Μελέτη με απεικονιστική μικροσκοπία των φωτοδυναμικών επιδράσεων σε ερυθρά αιμοσφαίρια

ΑΣΚΗΣΗ 7 Μελέτη με απεικονιστική μικροσκοπία των φωτοδυναμικών επιδράσεων σε ερυθρά αιμοσφαίρια 7.1. Εισαγωγή Παρόλο που τα κύτταρα του ανθρώπινου οργανισμού ποικίλουν ως προς τη μορφή και τις λειτουργίες τις οποίες επιτελούν, έχουν ως κοινό χαρακτηριστικό την ύπαρξη συγκεκριμένων κυτταρικών λειτουργιών οι οποίες είναι υπεύθυνες για την επιδιόρθωση και αναπαραγωγή τους. Υπό φυσιολογικές συνθήκες λοιπόν, τόσο η αναπαραγωγή όσο και ο θάνατος ενός κυττάρου θα συμβούν σε προκαθορισμένα από αυτές τις κυτταρικές λειτουργίες χρονικά διαστήματα. Αν για κάποιο λόγο η διαδικασία αυτή τεθεί εκτός ελέγχου τότε η διαίρεση μπορεί να εξακολουθήσει ανεξέλεγκτα, οδηγώντας σε συναθροίσεις κυττάρων, οι οποίες ονομάζονται όγκοι. Στο σύμπλεγμα αυτών των ασθενειών (περισσότερα από 200 διαφορετικά είδη) των προσβεβλημένων κυττάρων οι οποίες χαρακτηρίζονται από ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό και ανοργάνωτη ανάπτυξη έχει αποδοθεί ο όρος καρκίνος. Αρχικά η ύπαρξη ενός καρκινικού όγκου μπορεί να δημιουργήσει προβλήματα στη λειτουργία των γειτονικών φυσιολογικών ιστών λόγω της πίεσης που συνεπάγεται η αύξηση του μεγέθους του. Σε μεταγενέστερα στάδια τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να διεισδύσουν μέσα στους υγιείς ιστούς, καταστρέφοντάς τους πιθανώς στην προσπάθειά τους να

130 Άσκηση 7 βρεθούν κοντά στο κυκλοφορικό σύστημα. Μετακίνηση των καρκινικών κυττάρων μπορεί επίσης να συμβεί και μέσω του κυκλοφορικού συστήματος. Τα κύτταρα με αυτόν τον τρόπο θα φτάσουν σε ένα απομακρυσμένο σημείο, σε σχέση με αυτό που βρίσκεται ο αρχικός όγκος, όπου θα συνεχίσουν να πολλαπλασιάζονται ανεξέλεγκτα δημιουργώντας ένα δευτερογενή όγκο (μετάσταση). Υγιής ιστός και σχηματισμός όγκου Οι κυριότερες θεραπείες για την αντιμετώπιση των καρκινικών όγκων είναι: Χειρουργική αφαίρεση του όγκου. Η μέθοδος αυτή εφαρμόζεται σε ιστούς και όργανα τα οποία μπορούν να αφαιρεθούν με ασφάλεια. Πρόκειται γενικά για επώδυνη μέθοδο με την οποία καταστρέφονται ή αφαιρούνται ακόμη και κάποιοι (γειτονικοί του όγκου) υγιείς ιστοί, γεγονός που πολλές φορές καθιστά αναγκαία συμπληρωματική θεραπεία για την αποκατάσταση των βλαβών που προκλήθηκαν. Χημειοθεραπεία. Η μέθοδος αυτή αποσκοπεί στην επιλεκτική νέκρωση καρκινικών κυττάρων μέσω χημικών ουσιών. Στην πραγματικότητα όμως τα περισσότερα από τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται στη χημειοθεραπεία έχουν πολύ σοβαρές επιπτώσεις και σε υγιείς ιστούς, με αποτέλεσμα η μακροχρόνια χρήση τους να συνεπάγεται πολύ σοβαρές και επώδυνες παρενέργειες. Ο οργανισμός μετά τη χρήση τους γίνεται ευπρόσβλητος σε μολύνσεις, γεγονός που συνεπάγεται τη λήψη ειδικών μέτρων ή τη χορήγηση αντιβιοτικών. Πολλά είδη καρκινικών κυττάρων εμφανίζονται επίσης ανθεκτικά μετά από ένα χρονικό διάστημα σε κάποιο τέτοιο χημειοθεραπευτικό μέσο με αποτέλεσμα να είναι απαραίτητη αύξηση της δόσης του φαρμάκου ή αλλαγή της θεραπευτικής αγωγής. Ακτινοθεραπεία. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στη χρήση ακτινοβολίας (κυρίως ακτίνων Χ) για τη νέκρωση των κυττάρων του καρκινικού όγκου. Πρόκειται για ακριβή και χρονοβόρα μέθοδο στην οποία δεν ανταποκρίνονται όλα τα καρκινικά κύτταρα, ειδικότερα όταν η συγκέντρωση οξυγόνου σε αυτά είναι χαμηλή. Ανοσοθεραπεία. Κατά τη διάρκεια αυτής της θεραπείας χορηγούνται στον ασθενή κατάλληλα σκευάσματα ώστε να ενεργοποιηθεί το ανοσοποιητικό σύστημα του ασθενή προκειμένου να αντιμετωπίσει τον καρκίνο. Η χρήση αυτής της μεθόδου είναι ακόμη πολύ περιορισμένη κυρίως λόγω των σημαντικών παρενεργειών. Υπερθερμία. Στη θεραπεία αυτή χρησιμοποιείται αγωγή θερμότητας ή ακτινοβολία προκειμένου να αυξηθεί η θερμοκρασία στην περιοχή του όγκου για κάποιο μικρό χρονικό διάστημα. Τα αποτελέσματα αυτής της θεραπείας δεν

Μελέτη με απεικονιστική μικροσκοπία των φωτοδυναμικών επιδράσεων σε ερυθρά αιμοσφαίρια 131 είναι τόσο θεαματικά, όταν όμως αυτή συνδυαστεί με χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία τα αποτελέσματα είναι πολύ σημαντικά ενώ οι παρενέργειες περιορισμένες. 7.2. Φωτοδυναμική θεραπεία Η φωτοδυναμική θεραπεία είναι μία σχετικά σύγχρονη τεχνική αντιμετώπισης καρκινικών όγκων αλλά και άλλων μη κακοηθών όγκων και ασθενειών. Πρόκειται για το συνδυασμό δύο μέσων, μιας φωτοευαίσθητης ουσίας και φωτός, που από μόνα τους δεν μπορούν να προκαλέσουν καμία βλάβη στα καρκινικά κύτταρα, η συνδυασμένη όμως δράση τους επιφέρει τη νέκρωσή των καρκινικών κυττάρων. Η φωτοευαίσθητη ουσία ή φωτοευαισθητοποιητής είναι ένα εξωγενές χρωμοφόρο το οποίο έχει την ιδιότητα να κατακρατείται επιλεκτικά από τους πάσχοντες ιστούς. Μετά την πάροδο κατάλληλου χρονικού διαστήματος από τη χορήγησή του στον ασθενή, αφού δηλαδή ο φωτοευαισθητοποιητής έχει συγκεντρωθεί σε μεγάλο βαθμό στους πάσχοντες ιστούς, οι ιστοί αυτοί ακτινοβολούνται με οπτική ακτινοβολία κατάλληλων φασματικών χαρακτηριστικών. Με αυτόν τον τρόπο προκαλείται ενεργοποίηση του φωτοευασθητοποιητή η οποία και σημαίνει την έναρξη μιας σειράς φωτοχημικών αντιδράσεων, τα προϊόντα των οποίων προκαλούν σημαντικές βλάβες σε συστατικά, λειτουργίες, οργανίδια και μεμβράνες των μη υγιών κυττάρων, οδηγώντας τα τελικά σε νέκρωση. Σχηματικά, τα κυριότερα στάδια της φωτοδυναμικής θεραπείας θα μπορούσαν να αποδοθούν από το παρακάτω διάγραμμα. Χορήγηση Φωτοευαισθητοποιητή Επιλεκτική κατακράτηση του φωτοευαισθητοποιητή από τους πάσχοντες ιστούς Ακτινοβόληση των πασχόντων ιστών Διέγερση φωτοευασιθητοποιητήδημιουργία τοξικών ειδών Νέκρωση κυττάρων και όγκου Σχήμα 1: Σχηματικό διάγραμμα φωτοδυναμικής θεραπείας

132 Άσκηση 7 7.3. Επιδράσεις φωτεινής ακτινοβολίας σε ιστούς Η αλληλεπίδραση του φωτός με ένα τόσο πολύπλοκο μέσο όσο ένας ιστός αποτελεί πεδίο έρευνας, το ενδιαφέρον για το οποίο αυξάνεται συνεχώς, ενώ τα αποτελέσματα που προκύπτουν από αυτές τις έρευνες βρίσκουν όλο και περισσότερες εφαρμογές, όχι μόνο στη φωτοδυναμική θεραπεία αλλά και γενικότερα στη βιοϊατρική. Για αυτόν το λόγο στη συνέχεια θα γίνει μία σύντομη αναφορά στα φαινόμενα που λαμβάνουν χώρα όταν ένας ιστός ακτινοβοληθεί με φως συγκεκριμένων ιδιοτήτων. 7.3.1 Ορατή περιοχή του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος Το ορατό φως αποτελεί ένα μικρό μόνο κομμάτι του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος, 400 nm περίπου (1 nm = 10-9 m), το οποίο μπορεί να γίνει αντιληπτό από το ανθρώπινο μάτι. Το ορατό φάσμα βρίσκεται στην περιοχή μεταξύ 400 και 780 nm περίπου, ενώ το ανθρώπινο μάτι μπορεί να διακρίνει περιοχές πλάτους που κυμαίνονται μεταξύ 20 και 160 nm, γνωστές ως χρώματα. Το χρώμα δεν είναι μία ιδιότητα του φωτός αλλά μία φυσιολογική και ψυχολογική απόκριση του ανθρώπινου οργανισμού σε κάποια συγκεκριμένα μήκη κύματος. Κάποια χρώματα επίσης μπορούν να δημιουργηθούν και ως μίξη συχνοτήτων/μηκών κύματος που ανήκουν σε διαφορετικά χρώματα. Χρώμα Μήκος κύματος (nm) Ιώδες 400-455 Μπλε 455-492 Πράσινο 492-577 Κίτρινο 577-597 Πορτοκαλί 597-622 Κόκκινο 622-780 Το ορατό φάσμα «συνορεύει» προς τη μεριά των μεγαλύτερων συχνοτήτων με την υπεριώδη ακτινοβολία (UV) και προς τη μεριά των μικρότερων συχνοτήτων με την υπέρυθρη ακτινοβολία (IR). Αυτός είναι και ο κύριος λόγος για τον οποίο όταν αναφερόμαστε στην υπέρυθρη και την υπεριώδη ακτινοβολία τις περισσότερες φορές χρησιμοποιούμε τον όρο «φως». Με τον όρο UV ακτινοβολία αναφερόμαστε στην ακτινοβολία της οποίας το μήκος κύματος κυμαίνεται μεταξύ 200 και 400 nm. Παλαιότερα, η υπεριώδης ακτινοβολία διακρίνονταν σε μακρά υπεριώδη (200-300 nm) και σε εγγύς υπεριώδη (300-400 nm). Σήμερα, λόγω καλύτερης γνώσης των βιολογικών αποτελεσμάτων της υπεριώδους ακτινοβολίας τη διακρίνουμε σε τρεις περιοχές, την UVA 320-400 nm, την UVB 280-320 nm, και την UVC 200-280 nm. Το μήκος κύματος του φωτός λ είναι αντιστρόφως ανάλογο της ενέργειας των φωτονίων, των κβάντων της ενέργειας του φωτός και της συχνότητάς του ν, δηλαδή: c c h και όπου h η σταθερά του Planck και c η ταχύτητα φωτός. E

Μελέτη με απεικονιστική μικροσκοπία των φωτοδυναμικών επιδράσεων σε ερυθρά αιμοσφαίρια 133 7.3.2 Απορρόφηση Χρωμοφόρα ονομάζονται τα μόρια τα οποία απορροφούν κάποια μήκη κύματος του ορατού φωτός, γεγονός που έχει ως αποτέλεσμα να τα θεωρούμε έγχρωμα συστατικά. Πολλές φορές αυτός ο ορισμός επεκτείνεται για την UV και IR ακτινοβολία. Τα κύρια χρωμοφόρα των βιολογικών ιστών είναι η αιμοσφαιρίνη και η μελανίνη. Σε ένα βιολογικό ιστό επίσης, τα μήκη κύματος στα οποία απορροφά ισχυρά το νερό δε συμπίπτουν με την περιοχή του ορατού. Το «οπτικό παράθυρο των ιστών» βρίσκεται μεταξύ 630 και 1300 nm. Σε αυτά τα μήκη κύματος δηλαδή, η απορρόφηση από τα συστατικά του αίματος είναι πολύ μικρή και το βάθος διείσδυσης προσεγγίζει τις μέγιστες τιμές του. Μάλιστα όσο μεγαλύτερο είναι το μήκος κύματος τόσο μεγαλύτερο είναι και το βάθος διείσδυσης. Κάθε μόριο κατέχει μία σειρά ενεργειακών σταθμών και μπορεί να μεταβεί από μία χαμηλότερη σε μία υψηλότερη στάθμη με την απορρόφηση κβάντου φωτεινής ακτινοβολίας, ίσης ενέργειας με τη διαφορά των δύο ενεργειακών επιπέδων. Σε κάθε ηλεκτρονιακή στάθμη αντιστοιχεί επίσης ένα πλήθος δονητικών επιπέδων. Η πολλαπλότητα Μ μιας στάθμης, που εκφράζει την τροχιακή στροφορμή, σχετίζεται με το συνολικό spin της στάθμης S μέσω της σχέσης M 2 S 1. Έτσι στην περίπτωση ενός πολυατομικού μορίου του οποίου τα ηλεκτρόνια βρίσκονται σε ζεύγη με αντιπαράλληλα spin το συνολικό spin είναι 0 και η πολλαπλότητά του είναι ίση με 1. Αυτή η κατάσταση ονομάζεται μονήρης (singlet). Όταν το spin ενός ηλεκτρονίου αντιστραφεί, τότε στην κατάσταση αυτή υπάρχουν δύο ασύζευκτα ηλεκτρόνια με παράλληλα spin και ολικό spin 1 άρα η πολλαπλότητα της στάθμης είναι 3. Αυτή η ηλεκτρονιακή στάθμη καλείται τριπλή (triplet). Στη σταθερή τους κατάσταση τα περισσότερα μόρια βρίσκονται στη μονήρη κατάσταση (singlet state) S0. Η βασική αυτή στάθμη χαρακτηρίζεται από τη μικρότερη δυνατή ενέργεια που μπορεί να έχει το μόριο. Αυτό επιτυγχάνεται όταν όλα τα ηλεκτρόνια είναι συζευγμένα και έχουν αντιπαράλληλα spins. Δεν υπάρχει δηλαδή ασύζευκτο ηλεκτρόνιο. Η τριπλή κατάσταση είναι για τα περισσότερα μόρια μία ασταθής κατάσταση στην οποία μεταβαίνουν όταν διεγερθούν και η οποία χαρακτηρίζεται από δύο ασύζευκτα ηλεκτρόνια τα οποία έχουν παράλληλα spins. Το οξυγόνο αποτελεί εξαίρεση των παραπάνω, όντας μία από τις σπάνιες ενώσεις οι οποίες στη βασική τους κατάσταση βρίσκονται στην τριπλή στάθμη, ενώ όταν διεγερθούν μεταβαίνουν στην πολύ σημαντική για τη φωτοδυναμική θεραπεία μονήρη κατάσταση. Μετά την απορρόφηση ενός φωτονίου (διαδικασία που ολοκληρώνεται σε χρόνο της τάξεως των 10-15 sec) από το μόριο του χρωμοφόρου, ακολουθεί μετάβασή του στην πρώτη ή δεύτερη ηλεκτρονιακή κατάσταση ανάλογα με το εάν το φωτόνιο ανήκε στην περιοχή της ορατής ή της υπεριώδους ακτινοβολίας. Η διαδικασία αυτή είναι πολύ εξειδικευμένη και ακτινοβολία συγκεκριμένης ενέργειας απορροφάται από συγκεκριμένες χημικές δομές. Κατά τη διάρκεια παραμονής του μορίου στη διεγερμένη κατάσταση, η πλεονάζουσα ενέργεια σε σχέση με την ενέργεια του χαμηλότερου δονητικού επιπέδου της στάθμης διοχετεύεται μέσω συγκρούσεων σε άλλα μόρια. Με τη διαδικασία αυτή το μόριο καταλαμβάνει το χαμηλότερο δονητικό επίπεδο της διεγερμένης μονήρους στάθμης. Ο χρόνος ζωής αυτής της στάθμης είναι πολύ μικρός, της τάξεως του 1 μs. Το μόριο μπορεί να επιστρέψει στη βασική του στάθμη ακολουθώντας κάποιον από τους παρακάτω μηχανισμούς: Εσωτερική μετατροπή: το μόριο μπορεί από την διεγερμένη κατάσταση, να μεταπηδήσει σε ένα κοντινό δονητικό επίπεδο της βασικής ενεργειακής

134 Άσκηση 7 κατάστασης. Η ενέργεια χάνεται χωρίς εκπομπή ακτινοβολίας μέσω δονητικής αποδιέγερσης. Εσωτερική μετάπτωση: S* T* : το διεγερμένο ηλεκτρόνιο μπορεί να μεταβεί, εάν είναι ενεργειακά δυνατό, από τη μονήρη (S*) στην πρώτη διεγερμένη τριπλή στάθμη (Τ*). Η μετάβαση από τη βασική στην τριπλή διεγερμένη είναι απαγορευμένη (πολύ απίθανη). Σε αντιδιαστολή, η μετάπτωση από τη μονήρη στην τριπλή διεγερμένη στάθμη είναι περισσότερο πιθανή, αφού η ενέργεια του χαμηλότερου δονητικού επιπέδου της Τ* είναι μικρότερη αυτής της S*. Στη συνέχεια, το μόριο μπορεί να επανέλθει άμεσα στη βασική κατάσταση (S0), αφού η επιστροφή στη βασική μέσω της S* προϋποθέτει την πρόσληψη ενέργειας από το περιβάλλον (περίπτωση καθυστερημένου φθορισμού). Η άμεση επιστροφή στην βασική κατάσταση μπορεί να πραγματοποιηθεί είτε χωρίς εκπομπή ακτινοβολίας είτε με εκπομπή ακτινοβολίας, οπότε και έχουμε το φαινόμενο του φωσφορισμού. Εφόσον η πιθανότητα αντίστροφης μετάβασης από τη διεγερμένη τριπλή στη διεγερμένη μονήρη στάθμη είναι μικρή, η διεγερμένη τριπλή στάθμη είναι συνήθως μεγάλης διάρκειας ζωής (από msec ως λεπτά). Επίσης η σχετικά μεγάλη παραμονή των μορίων σε αυτή την κατάσταση τα καθιστά πιο επιρρεπή σε διαδικασίες αποδιέγερσης χωρίς εκπομπή ακτινοβολίας. Μεταφορά ενέργειας μέσω κρούσεων: αν το διεγερμένο μόριο συγκρουστεί με άλλο μόριο που βρίσκεται σε χαμηλότερο ενεργειακό επίπεδο, τότε η ενέργεια μπορεί να μεταφερθεί σε αυτό το μόριο χωρίς εκπομπή ακτονοβολίας. Η διαδικασία αυτή είναι γνωστή ως απόσβεση φθορισμού. Μεταφορά ενέργειας μέσω συντονισμού: η ενέργεια αυτή μπορεί να μεταφερθεί σε άλλο μόριο χωρίς επαφή μέσω μιας σύζευξης διπόλου-διπόλου ανάμεσα στα μόρια. Αν και αυτή η σύζευξη μειώνεται ανάλογα με την έκτη δύναμη της απόστασης ανάμεσα στα μόρια, στα βιολογικά συστήματα μπορεί να επιτευχθεί ικανοποιητική μεταφορά ενέργειας για αποστάσεις μέχρι και 5 mm. Το μόριο που δέχεται την ενέργεια, πρέπει να έχει και μια κατάλληλη ενεργειακή δομή. Το φαινόμενο αυτό είναι μια παραλλαγή της απόσβεσης φθορισμού. Φωτοχημική αντίδραση: η ενέργεια μπορεί να επάγει μια χημική αντίδραση, δηλαδή τη δημιουργία ενός νέου είδους μορίου. Η ενέργεια καταναλώνεται κατά τη δημιουργία αυτών των ενώσεων, που έχουν διαφορετικές ιδιότητες φθορισμού από τις αρχικές. Εκπομπή φθορισμού: το μόριο μπορεί να μεταβεί σε ένα διεγερμένο δονητικό επίπεδο στη βασική ηλεκτρονιακή κατάσταση, με εκπομπή ενός φωτονίου. Η ενέργεια του φωτονίου και άρα το μήκος κύματος της ακτινοβολίας, καθορίζεται από την ενεργειακή διαφορά μεταξύ της διεγερμένης και του δονητικού επιπέδου της βασικής ηλεκτρονιακής κατάστασης. Η διάρκεια ζωής του φθορισμού είναι της τάξης των nsec. Κατόπιν, μέσω απόσβεσης και χωρίς εκπομπή ακτινοβολίας, το μόριο επιστρέφει στο χαμηλότερο δονητικό επίπεδο της βασικής κατάστασης. Εξαιτίας της απώλειας ενέργειας κατά την παραμονή του μορίου στη διεγερμένη κατάσταση, η εκπεμπόμενη ενέργεια (φθορισμός) είναι μεγαλύτερου μήκους κύματος σε σχέση με την απορροφηθείσα ενέργεια. Το φάσμα φθορισμού (η κατανομή της έντασης της ακτινοβολίας φθορισμού για κάθε μήκος κύματος), εκφράζει τις διαφορετικές πιθανές μεταβάσεις από την μονήρη διεγερμένη κατάσταση στα διάφορα δονητικά επίπεδα της βασικής ηλεκτρονιακής κατάστασης. Η σχετική πιθανότητα να συμβεί κάποια από τις

Μελέτη με απεικονιστική μικροσκοπία των φωτοδυναμικών επιδράσεων σε ερυθρά αιμοσφαίρια 135 πιθανές διαδρομές διαφέρει από μόριο σε μόριο και εξαρτάται, όχι μόνο από τη δομή του, αλλά και από το τοπικό του περιβάλλον. 7.4. Μηχανισμοί φωτοδυναμικής θεραπείας Η εισαγόμενη από τη φωτοδυναμική θεραπεία κυτταροτοξικότητα θεωρείται ότι εισάγεται από φωτοοξειδωτικές αντιδράσεις. Οι αντιδράσεις αυτές πιστεύεται ότι ανήκουν σε δύο διαφορετικούς μηχανισμούς, των οποίων κοινό πρώτο στάδιο θεωρείται η διέγερση του μορίου του φωτοευαισθητοποιητή που λαμβάνει χώρα μετά την ακτινοβόλησή του. Το διεγερμένο μόριο του φωτοευαισθητοποιητή που βρίσκεται στην τριπλή διεγερμένη στάθμη μπορεί να δεχθεί ή να δώσει ένα ηλεκτρόνιο οπότε και θα «εμπλακεί» σε ένα μηχανισμό παραγωγής ελευθέρων ριζών (αντιδράσεις τύπου Ι), ή θα μεταφέρει την ενέργειά του σε ένα μόριο οξυγόνου (αντιδράσεις τύπου ΙΙ). Στη δεύτερη περίπτωση, το ενεργοποιημένο οξυγόνο (που αναφέρεται ως μονήρες οξυγόνο) μπορεί να παράξει ένα μεγάλο πλήθος υδρο-υπεροξειδικών παραγώγων. Αυτά τα είδη είναι ικανά να δημιουργήσουν νέες πορείες οξειδωτικών αντιδράσεων. Ενδιαφέρον επίσης είναι ότι και οι ελεύθερες ρίζες που παράγονται από τον πρώτο μηχανισμό μπορούν να οδηγήσουν σε παρόμοιες πορείες αντιδράσεων αντιδρώντας με το υπόστρωμα. Έτσι, αφού και οι δύο μηχανισμοί παράγουν παρόμοια προϊόντα είναι δύσκολο να διευκρινιστεί αν η προκαλούμενη τοξικότητα οφείλεται στον ένα ή τον άλλο μηχανισμό και σε ποιο βαθμό. Η εισαγόμενη από τη φωτοδυναμική θεραπεία κυτταροτοξικότητα φαίνεται να οφείλεται κύρια στις αντιδράσεις τύπου ΙΙ γιατί όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα σχετικών ερευνών: Πρώτον, έχει παρατηρηθεί μείωση της τοξικότητας της φωτοδυναμικής θεραπείας όταν στο σύστημα εισαχθούν κάποιοι ειδικοί αναστολείς του μονήρους οξυγόνου όπως τα παράγωγα του 1,3 διφαινυλισοβενζοφουρανίου, και Δεύτερον, αν κύτταρα ή ιστοί υποστούν φωτοδυναμική θεραπεία κάτω όμως από χαμηλές συγκεντρώσεις οξυγόνου, παρατηρείται πολύ σημαντική μείωση της κυτταροτοξικότητάς της. Το ποσοστό με το οποίο θα συμμετέχουν οι αντιδράσεις τύπου Ι ή ΙΙ στο τελικό κυτταροτοξικό αποτέλεσμα εξαρτάται από διάφορους παράγοντες όπως: Το είδος του φωτοευαισθητοποιητή Το είδος του ιστού ή των κυττάρων Το ph Τη συγκέντρωση οξυγόνου. 7.5. Φωτοευαισθητοποιητές Τα χαρακτηριστικά που πρέπει να πληρεί μία ένωση προκειμένου να χρησιμοποιηθεί ως φωτοευαισθητοποιητής μπορούν να διακριθούν στις παρακάτω κατηγορίες: Φυσικοχημικά χαρακτηριστικά Χημική καθαρότητα. Τα παράγωγα της αιματοπορφυρίνης ακόμη και στην «καθαρή μορφή» τους είναι πολύπλοκο μείγμα ολιγομερών. Ο φωτοευαισθητοποιητής θα πρέπει να έχει συγκεκριμένη χημική σύσταση καθώς

136 Άσκηση 7 αυτό κάνει περισσότερο εύκολες τις μελέτες του μεταβολισμού και της φαρμακοκινητικής του. Μεγάλο μοριακό συντελεστή απορρόφησης στην περιοχή του κόκκινου. Απορρόφηση σε μεγαλύτερα μήκη κύματος σημαίνει μεγαλύτερο βάθος διείσδυσης της ακτινοβολίας στον ιστό. Αυτό είναι σημαντικό για δύο λόγους. Πρώτον γιατί μπορεί να καταστραφεί μεγαλύτερο μέρος του όγκου σε κάθε θεραπεία γεγονός το οποίο συνεπάγεται λιγότερη ταλαιπωρία για τον ασθενή, και δεύτερον γιατί εάν το βάθος διείσδυσης είναι μεγάλο μπορούν να αντιμετωπιστούν και μη επιφανειακοί όγκοι. Μικρό μοριακό συντελεστή απορρόφησης στην UV περιοχή. Εάν ο φωτοευαισθητοποιητής παρουσιάζει σημαντική απορρόφηση στην UV περιοχή τότε είναι πιθανό ο ασθενής να παρουσιάσει προβλήματα φωτοευαισθησίας αν εκτεθεί στην ηλιακή ακτινοβολία και εφόσον ο φωτοευαισθητοποιητής δεν έχει ακόμη απομακρυνθεί από τους δερματικούς ιστούς. Μικρή τάση για σχηματισμό συσσωμάτων σε υδάτινο περιβάλλον. Οι φωτοευαισθητοποιητές οι οποίοι είναι υδατοδιαλυτοί είναι πιο εύκολο να χορηγηθούν στην κλινική πράξη. Επίσης θα πρέπει να είναι δυνατή η είσοδος τους στο εσωτερικό των κύτταρων διαμέσου των λιπιδίων της μεμβράνης. Επομένως ιδανικά θα πρέπει να είναι και υδρόφοβες ουσίες. Για να συνδυαστούν τα δύο αυτά χαρακτηριστικά, η διαλυτότητα στο νερό και η υδροφοβικότητα, θα πρέπει η ουσία να είναι αμφίφιλη. Φωτοφυσικά χαρακτηριστικά Μεγάλος χρόνος ζωής της τριπλής διεγερμένης κατάστασης. Όταν η τριπλή διεγερμένη κατάσταση του μορίου έχει μεγαλύτερο χρόνο ζωής αυξάνεται η πιθανότητα μεταφοράς της ενέργειας του σε κάποιο άλλο μόριο, όπως για παράδειγμα το οξυγόνο. Ικανοποιητική παραγωγή ελευθέρων ριζών και μονήρους οξυγόνου. Το χαρακτηριστικό αυτό καθορίζεται από την κβαντική απόδοση της ουσίας στην παραγωγή μονήρους οξυγόνου, ΦΔ. Φαρμακολογικά χαρακτηριστικά Ικανοποιητική και επιλεκτική συγκέντρωση σε καρκινικούς όγκους σε σχέση με τους υγιείς. Το χαρακτηριστικό αυτό είναι σημαντικό καθώς το σημαντικότερο πλεονέκτημα της φωτοδυναμικής θεραπείας είναι να προκαλέσει ικανοποιητική νέκρωση των όγκων με τις ελάχιστες δυνατές βλάβες στους παρακείμενους ιστούς. Γρήγορη αποδέσμευση από τους υγιείς ιστούς. Η γρήγορη αποδέσμευση από τους υγιείς ιστούς συνεπάγεται αύξηση της επιλεκτικότητας αλλά και μείωση της φωτοευαισθησίας σε περίπτωση που ο φωτοευαισθητοποιητής παρουσιάζει σημαντική απορρόφηση στην UV περιοχή. Έλλειψη τοξικότητας απουσία φωτός (dark toxicity). Ο φωτοευαισθητοποιητής δεν πρέπει να είναι τοξικός χωρίς την προηγούμενη ενεργοποίηση του από φως κατάλληλου μήκους κύματος.

Μελέτη με απεικονιστική μικροσκοπία των φωτοδυναμικών επιδράσεων σε ερυθρά αιμοσφαίρια 137 Φθορισμός. Καθώς ο φωτοευαισθητοποιητής συγκεντρώνεται επιλεκτικά στους καρκινικούς ιστούς, εάν είναι φθορίζον μόριο μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για τη διάγνωση του καρκίνου. Φωτοθεραπευτικά χαρακτηριστικά. Ικανοποιητική νέκρωση των κακοηθειών. Ο ιδανικός φωτοευαισθητοποιητής θα πρέπει να εμφανίζεται με μεγάλη συγκέντρωση στους καρκινικούς ιστούς ενώ σε μικρή στους υγιείς. Ακόμη θα πρέπει να γίνεται γρήγορη επούλωση πιθανόν καταστροφών υγιών ιστών. Χαμηλή παραμένουσα φωτοευαισθησία. Το βασικότερο μειονέκτημα της φωτοδυναμικής θεραπείας στην παρούσα της μορφή είναι η παραμένουσα φωτοευαισθησία που εμφανίζει ο ασθενής. Αυτό μπορεί να διαρκέσει αρκετές εβδομάδες μειώνοντας την ποιότητα ζωής του ασθενή. Ο φωτοευαισθητοποιητής θα πρέπει επομένως να εξασφαλίζει ελάχιστη συγκέντρωση στο δέρμα ώστε να αποφεύγεται η δερματική φωτοευαισθησία. 7.5.1 Photofrin I, II Ο πρώτος φωτοευαισθητοποιητής που δοκιμάστηκε κλινικά ήταν ένα μίγμα παραγώγων αιματοπορφυρίνης, η Photofrin Ι. Η Photofrin ήταν ένα μίγμα πορφυρινών το οποίο καθαρίστηκε στοιχειωδώς προκειμένου να απομονωθεί από αυτό το μίγμα το πιο ενεργό κλάσμα με τις επιθυμητές ιδιότητες (Photofrin II). Παρόλα αυτά η Photofrin παραμένει ακόμη ένα μίγμα μονομερών, διμερών και ολιγομερών της αιματοπορφυρίνης καθώς και των αντίστοιχων εστέρων και αιθέρων αυτών των ενώσεων. Το φάσμα απορρόφησης της Photofrin παρουσιάζει 5 κορυφές απορρόφησης με την ισχυρότερη απορρόφηση στα 400 nm και την ασθενέστερη στα 630 ή 625 nm in vivo. Αν και στα 630 nm η απορρόφηση είναι μικρή, αυτό είναι το μήκος κύματος που χρησιμοποιείται τόσο πειραματικά όσο και κλινικά, αφού σε αυτό το μήκος η διεισδυτικότητα της ακτινοβολίας στον ιστό είναι καλή ενώ επίσης για μήκη κύματος 650-800 nm μπορεί να επιτευχθεί νέκρωση των κυττάρων. Το φως των 625 nm μπορεί να διεισδύσει σε μήκος 5-10 mm στον ιστό, ανάλογα και με τη συγκέντρωση της φωτοευαισθητοποιού ουσίας σε αυτόν, με ένταση ικανή να προκαλέσει τις επιθυμητές φωτοδυναμικές αντιδράσεις. Πολύ επίπεδοι επίσης όγκοι μπορεί να θεραπευτούν με ακτινοβολία στα 514 nm, μήκος κύματος το οποίο μειώνει τον κίνδυνο νέκρωσης των γειτονικών υγιών ιστών οργάνων με λεπτές μεμβράνες όπως ο οισοφάγος και η ουροδόχος κύστη. Η Photofrin έχει χρόνο ημίσειας απομάκρυνσης από το πλάσμα 12-22 h και χρόνο απομάκρυνσης 5-6 ημέρες. Πάντως η κατακράτηση της Photofrin από το δέρμα, τους καρκινικούς όγκους και τους μυς έχει πολύ μεγαλύτερη διάρκεια ενώ οι συγκεντρώσεις της στο ήπαρ, τη σπλήνα και τους νεφρούς είναι μεγαλύτερη σε σχέση με τις αντίστοιχες των όγκων οποιαδήποτε χρονική στιγμή μετά τη χορήγηση του φαρμάκου. Tο σημαντικότερο μειονέκτημα της Photofrin είναι η παρατεταμένη φωτοευαισθησία που προκαλείται στο δέρμα μετά τη θεραπεία, εξαιτίας της οποίας οι ασθενείς πρέπει να προφυλάσσονται από το έντονο φως για 6-12 εβδομάδες. Αυτή η σοβαρή φωτοευαισθησία που προκαλείται στους ασθενείς σε συνδυασμό με τη χαμηλή απορρόφηση του φωτός στα 625 nm ώθησαν τους ερευνητές στην αναζήτηση

138 Άσκηση 7 φωτοευαισθητοποιητών δεύτερης γενιάς. Οι φωτοευαισθητοποιητές δεύτερης γενιάς περιλαμβάνουν τις πορφυρίνες, τα παράγωγα χλωρινών, τα παράγωγα βενζοχλωρινών, τις πουρπουρίνες, τις φθαλοκυανίνες, τις ναφθαλοκυανίνες και τις βακτηριοχλωρίνες. 7.5.2 5-Αμινολεβουλινικό οξύ (ALA) Ο πιο γνωστός φωτοευαισθητοποιητής δεύτερης γενιάς είναι το 5-Αμινολεβουλινικό οξύ το οποίο είναι μία πρόδρομη ένωση της πρωτοπορφυρίνης ΙΧ (Pp IX) στη μεταβολική πορεία της αίμης. Υπό κανονικές συνθήκες, η βιοσύνθεση της Pp IX από το μεταβολισμό περιορίζεται σε μικρές ποσότητες ακατάλληλες για τη φωτοδυναμική θεραπεία. Αν όμως επιπλέον ποσότητα ALA χορηγηθεί στον ασθενή οι αντιδράσεις ελέγχου της παραγωγής Pp IX παρακάμπτονται και Pp IX μπορεί να συσσωρευτεί στα αντίστοιχα σημεία. Αν και η Pp IX δεν έχει σημαντικές διαφορές από τα συστατικά της Photofrin αναφορικά με το φάσμα της, η θεραπεία με ALA παρουσιάζει σημαντικά πλεονεκτήματα έναντι της θεραπείας με Photofrin για αρκετές μορφές καρκίνου όπως καρκίνο του δέρματος, επιφανειακό καρκίνο της ουροδόχου κύστης και του οισοφάγου, στις οποίες η χορήγηση μπορεί να γίνει τοπικά ή ενδοκυστεϊκώς. Με τη χρήση του ALA έχει σημειωθεί επιτυχία της τάξης του 90% στη θεραπεία δερματικών καρκίνων με άριστα κοσμετολογικά αποτελέσματα. Η τοπική χορήγηση του ALA όμως επιτρέπεται σε καρκίνους με μέγιστο βάθος 3mm. Για μεγαλύτερα βάθη η χορήγηση δεν μπορεί να γίνει τοπικά. Στοματική πρέπει να είναι επίσης η χορήγηση για καρκίνους της στοματικής κοιλότητας και του πεπτικού συστήματος. Για επιφανειακούς καρκίνους (1-2mm) το ALA είναι ο καλύτερος φωτοευαισθητοποιητής που διατίθεται αυτή τη στιγμή. Για βαθύτερους καρκινικούς όγκους (3-10mm) είναι απαραίτητοι φωτοευαισθητοποιητές που ενεργοποιούνται σε μεγαλύτερα μήκη κύματος, προκειμένου να αποφευχθούν μεγάλοι χρόνοι ακτινοβόλησης και να επιτευχθούν καλύτερα θεραπευτικά αποτελέσματα. 7.5.3 Φθαλοκυανίνες Οι φθαλοκυανίνες είναι νέες και πολλά υποσχόμενες φωτοευαισθητοποιές ουσίες οι οποίες βρίσκονται ακόμη αυτήν την στιγμή σε στάδιο πειραματικής εξέλιξης. Δομικά εμφανίζουν πολλές ομοιότητες με τις πορφυρίνες. Ωστόσο οι μονομερείς μεταλλόφθαλοκυανίνες σε υδατικά διαλύματα, απορροφούν έντονα στα 350 nm, σε μια μικρή περιοχή γύρω από τα 600 nm, ενώ το μέγιστο απορρόφησης εντοπίζεται στα 670 nm περίπου, σε αντίθεση με τις πορφυρίνες που εμφανίζουν μέγιστο απορρόφησης στα 630 nm.

Μελέτη με απεικονιστική μικροσκοπία των φωτοδυναμικών επιδράσεων σε ερυθρά αιμοσφαίρια 139 Σχήμα 2: α) Χημική δομή τετρασουλφουρωμένης φθαλοκυανίνης. Στη μη μεταλλική της μορφή, στο εσωτερικό του δακτυλίου βρίσκονται δύο υδρογόνα. Στην περίπτωση των μεταλλοφθαλοκυανινών, το άτομο του μετάλλου καταλαμβάνει την κεντρική θέση του δακτυλίου. β) Χημική δομή της τετρασουλφουρωμένης πορφυρίνης (TSPP). Οι φωτοφυσικές ιδιότητες των φθαλοκυανινών επηρεάζονται έντονα από τις ιδιότητες του κεντρικού μεταλλικού ιόντος. Αποτέλεσμα αυτής της επίδρασης είναι η μεγάλη διακύμανση που παρουσιάζεται στην απόδοση και στους χρόνους ζωής της φωτοδιεγερμένης κατάστασης triplet. Τα σύμπλοκα των φθαλοκυανινών με παραμαγνητικά μέταλλα δίνουν ενώσεις με μικρούς χρόνους ζωής της κατάστασης triplet (της τάξης των ns), ενώ με διαμαγνητικά μέταλλα, όπως τα Zn 2+, Al 3+ και Ga 3+ δίνουν ουσίες με υψηλή απόδοση και μεγάλους χρόνους ζωής. Ακόμη, οι φθαλοκυανίνες είναι φωτοχημικά σταθερές, μη τοξικές στη μορφή που χορηγούνται στον ασθενή, και επίσης δείχνουν να είναι επιλεκτικές στην περιοχή του καρκινικού όγκου. Εξίσου σημαντικό είναι και το γεγονός ότι δεν εμφανίζουν παραμένουσα φωτοευαισθησία και περίπου μία ώρα μετά τη θεραπεία ο ασθενής μπορεί να εκτεθεί στο ηλιακό φως. Οι φθαλοκυανίνες είναι υδρόφοβες ενώσεις και επομένως αδιάλυτες στο νερό. Το πρόβλημα αυτό όμως αίρεται με κατάλληλες προσθήκες επιλεγμένων υποκαταστατών. Σύγχρονες εργασίες διερευνούν τα δομικά χαρακτηριστικά των φθαλοκυανινών, σε σχέση με τη δραστικότητα τους στη φωτοδυναμική θεραπεία. Μέχρι σήμερα, έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως τα σουλφονικά παράγωγα των φθαλοκυανινών και μάλιστα η υποκατάσταση σουλφονικών ομάδων στο δακτύλιο των φθαλοκυανινών προσδιορίζει τη διαλυτότητα τους, τον αριθμό των περιφερειακών φορτίων και την επακόλουθη κυτταρική πρόσληψη ή/και επιλεκτική κατακράτηση από τον όγκο. Οι Pc δεν έχουν εξασφαλίσει ακόμα έγκριση από τον FDA και οι μηχανισμοί δράσης τους αποτελούν ένα από τα θέματα μετωπικής έρευνας στον τομέα της PDT. 7.6. Δοσιμετρία 7.6.1 Βάθος διείσδυσης Το περιορισμένο βάθος διείσδυσης του φωτός κατά τη διάρκεια της θεραπείας θεωρείται από πολλούς ένα από τα σημαντικότερα μειονεκτήματα της φωτοδυναμικής

140 Άσκηση 7 θεραπείας. Για την περιοχή του κόκκινου φωτός, εμπειρικοί κανόνες αναφέρουν ότι το βάθος θεραπείας κυμαίνεται μεταξύ 2 και 5 mm. Υπάρχουν όμως και περιπτώσεις που όχι μόνο το μικρό βάθος διείσδυσης δεν αποτελεί πρόβλημα αλλά επιβάλεται. Μικρό βάθος διείσδυσης για παράδειγμα επιβάλεται όταν πρόκειται να θεραπευθούν in situ καρκίνοι κοιλοτήτων όπως π.χ. της ουροδόχου και του παχέως εντέρου. Σε αυτές τις περιπτώσεις εάν η ακτινοβολία διεισδύσει σε μεγάλο βάθος μπορούν να προκληθούν σοβαρές βλάβες όπως καταστροφή του τοιχώματος των οργάνων ή/και συστολή του οργάνου. Ανάλογα με τον ιστό το βάθος στο οποίο παρατηρούνται φωτοδυναμικές δράσεις μπορεί να μειώνεται σημαντικά και λόγω σκέδασης ή λόγω επιφανειακής μόνο απορρόφησης του φωτοευαισθητοποιητή. Ένα τέτοιο χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η θεραπεία δερματικών καρκίνων με τοπική εφαρμογή ALA. Το μικρό βάθος θεραπείας οφείλεται κύρια στο μικρό βάθος στο οποίο έχει απορροφηθεί ο φωτοευαισθητοποιητής και στη μικρή διείσδυση του φωτός. 7.6.2 Παλμική και συνεχής ακτινοβολία Πολλοί ερευνητές υποστηρίζουν πως τα αποτελέσματα της φωτοδυναμικής είναι πολύ καλύτερα αν αντί για συνεχή χρησιμοποιηθεί παλμική ακτινοβολία ή διακοπτόμενη ακτινοβόληση. Οι περισσότεροι αποδίδουν τα βελτιωμένα αποτελέσματα στο ότι στο χρόνο μεταξύ δύο παλμών ή δύο ακτινοβολήσεων ο ιστός προλαβαίνει να αναπληρώσει το οξυγόνο το οποίο έχει καταναλωθεί από τις δράσεις που προκλήθηκαν από τον πρώτο παλμό. Ο χρόνος αυτός στην περίπτωση που δεν έχουν υποστεί κάποια βλάβη τα αγγεία είναι ίσος με το χρόνο που απαιτείται για τη διάχυση του οξυγόνου από τα τριχοειδή στα κύτταρα ή στην περίπτωση που το αγγειακό σύστημα έχει υποστεί συστολή ο χρόνος που απαιτείται προκειμένου να πάρουν τα αγγεία τις φυσιολογικές τους διαστάσεις. Ένα άλλο στοιχείο το οποίο πρέπει να επιλεγεί για τους ίδιους λόγους πολύ προσεκτικά είναι η ακτινοβόληση (fluence rate). Μαθηματικά μοντέλα που αφορούν την κατανάλωση οξυγόνου θεωρούν ότι με ακτινοβολήσεις μεγαλύτερες των 50 mw/cm 2 η κατανάλωση του οξυγόνου είναι τόσο γρήγορη που η θεραπεία γίνεται μη αποτελεσματική. 7.6.3 Δόση ενέργειας Η συνολική ενέργεια που έχει τελικά δοθεί στον ιστό δίνεται από το γινόμενο της ακτινοβόλησης επί τον συνολικό χρόνο ακτινοβολίας: Total light dose (J/cm 2 )=fluence rate (W/cm 2 ) x treatment time (sec) Η συνολική δόση ενέργειας ποικίλει ανάλογα με τον όγκο το φωτοευαισθητοποιητή και την πηγή που θα χρησιμοποιηθεί στην περίπτωση που αυτή δεν είναι laser από 30-540 (J/cm 2 ). Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δοθεί στον υπολογισμό της δόσης ενέργειας στην περίπτωση που θα χρησιμοποιηθούν λάμπες με κάποια φίλτρα τα οποία θα αφήνουν μόνο την επιθυμητή για τη διέγερση του φωτοευαισθητοποιητή περιοχή του φάσματος να περάσει.

Μελέτη με απεικονιστική μικροσκοπία των φωτοδυναμικών επιδράσεων σε ερυθρά αιμοσφαίρια 141 7.7. Πλεονεκτήματα μειονεκτήματα Η φωτοδυναμική θεραπεία προσφέρει έναν αριθμό πλεονεκτημάτων συγκρινόμενη με άλλες ογκολογικές θεραπείες. Είναι μία από τις επιλεκτικότερες θεραπείες καρκίνου αφού και ο φωτοευαισθητοποιητής απορροφάται επιλεκτικά από τους καρκινικούς ιστούς αλλά και κατευθύνοντας την φωτεινή ακτινοβολία στοχεύονται μόνο οι κακρινικοί ιστοί. Είναι μία μη επεμβατική θεραπεία. Η θεραπεία είναι σχετικά γρήγορη αφού η ακτινοβόληση διαρκεί μόνο λίγα λεπτά. Ο σχηματισμός ουλής είναι ελάχιστος ως ανύπαρκτος. Δε χρειάζεται αναισθησία εάν ο όγκος είναι εύκολα προσβάσιμος. Η θεραπεία μπορεί να επαναληφθεί όσες φορές χρειαστεί αφού δεν υπάρχουν σοβαρές παρενέργειες. Το κόστος της είναι μικρό. Είναι ακίνδυνη για τον ασθενή αλλά και το ιατρικό προσωπικό. Το βασικότερο μειονέκτημα της φωτοδυναμικής θεραπείας είναι ότι δεν μπορεί να επιτευχθεί μεταφορά της φωτεινής ακτινοβολίας σε όλα τα σημεία του ανθρώπινου οργανισμού με αποτέλεσμα οι εφαρμογές της να είναι ακόμη περιορισμένες σε όγκους οργάνων εύκολα προσβάσιμων. 7.8. Σύνθετο μικροσκόπιο Ένα μικροσκόπιο αποτελείται από ένα σταθερό τμήμα, που ονομάζεται βάση, πάνω στην οποία είναι προσαρτημένο το οπτικό τμήμα καθώς και οι άλλες διατάξεις όπως η στήριξη των παρασκευασμάτων που θα μελετηθούν (αντικειμενοφόρος πλάκα), το σύνολο των μηχανισμών κίνησης για εστίαση και η συσκευή φωτισμού. Το φως διέρχεται από το σύστημα φωτισμού στο συναγωγό σύστημα, ένα σύστημα φακών που επιτρέπει τον ομοιόμορφο φωτισμό του παρασκευάσματος. Με τη βοήθεια διαφράγματος ρυθμίζεται κατάλληλα η ένταση της δέσμης. Tο σύστημα των δύο φακών που συμμετέχουν στη διαδικασία σχηματισμού του ειδώλου του αντικειμένου αποτελείται από τον αντικειμενικό φακό, που είναι κοντά στο προς παρατήρηση αντικείμενο και από τον προσοφθάλμιο που είναι κοντά στο μάτι του παρατηρητή. Ο αντικειμενικός δίνει το είδωλο πραγματικό αντεστραμμένο και μεγεθυμένο κοντά στο εστιακό επίπεδο του προσοφθάλμιου φακού. Ο προσοφθάλμιος φακός λειτουργεί κατά ανάλογο τρόπο με ένα φακό μεγεθύνσεως δίνοντας ένα φανταστικό μεγεθυμένο είδωλο που παραμένει αντεστραμμένο.

142 Άσκηση 7 Σχήμα 3: Διαδικασία σχηματισμού ειδώλου Οι αντικειμενικοί φακοί είναι τοποθετημένοι σε μια υποδοχή η οποία περιστρέφεται έτσι ώστε να γίνεται εύκολα η αντικατάσταση τους κατά τη διάρκεια της παρατήρησης και να μεταβάλλεται η μεγέθυνση. Η συνολική μεγέθυνση του τελικού ειδώλου σε σχέση με το αντικείμενο είναι το γινόμενο των μεγεθύνσεων του αντικειμενικού και του προσοφθάλμιου. Έτσι για αντικειμενικό με μεγέθυνση 40x και προσοφθάλμιο με 10x, η συνολική μεγέθυνση είναι 400x. Εκτός όμως από την μεγέθυνση το μικροσκόπιο προσφέρει τη δυνατότητα να αναδειχθούν τα δομικά στοιχεία που αποτελούν τα αντικείμενα. Στο παρακάτω σχήμα, φαίνονται τα οπτικά και μηχανικά χαρακτηριστικά ενός σύνθετου μικροσκοπίου. 12 1. Φωτισμός 2. Βίδες για εστίαση του φωτός 3. Φίλτρα 4. Διάφραγμα 5. Συμπυκνωτής δέσμης 6. Βάση 7. Αντικειμενικός φακός 8. Υψομετρική ρύθμιση του συμπυκνωτή δέσμης 9. Μηχανικός έλεγχος της βάσης 10. Κοινός έλεγχος εστίασης 11. Λεπτός έλεγχος εστίασης 12. Προσοφθάλμιοι φακοί. Σχήμα 4: Σύνθετο μικροσκόπιο

Μελέτη με απεικονιστική μικροσκοπία των φωτοδυναμικών επιδράσεων σε ερυθρά αιμοσφαίρια 143 7.8.1 Διακριτική ικανότητα Ένα βασικό χαρακτηριστικό του μικροσκοπίου είναι η διακριτική του ικανότητα. Ως όριο διακριτικής ικανότητας ορίζεται η ελάχιστη απόσταση μεταξύ δύο σημείων του παρατηρούμενου αντικειμένου που μπορούν να παρατηρηθούν ξεχωριστά. Το όριο αυτό για το μάτι του ανθρώπου είναι περίπου 0.1mm ενώ για ένα καλής ποιότητας οπτικό μικροσκόπιο είναι περίπου 0.2 μm, δηλ. 500 φορές βελτιωμένη. Το όριο διακριτικής ικανότητας (l.r. : limit of resolution), δίνεται από τη σχέση (Abbe): όπου: 0.61 l.r. N.A. λ το μήκος κύματος του χρησιμοποιούμενου φωτός, Ν.Α. το αριθμητικό άνοιγμα του αντικειμενικού φακού (που καθορίζει τη γωνία εισόδου του φωτός σε αυτόν), Ν.Α. = n sinθ, n o δείκτης διάθλασης του μέσου που παρεμβάλλεται μεταξύ του αντικειμενικού φακού και του δείγματος, και θ η γωνία που σχηματίζει μια φωτεινή ακτίνα που προέρχεται από το αντικείμενο και συλλέγεται από τον αντικειμενικό φακό, με τον άξονά του. Επειδή η διακριτική ικανότητα είναι περιορισμένη μια μεγέθυνση πέρα από κάποιο όριο (μέγιστη χρήσιμη μεγέθυνση), δεν παρέχει καμία επιπλέον πληροφορία. Μεγαλύτερη μεγέθυνση από το όριο αυτό θα έχει σαν αποτέλεσμα να ελαττωθεί η ποιότητα του ειδώλου. Έτσι στην πράξη δεν χρησιμοποιούνται μεγεθύνσεις μεγαλύτερες από 2500x. Η διακριτική ικανότητα μπορεί να βελτιωθεί και επομένως να χρησιμοποιηθούν και μεγαλύτερες μεγεθύνσεις ενεργώντας κατά τρεις τρόπους: 1. Ελαττώνοντας το λ, 2. Αυξάνοντας το θ, δηλαδή το άνοιγμα του αντικειμενικού φακού και 3. Αυξάνοντας το n με παρεμβολή μεταξύ αντικειμενικού και δείγματος ενός μέσου με δ.δ. > 1. Το μέσο που χρησιμοποιείται είναι συνήθως ένα ειδικό έλαιο. Στο τέλος του 19ου αιώνα χρησιμοποιώντας αντικειμενικούς φακούς με ειδικά έλαια, επιτεύχθηκε μία τιμή του N.A. 1.4, η οποία επιτρέπει στα οπτικά μικροσκόπια να ξεχωρίζουν δύο σημεία τα οποία απέχουν μεταξύ τους 0.2 μm. Με εξαίρεση ορισμένων ασυνήθιστων υγρών ως μέσα, ή με χρήση υπεριώδους πηγής φωτός, το όριο αυτό παραμένει μέχρι και σήμερα για τα οπτικά μικροσκόπια. 7.8.2 Βάθος εστίασης Βάθος εστίασης (Depth of Field) ορίζουμε το μικρό πάχος του παρασκευάσματος στο οποίο μπορούμε να εστιάσουμε με το μικροσκόπιο. Το βάθος εστίασης εξαρτάται από τον αντικειμενικό φακό που χρησιμοποιούμε και καθώς το Ν.Α. αυξάνει, μειώνεται σημαντικά.

144 Άσκηση 7 D F N.A. Επίσης ένα άλλο χαρακτηριστικό είναι η διάμετρος του πεδίου, που είναι αντιστρόφως ανάλογη της ολικής μεγέθυνσης. 7.8.3 Αντίθεση Η αντίθεση (contrast) του σχηματιζόμενου ειδώλου είναι ο αριθμός των αποχρώσεων στην εικόνα. Μία εικόνα υψηλής αντίθεσης έχει μόνο δύο αποχρώσεις, το άσπρο και το μαύρο. Ωστόσο περισσότερες αποχρώσεις, δηλαδή χαμηλότερη αντίθεση, δίνουν περισσότερη πληροφορία. Η αντίθεση ελέγχεται από το διάφραγμα του συναγωγού συστήματος (condenser iris). Αρκετές φορές είναι απαραίτητο να κλείνουμε λίγο το διάφραγμα, γεγονός που έχει σαν αποτέλεσμα να μειώνεται η διακριτική ικανότητα, αλλά να βελτιώνεται δραστικά η αντίθεση καθώς και το βάθος εστίασης. Η αντίθεση μπορεί να βελτιωθεί και με τη χρήση έγχρωμων φίλτρων. Συνήθως στην πράξη χρησιμοποιείται πράσινο φίλτρο (λ= 500-600nm). Η φωτεινότητα ρυθμίζεται από τη διάταξη μετασχηματιστή στη βάση του μικροσκοπίου, που ελαττώνει την ένταση του φωτός χωρίς να μεταβάλλεται όμως η χρωματική ποιότητα του φωτισμού. 7.9. Πειραματική διαδικασία Σκοπός των πειραμάτων είναι η μελέτη της φωτοδυναμικής επίδρασης της φωτοευαισθητοποιούς ουσίας ZnPcS4 στα ερυθρά αιμοσφαίρια. Για μία συγκεκριμένη συγκέντρωση χρωστικής θα εξεταστούν τρείς διαφορετικές δόσεις ακτινοβόλησης. Θα προσδιοριστεί το ποσοστό επιβίωσης των ερυθροκυττάρων και θα σχεδιάστουν τα διαγράμματα Δόσης - Απόκρισης. Η πειραματική μεθοδολογία συνοψίζεται ως εξής: 1. Παρασκευή των συμπυκνωμένων ερυθρών αιμοσφαιρίων από το αίμα. 2. Επώαση των ερυθρών αιμοσφαιρίων με τη χρωστική ZnPcS4. 3. Ακτινοβόληση του βιολογικού δείγματος. 4. Παρατήρηση και καταγραφή εικόνων του δείγματος σε προκαθορισμένα χρονικά διαστήματα. 5. Επεξεργασία των εικόνων ώστε να προσδιοριστεί το ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων στο πεδίο. 6. Δημιουργία των διαγραμμάτων Δόσης-Απόκρισης. 2