ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ: ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Επιβλέπουσα Καθηγήτρια: κα. Μουζάκη Αθανασία, Αναπ/τρια καθηγήτρια Σακελλαράκη Παναγιώτα ΑΜ: 362 ΠΑΤΡΑ 2007
Μέλη Τριμελούς Εξεταστικής - Συμβουλευτικής Επιτροπής Αθανασία Μουζάκη Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Πατρών Επιβλέπουσα Καθηγήτρια Μαρίνα Καρακάντζα Επίκουρη Καθηγήτρια Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Πατρών Μαρία Λαμπροπούλου Μαρμάρα Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών 2
ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ 1. ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ 1.1 Γενικά 1.2 Ιστορική αναδρομή 1.3 Αρχές λειτουργίας κυτταρομετρίας ροής 2. ΙΔΙΟΠΑΘΗΣ ΘΡΟΜΒΟΠΕΝΙΚΗ ΠΟΡΦΥΡΑ (ΙΤΡ) 2.1 Γενικά 6 7 7 7 8 11 11 2.2 Ιστορική αναδρομή 12 2.3 Συμπτώματα και διάγνωση της ιδιοπαθούς θρομβοπενικής 14 πορφύρας 2.4 Παθοφυσιολογία της ιδιοπαθούς θρομβοπενικής πορφύρας 16 Μοριακός μιμητισμός και διασταυρούμενες αντιδράσεις 17 «Κρυφοί» επίτοποι 17 Αδυναμία ανοχής αυτοαντιγόνων από τα Τ λεμφοκύτταρα 18 Αδυναμία ανοχής αυτοαντιγόνων από τα Β λεμφοκύτταρα 19 Κυτταρική επικοινωνία 20 Κυτταροκίνες 22 Κυτταροτοξικότητα 24 Παραγωγή μεγακαρυοκυττάρων στο μυελό των οστών 24 2.5 Θεραπευτικές προσεγγίσεις στην ιδιοπαθή θρομβοπενική 25 πορφύρα Χορήγηση στεροειδών και ανοσοσφαιρινών 25 Σπληνεκτομή 26 Άλλες θεραπευτικές προσεγγίσεις 27 3. Τ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ 28 3.1 Γενικά 28 3
3.2 Ρυθμιστικά κύτταρα και αυτοανοσία 32 3.3 Φυσικά Τ ρυθμιστικά κύτταρα 33 Γενικά Φαινότυπος φυσικών Τ ρυθμιστικών κυττάρων Υποδοχέας ιντερλευκίνης-2 (CD25) 34 CD28 και CTLA-4 35 Μέλη της οικογένειας TNFR 36 Υποδοχέας ιντερλευκίνης-7 (CD127) 37 Toll-like receptors (TLRs) Τransforming growth factor-β (TGF-β) Παραγωγή φυσικών Τ ρυθμιστικών κυττάρων 39 Μηχανισμός δράσης φυσικών Τ ρυθμιστικών κυττάρων 3.4 Επαγώγιμα Τ ρυθμιστικά κύτταρα Τύπου Ι επαγώγιμα ρυθμιστικά κύτταρα (Tr1) Άλλοι τύποι επαγώγιμων ρυθμιστικών κυττάρων 3.5 Θεραπευτική χρήση ρυθμιστικών Τ κυττάρων 4. Ο ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ FoxP3 52 4.1 Γενικά 52 4.2 Δομή 53 4.3 FoxP3 και ρυθμιστικά κύτταρα 55 4.4 Ρόλος του FoxP3 στη βιολογία των ρυθμιστικών κυττάρων 57 4.5 FoxP3 και NFAT 61 5. ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 5.1 Ασθενείς και υγιείς δότες 5.2 Αντιδραστήρια και Αντισώματα 68 5.3 Προσδιορισμός Τ ρυθμιστικών κυττάρων σε ολικό περιφερικό αίμα με κυτταρομετρία ροής 33 33 38 38 40 43 45 46 48 64 64 68 4
Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής 70 5.4 Προσδιορισμός του υποδοχέα της ιντερλευκίνης 7 (CD127) στα Τ 71 ρυθμιστικά κύτταρα περιφερικού ολικού αίματος με κυτταρομετρία ροής. Διαδικασία σήμανσης επιφάνειας με CD127 71 Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής 72 5.5 Προσδιορισμός πλήρους ανοσοφαινότυπου επιφανείας 74 λεμφοκυττάρων ολικού περιφερικού αίματος με κυτταρομετρία ροής. Διαδικασία πλήρους ανοσοφαινοτύπησης επιφάνειας 74 Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής 75 5.6 Προσδιορισμός ενδοκυττάριων κυτταροκινών, INF-γ, IL-2, IL-4, IL- 77 10 σε λεμφοκύτταρα ολικού περιφερικού αίματος με κυτταρομετρία ροής. Καλλιέργεια μικρής διάρκειας 77 Ενδοκυττάρια χρώση κυτταροκινών 78 Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής 81 6. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 6.1 Μέτρηση του συνολικού αριθμού λευκών αιμοσφαιρίων και του απόλυτου αριθμού λεμφοκυττάρων 6.2 Μέτρηση των Τ ρυθμιστικών λεμφοκυττάρων 87 6.3 Μέτρηση αντιγόνων επιφανείας 92 6.4 Μέτρηση ενδοκυττάριων κυτταροκινών INF-γ, IL-2, IL-4, IL-10 97 7. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ- ΣΥΖΗΤΗΣΗ 104 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 107 87 87 5
ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η εργασία αυτή εκπονήθηκε στο εργαστήριο κυτταρομετρίας ροής του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών. Φτάνοντας λοιπόν στη συγγραφή της παρούσας εργασίας αισθάνομαι πραγματικά την ανάγκη να ευχαριστήσω ιδιαίτερα κάποιους ανθρώπους που μου έδωσαν τη δυνατότητα να την ξεκινήσω, με στήριξαν κατά τη διάρκεια εκπόνησης της και με βοήθησαν να την φέρω εις πέρας. Την επιβλέπουσα καθηγήτρια μου κα. Αθανασία Μουζάκη για το καθορισμό του θέματος αυτής της μελέτης, για τη σωστή και δημιουργική καθοδήγηση της κατά τη διάρκεια αυτής, καθώς και για τις ώρες που πάντα πρόθυμα μου αφιέρωσε συμβουλεύοντας με στις προκύπτουσες δυσκολίες. Τη κα. Μαρίνα Καρακάντζα η οποία με μύησε στη χρήση της κυτταρομετρίας ροής και τα μυστικά αυτής. Η πολύτιμη βοήθεια της βέβαια δεν περιορίστηκε μόνο σε ερευνητικό, συμβουλευτικό και εκπαιδευτικό επίπεδο, αλλά εξελίχθηκε σε μια πολύτιμη για εμένα προσωπική σχέση. Τη κα. Μαρία Λαμπροπούλου-Μαρμάρα, καθηγήτρια μου στο μεταπτυχιακό πρόγραμμα σπουδών του τμήματος βιολογίας που με ιδιαίτερη προθυμία και ευχαρίστηση δέχθηκε να συμμετάσχει στην τριμελή εξεταστική επιτροπή, καθώς και για τις πολύτιμες συμβουλές της κατά τη συγγραφή της παρούσας εργασίας. Τον κ. Γιώργο Θεοδώρου που με ιδιαίτερη προθυμία μου προσέφερε τις γνώσεις, την εργαστηριακή του εμπειρία και τον περιορισμένο λόγω φόρτου εργασίας χρόνο του προκειμένου να στηθούν οι μέθοδοι που συγκροτούν τη παρούσα εργασία. Την ειδικευόμενη ιατρό του αιματολογικού τμήματος της παθολογικής κλινικής του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών Παλασοπούλου Μαρία για την πολύτιμη βοήθεια της στη συλλογή των δειγμάτων και του ιστορικού των ασθενών. Το φίλο και συνεργάτη μου Ιωάννη Παναγούλια για την παραγωγική μας συνεργασία και τη πολύτιμη φιλία του. Όλα τα μέλη του εργαστηρίου κυτταρομετρίας ροής για το ευχάριστο κλίμα συνεργασίας που συνέβαλε στο να περνούν ευχάριστα οι πολλές ώρες παραμονής στο εργαστήριο. Τέλος, την οικογένεια μου, για την πολύτιμη ηθική και ουσιαστική συμπαράσταση της, τα εφόδια που όλα αυτά τα χρόνια μου εξασφάλισε και την αμέριστη συμπαράσταση της καθ όλη τη διάρκεια αυτή της πορείας. 6
1. ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ 1.1 Γενικά Η κυτταρομετρία ροής αποτελεί μια αυτοματοποιημένη μέθοδο ανάλυσης των φυσικών και χημικών ιδιοτήτων κυττάρων που βρίσκονται σε εναιώρημα συνεχόμενης ροής. Η ανάλυση αυτή γίνεται με βάση τον σκεδασμό που εμφανίζουν τα κύτταρα σε συνδυασμό με τον φθορισμό που προκύπτει από τη σήμανση με κατάλληλες φθορίζουσες ουσίες. Η ανάπτυξη της μας έδωσε τη δυνατότητα της πολυπαραμετρικής ανάλυσης των μοριακών, λειτουργικών και βιοχημικών δεδομένων των κυττάρων. Η κυτταρομετρία ροής ως τεχνική εμφανίζει μοναδικά πλεονεκτήματα σε σχέση με άλλες τεχνικές όπως υψηλή ταχύτητα ανάλυσης, υψηλή ευαισθησία, μεγάλη ποικιλία υλικών που μπορούν ν αναλυθούν, δυνατότητα τυποποίησης σπάνιων πληθυσμών καθώς και ασθενών αντιγόνων, και τέλος όπως αναφέρθηκε παραπάνω δυνατότητα πολυπαραμετρικής ανάλυσης. Η ραγδαία εξέλιξη που παρατηρείται τη τελευταία δεκαετία, στη τεχνολογία των κυτταρομετρητών, τη παραγωγή φθοροχρωμάτων αλλά και την εξέλιξη των ηλεκτρονικών υπολογιστών και των λογισμικών ανάλυσης των δεδομένων ενδυνάμωσε τις δυνατότητες της κυτταρομετρίας, καθιστώντας την αναπόσπαστο κομμάτι τόσο της κλινικής πράξης, όσο και των ερευνητικών δραστηριοτήτων. [1, 2, 3,12] 1.2 Ιστορική αναδρομή Η πρώτη περιγραφή του πρόδρομου των σημερινών κυτταρομετρητών έγινε το 1947 κατά τη διάρκεια του 2 ου Παγκοσμίου πολέμου από τον Gucker. Επρόκειτο για ένα όργανο με δυνατότητα ανίχνευσής βακτηριδίων και σπόρων στον αέρα. Η αρχή λειτουργίας του συγκεκριμένου οργάνου χρησιμοποιήθηκε το 1956 από τον Coulter για τη κατασκευή του πρώτου αυτοματοποιημένου αναλυτή των έμμορφων συστατικών του αίματος. Η δεκαετία 1950-1960 έπαιξε καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη των κυτταρομετρητών χάρη στη πρόοδο της επιστήμης στο τομέα των ηλεκτρονικών υπολογιστών, την ανάπτυξη φθοροχρωμάτων καθώς και τη δημιουργία του μικροσκοπίου φθορισμού. Το 1960 ο Louis Kamentsky σε συνεργασία και με άλλους επιστήμονες κατασκεύασε τον πρώτο ολοκληρωμένο κυτταρομετρητή ροής με δυνατότητα αναγνώρισης των κυτταρικών πληθυσμών και στατιστικής ανάλυσης των αποτελεσμάτων. 7
Παράλληλα ο Mack Fulwyer παρουσιάζει μια συσκευή διαχωρισμού των κυτταρικών πληθυσμών με βάση το μέγεθος τους, ο Hullet εισάγει τη χρήση φθοριζουσών ουσιών, ο Van Dilla χρησιμοποιεί για πρώτη φορά την πηγή ακτίνων laser, οι Crosland και Taylor εφαρμόζουν τις τεχνικές υδροδυναμικής εστίασης, ενώ οι Dittrich και Godhe εισάγουν τη χρήση ιστογραμμάτων για τη περιγραφή των αποτελεσμάτων. Στη δεκαετία του 1970 ξεκινά η κατασκευή εμπορευματοποιημένων πλέον κυτταρομετρητών (1973 Beckton Dickinson, 1975 Coulter Electronics, 1978 Ortho). Σήμερα ο ανταγωνισμός μεταξύ των εταιρειών και η εξέλιξη της τεχνολογίας έχει οδηγήσει στη κατασκευή κυτταρομετρητών ροής με πολλαπλές φωτεινές πηγές laser και τη χρήση μέχρι και 21 διαφορετικών φθοροχρωμάτων. [80, 81, 82, 83, 87] 1.3 Αρχές λειτουργίας κυτταρομετρίας ροής Οι κυτταρομετρητές ροής αποτελούνται από τα εξής τρία βασικά συστήματα: 1) υδροδυναμικό σύστημα ροής 2) οπτικό σύστημα 3) ηλεκτρονικό σύστημα ανάλυσης δεδομένων (www.pardue.com) Εικόνα 1: Τα τρία βασικά συστήματα ενός κυτταρομετρητή ροής Το υδροδυναμικό σύστημα ροής που διαφορετικά ονομάζεται και σύστημα fluidics, περιλαμβάνει τη κεντρική κυψελίδα ροής που λειτουργεί σαν κανάλι μέσα στο οποίο ρέει το κυτταρικό εναιώρημα, περιβαλλόμενο από 8
ισότονο διάλυμα (sheath fluid). Σε αυτό ακριβώς το σημείο η εφαρμογή της θεωρίας της υδροδυναμικής εστίασης επιτυγχάνει την μονήρη ροή των κυττάρων μέσω της κυψελίδας. Η υδροδυναμική εστίαση επιτυγχάνεται με κατάλληλη ρύθμιση των ταχυτήτων τόσο του δείγματός όσο και του ισότονου διαλύματος. Στην έξοδο αυτού του ρύγχους όπου τα κύτταρα εξέρχονται ένα ένα προσπίπτει κάθετα η ακτίνα laser. (www.pardue.com) Εικόνα 2: Αναπαράσταση του υδροδυναμικού συστήματος ροής. Το οπτικό σύστημα περιλαμβάνει μονοχρωματικές πηγές φωτός που είναι γνωστές σε όλους μας με την ονομασία laser (μία ή και περισσότερες), καθώς και ένα πολύπλοκο σύστημα φακών, φωτοανιχνευτών και φωτοπολλαπλασιαστών. Με την πρόσκρουση της ακτίνας laser επάνω στα κύτταρα καθώς αυτά εξέρχονται από τη κυψελίδα ροής ένα ένα προκαλείται πρόσθιος σκεδασμός (forward scatter) που αντιστοιχεί στο μέγεθος τους και πλάγιος σκεδασμός (side scatter) που αφορά στην κοκκίωση τους, την πυκνότητα δηλαδή του εσωτερικού τους περιεχομένου. Κατ αυτό τον τρόπο γίνεται ο αρχικός διαχωρισμός των κυτταρικών πληθυσμών. Επιπλέον η ακτίνα laser προκαλεί διέγερση στις φθορίζουσες χρωστικές με τις οποίες είναι σημασμένα τα κύτταρα προκαλώντας την εκπομπή σήματος διαφορετικού μήκους κύματος για κάθε μία από αυτές. 9
(www.google.com) Εικόνα 3: Οι βασικές παράμετροι μέτρησης ενός κυτταρομετρητή ροής. Η συλλογή των φωτεινών σημάτων και η διοχέτευση τους στο ηλεκτρονικό σύστημα του κυτταρομετρητή επιτυγχάνεται με ένα πολύπλοκο σύστημα φακών, φωτοανιχνευτών και φωτοπολλαπλασιαστών. Όπως είναι αναμενόμενο η χρήση περισσότερων φθορίζουσων χρωστικών καθιστά πολυπλοκότερη την ανάλυση και τη διαδικασία διαχωρισμού και πιθανής επικάλυψης της εκπομπής φθορισμού των επιμέρους χρωστικών. Η διαδικασία αφαίρεσης των κοινών περιοχών μήκους κύματός εκπομπής των επιμέρους χρωστικών είναι απαραίτητη για μία σωστή ανάλυση και είναι γνωστή ως compensation. (www.google.com) 10
Εικόνα 4: Σχηματική απεικόνιση των επικαλυμμένων περιοχών εκπομπής. Το ηλεκτρονικό σύστημα ανάλυσης δεδομένων είναι απαραίτητο για τη μετατροπή των φωτεινών σημάτων σε πληροφορίες καθώς και για την ανάλυση των δεδομένων. Υπάρχουν διαφορετικοί τύποι ηλεκτρονικών συστημάτων και λογισμικών που τα συνοδεύουν και κάθε εταιρεία επιλέγει το ποια είναι αυτά που σε κάθε περίπτωση είναι καταλληλότερα. Υπάρχουν επίσης διαφορετικοί τρόποι απεικόνισης των αποτελεσμάτων, όπως για παράδειγμα ιστογράμματα ή στικτογράμματα, χρησιμοποιώντας διαφορετικές παραμέτρους σε κάθε άξονα όπως τον πρόσθιο ή τον πλάγιο σκεδασμό που μεταφράζονται σε μέγεθος και κοκκίωση αντίστοιχα, ή την ένταση του φθορισμού. Η ανάλυση αυτή μπορεί να περιλαμβάνει και περισσότερες της μίας παραμέτρους.[84, 85, 86, 87] Εικόνα 5: Παραδείγματα ιστογράμματος και στικτογράμματος αντίστοιχα, που προέρχονται από ανάλυση αποτελεσμάτων σε κυτταρομετρητή ροής. 2. ΙΔΙΟΠΑΘΗΣ ΘΡΟΜΒΟΠΕΝΙΚΗ ΠΟΡΦΥΡΑ (ΙΤΡ) 2.1 Γενικά Η ιδιοπαθής θρομβοπενική πορφύρα (ΙΤΡ) είναι ένα επίκτητο αυτοάνοσο νόσημα που χαρακτηρίζεται από τη παραγωγή αντισωμάτων έναντι αντιγόνων που βρίσκονται στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων με αποτέλεσμα τη καταστροφή τους. Αυτή η καταστροφή των αιμοπεταλίων οδηγεί στην εμφάνιση αιμορραγιών που μπορούν να αποβούν ακόμα και μοιραίες για τον ασθενή. Η ονομασία της νόσου περιγράφει τα κυριότερα χαρακτηριστικά αυτής, ιδιοπαθής διότι τα ακριβή αίτια που την προκαλούν παραμένουν άγνωστα, θρομβοπενική διότι κύριο χαρακτηριστικό της είναι ο μειωμένος αριθμός αιμοπεταλίων στο αίμα, πορφύρα λόγω των αιμορραγικών κηλίδων 11
και των πετέχειων που εμφανίζονται στο δέρμα των ασθενών. Η ιδιοπαθής θρομβοπενική πορφύρα χωρίζεται σε δύο επιμέρους κατηγορίες: 1) Χρόνια ιδιοπαθή θρομβοπενική πορφύρα 2) Οξεία ιδιοπαθή θρομβοπενική πορφύρα Η χρόνια μορφή της νόσου συναντάται κυρίως στους ενήλικες και παραμένει τις περισσότερες φορές με κατάλληλη θεραπευτική αγωγή υπό έλεγχο, ενώ η οξεία εμφανίζεται κατά κύριο λόγο στα παιδιά μερικές βδομάδες μετά από ιϊκή μόλυνση. Γενικότερα η ΙΤΡ φαίνεται ότι είναι πιο συχνή στα παιδιά καθώς το 40% του συνόλου των ασθενών είναι παιδιά ηλικίας κάτω των δέκα ετών. Η παιδική ΙΤΡ επηρεάζει εξίσου άτομα και των δύο φύλων, ενώ στους ενήλικες η αναλογία των γυναικών προς τους άνδρες είναι 3:1. Μέχρι και σήμερα η αιτιολογία της πάθησης αυτής παραμένει άγνωστη και η παθογένεια της ιδιαίτερα πολύπλοκη. Τα πιθανότερα αίτια της φαίνεται ότι αφορούν ανωμαλίες στην αντιγονοπαρουσίαση, στην ενεργοποίηση και τη μεταγωγή σήματος των Τ λεμφοκυττάρων, απορύθμιση των Β λεμφοκυττάρων και των αντισωμάτων που αυτά παράγουν, ανωμαλίες στην ενεργοποίηση και καταστολή της δράσης του συμπληρώματος, και τέλος στην απορύθμιση της απόπτωσης. Παρότι λοιπόν κύριο χαρακτηριστικό της νόσου είναι η παραγωγή αυτοαντισωμάτων από τα Β λεμφοκύτταρα έναντι των αιμοπεταλίων, έχουν παρατηρηθεί και άλλες ανοσολογικές ανωμαλίες που αφορούν τόσο τα Τ λεμφοκύτταρα όσο και τις κυτταροκίνες που συμμετέχουν στην ανοσολογική απόκριση. Για το λόγο αυτό στη παρούσα ερευνητική εργασία γίνεται διερεύνηση των πληθυσμών των Τ λεμφοκυττάρων με κύρια έμφαση στα ρυθμιστικά Τ λεμφοκύτταρα, καθώς και προσδιορισμός των κυτταροκινών που εκκρίνονται. [1, 2, 3, 4] 2.2 Ιστορική αναδρομή Οι πρώτες αναφορές σε νόσημα του οποίου τα κλινικά χαρακτηριστικά μοιάζουν με αυτά της ιδιοπαθούς θρομβοπενικής πορφύρας προέρχονται από τους αρχαίους ήδη χρόνους. Ο Ιπποκράτης και ο Γαληνός 12
αναφέρουν σαν κλινικό σύμπτωμα τη παρουσία «κόκκινων κηλίδων» την οποία όμως συσχέτιζαν με την εμφάνιση πυρετού. Το 10 ο αιώνα ο Άραβας θεραπευτής Avicenna περιγράφει τη νόσο στη χρόνια μορφή της. Η πορφύρα προσδιορίστηκε σαν κλινικό σύνδρομο κατά τους 16 ο,17 ο και 18 ο αιώνες. Πιο συγκεκριμένα, το 1580 Amatus Lusitanus αποσυνδέει το νόσημα από τη ταυτόχρονη παρουσία πυρετού. Το 1658 ο Lazarus de la Riviere, ιατρός του βασιλιά της Γαλλίας, αποδίδει τη παρουσία της νόσου στη χαμηλή πυκνότητα του αίματος, ενώ το 1735 ο Paul Gottleib Werlhof περιγράφει τη πρώτη κλασσική περίπτωση της νόσου. Εβδομήντα περίπου χρόνια αργότερα ο Robert Willan στο βιβλίο του με τίτλο «On Cutaneous Diseases» κατηγοριοποιεί τη πορφύρα σε τέσσερις υποκατηγορίες εκ των οποίων αυτή που ήταν ταυτόσημη με τη σημερινή ιδιοπαθή θρομβοπενική πορφύρα περιγραφόταν ως «Purpura Hemmorrhagica» με χαρακτηριστική την αιμορραγία από τις μεμβράνες των βλεννογόνων. Η πρόοδος που ακολούθησε στον τομέα της μικροσκοπίας κατά τον 19 ο αιώνα οδήγησε στην ανακάλυψη των αιμοπεταλίων και κατά συνέπεια στο προσδιορισμό της θρομβοκυτταροπενίας που χαρακτήριζε τη νόσο. Έτσι, το 1842 στο Παρίσι ο Alfred Donne περιέγραψε ένα νέο στοιχείο του αίματος που πιθανότατα ήταν τα γνωστά μας σήμερα αιμοπετάλια. Λίγα χρόνια αργότερα το 1874 ο Καναδός William Osler περιγράφει «άχρωμες σφαιρικές μάζες» στο αίμα στις οποίες όταν αφαιρεθούν από τη κυκλοφορία παρατηρείται συγκόλληση. Κατόπιν, το 1883 ο Giulio Bizzozero στην εργασία του με τίτλο «On a new morphological element of blood» αναφέρει την ύπαρξη και περιγράφει το ρόλο και τη δομή των αιμοπεταλίων, καταλήγοντας ότι σχετίζονται άμεσα με τη πήξη του αίματος, ενώ δύο χρόνια αργότερα ο Krauss στη Γερμανία συσχετίζει τη «Purpura Hemorrhagica» του Willan με την παρουσία χαμηλού αριθμού αιμοπεταλίων στο αίμα των ασθενών. Η πρώτη πραγματική μέτρηση αιμοπεταλίων σε ασθενή με ΙΤΡ πραγματοποιείται το 1889 στο Παρίσι από τον George Hayem και ένα χρόνο αργότερα περιγράφονται για πρώτη φορά τα μεγακαρυοκύτταρα. Κατά τον 20 ο αιώνα μελετήθηκε και έγινε σαφέστερη η παθοφυσιολογία της νόσου, διασαφηνίστηκαν τα κλινικά συμπτώματα και αναπτύχθηκαν θεραπείες για την αποτελεσματική αντιμετώπιση της. Στο δεύτερο μισό του ίδιου αιώνα δόθηκε ιδιαίτερη έμφαση στα χαρακτηριστικά αυτοάνοσου νοσήματος που εμφάνιζε καθώς και στη διερεύνηση της ανοσολογικής απορύθμισης με την οποία φαινόταν ότι σχετίζεται. Επιπλέον έγιναν συντονισμένες προσπάθειες για την ανάπτυξη διαγνωστικών τεστ και την εφαρμογή νέων θεραπειών. Αναλυτικότερα, το 1910 ο Wright προσδιορίζει τη σχέση μεταξύ μεγακαρυοκυττάρων και αιμοπεταλίων και ο Ε. Frank συσχετίζει τα μεγακαρυοκύτταρα με τη θρομβοπενική πορφύρα, 13
υπογραμμίζοντας ότι δεν παρατηρείται μείωση του αριθμού τους στους ασθενείς. Τα πρώτα χρόνια του 20 ου αιώνα επικρατούν δύο βασικές θεωρίες σχετικά με την αιτιολογία της νόσου: η πρώτη με υποστηριχτή τον Ε. Frank απέδιδε τη νόσο στη μειωμένη παραγωγή αιμοπεταλίων, ενώ η δεύτερη με υποστηριχτές τους Minot και Kaznelson στον υψηλό ρυθμό καταστροφής τους. Καθώς οι μεταγγίσεις δεν είχαν το επιθυμητό αποτέλεσμα η θεωρία του Kaznelson σχετικά με τον υψηλό ρυθμό καταστροφής των αιμοπεταλίων στο σπλήνα οδηγεί στη πρώτη σπληνεκτομή το 1916. Η επιτυχία του εγχειρήματος καθιέρωσε τη σπληνεκτομή ως κύριο τρόπο θεραπείας. Τα κλασσικά πειράματα του Harringhton το 1951 έδωσαν νέα τροπή στην άποψη των επιστημόνων. Στα πειράματα αυτά ο Harringhton χορήγησε πλάσμα ασθενών σε υγιή άτομα και παρατήρησε ότι εμφάνισαν τα συμπτώματα της νόσου. Τα αποτελέσματα αυτού του πειράματος αποδόθηκαν από τον Evans και τους συνεργάτες του στη παρουσία αυτοαντισωμάτων. Από αυτή τη χρονική στιγμή και μετά «ξυπνά» η ιδέα ότι πιθανότατα πρόκειται για αυτοάνοσο νόσημα και ξεκινούν μελέτες που αφορούν στην ανοσολογική πλευρά της νόσου. Επιπλέον το 1951 γίνεται διαχωρισμός μεταξύ χρόνιας και οξείας νόσου, ενώ χορηγούνται για πρώτη φορά κορτικοστεροειδή ως θεραπεία. Ακολουθούν μετρήσεις και κατηγοριοποιήσεις αντισωμάτων που σχετίζονται με τα αιμοπετάλια, μελέτες σχετικά με τους στόχους που έχουν τα εκάστοτε αυτοαντισώματα, με την απορύθμιση του ανοσοποιητικού συστήματος, τους υποπληθυσμούς λεμφοκυττάρων, την έκκριση κυτταροκινών και λοιπά. Παράλληλα, δημιουργούνται και δοκιμάζονται πολλοί νέοι παράγοντες με σκοπό τη θεραπεία παρότι η χορήγηση κορτικοστεροειδών, ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων και η σπληνεκτομή παραμένουν οι κύριοι τρόποι αντιμετώπισης. [ 5, 6] 2.3 Συμπτώματα και διάγνωση της ιδιοπαθούς θρομβοπενικής πορφύρας Τα συμπτώματα που παρατηρούνται σε ασθενείς είναι απόρροια του χαμηλού αριθμού αιμοπεταλίων. Όσο χαμηλότερες είναι οι τιμές των αιμοπεταλίων, τόσο εντονότερα και εμφανέστερα γίνονται τα συμπτώματα. Ανάλογα με τη βιαιότητα της νόσου και την ιδιοσυγκρασία του ασθενούς τα συμπτώματα αυτά ποικίλουν. Μεταξύ των πιο κοινών είναι η εμφάνιση αιμορραγικών κηλίδων (μώλωπες) στο δέρμα. Η παρουσία τους οφείλεται σε αιμορραγία μικρών αγγείων κάτω από το δέρμα και είναι συχνότερη στις αρθρώσεις όπου δημιουργούνται λόγω της κίνησης. Μικρότερης έκτασης 14
αιμορραγίες κάνουν την εμφάνιση τους στο δέρμα με τη μορφή πετεχειών, μικρών κόκκινων κηλίδων. (www.google.com) Εικόνα 6: Εμφάνιση αιμορραγικών κηλίδων (μώλωπες) και πετεχειών αντίστοιχα σε ασθενείς με ΙΤΡ. Σε ορισμένους ασθενείς παρατηρούνται ρινορραγίες, αιμορραγία στο στόμα και γύρω από τα ούλα, εμφάνιση αίματος σε βιολογικά υγρά όπως στα ούρα. Το σοβαρότερο των συμπτωμάτων είναι η ενδοκρανιακή αιμορραγία που μπορεί να είναι μοιραία για τη ζωή του ασθενούς. Παλαιότερες μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί δείχνουν ότι το ποσοστό των ασθενών που πεθαίνουν από τη νόσο ανέρχεται στο 5%. Αν συνυπολογίσουμε δε τη πρόοδο και την εξέλιξη των θεραπευτικών μεθόδων που έχουν αναπτυχθεί τα τελευταία χρόνια το ποσοστό αυτό κατά πάσα πιθανότητα είναι ακόμα μικρότερο. [77, 78] Δεδομένου ότι τα συμπτώματα της ΙΤΡ είναι παρόμοια με άλλων ασθενειών ο ασφαλέστερος τρόπος για να γίνει διάγνωση της νόσου είναι μέσω αποκλεισμού όλων των πιθανών περιπτώσεων που θα μπορούσαν να δικαιολογούν μια θρομβοπενία όπως για παράδειγμα η λήψη συγκεκριμένων φαρμακευτικών σκευασμάτων, κληρονομικότητα, λευχαιμίες, άλλα αυτοάνοσα νοσήματα και λοιπά. Όπως έχει ήδη αναφερθεί η πρώτη ένδειξη είναι ο χαμηλός αριθμός αιμοπεταλίων στο περιφερικό αίμα που μετράται με μία απλή γενική εξέταση αίματος. Επόμενο πολύ σημαντικό βήμα για τον αποκλεισμό άλλων πιθανών αιτίων που δικαιολογούν μια θρομβοπενία είναι η λήψη ενός πλήρους ιατρικού ιστορικού (παρουσία αιμορραγικών τάσεων κατά το παρελθόν, θρομβοπενίες σε πρόσωπα του συγγενικού περιβάλλοντος, εμφάνιση πυρετού και λοιπά) και αναλυτική καταγραφή φαρμακευτικών σκευασμάτων που τυχόν λαμβάνει ο ασθενής. Ακολουθεί φυσική εξέταση για τυχόν παρουσία αιμορραγικών κηλίδων και πετεχειών στο δέρμα ή τις βλεννώδεις μεμβράνες, σημάδια 15
αιμορραγίας στο στόμα και στα ούλα, ψηλάφηση του σπλήνα για τυχόν διόγκωση του. Εάν ο σπλήνας παρατηρηθεί διογκωμένος η πιθανότητα ο ασθενής να πάσχει από ΙΤΡ είναι μικρότερη. Πέραν της γενικής εξέτασης αίματος θα πρέπει επίσης να διενεργηθεί μικροσκοπική εξέταση επιχρίσματος περιφερικού αίματος για τυχόν παρουσία ασυνήθιστα μεγάλων αιμοπεταλίων που έρχονται στη κυκλοφορία λόγω της αυξημένης παραγωγής μεγακαρυοκυττάρων στο μυελό των οστών στη προσπάθεια που καταβάλλει ο οργανισμός ν αυξήσει τον αριθμό των αιμοπεταλίων στη περιφέρεια. Επίσης απαραίτητη είναι η διενέργεια όλων εκείνων των εξετάσεων που σχετίζονται με τη πήξη, όπως χρόνος πήξης, χρόνος προθρομβίνης και μερικός χρόνος θρομβοπλαστίνης. Δεδομένου ότι η βλάβη εντοπίζεται στα αιμοπετάλια και όχι στο καταρράκτη της πήξης, ο χρόνος πήξης είναι αυξημένος ενώ ο χρόνος προθρομβίνης και μερικός χρόνος θρομβοπλαστίνης εμφανίζονται φυσιολογικοί. Κλείνοντας το κομμάτι της διάγνωσης δεν θα πρέπει να παραλείψουμε την εξέταση μυελού που θα πρέπει να διενεργείται όταν ο ασθενής είναι πάνω από 60 ετών διότι σε αυτή την ηλικία είναι πιθανή η εμφάνιση μυελοδυσπλασιών, καθώς και σε ασθενείς που πρόκειται να υποβληθούν σε σπληνεκτομή έτσι ώστε να επιβεβαιωθεί η διάγνωση. [77, 78, 79, 88-92] 2.4 Παθοφυσιολογία της ιδιοπαθούς θρομβοπενικής πορφύρας Η μελέτη της παθοφυσιολογίας της ιδιοπαθούς θρομβοπενικής πορφύρας βρίσκεται υπό διερεύνηση εδώ και αρκετά χρόνια χωρίς όμως να έχουν διευκρινιστεί μέχρι και σήμερα πλήρως τα αίτια που τη προκαλούν. Έχει βρεθεί ότι η μείωση του αριθμού των αιμοπεταλίων οφείλεται στην παραγωγή αυτοαντισωμάτων, κυρίως IgG τύπου, έναντι της γλυκοπρωτεΐνης IIb/IIIa. Πρόκειται για μια ιντεγκρίνη που εντοπίζεται στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων και είναι υπεύθυνη για τη φυσιολογική τους συγκόλληση και προσκόλληση στο ενδοθήλιο. Τα αντισώματα που προσδένονται στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων αναγνωρίζονται από τους Fcγ υποδοχείς των μακροφάγων που βρίσκονται στο σπλήνα και σε άλλα μέρη του σώματος με αποτέλεσμα την πιο γρήγορη καταστροφή τους. Ανταποκρινόμενος στο μειούμενο αριθμό αιμοπεταλίων ο μυελός των οστών παράγει μεγαλύτερες ποσότητες μεγακυρυοκυττάρων προς σχηματισμό αιμοπεταλίων. Αυτή η ανωμαλία είναι πιθανότατα αποτέλεσμα δυσλειτουργίας μιας πληθώρας μηχανισμών του κυττάρου, συμπεριλαμβανομένης της αδυναμίας αναγνώρισης των αυτοαντιγόνων και της αυτοανοχής, ανωμαλίες στην έκκριση κυτταροκινών, 16
ελαττωμένη κυτταροτοξικότητα και άλλα, με τα Τ λεμφοκύτταρα να παίζουν ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο στη παθοφυσιολογία της νόσου. Η αποσαφήνιση του συνόλου αυτών των δυσλειτουργιών είναι ιδιαίτερης βαρύτητας για τη κατανόηση της παθοφυσιολογίας της νόσου και την ανάπτυξη νέων θεραπειών. [7] (www.google.com) Εικόνα 7: Πορεία ωρίμανσης προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων προς αιμοπετάλια. Μοριακός μιμητισμός και διασταυρούμενες αντιδράσεις Ένας από τους μηχανισμούς που φαίνεται να παίζει ρόλο στην αναγνώριση αυτοαντισωμάτων είναι ο μοριακός μιμητισμός και οι διασταυρούμενες αντιδράσεις. Με τον όρο μοριακός μιμητισμός περιγράφεται η παρουσία ομοιοτήτων μεταξύ μορίων που παράγονται από διαφορετικά γονίδια. Η παρουσία ενός μικροβίου μπορεί να προκαλέσει αλλοιώσεις στα κύτταρα με συνέπεια την απελευθέρωση αυτοαντισωμάτων που οδηγούν στην ενεργοποίηση της ανοσιακής απόκρισης. Κατόπιν τα προϊόντα αυτής της απόκρισης αναγνωρίζουν άλλα αντιγόνα του ίδιου οργανισμού. Χαρακτηριστικό παράδειγμα τέτοιας μορφής διασταυρούμενης αντίδρασης αποτελεί η μόλυνση από τον ιό της ανεμοβλογιάς σε παιδία που οδηγεί στην εμφάνιση ΙΤΡ. Στο σημείο αυτό θα πρέπει να επισημάνουμε ότι δεν είναι απαραίτητη η συνεχής παρουσία του ξένου αντιγόνου συνεπώς η διασταυρούμενη αυτή αντίδραση μπορεί να πραγματοποιηθεί και μετά την απομάκρυνση του. Υπάρχουν βάσιμες υποψίες ότι πιθανότατα αυτός είναι και ο λόγος που ένα μικρό ποσοστό παιδιών με οξεία νόσο μεταπίπτουν σε χρόνια. Συνεπώς δεν μπορεί να αποκλειστεί η πιθανότητα ακόμα και η χρόνια μορφή της νόσου να προκαλείται λόγω ιϊκής μόλυνσης της οποίας τα συμπτώματα δεν γίνονται εμφανή.[8, 9] «Κρυφοί» επίτοποι Ένας ακόμα μηχανισμός που εμπλέκεται στην αναγνώριση αυτοαντισωμάτων είναι η παρουσία «κρυφών» επίτοπων. Έχει παρατηρηθεί ότι Τ λεμφοκύτταρα που στρέφονται έναντι των αυτοαντιγόνων αναγνωρίζουν 17
«κρυφούς» επίτοπους της γλυκοπρωτεΐνης ΙΙb/ΙΙΙa που δεν προκύπτουν από τα φυσιολογικά μονοπάτια ωρίμανσης της. Πιθανότατα λοιπόν, κάποιοι παράγοντες να εμπλέκονται στη φυσιολογική ωρίμανση των πρωτεϊνών του ίδιου του οργανισμού και να οδηγούν στην «αποκάλυψη» των «κρυφών» αυτών επίτοπων. Φυσιολογικά αυτού του είδους οι επίτοποι δεν εκτίθενται σε αυτοαντιγόνα μπορεί όμως κάτω από συγκεκριμένες περιστάσεις, για παράδειγμα σε μια μόλυνση, να γίνονται «ορατές» και συνεπώς προσβάσιμες. Όταν τέτοιου είδους επίτοποι εκτίθενται σε μία αυτοάνοση αντίδραση, η ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων μπορεί να οδηγήσει σε καταστροφή ιστών. Στην περίπτωση της ιδιοπαθούς θρομβοπενικής πορφύρας τα αιμοπετάλια που φέρουν στην επιφάνεια τους αντισώματα έναντι της γλυκοπρωτεΐνης ΙΙb/IIIa αποικοδομούνται από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Η καταστροφή πρωτεϊνών όπως η ΙΙb/IIIa μπορεί να οδηγήσει στη δημιουργία μιας ποικιλίας «κρυφών» επίτοπων. Τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα που εκφράζουν αυτά τα νέα πεπτίδια σε συνδυασμό με άλλα μόρια, βοηθούν στην ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων έναντι των επιπρόσθετων αυτών αντιγόνων. Επιπλέον, η επαφή των αυτοαντιγόνων με αντιγινοπαρουσιαστικά κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία νέων επίτοπων. Η διαδικασία αυτή είναι γνωστή ως εξάπλωση των επίτοπων και μπορεί να οδηγήσει σε ενίσχυση της φλεγμονώδους αντίδρασης. [10, 11] Αδυναμία ανοχής αυτοαντιγόνων από τα Τ λεμφοκύτταρα Ένα αυτοαντιγόνο μπορεί να βρεθεί στην περιφέρεια όπως αναφέρθηκε παραπάνω είτε ως τροποποιημένο αντιγόνο του ίδιου του οργανισμού είτε μέσω διασταυρούμενων αντιδράσεων. Επιπλέον, υπάρχει η περίπτωση τα αυτοαντιδρώντα CD4+ Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα να «ξεφύγουν» από την επιλογή την οποία κάνει ο θύμος αδένας και έτσι ερχόμενα αυτά τα κύτταρα στην περιφέρεια στρέφονται έναντι αντιγόνων του ίδιου το οργανισμού. Στη περίπτωση της ιδιοπαθούς θρομβοπενικής πορφύρας φαίνεται ότι κάποια τέτοια Τ κύτταρα στρέφονται έναντι πεπτιδίων που προέρχονται από τα φυσιολογικά μονοπάτια ωρίμανσης της GPIIb/IIIa. Προκειμένου λοιπόν να ελαχιστοποιηθεί η πιθανότητα τέτοιων συμβάντων υπάρχουν δυο ζώνες ελέγχου η κύρια ανοχή και η περιφερική ανοχή. Η πρώτη πραγματοποιείται στο θύμο και έχει σαν αποτέλεσμα την άμεση καταστροφή ή αδρανοποίηση αυτοαντιδρώντων Τ λεμφοκυττάρων. Σε περίπτωση που κάποια από αυτά ξεφύγουν από το θύμο ενεργοποιείται η περιφερική ανοχή. Η περιφερική αυτή ανοχή επιτυγχάνεται με διαφορετικούς τρόπους όπως με επαγωγή του κυτταρικού θανάτου μέσω του μονοπατιού 18
Fas/FasL, μπλοκάρισμα μορίων επιφανείας όπως το CTLA-4, ενεργοποίηση Τ ρυθμιστικών κυττάρων και έκκριση κυτταροκινών που εμποδίζουν το πολλαπλασιασμό και την ενεργοποίηση αυτών των αυτοαντιδρώντων Τ λεμφοκυττάρων. Αποτέλεσμα της αποτυχημένης δράσης των μηχανισμών που περιγράφηκαν παραπάνω οδηγεί στη παρουσία αυτοαντιδρώντων Τ κυττάρων στη περιφέρεια που επιτίθενται σε αντιγόνα του ίδιου του οργανισμού. Για το λόγο αυτό στη κλινική πράξη για τη θεραπεία της νόσου γίνεται χρήση ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων.[7,12, 13, 14, 15, 16] www.elsevier.com Εικόνα 8: Σχηματική αναπαράσταση κύριας και περιφερικής ανοχής. Αδυναμία ανοχής αυτοαντιγόνων από τα Β λεμφοκύτταρα Όπως θα ήταν αναμενόμενο ιδιαίτερα σημαντική είναι και η συμμετοχή της αυτοανοχής των Β λεμφοκυττάρων στη παθοφυσιολογία της νόσου, καθώς αυτά είναι υπεύθυνα για την έκκριση των αυτοαντισωμάτων. Όπως συμβαίνει και με τα Τ λεμφοκύτταρα και σε αυτή τη περίπτωση οι μηχανισμοί τόσο της κύριας όσο και της περιφερικής ανοχής ενεργοποιούνται προκειμένου ν αποφευχθεί τυχόν απελευθέρωση αυτοαντιδρώντων Β λεμφοκυττάρων. Ένα από τα πιο σημαντικά στοιχεία που συμμετέχουν στη διατήρηση της ανοχής είναι το FCγIIB. Πρόκειται για ένα από τα τρία γονίδια που κωδικοποιούν τον FCγII υποδοχέα (CD32). Οι FCγ υποδοχείς, παρά το γεγονός ότι η αλληλουχία που αφορά στην εξωκυττάρια περιοχή τους παρουσιάζει πάνω από 95% ομοιότητα έχουν ενδοκυττάριους τομείς που διαφέρουν μεταφέροντας διαφορετικά είδη σημάτων. Αντίθετα οι FCγ 19
υποδοχείς που φέρουν ΙΤΑΜs (συστατικά μόρια που συμμετέχουν στη μεταβίβαση του σήματος) μπορούν να προωθήσουν την εμφάνιση αυτοάνοσων νοσημάτων και να συνεισφέρουν στη διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ των FCγ υποδοχέων που συμμετέχουν στην ενεργοποίηση και τη καταστολή. Πιθανολογείται ότι ο τρόπος με τον οποίο ενεργοποιούνται τ αυτοαντιδρώντα Τ λεμφοκύτταρα περιλαμβάνει την παρουσία κρυφών επίτοπων στη πρωτεΐνη IIb/IIIa καθώς και τη δημιουργία αυτοαντιδρώντων Β κυττάρων λόγω διασταυρούμενων αντιδράσεων. Αναλυτικότερα φαίνεται ότι η παρουσία αυτοαντιδρώντων Β κυττάρων προκύπτει από τη παρουσία μιας ξένης πρωτεΐνης που δρα ως μιμητικό μόριο, προσδένεται και επεξεργάζεται. Στη συνέχεια, στα Τ κύτταρα παρουσιάζονται μικρά χαρακτηριστικά κομμάτια που έχουν απομονωθεί ενώ μπορούν να δημιουργηθούν και παρθένα αυτοαντιδρώντα Τ κύτταρα. Αυτή η άλληλο -ενεργοποίηση μεταξύ Τ και Β κυττάρων έχει σαν αποτέλεσμα τη παραγωγή αυτοαντισωμάτων. Προκειμένου ν ανασταλεί αυτή η αλληλεπίδραση μεταξύ Τ και Β κυττάρών γίνεται χορήγηση ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων όπως κυκλοσπορίνης, κυκλοφωσφαμιδίου και άλλων, καθώς και αντισωμάτων έναντι του CD20 με σκοπό τη μείωση του αριθμού των Β κυττάρων.[17, 18, 19, 20, 21] Κυτταρική επικοινωνία H ενδοκυττάρια επικοινωνία παίζει ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο τόσο στην ενεργοποίηση όσο και στη λειτουργικότητα των Τ, Β κυττάρων και των μακροφάγων. Μέσω ενός συνόλου επιφανειακών μορίων διαφορετικά σήματα που επηρεάζουν το φαινότυπο αυτών των κυττάρων εισέρχονται από το εξωτερικό περιβάλλον στο πυρήνα. Από τα μόρια που έχουν μελετηθεί εκτενώς είναι τα CD40/CD40L, B7/CD28, CTLA-4 και Fas/FasL. Έχει παρατηρηθεί ότι στη περίπτωση της ιδιοπαθούς θρομβοπενικής πορφύρας υπάρχουν αλλαγές στην ενδοκυττάρια επικοινωνία και πιθανώς η μελέτη αυτών των αλλαγών βοηθήσει στην αποσαφήνιση της παθοφυσιολογίας της νόσου. [22, 23] Ένα από τα πιο σημαντικά δευτερογενή σήματα για την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων είναι το Β7/CD28. Πολλές μελέτες υποστηρίζουν ότι η παρεμπόδιση αλληλεπίδρασης των Β7/CD28 συνεισφέρει στη πρόληψη και στη βελτίωση των αυτοάνοσων νοσημάτων. Το μεμβρανικό μόριο CTLA-4 έχει τη δυνατότητα να μεταφέρει το αρνητικό μήνυμα όταν προσδέσει το Β7 και για αυτόν ακριβώς το λόγο θεωρείται πολύ σημαντικός ο ρόλος του στη διατήρηση της περιφερικής ανοχής. Με τον ίδιο τρόπο μπορεί να δράσει και η συνθετική πρωτεΐνη CTLA4-Ig, συνεπώς τόσο το Β7 όσο και η CTLA4-Ig 20
μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πιθανοί μελλοντικοί θεραπευτικοί παράγοντες. [24, 25, 26] Ιδιαίτερα σημαντικός φαίνεται να είναι και ο ρόλος του CD40/CD40L, καθώς η αλληλεπίδραση του CD40L (CD154) στα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα με τον υποδοχέα CD40 που βρίσκεται στην επιφάνεια των Β κυττάρων είναι καθοριστική για το πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των δεύτερων. Το CD154 εντοπίζεται φυσιολογικά ενδοκυττάρια στα αιμοπετάλια ενώ σε χαμηλά ποσοστά στην επιφάνεια αυτών. Όταν τα αιμοπετάλια για κάποιο λόγο ενεργοποιηθούν τότε ακολούθως και η συγκέντρωση του CD154 στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων αυξάνεται. Γίνεται λοιπόν αντιληπτό ότι η παρουσία του στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων μπορεί να είναι ιδιαίτερα σημαντική για την εκδήλωση της νόσου καθώς με αυτόν τον τρόπο ενεργοποιούνται τα Β κύτταρα για τη παραγωγή αυτοαντισωμάτων. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις γίνονται προσπάθειες ανάπτυξης θεραπειών με τη χρήση αντισωμάτων που εμποδίζουν αυτές τις αλληλεπιδράσεις. [28-36] Ένα ακόμα μονοπάτι που φαίνεται να διαφοροποιείται και να συμμετέχει στη παθοφυσιολογία αυτοάνοσων νοσημάτων είναι το Fas/FasL. Το Fas είναι μέλος της υπεροικογένειας των υποδοχέων του ΤΝF ενώ το πρόσδεμα του ανήκει στις τύπου ΙΙ διαμεμβρανικές πρωτεΐνες της υπεροικογένειας του TNF. H πρόσδεση του οδηγεί τα κύτταρα στο προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο και μπορεί να παίξει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της ανοσοαπόκρισης, στη ρύθμιση της διάρκειας ζωής των λεμφοκυττάρων και στη διατήρηση της περιφερικής ανοχής. Αν αναλογιστούμε την σημαντικότητα του μονοπατιού Fas/FasL να οδηγεί τα λεμφοκύτταρα στο κυτταρικό θάνατο, μπορούμε να καταλάβουμε πως πιθανές αλλαγές σε αυτό το μονοπάτι είναι καθοριστικές για την εμφάνιση αυτοάνοσων καταστάσεων. [37, 38, 39,] Ιδιαίτερη βαρύτητα έχει δοθεί επίσης στη συμμετοχή του Fc υποδοχέα στη καταστροφή των αιμοπεταλίων στη περίπτωση της ιδιοπαθούς θρομβοπενικής πορφύρας. Δεδομένου ότι η καταστροφή αυτή έχει σαν κέντρο το σπλήνα, η σπληνεκτομή εμφανίζει διπλό πλεονέκτημα καθώς όχι μόνο αφαιρείται η κύρια πηγή αυτοαντισωμάτων αλλά και η κύρια τοποθεσία καταστροφής των αιμοπεταλίων. Σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες η φαγοκυττάρωση από τα μακροφάγα φαίνεται να ρυθμίζεται από ΙgG Fc και υποδοχείς του συμπληρώματος. Για ορισμένους Fc υποδοχείς υπάρχουν διαφορετικές εκδοχές στο σύνολο του πληθυσμού τους. Αυτό είναι συνέπεια της παρουσίας απλών νουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNPs) και έχει ως αποτέλεσμα τη διαφορετική ικανότητα δέσμευσης ανοσοσφαιρινών. Άμεση 21
συνέπεια αυτού είναι πολλές φορές η χορήγηση ανοσοσφαιρίνης να μην έχει το αναμενόμενο αποτέλεσμα. [40, 41, 42, 43, 46] Ολοκληρώνοντας αυτή την αναφορά μορίων και μονοπατιών που συμμετέχουν στη παθοφυσιολογία της νόσου δεν θα πρέπει να παραλείψουμε τη συμμετοχή μορίων που αφορούν στους φυσικούς φονείς (ΝΚ κύτταρα). Οι φυσικοί φονείς είναι κύτταρα που έχουν δυνατότητα να καταστρέφουν τα αιμοπετάλια καθώς και να εκκρίνουν ΙΝF-γ και TNF-α που ενισχύουν αυτή την ανοσοαπόκριση. Στην επιφάνεια τους φέρουν υποδοχείς ενεργοποίησης (Killer Cell Activating Receptors) και αναστολής της δράσης τους (Killer Cell Inhibitory Receptors). Οι υποδοχείς KIRs προσδένονται σε μόρια του μείζονος συστήματος ιστοσυμβατότητας τύπου I (MHC I) αναστέλλοντας τη καταστροφή των πιθανών κυττάρων στόχων όπως τα αιμοπετάλια. Ένα νέο παράθυρο στη θεραπεία της νόσου φαίνεται ν ανοίγει η μελέτη αυτών των υποδοχέων καθώς είναι πιθανό η ενίσχυση των KIRs έναντι των KARs σε ασθενείς με ΙΤΡ να είναι ευεργετική. [44, 45] Κυτταροκίνες Οι κυτταροκίνες είναι μια ομάδα πρωτεϊνών και πεπτιδίων που αποτελούν μηνυματοφόρα μόρια. Παρουσιάζουν ομοιότητες τόσο με τις ορμόνες όσο και με τους νευροδιαβιβαστές και επιτρέπουν την επικοινωνία των κυττάρων μεταξύ τους αλλά και με το περιβάλλον τους. Η πλειοψηφία αυτών είναι υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες και γλυκοπρωτεΐνες με μάζα που ανέρχεται στα 8-30kDa. Εκκρίνονται από ποικιλία κυττάρων (αιμοποιητικών και μη) και διαδραματίζουν σπουδαίο ρόλο στην ανοσοαπόκριση και στη διατήρηση της ομοιόστασης των Τ κυττάρων. Η δράση τους μπορεί να είναι αυτοκρινής, παρακρινής ή ενδοκρινής και δεν περιορίζεται μόνο στο ανοσοποιητικό σύστημα, καθώς σημαντική είναι η συμβολή των κυτταροκινών σε πολλές αναπτυξιακές διεργασίες κατά την εμβρυογένεση και αλλού. Με τον όρο ομοιόσταση Τ κυττάρων εννοούμε την ικανότητα του ανοσοποιητικού συστήματος να διατηρεί σε φυσιολογικά επίπεδα τον αριθμό αυτών. Αυτές οι διαδικασίες ρυθμίζονται από ποικιλία σημάτων και οι κυτταροκίνες παίζουν πρωταγωνιστικό ρόλο. Δύο μέλη της οικογένειας των γ κυτταροκινών η ιντερλευκίνη-7 και η ιντερλευκίνη-15 είναι κύριοι ρυθμιστές του πολλαπλασιασμού και της επιβίωσης γενικότερα των ώριμων CD4 και CD8 κυττάρων. Διαφορετικό ρόλο κατά τα διάφορα στάδια ανάπτυξης των Τ κυττάρων φαίνεται ότι παίζουν και οι ιντερλευκίνη-2, 10, 12, οι ιντερφερόνες και ο TGF-β. Στη παρούσα εργασία με τη βοήθεια της κυτταρομετρίας ροής 22
κάναμε ενδοκυττάριο προσδιορισμό των ΤΗ1 κυτταροκινών ιντερφερόνη-γ, ιντερλευκίνη-2, καθώς και των ΤΗ2 ιντερλευκίνη-4 και 10. [140-142] Όπως έχει αναφερθεί και νωρίτερα κύριο χαρακτηριστικό της ιδιοπαθούς θρομβοπενικής πορφύρας αποτελεί η παραγωγή αυτοαντισωμάτων. Αυτά τα αυτοαντισώματα φαίνεται ότι ελέγχονται από τα Τ βοηθητικά κύτταρα και τις κυτταροκίνες που αυτά παράγουν. Η ισορροπία μεταξύ ανοσολογικής απόκρισης τύπου Ι και ΙΙ είναι μείζονος σημασίας για τη σωστή λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος και φαίνεται να παρουσιάζει διαφοροποιήσεις σε ορισμένα αυτοάνοσα νοσήματα, μεταξύ των οποίων και η ΙΤΡ. Συγκεκριμένα σε ασθενείς με ΙΤΡ σε ενεργή φάση έχουν παρατηρηθεί αυξημένα ποσοστά ιντερλευκίνης 2, 10, 15, Μ-CSF και sfas, ενώ μειωμένα ποσοστά ΙL-4, 5, 6, 13, TGF-β. Υπάρχουν μελέτες που υποδεικνύουν ότι πρόκειται για μια ασθένεια ανοσολογικού τύπου Ι (Th1), ενώ ο λόγος Th1/Th2 είναι υψηλότερος και αντιστρόφως ανάλογος του αριθμού των αιμοπεταλίων. Αντίθετα σε ασθενείς που βρίσκονται σε ύφεση ή ακολουθούν θεραπεία με ανοσοσφαιρίνες παρατηρείται τύπου ΙΙ ανοσολογική απόκριση. Σε ασθενείς με ITP παρατηρούνται αυξημένα ποσοστά IL-2 που μπορούν να επάγουν τη νόσο μέσω μηχανισμών όπως η αύξηση του CD80 στην επιφάνεια των Β κυττάρων και η έκκριση κυτταροκινών όπως η INF-γ και η IL-10. Επιπλέον, σε ασθενείς σε ενεργή φάση της νόσου παρατηρούνται αυξημένα επίπεδα του υποδοχέα της IL-2 που πιθανότατα έχουν ως αποτέλεσμα τον έλεγχο της αυτοανοσίας μέσω δέσμευσης και κατά συνέπεια απενεργοποίησης της IL-2. Αυξημένη επίσης εντοπίζεται και η IL-10, μια κυτταροκίνη τύπου ΙΙ που συμμετέχει ενεργά στην ενεργοποίηση των Β κυττάρων, στη καταστολή της δράσης μονοκύτταρων και μακροφάγων και κατά συνέπεια φλεγμονωδών κυτταροκινών όπως είναι η ΙL-6. Αν αναλογιστούμε την ικανότητα της να καταστέλλει τη δράση φλεγμονωδών κυτταροκινών μπορούμε να καταλάβουμε πόσο σημαντικό αντιφλεγμονώδη ρόλο παίζει. Η ακριβής συμμετοχή της IL-10 στη παθοφυσιολογία της νόσου δεν είναι γνωστή, πιθανολογείται όμως ότι βοηθά στη μείωση της δραστικότητας των αυτοαντισωμάτων. Σε ασθενείς με χρόνια ΙΤΡ επίσης αυξημένος παρουσιάζεται ο M-CSF, που μειώνεται όμως μετά τη χορήγηση ανοσοσφαιρίνης. Πιθανότατα η αυξημένη παρουσία του έχει ως αποτέλεσμα την αντιγονοπαρουσίαση αυτοαντιγόνων από τα μακροφάγα στα Τ βοηθητικά κύτταρα επιδεινώνοντας με αυτό το τρόπο τη νόσο. Αντίθετα, τα επίπεδα TGF-β παρουσιάζονται μειωμένα με αποτέλεσμα να παραμένει ανεξέλεγκτη η παραγωγή αυτοαντισωμάτων έναντι των 23
αιμοπεταλίων. Γνωρίζοντας ότι ο TGF-β1 επάγει τη παραγωγή θρομβοποιητίνης και αυτή με τη σειρά της τη παραγωγή αιμοπεταλίων, καταλαβαίνουμε ότι τα χαμηλά επίπεδα TGF-β1 μπορεί να είναι άμεσα συσχετιζόμενα και με τον χαμηλό αριθμό αιμοπεταλίων. Οι φυσικοί φονείς που αποτελούν πηγή παραγωγής ΤGF-β μετά από σπληνεκτομή αυξάνονται, επαναφέροντας τα επίπεδα TGF-β με αποτέλεσμα να περιορίζεται τόσο η δράση της INF-γ όσο και η παραγωγή αυτοαντισωμάτων. Ολοκληρώνοντας τη σύντομη αυτή αναφορά στις συγκεντρώσεις των κυτταροκινών θα πρέπει να επισημάνουμε ότι τα δεδομένα παραμένουν συγκεχυμένα καθώς υπάρχει πληθώρα δημοσιεύσεων που αντικρούει την επικρατούσα αυτή άποψη. [1, 46-48, 140-142] Κυτταροτοξικότητα Μια ακόμη παράμετρος που φαίνεται να συμμετέχει στη παθοφυσιολογία της νόσου είναι η καταστροφή των αιμοπεταλίων από τα Τ κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα. Γνωρίζοντας ότι αυτοαντισώματα μπορούν ν ανιχνευθούν μόνο στο 50-70% των ασθενών καθώς και ότι παρά τη παρουσία τους ένας ασθενής μπορεί να είναι σε ύφεση, ενισχύεται η μέχρι τώρα πεποίθηση ότι συμμετέχουν και άλλοι μηχανισμοί στη παρουσία και εξέλιξη της νόσου. Έτσι δίνεται μεγαλύτερη βαρύτητα στο ρόλο της φαγοκυττάρωσης από τα μακροφάγα και τη καταστροφή από τα Τ κυτταροτοξικά κύτταρα. Ένα τύπου Ι κυτταροκινικό προφίλ σαν αυτό που υποστηρίζεται ότι εμφανίζει η ΙΤΡ γνωρίζουμε ότι επάγει τη κυτταροτοξικότητα και τη δημιουργία αντισωμάτων IgG τύπου. Υπάρχουν πρόσφατες μελέτες που υποδεικνύουν την αυξημένη έκφραση κυτταροτοξικών γονιδίων και γονιδίων κυτταροκινών τύπου Ι, όπως της INF-γ. [45, 70-73] Παραγωγή μεγακαρυοκυττάρων στο μυελό των οστών Όπως έχει αναφερθεί και νωρίτερα τα αιμοπετάλια προέρχονται από τα πολυδύναμα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα από τα οποία προκύπτουν τα μεγακαρυοκύτταρα που με τη σειρά τους ωριμάζουν προς αιμοπετάλια. Κατά τη διάρκεια αυτής της ωρίμανσης τα μεγακαρυοκύτταρα φέρουν στην επιφάνεια τους τη γλυκοπρωτεΐνη ΙΙb/IIIa καθώς και την Ib/IX που αποτελούν στόχους για τα αυτοαντισώματα. Συνεπώς δεν θα ήταν παράλογο να υποθέσει κανείς ότι αυτά τ αυτοαντισώματα μπορούν να προκαλέσουν επιπλοκές στην ωρίμανση των μεγακαρυοκυττάρων προς αιμοπετάλια. Μελέτες που έχουν γίνει σε in vitro συστήματα ενισχύουν αυτή την άποψη. 24
Ένα άλλο μόριο που έχει βρεθεί αυξημένο στα μεγακαρυοκύτταρα ασθενών με ΙΤΡ είναι το CD154. Όπως αναφέραμε και παραπάνω το μόριο αυτό είναι ιδιαίτερα χρήσιμο για το πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των Β κυττάρων, κατά συνέπεια τα αυξημένα επίπεδα του μπορούν να οδηγήσουν στη περαιτέρω παραγωγή αυτοαντισωμάτων. Η χρήση ανασυνδυασμένων αναλόγων του παράγοντα που είναι υπεύθυνος για την ανάπτυξη των μεγακαρυοκυττάρων (HuMGDF) μπορεί να έχει ευεργετικά αποτελέσματα στη καταπολέμηση της θρομβοπενίας που παρατηρείται στους ασθενείς με ΙΤΡ. [74, 75, 76] 2.5 Θεραπευτικές προσεγγίσεις στην ιδιοπαθή θρομβοπενική πορφύρα Εδώ και πάρα πολλά χρόνια η ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων για τη θεραπεία της ιδιοπαθούς θρομβοπενικής πορφύρας βρίσκονται στο επίκεντρο του ενδιαφέροντος πολλών επιστημονικών ομάδων ανά τον κόσμο. Τα τελευταία χρόνια δίνεται ιδιαίτερη έμφαση στο σχεδιασμό νέων προσεγγίσεων που έχουν στόχο την ανοσολογική πλευρά της νόσου. Χορήγηση στεροειδών και ανοσοσφαιρινών Στη πλειοψηφία των περιστατικών αρχικά γίνεται χορήγηση στεροειδών και ανοσοσφαιρινών με σκοπό ν αυξηθεί ο αριθμός των αιμοπεταλίων. Τα στεροειδή έχουν την ικανότητα να μπλοκάρουν τους Fc υποδοχείς και με αυτό τον τρόπο ν αποτρέπουν τη καταστροφή των καλυμμένων με αυτοαντισώματα αιμοπεταλίων από τα μακροφάγα. Περίπου τα 2/3 των ασθενών αντιδρούν αρχικά θετικά στη λήψη σκευασμάτων στεροειδών από το στόμα, στη συνέχεια όμως υποτροπιάζουν, ενώ το 1/3 έχει μόνιμη ικανοποιητική ανταπόκριση. Συνήθως, λίγες μέρες μετά τη χορήγηση τους παρατηρείται αύξηση στον αριθμό των αιμοπεταλίων αν και σε ορισμένες περιπτώσεις το διάστημα αυτό μπορεί ν ανέλθει και στις 2 με 3 εβδομάδες. Ένας πιο γρήγορος τρόπος να αυξηθεί ο αριθμός των αιμοπεταλίων είναι η ενδοφλέβια χορήγηση ανοσοσφαιρινών (IVIG). Οι ανοσοσφαιρίνες αυτές προέρχονται από γιγάντιες «δεξαμενές» πλάσματος υγιών δοτών και περιέχουν κατά κύριο λόγο IgG με ίχνη ανοσοσφαιρινών άλλων κατηγοριών όπως για παράδειγμα IgM. Η πρώτη εργασία που αναφέρεται στη χορήγηση IVIG σε παιδιά με ΙΤΡ δημοσιεύτηκε το 1981 από τον Imbach. Για τη θεραπεία της νόσου γίνεται επίσης χορήγηση anti-d ανοσοσφαιρίνης που προέρχεται από το πλάσμα δοτών ανοσοποιημένων για το αντιγόνο D. 25
Κύρια τοποθεσία καταστροφής των αιμοπεταλίων αποτελεί ο σπλήνας διότι φέρει μεγάλο αριθμό φαγοκυττάρων που φέρουν Fc υποδοχείς (μακροφάγα, μονοκύτταρα). Αν και ο πλήρης μηχανισμός δράσης παραμένει αδιευκρίνιστος η επιτυχής χορήγηση IVIG και anti-d ανοσοσφαιρίνης οφείλεται κατά κύριο λόγο στο μπλοκάρισμα των Fc υποδοχέων και συνεπώς την αναστολή της αναγνώρισης από τα φαγοκύτταρα. Τα κύτταρα του σπλήνα και γενικότερα του δικτυοενδοθηλιακού συστήματος φέρουν τρία είδη Fcγ υποδοχέων Ι,ΙΙ και ΙΙΙ. Η πρώτη κατηγορία προσδένει μονομερή IgG ενώ οι άλλες δύο σύμπλοκα IgG. Υπάρχουν μελέτες που υποδεικνύουν ότι η χορήγηση διμερών IVIG είναι αποτελεσματικότερη από τη χορήγηση μονομερών IVIG. Επιπλέον η χορήγηση IVIG εμπλέκεται και στη λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος, ενισχύοντας την ανοσολογική ανοχή τόσο των Τ όσο και των Β κυττάρων. Αυτή η δράση φαίνεται ότι οφείλεται σε διαφοροποιήσεις που δημιουργούνται στα επίπεδα των κυτταροκινών και των υποδοχέων αυτών. Κυτταροκίνη «κλειδί» στην ανοσοαπόκριση είναι η ιντερλευκίνη 2 που αναστέλλεται από τη παρουσία IVIG. Πιθανώς με αυτό τον τρόπο δρομολογείται μια αλλαγή στα Β και Τ λεμφοκύτταρα που έχει σαν αποτέλεσμα τη μείωση της παραγωγής αυτοαντισωμάτων. Επίσης σε πρόσφατες μελέτες σε in vivo μοντέλα έχει φανεί ότι προκαλούνται αυξημένα ποσοστά απόπτωσης σε διάφορους κυτταρικούς τύπους μεταξύ των οποίων και τα υπεύθυνα για τη καταστροφή των αιμοπεταλίων μονοκύτταρα. Με τη συνεχή έρευνα τόσο in vitro, όσο και σε in vivo μοντέλα γίνονται καθημερινά μικρά βήματα με σκοπό να γίνει πλήρως κατανοητός ο τρόπος δράσης της χορήγησης IgG και anti-d ανοσοσφαιρινών. [77, 88-92] Σπληνεκτομή Η πρώτη σπληνεκτομή σε ασθενή που έπασχε από ΙΤΡ πραγματοποιήθηκε το 1916. Πρόκειται για τη πρώτη θεραπευτική προσέγγιση που εφαρμόστηκε ποτέ σε πάσχοντα και καθιερώθηκε πολύ πριν την εισαγωγή των στεροειδών στη θεραπεία. Τα 2/3 των ασθενών που υπόκεινται σε σπληνεκτομή εμφανίζουν πλήρη ύφεση χωρίς να λαμβάνουν επιπλέον φαρμακευτική αγωγή. Η αποτελεσματικότητα της συνήθως γίνεται εμφανής λίγες μέρες μετά την επέμβαση, ενώ πολύ σπάνια μετά τις δέκα ημέρες. Στους ασθενείς που δεν είναι επιτυχής η υποτροπή συμβαίνει τις περισσότερες φορές μέσα στους έξι πρώτους μήνες. Η χειρουργική αφαίρεση του σπλήνα πρέπει να διενεργείται μετά από σχολαστική εξέταση της πορείας της νόσου στον εκάστοτε ασθενή και πιο συγκεκριμένα όταν μετά από χορήγηση της 26
αρχικής θεραπείας ο ασθενής βρίσκεται σε ενεργή φάση της νόσου πάνω από έξι εβδομάδες (10000-109000/μl) ή σε χρονικό διάστημα τριών μηνών από τη διάγνωση δεν έχει επιτευχθεί ικανοποιητική βελτίωση με την αρχική θεραπεία(<30.000-109000/μl). Μέχρι και σήμερα η σπληνεκτομή θεωρείται η πιο αποτελεσματική θεραπευτική προσέγγιση παρά τη συνεχή ανάπτυξη νέων θεραπευτικών μεθόδων. [77, 88-92] Άλλες θεραπευτικές προσεγγίσεις Σε περιπτώσεις ασθενών που οι αρχικές θεραπείες και η σπληνεκτομή δεν αποδεικνύονται αποτελεσματικές εφαρμόζονται άλλες θεραπευτικές μέθοδοι. Τα ποσοστά επιτυχίας τους παρόλα αυτά δεν είναι ιδιαίτερα ικανοποιητικά. Τα σκευάσματα που χορηγούνται σε αυτές τις περιπτώσεις είναι κυρίως ανοσοκατασταλτικά με τη συνοδεία ή όχι στεροειδών. Δυο από τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα παρόμοια ανοσοκατασταλτικά φάρμακα είναι το κυκλοφωσφαμίδιο και η αζαθειοπρίνη, χορηγούνται συνήθως από το στόμα αλλά και ενδοφλέβια σε συνδυασμό με στεροειδή και επιτυγχάνουν παροδική ύφεση στο 50% των ασθενών, το 1/3 των οποίων εμφανίζει πλήρη ύφεση. Πρόσφατα στη θεραπεία της ΙΤΡ αλλά και άλλων αιματολογικών αυτάνοσων εισήχθη και η κυκλοσπορίνη Α που πιστεύεται ότι δρα μπλοκάροντας τη δράση των Τ λεμφοκυττάρων. Συνήθως, για να έχουμε το επιθυμητό αποτέλεσμα απαιτείται συνεχής λήψη. Σε ορισμένες περιπτώσεις ασθενών γίνεται επίσης συνδυαστική χρήση χημειοθεραπειών με προσωρινά αλλά σε ορισμένες περιπτώσεις και πιο μόνιμα αποτελέσματα. Η χρήση του συνθετικού ανδρογόνου «danazol» που έχει μειωμένη αρρενοποιητική ικανότητα φαίνεται ότι δρα ευεργετικά μειώνοντας τους Fc υποδοχείς στην επιφάνεια των μακροφάγων και των μονοκύτταρων και τροποποιώντας τη δράση του ανοσοποιητικού συστήματος επιτυγχάνει μείωση των κυκλοφορούντων αυτοαντισωμάτων. Προσωρινή αύξηση του αριθμού των αιμοπεταλίων στο 50-70% των ασθενών επιτυγχάνει η χορήγηση των αλκαλοειδών «vincristine» και «vinblastin» σε χρονικό διάστημα 5 με 10 ημερών. Τα αλκαλοειδή φαίνεται ότι έχουν τη τάση να δημιουργούν σύμπλοκα με τη τουμπουλίνη των αιμοπεταλίων με αποτέλεσμα την αναστολή της φαγοκυττάρωσης καθώς και να ενισχύουν τη μεγακαρυοποίηση. Παρόμοια δράση έχει και η κολχικίνη η οποία δεν έχει όμως μελετηθεί πλήρως και δεν έχει εισαχθεί στη κλινική πράξη. 27
Επίσης αύξηση του αριθμού των αιμοπεταλίων έχει παρατηρηθεί με τη χρήση της ιντερφερόνης α και του ασκορβικού οξέος. Στη πρώτη περίπτωση ο τρόπος δράσης δεν είναι γνωστός, πιθανώς όμως να σχετίζεται με τη δράση των Β κυττάρων που είναι υπεύθυνα για την παραγωγή των αυτοαντισωμάτων. Η χρήση της πρέπει να είναι περιορισμένη χρονικά διότι σχετίζεται με την εμφάνιση άλλων αυτοάνοσων καταστάσεων. Στη δεύτερη περίπτωση, τα αρχικά ενθαρρυντικά αποτελέσματα δεν επαληθεύτηκαν και οι προσπάθειες για πιθανή χρήση του ασκορβικού οξέος εγκαταλείφθηκαν. Μια άλλη προσέγγιση που εφαρμόστηκε για πρώτη φορά στη δεκαετία 1975-85 είναι η πλασμαφαίρεση. Γνωρίζοντας ότι η ΙΤΡ είναι μια ασθένεια που σχετίζεται με τη παρουσία αντισωμάτων επιχειρήθηκε η εισαγωγή ξένου πλάσματος. Σε ορισμένους ασθενείς παρατηρήθηκε βελτίωση δεδομένου όμως ότι ακολουθούσαν θεραπεία με στεροειδή δεν ήταν δυνατόν να καταλήξουμε στο αν τελικά η πλασμαφαίρεση ήταν αυτή που βοήθησε στη βελτίωση τους. Ακολούθησε δοκιμαστική συνδυαστική χρήση της με IVIG αλλά σήμερα πιστεύεται ότι ο ρόλος της πλασμαφαίρεσης είναι πολύ περιορισμένος. Κλείνοντας, άλλες θεραπευτικές προσεγγίσεις που έχουν δοκιμαστεί είναι η χορήγηση θρομβοποιητίνης και αυξητικού παράγοντα μεγακαρυοκυττάρων (MGDF) με σκοπό να αποσαφηνιστεί κατά πόσο η θρομβοπενία οφείλεται σε μειωμένη παραγωγή αιμοπεταλίων, anti-cd40 που συμμετέχει στην ενεργοποίηση των Τ και Β κυττάρων, ανοσοαπορρόφηση πρωτεΐνης Α σταφυλόκοκκου που έχει την ικανότητα πρόσδεσης στους Fc υποδοχείς, προγεστερόνη καθώς πιστεύεται ότι η συμμετοχή των ορμονών στα αυτοάνοσα νοσήματα είναι σημαντική, υψηλές δόσεις δεξαμεθαζόνης και μετάγγιση αιμοπεταλίων σε ασθενείς με βαριά θρομβοπενία με σκοπό την άμεση έστω και παροδική βελτίωση της κατάστασης.[77, 90, 91, 92] 3. Τ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ 3.1 Γενικά Όπως κάθε φυσιολογική διαδικασία έτσι και το ανοσοποιητικό σύστημα πρέπει να ελέγχεται και η λειτουργία του να καταστέλλεται όταν ολοκληρωθεί η αποστολή του. Χωρίς τη παρουσία μηχανισμών καταστολής, η φυσιολογική αυτή διαδικασία μπορεί εύκολα να μετατραπεί σε παθολογική που τελικώς αντί να προστατεύει τον οργανισμό μας στρέφεται εναντίον του. Για πολλά χρόνια οι ανοσολόγοι μελετούσαν τη κυτταρική και μοριακή βάση της ανοσοαπόκρισης αγνοώντας τυχόν κατασταλτικούς μηχανισμούς που 28