήρηση της βιομάζας. Η μεταφορά οξυγόνου από την αέρια φάση στο μικροβιακό κύτταρο ελέγχεται από τη μεσολαβούσα υγρή φάση, η οποία λειτουργεί ως αντίσταση. Ο ρυθμός μεταφοράς οξυγόνου (N A, mm.(l.h) -1 ) δίνεται από τη σχέση: Ν Α =K L α (C* - C L ) (2.5.1) όπου K L ο συντελεστής μεταφοράς μάζας στην υγρή φάση (cm 2.h -1 ), α η ειδική επιφάνεια επαφής των δύο φάσεων (cm 2.cm -3 ), C* η συγκέντρωση του οξυγόνου στην υγρή φάση στην κατάσταση κορεσμού (mm.l -1 ) και C L η συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου στην υγρή φάση (mm.l -1 ). Το ισοζύγιο μάζας για το διαλυμένο οξυγόνο κατά τη διάρκεια μιας μικροβιακής καλλιέργειας είναι: dc L /dt = K L α (C* - C L ) - qo 2 x (2.5.2) [16]

όπου qo 2 ο ειδικός ρυθμός κατανάλωσης O 2 και x η συγκέντρωση της βιομάζας. Αν κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας διακόψουμε την παροχή αέρα, τότε η συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου μειώνεται, όπως φαίνεται στην Εικόνα 2.5.1. Με την παύση του αερισμού ο συντελεστής K L α μηδενίζεται, οπότε η εξίσωση (2.5.2) γίνεται: dc L /dt = - qo 2 x (2.5.3) Η σχέση, συνεπώς, C L =f(t), το χρονικό διάστημα κατά το οποίο διαρκεί η παύση του αερισμού, είναι γραμμική, η δε κλίση της ισούται με - qo 2 x. Η μέτρηση της συγκέντρωσης του DO στις κωνικές φιάλες πραγματοποιήθηκε με εκλεκτικό ηλεκτρόδιο τύπου Hanna instrument (Padova, Italy). Κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας το ηλεκτρόδιο τοποθετήθηκε στην κωνική φιάλη και μετά τη σταθεροποίηση των συνθηκών του ανακινούμενου επωαστικού θαλάμου καταγράφηκε η τιμή του DO σε ppm. Στη συνέχεια, διακόπηκε ο αερισμός της καλλιέργειας και καταγράφηκε η πτώση της τιμής του DO ανά 5 sec για 30 sec. Κατά τη διάρκεια διακοπής του αερισμού η συνάρτηση DO= f(t) είναι γραμμική και η κλίση της ισούται με qo 2 x, όπου qo 2 ο ειδικός ρυθμός κατανάλωσης O 2, που εκφράζεται σε h -1 και x η συγκέντρωση της βιομάζας (Εικόνα 2.5.1). Ο προσδιορισμός της ξηρής βιομάζας πραγματοποιήθηκε με εκτίμηση της οπτικής πυκνότητας (Optical Density- OD) της καλλιέργειας σε διαφορετικές αραιώσεις σε μήκος κύματος λ=620 nm (όπου έχει παρατηρηθεί η μέγιστη απορρόφηση) και με τη βοήθεια της πρότυπης καμπύλης OD= f(x) (Εικόνα 2.5.2). Μια δεύτερη καμπύλη αναφοράς έδωσε το συσχετισμό μεταξύ της συγκέντρωσης της ξηρής βιομάζας και του αριθμού των κυττάρων της καλλιέργειας στις διαφορετικές αραιώσεις (Εικόνα 2.5.3). Από την τελευταία υπολογίστηκε για κάθε χρονική στιγμή των μετρήσεων η ξηρή βιομάζα που αντιστοιχεί στους μετρηθέντες αριθμούς κυττάρων, ενώ η κλίση της συνάρτησης διακοπής αερισμού έδωσε και τους αντίστοιχους ειδικούς ρυθμούς κατανάλωσης οξυγόνου. [17]

Εικόνα 2.5.1: Καμπύλη συνάρτησης διακοπής αερισμού σε καλλιέργεια της ζύμης Yarrowia lipolytica. Εικόνα 2.5.2: Καμπύλη αναφοράς για τον προσδιορισμό της ξηρής βιομάζας σε καλλιέργεια της ζύμης Yarrowia lipolytica με μέτρηση της οπτικής πυκνότητας (OD: οπτική πυκνότητα, Χ: ξηρή βιομάζα). [18]

Εικόνα 2.5.3: Καμπύλη αναφοράς για τον προσδιορισμό της ξηρής βιομάζας σε καλλιέργεια της ζύμης Yarrowia lipolytica με μέτρηση του αριθμού των κυττάρων (logc: λογάριθμος περιεκτικότητας καλλιέργειας σε κύτταρα, Χ: ξηρή βιομάζα). 2.6 Ηλεκτρονική μικροσκοπία Για τη διερεύνηση της μορφολογίας των κυττάρων της ζύμης Y. lipolytica πραγματοποιήθηκε, τέλος, ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM, Scanning Electron Microscopy) σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο JEOL JSM 6300 με επιταχύνουσα τάση δέσμης ηλεκτρονίων 20.000V και ρεύμα δέσμης 10-11 -10-10 Α. Η προετοιμασία των δειγμάτων έγινε με επίστρωση μικρής ποσότητας καλλιέργειας στην επιφάνεια μεταλλικών κυλινδρικών φορέων δειγμάτων και ξήρανση στους 38 o C για 24h προς απομάκρυνση της υγρασίας. Της παρατήρησης προηγήθηκε επιχρύσωση των δειγμάτων σε συσκευή JFC 1100 (Jeol Fine Coat). [19]

3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 Καλλιέργεια Yarrowia lipolytica με πηγή άνθρακα τη γλυκόζη και ρυθμό ανάδευσης 180 rpm Η ζύμη Y. lipolytica καλλιεργήθηκε σε κωνικές φιάλες Erlenmeyer των 250 cc σε τελικό όγκο καλλιέργειας 50 ml. Ως πηγή άνθρακα σε αυτό το μέρος των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε η γλυκόζη (10 g/l), το θρεπτικό μέσο ήταν περιοριστικό ως προς την πηγή αζώτου και το ph διατηρείτο σταθερό και ίσο με 6±0,5 με προσθήκη διαλύματος NaOH 1M, όταν χρειαζόταν. Οι φιάλες καλλιέργειας τοποθετήθηκαν σε ανακινούμενο επωαστικό θάλαμο, σε θερμοκρασία 28±1 o C και ρυθμό ανάδευσης 180 rpm. Ανά τακτά χρονικά διαστήματα, δείγμα από την καλλιέργεια ετίθετο σε αιματοκυττόμετρο, προκειμένου να γίνει καταμέτρηση του αριθμού των κυττάρων και παρατήρηση της μορφολογίας τους στο οπτικό μικροσκόπιο. Παράλληλα, γινόταν μέτρηση της περιεκτικότητας της καλλιέργειας σε διαλυμένο οξυγόνο με τη χρήση οξυγονόμετρου και υπολογισμός του ειδικού ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου μετά από διακοπή του αερισμού στο θάλαμο. Από τις παραπάνω μετρήσεις προέκυψε η καμπύλη αύξησης της ζύμης (Εικόνα 3.1.1) και η μεταβολή του ειδικού ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου (qo 2 ) στην καλλιέργεια (Εικόνα 3.1.1). Στην εκθετική φάση αύξησης (περιοχή Α στο διάγραμμα της Εικόνας 3.1.1) παρατηρήθηκε αύξηση του qo 2 και επακόλουθη μείωση αυτού κατά την είσοδο στη στάσιμη φάση (περιοχή Β1-B2), οπότε και παραμένει σχεδόν σταθερός. Ο ταχύς ρυθμός ανάδευσης της καλλιέργειας εξασφαλίζει τη μεταφορά μεγάλης ποσότητας οξυγόνου από την αέρια στην υγρή φάση μέχρι μια κρίσιμη συγκέντρωση, όπου ο qo 2 λαμβάνει τη μέγιστη τιμή του. Η αντίστοιχη μορφολογία της ζύμης κατά τις διάφορες φάσεις αύξησης απεικονίζεται στην Εικόνα 3.1.2. Στην εκθετική φάση παρατηρήθηκαν σταδιακά αυξανόμενα σε αριθμό, μικρά σε μέγεθος, μεμονωμένα κύτταρα ζύμης, που πολλαπλασιάζονταν με εκβλαστήσεις. Η στάσιμη φάση έδωσε εικόνες μεγαλύτερων σε μέγεθος κυττάρων, λόγω της συσσώρευσης λιπιδίων σε αυτά, τα οποία μειώνονταν σε μέγεθος και αριθμό με την αύξηση του χρόνου καλλιέργειας. [20]

A B1 Β2 Εικόνα 3.1.1: Κινητική αύξησης και μεταβολή του ειδικού ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου της ζύμης Yarrowia lipolytica, καλλιεργούμενης σε κωνικές φιάλες. Συνθήκες καλλιέργειας: αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 10 g/l, ph 6±0,5, θερμοκρασία 28±1 ο C, ρυθμός ανάδευσης 180 rpm. Σύμβολα: logc λογάριθμος περιεκτικότητας της καλλιέργειας σε κύτταρα (κύτταρα/ml), qo 2 (h -1 ) ειδικός ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου, t (h) χρόνος καλλιέργειας. [21]

A1 A2 B1.1 B1.2 Β2.1 Β2.2 Εικόνα 3.1.2: Μορφολογία της ζύμης Yarrowia lipolytica, καλλιεργούμενης σε γλυκόζη και ρυθμό ανάδευσης 180 rpm. A1-A2: Εκθετική φάση. Β1.1-Β2.2: Στάσιμη φάση. Μεγέθυνση x100. [22]

3.2 Καλλιέργεια Yarrowia lipolytica με πηγή άνθρακα τη γλυκόζη και ρυθμό ανάδευσης 50 rpm Η ζύμη Y. lipolytica καλλιεργήθηκε σε κωνικές φιάλες Erlenmeyer των 250 cc σε τελικό όγκο καλλιέργειας 50 ml. Ως πηγή άνθρακα σε αυτό το μέρος των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε η γλυκόζη (10 g/l), το θρεπτικό μέσο ήταν περιοριστικό ως προς την πηγή αζώτου και το ph διατηρείτο σταθερό και ίσο με 6±0,5 με προσθήκη διαλύματος NaOH 1M, όταν χρειαζόταν. Οι φιάλες καλλιέργειας τοποθετήθηκαν σε ανακινούμενο επωαστικό θάλαμο, σε θερμοκρασία 28±1 o C και ρυθμό ανάδευσης 50 rpm. Ανά τακτά χρονικά διαστήματα, δείγμα από την καλλιέργεια ετίθετο σε αιματοκυττόμετρο, προκειμένου να γίνει καταμέτρηση του αριθμού των κυττάρων και παρατήρηση της μορφολογίας τους στο οπτικό μικροσκόπιο. Παράλληλα, γινόταν μέτρηση της περιεκτικότητας της καλλιέργειας σε διαλυμένο οξυγόνο με τη χρήση οξυγονόμετρου και υπολογισμός του ειδικού ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου μετά από διακοπή του αερισμού στο θάλαμο. Από τις παραπάνω μετρήσεις προέκυψε η καμπύλη αύξησης της ζύμης (Εικόνα 3.2.1) και η μεταβολή του ειδικού ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου (qo 2 ) στην καλλιέργεια (Εικόνα 3.2.1). Στην εκθετική φάση αύξησης (περιοχή Α στο διάγραμμα της Εικόνας 3.2.1) παρατηρήθηκε μείωση του qo 2, ο οποίος έλαβε έως μηδενικές τιμές κατά τη στάσιμη φάση (περιοχή Β1-B2). Ο αργός ρυθμός ανάδευσης της καλλιέργειας ευθύνεται για τη μεταφορά μικρής ποσότητας οξυγόνου από την αέρια στην υγρή φάση και τη δημιουργία αναερόβιων συνθηκών, εφόσον σε μικρές συγκεντρώσεις διαλυμένου οξυγόνου παρατηρείται ισχυρή εξάρτηση του qo 2 από αυτήν. Για τη διατήρηση συνθηκών πλήρους αεροβίωσης το σύστημα αερισμού θα πρέπει να είναι ικανό να διατηρεί τη συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου πάνω από μια κρίσιμη τιμή καθ όλη τη διάρκεια της αύξησης. Η αντίστοιχη μορφολογία της ζύμης κατά τις διάφορες φάσεις αύξησης απεικονίζεται στην Εικόνα 3.2.2. Στην εκθετική φάση παρατηρήθηκαν σταδιακά αυξανόμενα σε αριθμό, μικρά σε μέγεθος, μεμονωμένα κύτταρα ζύμης, που πολλαπλασιάζονταν με εκβλαστήσεις, καθώς και ψευδομυκήλια. Η φάση στασιμότητας χαρακτηρίστηκε από την εμφάνιση αληθούς μυκηλίου μαζί με μεμονωμένα κύτταρα ζύμης. [23]

A B1 Β2 Εικόνα 3.2.1: Κινητική αύξησης και μεταβολή του ειδικού ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου της ζύμης Yarrowia lipolytica, καλλιεργούμενης σε κωνικές φιάλες. Συνθήκες καλλιέργειας: αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 10 g/l, ph 6±0,5, θερμοκρασία 28±1 ο C, ρυθμός ανάδευσης 50 rpm. Σύμβολα: logc λογάριθμος περιεκτικότητας της καλλιέργειας σε κύτταρα (κύτταρα/ml), qo 2 (h -1 ) ειδικός ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου, t (h) χρόνος καλλιέργειας. [24]

A1 A2 B1.1 B1.2 Β2.1 Β2.2 Εικόνα 3.2.2: Μορφολογία της ζύμης Yarrowia lipolytica, καλλιεργούμενης σε γλυκόζη και ρυθμό ανάδευσης 50 rpm. A1-A2: Εκθετική φάση. Β1.1-Β2.2: Στάσιμη φάση. Μεγέθυνση x100. [25]

3.3 Καλλιέργεια Yarrowia lipolytica με πηγή άνθρακα το ελαιόλαδο και ρυθμό ανάδευσης 180 rpm Η ζύμη Y. lipolytica καλλιεργήθηκε σε κωνικές φιάλες Erlenmeyer των 250 cc σε τελικό όγκο καλλιέργειας 50 ml. Ως πηγή άνθρακα σε αυτό το μέρος των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε το ελαιόλαδο (5,2 g/l), το θρεπτικό μέσο ήταν περιοριστικό ως προς την πηγή αζώτου και το ph διατηρείτο σταθερό και ίσο με 6±0,5 με προσθήκη διαλύματος NaOH 1M, όταν χρειαζόταν. Οι φιάλες καλλιέργειας τοποθετήθηκαν σε ανακινούμενο επωαστικό θάλαμο, σε θερμοκρασία 28±1 o C και ρυθμό ανάδευσης 180 rpm. Ανά τακτά χρονικά διαστήματα, δείγμα από την καλλιέργεια ετίθετο σε αιματοκυττόμετρο, προκειμένου να γίνει καταμέτρηση του αριθμού των κυττάρων και παρατήρηση της μορφολογίας τους στο οπτικό μικροσκόπιο. Παράλληλα, γινόταν μέτρηση της περιεκτικότητας της καλλιέργειας σε διαλυμένο οξυγόνο με τη χρήση οξυγονόμετρου και υπολογισμός του ειδικού ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου μετά από διακοπή του αερισμού στο θάλαμο. Από τις παραπάνω μετρήσεις προέκυψε η καμπύλη αύξησης της ζύμης (Εικόνα 3.3.1) και η μεταβολή του ειδικού ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου (qo 2 ) στην καλλιέργεια (Εικόνα 3.3.1). Στην εκθετική φάση αύξησης (περιοχή Α στο διάγραμμα της Εικόνας 3.3.1) παρατηρήθηκε αύξηση του qo 2 και επακόλουθη μείωση αυτού κατά την είσοδο στη στάσιμη φάση (περιοχή Β1-B2), οπότε και παραμένει σχεδόν σταθερός. Ο ταχύς ρυθμός ανάδευσης της καλλιέργειας εξασφαλίζει τη μεταφορά μεγάλης ποσότητας οξυγόνου από την αέρια στην υγρή φάση μέχρι μια κρίσιμη συγκέντρωση, όπου ο qo 2 λαμβάνει τη μέγιστη τιμή του. Η αντίστοιχη μορφολογία της ζύμης κατά τις διάφορες φάσεις αύξησης απεικονίζεται στην Εικόνα 3.3.2. Στην εκθετική φάση παρατηρήθηκαν σταδιακά αυξανόμενα σε αριθμό, μικρά σε μέγεθος, μεμονωμένα κύτταρα ζύμης, που πολλαπλασιάζονταν με εκβλαστήσεις. Η στάσιμη φάση έδωσε εικόνες μεγαλύτερων σε μέγεθος κυττάρων, λόγω της συσσώρευσης λιπιδίων σε αυτά, τα οποία μειώνονταν σε μέγεθος και αριθμό με την αύξηση του χρόνου καλλιέργειας. Παρατηρήθηκε, επίσης, μεγαλύτερη χρονική διάρκεια στις διαδοχικές φάσεις αύξησης του μικροοργανισμού σε σχέση με τις αντίστοιχες της καλλιέργειας σε γλυκόζη και μεγαλύτερες απαιτήσεις σε οξυγόνο, λόγω της μεγαλύτερης περιεκτικότητας του ελαιόλαδου σε άνθρακα. [26]

A B1 Β2 Εικόνα 3.3.1: Κινητική αύξησης και μεταβολή του ειδικού ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου της ζύμης Yarrowia lipolytica, καλλιεργούμενης σε κωνικές φιάλες. Συνθήκες καλλιέργειας: αρχική συγκέντρωση ελαιόλαδου 5,2 g/l, ph 6±0,5, θερμοκρασία 28±1 ο C, ρυθμός ανάδευσης 180 rpm. Σύμβολα: logc λογάριθμος περιεκτικότητας της καλλιέργειας σε κύτταρα (κύτταρα/ml), qo 2 (h -1 ) ειδικός ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου, t (h) χρόνος καλλιέργειας. [27]

A1 A2 B1.1 B1.2 Β2.1 Β2.2 Εικόνα 3.3.2: Μορφολογία της ζύμης Yarrowia lipolytica, καλλιεργούμενης σε ελαιόλαδο και ρυθμό ανάδευσης 180 rpm. A1-A2: Εκθετική φάση. Β1.1-Β2.2: Στάσιμη φάση. Μεγέθυνση x100. [28]

3.4 Καλλιέργεια Yarrowia lipolytica με πηγή άνθρακα το ελαιόλαδο και ρυθμό ανάδευσης 50 rpm Η ζύμη Y. lipolytica καλλιεργήθηκε σε κωνικές φιάλες Erlenmeyer των 250 cc σε τελικό όγκο καλλιέργειας 50 ml. Ως πηγή άνθρακα σε αυτό το μέρος των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε το ελαιόλαδο (5,2 g/l), το θρεπτικό μέσο ήταν περιοριστικό ως προς την πηγή αζώτου και το ph διατηρείτο σταθερό και ίσο με 6±0,5 με προσθήκη διαλύματος NaOH 1M, όταν χρειαζόταν. Οι φιάλες καλλιέργειας τοποθετήθηκαν σε ανακινούμενο επωαστικό θάλαμο, σε θερμοκρασία 28±1 o C και ρυθμό ανάδευσης 50 rpm. Ανά τακτά χρονικά διαστήματα, δείγμα από την καλλιέργεια ετίθετο σε αιματοκυττόμετρο, προκειμένου να γίνει καταμέτρηση του αριθμού των κυττάρων και παρατήρηση της μορφολογίας τους στο οπτικό μικροσκόπιο. Παράλληλα, γινόταν μέτρηση της περιεκτικότητας της καλλιέργειας σε διαλυμένο οξυγόνο με τη χρήση οξυγονόμετρου και υπολογισμός του ειδικού ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου μετά από διακοπή του αερισμού στο θάλαμο. Από τις παραπάνω μετρήσεις προέκυψε η καμπύλη αύξησης της ζύμης (Εικόνα 3.4.1) και η μεταβολή του ειδικού ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου (qo 2 ) στην καλλιέργεια (Εικόνα 3.4.1). Στην εκθετική φάση αύξησης (περιοχή Α στο διάγραμμα της Εικόνας 3.4.1) παρατηρήθηκε μείωση του qo 2, ο οποίος έλαβε έως μηδενικές τιμές κατά τη στάσιμη φάση (περιοχή Β1-Β2). Ο αργός ρυθμός ανάδευσης της καλλιέργειας ευθύνεται για τη μεταφορά μικρής ποσότητας οξυγόνου από την αέρια στην υγρή φάση και τη δημιουργία αναερόβιων συνθηκών, εφόσον σε μικρές συγκεντρώσεις διαλυμένου οξυγόνου παρατηρείται ισχυρή εξάρτηση του qo 2 από αυτήν. Για τη διατήρηση συνθηκών πλήρους αεροβίωσης το σύστημα αερισμού θα πρέπει να είναι ικανό να διατηρεί τη συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου πάνω από μια κρίσιμη τιμή καθ όλη τη διάρκεια της αύξησης. Η αντίστοιχη μορφολογία της ζύμης κατά τις διάφορες φάσεις αύξησης απεικονίζεται στην Εικόνα 3.4.2. Στην εκθετική φάση παρατηρήθηκαν σταδιακά αυξανόμενα σε αριθμό, μικρά σε μέγεθος, μεμονωμένα κύτταρα ζύμης, που πολλαπλασιάζονταν με εκβλαστήσεις, καθώς και ψευδομυκήλια και κύτταρα με επίμηκες σχήμα, ενδεικτικά της έναρξης σχηματισμού αληθούς μυκηλίου. Η φάση στασιμότητας χαρακτηρίστηκε από την εμφάνιση αληθούς μυκηλίου μαζί με μεμονωμένα κύτταρα ζύμης. [29]

Παρατηρήθηκε, επίσης, μεγαλύτερη χρονική διάρκεια στις διαδοχικές φάσεις αύξησης του μικροοργανισμού σε σχέση με τις αντίστοιχες της καλλιέργειας σε γλυκόζη και μεγαλύτερες απαιτήσεις σε οξυγόνο, λόγω της μεγαλύτερης περιεκτικότητας του ελαιόλαδου σε άνθρακα. Ο αριθμός των αληθών μυκηλίων και ψευδομυκηλίων και το μέγεθος των υφών ήταν μεγαλύτερα στην καλλιέργεια της ζύμης σε ελαιόλαδο σε σχέση με τα αντίστοιχα της καλλιέργειας σε γλυκόζη. A B1 Β2 Εικόνα 3.4.1: Κινητική αύξησης και μεταβολή του ειδικού ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου της ζύμης Yarrowia lipolytica, καλλιεργούμενης σε κωνικές φιάλες. Συνθήκες καλλιέργειας: αρχική συγκέντρωση ελαιόλαδου 5,2 g/l, ph 6±0,5, θερμοκρασία 28±1 ο C, ρυθμός ανάδευσης 50 rpm. Σύμβολα: logc λογάριθμος περιεκτικότητας της καλλιέργειας σε κύτταρα (κύτταρα/ml), qo 2 (h -1 ) ειδικός ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου, t (h) χρόνος καλλιέργειας. [30]

A1 A2 B1.1 B1.2 Β2.1 Β2.2 Εικόνα 3.4.2: Μορφολογία της ζύμης Yarrowia lipolytica, καλλιεργούμενης σε ελαιόλαδο και ρυθμό ανάδευσης 50 rpm. A1-A2: Εκθετική φάση. Β1.1-Β2.2: Στάσιμη φάση. Μεγέθυνση x100. [31]

3.5 Εικόνες της Y. lipolytica από το Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης Εικόνα 3.5.1: Ψευδομυκήλιο και μεμονωμένα κύτταρα της ζύμης Yarrowia lipolytica, καλλιεργούμενης σε γλυκόζη και ρυθμό ανάδευσης 50 rpm. Μεγέθυνση x5000. [32]

Εικόνα 3.5.2: Κύτταρα της ζύμης Yarrowia lipolytica, καλλιεργούμενης σε γλυκόζη και ρυθμό ανάδευσης 50 rpm. Μεγέθυνση x3000. [33]

Εικόνα 3.5.3: Αληθές μυκήλιο και μεμονωμένα κύτταρα της ζύμης Yarrowia lipolytica, καλλιεργούμενης σε ελαιόλαδο και ρυθμό ανάδευσης 50 rpm. Μεγέθυνση x5000. [34]

Εικόνα 3.5.4: Αληθές μυκήλιο και μεμονωμένα κύτταρα της ζύμης Yarrowia lipolytica, καλλιεργούμενης σε ελαιόλαδο και ρυθμό ανάδευσης 50 rpm. Μεγέθυνση x1900. [35]

4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η επίδραση της φύσης της πηγής άνθρακα και του διαλυμένου οξυγόνου στην εμφάνιση του φαινομένου του διμορφισμού στη ζύμη Yarrowia lipolytica. Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν ένα υδρόφιλο (γλυκόζη) κι ένα υδρόφοβο (ελαιόλαδο) υπόστρωμα, σε θρεπτικό υλικό περιοριστικό ως προς την πηγή αζώτου και σταθερό ph (6±0,5). Οι κύκλοι αύξησης του μικροοργανισμού παραγματοποιήθηκαν υπό αερόβιες συνθήκες και σε διαφορετικούς ρυθμούς ανάδευσης της καλλιέργειας, άρα διαφορετικές συγκεντρώσεις διαλυμένου οξυγόνου. Γενικά, η φύση της πηγής άνθρακα που χρησιμοποιείται (και όχι η συγκέντρωσή της), θεωρείται ως ένας σημαντικός παράγοντας στη μορφολογία της Y. lipolytica. Ωστόσο, τα αποτελέσματα που προκύπτουν κάθε φορά, μπορεί να είναι αμφιλεγόμενα (Papanikolaou et al., 2009). Για παράδειγμα, σε κάποιες μελέτες αναφέρεται ότι η ανάπτυξη στελεχών Y. lipolytica κυρίως σε νηματοειδή μορφή, ενισχύθηκε από την παρουσία λίπους στο θρεπτικό μέσο (Oswal et al., 2002; Papanikolaou et al., 2007). Αντίθετα, η καλλιέργεια στελεχών Y. lipolytica σε άλλα υδρόφοβα υποστρώματα (π.χ. αλκάνια) ή γλυκερόλη φάνηκε να ευνοεί την ανάπτυξη του μικροοργανισμού με τη μορφή της ζύμης (Zinjarde and Pant, 1998; Papanikolaou et al., 2002). Σε άλλες μελέτες, διαφορετικά στελέχη Y. lipolytica καλλιεργούμενα σε υδρόφιλα θρεπτικά μέσα (π.χ. γλυκόζη, κιτρικό οξύ), έδειξαν αξιοσημείωτο σχηματισμό μυκηλίου (Perez-Campo and Dominguez, 2001; Ruiz-Herrera and Sentandreu, 2002). Στην παρούσα μελέτη, η μορφολογία της ζύμης Y. lipolytica επέδειξε παρόμοια χαρακτηριστικά τόσο με τη γλυκόζη όσο και με το ελαιόλαδο ως πηγή άνθρακα. Και στις δύο περιπτώσεις διαπιστώθηκε μετάβαση του μικροοργανισμού από τη μορφή της ζύμης στη μυκηλιακή, γεγονός που έρχεται σε συμφωνία και με τα παρατηρούμενα από τη βιβλιογραφία αποτελέσματα άλλων ερευνητών. Έχουν γίνει κάποιες μελέτες που αναδεικνύουν τη σπουδαιότητα της μορφολογίας της Y. lipolytica για την αποδόμηση των υδρογονανθράκων. Παρόλο που ο μικροοργανισμός αυτός είναι διμορφικός, έχει επιβεβαιωθεί ότι η μορφή της [36]