In vitro και in vivo φαρμακοκινητική ανάλυση των παραγώγων ανθρακινόνης σε φυτικά σκευάσματα

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ In vitro και in vivo φαρμακοκινητική ανάλυση των παραγώγων ανθρακινόνης σε φυτικά σκευάσματα ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ της ΣΟΦΙΑΣ ΣΩΤΗΡΙΑΣ Ι. ΞΑΝΘΟΠΟΥΛΟΥ Πτυχιούχου Φαρμακοποιού Α.Π.Θ. (2008) Επιβλέπων: Ιωάννης Νιώπας Καθηγητής Φαρμακευτικής Α.Π.Θ. Θεσσαλονίκη, Φεβρουάριος 2012 1

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ In vitro και in vivo φαρμακοκινητική ανάλυση των παραγώγων ανθρακινόνης σε φυτικά σκευάσματα ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ της ΣΟΦΙΑΣ ΣΩΤΗΡΙΑΣ Ι. ΞΑΝΘΟΠΟΥΛΟΥ Πτυχιούχου Φαρμακοποιού Α.Π.Θ. (2008) ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγητής Α.Π.Θ. Ιωάννης Νιώπας (Επιβλέπων) Καθηγητής Α.Π.Θ. Ευγένιος Κοκκάλου Αναπληρωτής Καθηγητής Α.Π.Θ. Ιωάννης Βιζιριανάκης Θεσσαλονίκη, Φεβρουάριος 2012 2

Στη μνήμη του πατέρα μου Ιωάννη 3

Ευχαριστίες Η παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακοκινητικής του τομέα Φαρμακολογίας Φαρμακογνωσίας του τμήματος Φαρμακευτικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης υπό την επίβλεψη του Καθηγητή κ. Ιωάννη Νιώπα. Καθόλη τη διάρκεια της μελέτης αποκόμισα πολλές εμπειρίες που ενδυνάμωσαν την ερευνητική μου σκέψη και βελτίωσαν το χαρακτήρα μου. Ευχαριστώ θερμά τον κ. Ιωάννη Νιώπα για την ευκαιρία που μου έδωσε να πραγματοποιήσω τη διπλωματική μου εργασία, για τη συνεχή υποστήριξη και τις εποικοδομητικές παρατηρήσεις του. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τα άλλα δύο μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής, τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Ιωάννη Βιζιριανάκη και τον Καθηγητή κ. Ευγένιο Κοκκάλου για τις γνώσεις που μου προσέφεραν τόσο στις προπτυχιακές όσο και στις μεταπτυχιακές σπουδές μου. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου, στον υποψήφιο διδάκτορα Μάριο Σπανάκη για την ορθή καθοδήγηση, τις συμβουλές και την υπομονή του και στην Ιωάννα Κρητιώτου για την άψογη συνεργασία μας. Ευχαριστώ ιδιαιτέρως τους εθελοντές, τη Χρυσούλα Αντωνιάδου, τον Κωνσταντίνο Δολδούρη, την Ελένη Ξανθοπούλου και τον Θοδωρή Τζιγκαλίδη που έλαβαν μέρος στη φαρμακοκινητική μελέτη για την βοήθεια και την κατανόησή τους. Τέλος, ευχαριστώ πολύ τη μητέρα μου για τη συνεχή συμπαράσταση και την ανιδιοτελή αγάπη της όλα αυτά τα χρόνια. 4

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT 4 9 10 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: Ανθρακινόνες 1.1 Ορισμός και χημική δομή ανθρακινονών 1.2.1 Μηχανισμός δράσης και φαρμακευτική χρήση ανθρακινονών 1.2.2 Ανεπιθύμητες ενέργειες και αλληλεπιδράσεις ανθρακινονών 1.2.3 Απορρόφηση, μεταβολισμός και απομάκρυνση ανθρακινονών 1.3 Φυτά που περιέχουν ανθρακινόνες 1.3.1 Φλοιός κασκάρας (Cascara sagrada) 1.3.2 Ρίζωμα ρήου (Rhubarb) 1.3.3 Αλόη 1.3.4 Φύλλα σέννας ή φύλλα αλεξανδρείας (Cassia angustifolia) 1.3.5 Φλοιός φραγκούλας (Frangula bark) 11 12 12 14 16 17 20 20 20 21 23 24 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: Χρωματογραφικές Αναλυτικές Μέθοδοι 2.1 Χρωματογραφικές Μέθοδοι 2.1.1 Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) 2.1.2 Αέρια χρωματογραφία 2.1.3 Αέρια χρωματογραφία φασματομετρία μάζας (GC MS) 2.2 Προετοιμασία δείγματος 2.2.1 Εκχύλιση (extraction) και ανάκτηση (recovery) 2.3 Καμπύλη βαθμονόμησης ή καμπύλη αναφοράς 2.4 Μέθοδος εσωτερικού προτύπου (internal standard method) 2.5 Επικύρωση Βιοαναλυτικής Μεθόδου 2.5.1 Παράμετροι επικύρωσης 25 25 25 27 28 30 30 33 35 36 37 5

2.5.1.1 Εκλεκτικότητα (selectivity) 2.5.1.2 Ακρίβεια (accuracy) και πιστότητα (precision) 2.5.1.3 Ευαισθησία (sensitivity), όριο ανίχνευσης (limit of detection, LOD) και κατώτερο όριο ποσοτικοποίησης (lower limit of quantification, LLOQ) 2.5.1.4 Σταθερότητα (stability) και ανθεκτικότητα (ruggedness) 2.6 Ποιοτικός έλεγχος φυτικών σκευασμάτων 2.7 Μελέτες διαπερατότητας φαρμακευτικών ουσιών διαμέσου του ανθρώπινου εντερικού επιθηλίου 2.7.1 Εισαγωγή 2.7.2 Το μοντέλο των Caco 2 κυττάρων για τη μελέτη της διαπερατότητας των φαρμακευτικών ουσιών διαμέσου του εντερικού επιθηλίου 2.7.3 Caco 2 κύτταρα και Ρ γλυκοπρωτεΐνη 37 37 39 40 41 44 44 46 48 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: Ανάπτυξη και επικύρωση αναλυτικής μεθόδου για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό ελεύθερων ανθρακινονών σε ανθρώπινο πλάσμα και ούρα με αέρια χρωματογραφίαφασματομετρία μάζας (GC MS) 3.1 Εισαγωγή 3.2 Υλικά και Αντιδραστήρια 3.3 Παραγωγοποίηση (derivatization) 3.4 Οργανολογία 3.5 Χρωματογραφικές/Φασματομετρικές Συνθήκες 3.6 Παρασκευή διαλυμάτων 3.6.1 Πρότυπα διαλύματα για το πλάσμα 3.6.2 Πρότυπα διαλύματα για τα ούρα 3.7 Παρασκευή δειγμάτων ποιοτικού ελέγχου 3.7.1 Δείγματα ποιοτικού ελέγχου για το πλάσμα 52 52 52 53 58 59 59 60 61 61 61 6

3.7.2 Δείγματα ποιοτικού ελέγχου για τα ούρα 3.8 Προετοιμασία δειγμάτων πλάσματος και ούρων 3.9 Αποτελέσματα και Συζήτηση 3.9.1 Κατασκευή καμπυλών αναφοράς 3.9.1.1 Για το πλάσμα 3.9.1.2 Για τα ούρα 3.9.2 Ακρίβεια κι Επαναληψιμότητα 3.9.3 Ανάκτηση 3.9.4 Κατώτερο όριο ποσοτικοποίησης (LLOQ) 3.9.5 Συζήτηση 62 62 63 63 66 67 68 69 70 71 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4: Φαρμακοκινητική μελέτη ελεύθερων ανθρακινονών μετά από εφάπαξ από του στόματος χορήγηση του φυτικού φαρμακευτικού προϊόντος Laxfruit σε υγιείς εθελοντές 4.1 Εισαγωγή Επιλογή φυτικού φαρμακευτικού προϊόντος 4.2 Υλικά και Μέθοδοι 4.2.1 Επιλογή εθελοντών 4.2.2 Σχεδιασμός της μελέτης και συλλογή δειγμάτων αίματος και ούρων 4.2.3 Επεξεργασία κι Ανάλυση δειγμάτων 4.3 Φαρμακοκινητική αξιολόγηση 4.3.1 Αποτελέσματα 4.3.1.1 Κατασκευή φαρμακοκινητικών διαγραμμάτων 4.3.1.2 Προσδιορισμός φαρμακοκινητικών παραμέτρων 4.3.2 Συζήτηση 4.4 Φαρμακοκινητική μελέτη ελεύθερων ανθρακινονών μετά την εφάπαξ από του στόματος χορήγησή τους σε ένα υγιή εθελοντή 4.5 Μέθοδος 4.5.1 Σχεδιασμός της μελέτης και Συλλογή δειγμάτων 4.5.2 Επεξεργασία κι ανάλυση δειγμάτων 72 72 73 73 74 75 76 78 78 82 87 89 90 90 91 7

4.6 Υπολογιστικό Μέρος 4.6.1 Κατασκευή καμπυλών αναφοράς για πλάσμα και ούρα 4.6.2 Υπολογισμός παραμέτρων επικύρωσης 4.7 Αποτελέσματα 4.7.1 Κατασκευή φαρμακοκινητικών διαγραμμάτων 4.7.2 Προσδιορισμός φαρμακοκινητικών παραμέτρων 4.8 Συζήτηση 91 91 93 96 96 98 99 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5: Ποιοτικός έλεγχος φυτικού σκευάσματος Laxfruit 5.1 Εισαγωγή Σκοπός 5.2 Υλικά και Μέθοδοι 5.2.1 Επεξεργασία σκευάσματος 5.2.1.1 Προσδιορισμός συγκεντρώσεων ολικών ανθρακινονών 5.2.1.2 Προσδιορισμός συγκεντρώσεων ελεύθερων ανθρακινονών 5.3 Υπολογιστικό Μέρος Αποτελέσματα 5.4 Συζήτηση 101 101 103 103 103 104 104 105 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6: Διαπερατότητα ανθρακινονών κατά μήκος της Caco 2 κυτταρικής σειράς 6.1 Εισαγωγή 6.2 Υλικά και Μέθοδος 6.2.1 Καλλιέργειες κυττάρων 6.2.2 Παρασκευή και Επεξεργασία προτύπων διαλυμάτων 6.3 Αποτελέσματα και Συζήτηση 6.3.1 Κατασκευή καμπυλών αναφοράς για τα Caco 2 κύτταρα 6.3.2 Υπολογισμός παραμέτρων επικύρωσης για τα Caco 2 κύτταρα 6.3.3 Υπολογιστικό μέρος διαπερατότητας ανθρακινονών 6.3.4 Συζήτηση 107 107 107 107 110 111 111 112 113 119 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7: Συμπεράσματα ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 121 123 8

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μία αναλυτική μέθοδος αέριας χρωματογραφίας φασματομετρίας μάζας (SIM GC/MS) για τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό των τεσσάρων ανθρακινονών αλοεμοδίνη, εμοδίνη, ρεΐνη και φυσκιόνη σε διάφορα υποστρώματα. Η μέθοδος ήταν απλή, εκλεκτική, ευαίσθητη, ακριβής, επαναλήψιμη και γενικά αξιόπιστη και μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για τη διεξαγωγή φαρμακοκινητικών μελετών. Ακολούθως, διεξήχθη η φαρμακοκινητική ανάλυση των ανθρακινονών μετά την από του στόματος εφάπαξ χορήγηση 1 g του φυτικού σκευάσματος Laxfruit σε πέντε υγιείς εθελοντές και προσδιορίστηκαν οι φαρμακοκινητικές τους παράμετροι στο πλάσμα και τα ούρα. Το κύριο χαρακτηριστικό της φαρμακοκινητικής ανάλυσης στο πλάσμα ήταν η παρουσία πολλαπλών κορυφών στις καμπύλες συγκέντρωσης χρόνου που μπορεί να οφείλεται στην απορρόφηση των ανθρακινονών σε διαφορετικές θέσεις του εντερικού σωλήνα και στην εντεροηπατική ανακύκλωση των γλυκουρονιδίων των ανθρακινονών. Για την περαιτέρω διευκρίνιση του συγκεκριμένου φαινομένου διεξήχθη μία επιπλέον φαρμακοκινητική μελέτη μετά την από του στόματος εφάπαξ χορήγηση 20 mg καθαρών ελεύθερων ανθρακινονών σε έναν υγιή εθελοντή αλλά και πάλι οι καμπύλες συγκέντρωσης χρόνου των ανθρακινονών παρουσίασαν πολλαπλές κορυφές. Χρησιμοποιώντας την αναλυτική μέθοδο διεξήχθη και ο ποιοτικός έλεγχος του Laxfruit και προσδιορίστηκε η περιεκτικότητά του σε ελεύθερες και σε ολικές ανθρακινόνες, μετά την όξινη υδρόλυση των γλυκοζιτών τους. Το φυτικό σκεύασμα περιέχει και τις τέσσερις ανθρακινόνες, τόσο υπό μορφή γλυκοζιτών όσο και υπό ελεύθερη μορφή, ως άγλυκα. Τέλος, μελετήθηκε η διαπερατότητα των αγλύκων των ανθρακινονών διαμέσου του λεπτού εντέρου χρησιμοποιώντας τη μεθοδολογία της Caco 2 κυτταρικής μονοστιβάδας απουσία και παρουσία βεραπαμίλης, γνωστού αναστολέα της Ρ γλυκοπρωτεΐνης. Υπολογίσθηκε ο φαινόμενος συντελεστής διαπερατότητας (Papp) βάσει του οποίου προσδιορίσθηκε ο μηχανισμός απορρόφησης από το λεπτό έντερο και εξήχθη το συμπέρασμα ότι οι ελεύθερες ανθρακινόνες απορροφούνται μέτρια από το λεπτό έντερο. 9

ABSTRACT In this study, an analytical method using gas chromatography mass spectrometry (SIM GC/MS) was developed and validated for the simultaneous determination of four anthraquinones aloe emodin, emodin, rhein and physcion in different matrices. The method was simple, selective, sensitive, accurate, precise and reliable for the conduct of pharmacokinetic studies. A pharmacokinetic study of anthraquinones was carried out after oral administration of a single dose of 1 g of the herbal medicinal product Laxfruit to five healthy volunteers and the pharmacokinetic parameters were determined in plasma and urine. The principal feature of the pharmacokinetic analysis in plasma was the presence of multiple peaks in the curves of concentration time that may appear due to the absorption of anthraquinones in different positions of the intestinal tract and due to the enterohepatic reclycling of their glucuronides. In order to clarify further this phenomenon a second pharmacokinetic study was carried out after oral administration of 20 mg of pure free anthraquinones to a healthy volunteer but the multiple peaks appeared again, suggesting the enterohepatic reclycling of their glucuronides. Using the analytical method the quality control of Laxfruit was carried out and the content of the herbal product in free and total anthraquinones was determined after the acid hydrolysis of their glycosides. The herbal product contains the four anthraquinones both in the form of glycosides and aglycones. Finally, the permeability of the aglycones of anthraquinones through the small intestine was studied with the help of the methodology of Caco 2 cell monolayer in the absence and presence of verapamil which is a well known inhibitor of P glycoprotein. The apparent permeability coefficient (Papp) was calculated, the mechanism of absorption from the small intestine was determined and it was found that the free anthraquinones were moderately absorbed from the small intestine. 10

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Στην αγορά κυκλοφορούν αρκετά φυτικά σκευάσματα που περιέχουν ως δραστικά συστατικά παράγωγα ανθρακινονών και χρησιμοποιούνται κυρίως ως καθαρτικά κατά της δυσκοιλιότητας. Στα φυτά τα παράγωγα των ανθρακινονών απαντώνται κυρίως υπό τη μορφή των γκυκοζιτών τους και δευτερευόντως υπό τη μορφή των αγλύκων τους (ελεύθερες ανθρακινόνες). Στην εργασία αυτή επιλέχθηκαν να μελετηθούν 4 άγλυκα των ανθρακινονών όπως η αλοεμοδίνη, η εμοδίνη, η ρεΐνη και η φυσκιόνη τα οποία μαζί με τους γλυκοζίτες τους είναι αποδεκτά ως σημαντικά δραστικά συστατικά με ποικίλες φαρμακολογικές ιδιότητες [Koyama et al, 2007] και απαντώνται σε διάφορα φυτά όπως η αλόη (Aloe vera), το ρήο (ραβέντι) (Rheum rhabarbarum), η σέννα (Cassia angustifolia), η κασκάρα (Rhamnus purshiana) και η φράγκουλα (Rhamnus framgula), τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως στην παραδοσιακή θεραπευτική. Επίσης, ένα προφάρμακο της ρεΐνης, η διακερεΐνη ή διακετυλορεΐνη, χρησιμοποιείται ως συμβατικό αντιφλεγμονώδες φάρμακο για τη θεραπεία της οστεοαρθρίτιδας, μίας από τις κύριες μυοσκελετικές ασθένειες που επηρεάζουν τις αρθρώσεις. Χορηγείται από του στόματος σε δοσολογία 50 mg δύο φορές ημερησίως και κατά την απορρόφησή της στο λεπτό έντερο μεταβολίζεται πλήρως σε ρεΐνη, πριν από την είσοδό της στη συστηματική κυκλοφορία. Σε σύγκριση με άλλα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα, και αν εξαιρεθούν κάποιες ήπιες ενοχλήσεις που παρουσιάζονται στο πεπτικό σύστημα, η διακερεΐνη είναι καλά ανεκτή και φαίνεται ότι δεν ευθύνεται ούτε για γαστρεντερική αιμορραγία, ούτε για νεφρική, ηπατική ή αιματολογική τοξικότητα [Nicolas et al, 1998]. 11

Οι σημαντικότεροι επιμέρους σκοποί της διπλωματικής εργασίας ήταν οι παρακάτω: 1) 2) 3) 4) 5) Η ανάπτυξη και επικύρωση μίας ευαίσθητης καιι αξιόπιστης αναλυτικής μεθόδου αέριας χρωματογραφίας φασματομετρίας μάζας (GC/MS) για τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό των τεσσάρων αυτών αγλύκων των ανθρακινονών σε διάφορα υποστρώματα (φυτικάά εκχυλίσματα, πλάσμα, ούρα). Ο ποιοτικός έλεγχος του φυτοθεραπευτικού σκευάσματος (Laxfruit) που κυκλοφορεί στην ελληνική αγορά και που περιέχει τα τ παραπάνω παράγωγα της ανθρακινόνης, υπό μορφή γλυκοζιτών και/ή αγλύκων. Η φαρμακοκινητική ανάλυση των αγλύκων των ανθρακινονών στο πλάσμα και τα ούρα υγιών εθελοντών μετά από του στόματος εφάπαξ χορήγηση του παραπάνω φυτοθεραπευτικού σκευάσματος. Η φαρμακοκινητική ανάλυση των αγλύκων των ανθρακινονών στο πλάσμα και τα ούρα υγιών εθελοντών μετά από του στόματος εφάπαξ χορήγηση των παραπάνω καθαρών αγλύκων των ανθρακινονών. Η μελέτη της διαπερατότητας των αγλύκων των ανθρακινονών χρησιμοποιώντας τη μεθοδολογία της Caco 2 κυτταρικής μονοστιβάδας, απουσία και παρουσία αναστολέα της Ρ γλυκοπρωτεΐνης. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: Ανθρακινόνες 1.1 Ορισμός και χημική δομή ανθρακινονών Οι ανθρακινόνες είναι οργανικές ουσίες φυτικής προέλευσης που είναι παράγωγα του ανθρακενίου που απαρτίζεται από 3 συμπυκνωμένους βενζολικούς δακτυλίους. Υπάρχουν αρκετά ισομερή ανθρακινονών αλλά συνήθως ο όρος ανθρακινόνη αναφέρεται στο ισομερέςς 9,10 ανθρακινόνη όπου οι δύο κετο ομάδες βρίσκονται στον κεντρικό δακτύλιο. Σχήμα 1.1: Χημική δομή 9,10 ανθρακινόνης 12

Τα παράγωγα των ανθρακινονών αποτελούν τα δραστικά συστατικά αρκετών δρογών με καθαρτικές ιδιότητες. Στη φύση απαντώνται υπό τη μορφή των αγλύκων τους ή συνήθως υπό τη μορφή των γλυκοζιτών τους,, με συνηθέστερο σάκχαρο τη γλυκόζη ή τη ραμνόζη, και η παρουσία του σακχάρου θεωρείται αναγκαία προϋπόθεση για την εμφάνιση της φαρμακολογικής τους δράσης. Οι ελεύθερες ανθρακινόνες (άγλυκα) είναι έγχρωμες ενώσεις (συνήθως κίτρινες κρυσταλλικές σκόνες), ελάχιστα διαλυτές στο νερό ν αλλά καλά διαλυτές σε οργανικούς διαλύτες και ακολουθούν την παραπάνωω βασική χημική δομή με διαφορές στη διάταξη των υποκαταστατών τους. Αποτελούν το κύριο παραπροϊόν του ανθρακενίου και τη βασική πρώτη ύληη για ποικίλες βαφές και χρωστικές. Η δράση τους οδήγησεε τους επιστήμονες στην σ προσπάθεια για το διαχωρισμό τους από άλλα συστατικά λόγω της χρησιμότητας των ιδιοτήτων τους. Οι ελεύθερες ανθρακινόνες που επιλέξαμε να μελετήσουμε και οι χημικές δομές τους δίδονται στον παρακάτω πίνακα: Πίνακας 1.1: Χημική δομή και χαρακτηριστικά των αγλύκων των ανθρακινονών πουυ επιλέχθηκαν να μελετηθούνν Ανθρακινόνη Χημική δομή Ονομασία IUPAC Μοριακός Μοριακό τύπος βάρος Αλοεμοδίνη 1,8 Dihydroxy 3 9,10 anthracenedione (hydroxymethyl) C 15 H 1 10O 5 27 70,24 Εμοδίνη 1,3,8 Trihydroxy 9,10 dione 6 methylanthracene C 15 H 1 10O 5 27 70,24 Ρεΐνη 4,5 Dihydroxy 9,10 dioxoanthracene 2 carboxylic acid C 15 H 8 8O 6 284,22 Φυσκιόνη 1,8 Dihydroxy 3 C 16 H 1 methyl 6 methoxy anthraquinone 12O 5 28 84,27 13

1.2.1 Μηχανισμός δράσης και φαρμακευτική χρήση ανθρακινονών Οι δρόγες που περιέχουν παράγωγα ανθρακινόνης χρησιμοποιούνται ως καθαρτικά στη δυσκοιλιότητα καθώς δρουν τοπικά στο παχύ έντερο διεγείροντας τις συσπάσεις του και διευκολύνοντας την αφόδευση. Είναι ευρέως διαθέσιμες σαν διαιτητικά συμπληρώματα στα φαρμακεία και στα καταστήματα βιολογικών προϊόντων και συνήθως συνταγογραφούνται ως απλά εκχυλίσματα δρογών κι όχι ως καθαρές ουσίες. Το τμήμα του σακχάρου των γλυκοζιτών αυξάνει τη διαλυτότητα και διευκολύνει τη μεταφορά στο σημείο δράσης. Μετά από του στόματος χορήγηση, οι γλυκοζίτες ανθρακινόνης μεταφέρονται στο παχύ έντερο όπου υδρολύονται με βραδύ ρυθμό από τα ένζυμα της βακτηριδίων της εντερικής χλωρίδας προς τις αντίστοιχες ελεύθερες ανθρακινόνες (άγλυκα) οι οποίες αποτελούν τις φαρμακολογικά δραστικές μορφές και η έναρξη της δράσης τους εμφανίζει υστέρηση 6 έως 12 ώρες μετά την λήψη τους. Στο παχύ έντερο οι ανθρακινόνες μπορούν επίσης να αναχθούν από τα βακτήρια της εντερικής χλωρίδας προς παράγωγα ανθρόνης που κατέχουν επίσης καθαρτική δράση. Η δυσκοιλιότητα αποτελεί μια κοινή πάθηση στο 1 6% των μεσηλίκων και 20 80% των ηλικιωμένων, είναι συχνότερη μεταξύ των γυναικών και αντιμετωπίζεται με τη χρήση καθαρτικών. Ο συνηθέστερος τύπος είναι η λειτουργική δυσκοιλιότητα χωρίς κάποια συγκεκριμένη αιτιολογία. Τα περισσότερο χρησιμοποιούμενα καθαρτικά περιλαμβάνουν φυτοθεραπευτικά σκευάσματα που περιέχουν διεγερτικά παράγωγα ανθρακινονών, λιπαντικά καθαρτικά (φυτικά ή ορυκτά έλαια) ή παράγοντες αύξησης όγκου. Τα φυτοθεραπευτικά σκευάσματα που περιέχουν παράγωγα ανθρακινονών προορίζονται «για βραχυχρόνια χρήση σε περιπτώσεις περιστασιακής δυσκοιλιότητας» και θεωρούνται ως φυτικά φαρμακευτικά προϊόντα με «καλά εδραιωμένη φαρμακευτική χρήση». Η καθαρτική δράση των παραγώγων ανθρακινόνης οφείλεται σε μεγάλο βαθμό σε τοπική δράση στο παχύ έντερο. Υπάρχουν δύο διακριτοί μηχανισμοί για την εμφάνιση της καθαρτικής δράσης των παραγώγων ανθρακινόνης. 14

Κυρίως προκαλούν αύξηση της κινητικότητας του εντέρου με αποτέλεσμα τη μείωση του χρόνου διέλευσης και τη μείωση της απορρόφησης υγρών από το έντερο. Δευτερευόντως, αναστέλλουν την απορρόφηση νερού και ηλεκτρολυτών από τα επιθηλιακά κύτταρα του παχέος εντέρου και το τελικό αποτέλεσμα είναι η συσσώρευση νερού και ηλεκτρολυτών στον αυλό του εντέρου που μπορεί να οδηγήσει σε καθαρτική δράση. Πειράματα σε πειραματόζωα και ανθρώπους έδειξαν ότι οι ελεύθερες ανθρακινόνες στο παχύ έντερο προκαλούν ζωηρές περισταλτικές κινήσεις και αυξάνουν την κινητικότητα του εντέρου. Η δράση αυτή στο έντερο βασίζεται, τουλάχιστον μερικώς, στην αύξηση της παραγωγής της προσταγλαδίνης PGE2 από τον εντερικό ιστό και εξουδετερώνεται από την ινδομεθακίνη και άλλα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα (αναστολείς βιοσύνθεσης προσταγλανδινών). Όμως, άλλες μελέτες έδειξαν ότι η καθαρτική δράση μπορεί να είναι και συστηματική μέσω δράσης στο νευρικό πλέγμα του εντερικού τοιχώματος. Η διπλή δράση των παραγώγων ανθρακινόνης παίζει σημαντικό ρόλο στην ασφάλεια και αποτελεσματικότητά τους. Με μικρότερες καθαρτικές δόσεις επικρατεί μια σχετικά ήπια αύξηση της κινητικότητας του εντέρου, ενώ με μεγαλύτερες δόσεις επικρατεί συσσώρευση ηλεκτρολυτών και υγρών στο έντερο με αποτέλεσμα την πρόκληση διάρροιας. Η απώλεια ηλεκτρολυτών, που οφείλεται σε χορήγηση μεγάλων δόσεων, ακολουθείται από εθισμό και ανεπιθύμητες ενέργειες. Χρόνια κατάχρηση των καθαρτικών της ανθρακινόνης αυξάνει τα επίπεδα αλδοστερόνης, λόγω αντίδρασης του οργανισμού στην απώλεια ηλεκτρολυτών, και αυτό μειώνει την αποτελεσματικότητά τους. Μεγαλύτερες δόσεις προκαλούν κένωση ενός μεγάλου μέρους του περιεχομένου του παχέος εντέρου, με αποτέλεσμα η απουσία της αφόδευσης την επόμενη ημέρα να οδηγεί στην ανάγκη για επαναχρησιμοποίηση των καθαρτικών, πιθανά σε μεγαλύτερες δόσεις και έτσι επαναλαμβάνεται η χρήση τους. Η ρεΐνη είναι ένα άγλυκο ανθρακινόνης που βρέθηκε να αναστέλλει τη δράση των κυτοκινών και μπορεί να έχει ευεργετικές αντιφλεγμονώδεις και αναλγητικές ιδιότητες στην οστεοαρθρίτιδα. Η παρατήρηση αυτή οδήγησε στην 15

ανάπτυξη της διακετυλορεΐνης, ενός συνθετικού περισσότερο λιπόφιλου παραγώγου με μεγαλύτερη βιοδιαθεσιμότητα από τη ρεΐνη. Κλινικές μελέτες έδειξαν ότι η από του στόματος λαμβανόμενη διακετυλορεΐνη, σε δόση 100 mg ημερησίως, βελτιώνει τα συμπτώματα σε ασθενείς με οστεοαρθρίτιδα, ενώ η συχνότερη ανεπιθύμητη ενέργεια της είναι η διάρροια. Οι ανθρακινόνες κατέχουν επίσης κι άλλες ενδιαφέρουσες βιολογικές ιδιότητες. Επιδημιολογικές μελέτες έδειξαν ότι η κατανάλωση τροφών πλούσιων σε πολυφαινόλες σχετίζεται με μείωση εμφάνισης ορμονοεξαρτώμενων μορφών καρκίνου όπως ο καρκίνος του μαστού και του προστάτη. Επίσης, τα παράγωγα των ανθρακινονών έχουν αντιμυκητισιακή δράση, καθυστερούν την επιδείνωση της νεφρικής ανεπάρκειας και ρυθμίζουν τη φλεγμονή αναστέλλοντας μερικώς την κυκλοοξυγενάση. Εκτενείς κλινικές κι εργαστηριακές μελέτες έχουν αποδείξει ότι τα φυτοθεραπευτικά σκευάσματα που περιέχουν ανθρακινόνες έχουν υψηλή αντιοξειδωτική, αντιβακτηριδιακή, αντιγηραντική, αντισπασμωδική, τονωτική, καρδιοτονωτική, καταπραϋντική και ηρεμιστική δράση [Zuo et al, 2008]. 1.2.2 Ανεπιθύμητες ενέργειες και αλληλεπιδράσεις ανθρακινονών Τα άτομα που χρησιμοποιούν τακτικά και μακροχρόνια φυτοθεραπευτικά σκευάσματα που περιέχουν ανθρακινόνες ως ήπια καθαρτικά πρέπει να είναι προσεκτικά καθώς η αλόγιστη χρήση τους οδηγεί σε σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες. Τα καθαρτικά ανθρακινόνης μπορεί να προκαλέσουν ήπια κοιλιακά ενοχλήματα όπως κοιλιακούς πόνους και κράμπες εξαιτίας των ερεθισμών που επιφέρουν στα τοιχώματα του εντέρου αλλά και λόγω της ηλεκτρολυτικής ανισορροπίας (υπονατριαιμία), καθώς και νεφρίτιδες από υπερβολική απώλεια υγρών και ηλεκτρολυτών. Άλλες παρενέργειες περιλαμβάνουν αποχρωματισμό των ούρων και υπεραιμία αιμορροΐδων. Η υπερδοσολογία μπορεί να προκαλέσει διάρροια και η παρατεταμένη χρήση ή κατάχρηση μπορεί να οδηγήσει σε απώλεια ηλεκτρολυτών, ιδιαίτερα καλίου (υποκαλιαιμία). Η κατάχρηση καθαρτικών της ανθρακινόνης μπορεί να 16

οδηγήσει σε εθισμό, λόγω αύξησης των επιπέδων αλδοστερόνης (υπεραλδοστερινισμός) που οφείλεται στην αντίδραση του οργανισμού λόγω απώλειας ηλεκτρολυτών. Ο πιο ασφαλής κι αποτελεσματικός τρόπος χρήσης τους είναι να λαμβάνονται για περιορισμένο χρονικό διάστημα. Η παρατηρούμενη υποκαλιαιμία μπορεί να αυξήσει τη δράση των καρδιακών γλυκοζιτών (π.χ. διγοξίνη) και να επηρεάσει τη δράση των αντιαρρυθμικών φαρμάκων (π.χ. κινιδίνη), καθώς και άλλων φαρμάκων που επάγουν την επιμήκυνση του QT τμήματος του ηλεκτροκαρδιογραφήματος, προκαλώντας επικίνδυνες καρδιακές αρρυθμίες. Ταυτόχρονη λήψη με φάρμακα που προκαλούν υποκαλιαιμία (π.χ. διουρητικά, κορτικοστεροειδή, ρίζα γλυκύρριζας) μπορεί να επιδεινώσει την ηλεκτρολυτική ανισορροπία. Τα παράγωγα των ανθρακινονών που χορηγούνται ως ήπια καθαρτικά μπορούν να μειώσουν την απορρόφηση άλλων συγχορηγούμενων φαρμάκων εξαιτίας της αύξησης της κινητικότητας του εντέρου, γι αυτό πρέπει ν αποφεύγεται η ταυτόχρονη λήψη τους με άλλα φάρμακα. Επίσης, έχει αναφερθεί ότι αντενδείκνυται η κατανάλωση παραγώγων ανθρακινονών κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης, αλλά απόδειξη για την έλλειψη της ασφάλειάς τους δεν είναι ακόμα διαθέσιμη. Λόγω των παραπάνω κινδύνων, οι περισσότεροι διεθνείς Οργανισμοί Φαρμάκων απαιτούν τη βραχυχρόνια χρήση των φυτοθεραπευτικών σκευασμάτων που περιέχουν παράγωγα ανθρακινόνης για τη θεραπευτική αντιμετώπιση της περιστασιακής δυσκοιλιότητας, η οποία μπορεί να θεωρηθεί ως ασφαλής. 1.2.3 Απορρόφηση, μεταβολισμός και απομάκρυνση ανθρακινονών Το βασικότερο πρόβλημα σχετικά με τα παράγωγα των ανθρακινονών είναι η περιορισμένη γνώση των χαρακτηριστικών απορρόφησης και των μεταβολικών μονοπατιών στο γαστρεντερικό σωλήνα που καθιστά δύσκολη την κατανόηση των αιτιών για τη φτωχή βιοδιαθεσιμότητά τους [Teng et al, 2007]. 17

Οι γλυκοζίτες ανθρακινόνης μεταφέρονται, αναπαρρόφητοι, στο παχύ έντερο, όπου με βακτηριακή υδρόλυση του γλυκοζιτικού δεσμού ελευθερώνεται το σάκχαρο και η δραστική ελεύθερη ανθρακινόνη (άγλυκο). Η εντερική βακτηριακή χλωρίδα είναι επίσης υπεύθυνη για την αναγωγή των αγλύκων της ανθρακινόνης προς τις αντίστοιχες ανθρόνες. Μετά την απορρόφησή τους τα ανθρανοειδή (ελεύθερες ανθρακινόνες και ανθρόνες) μεταβολίζονται προς τα αντίστοιχα γλυκουρονίδια και θειϊκούς εστέρες, που απεκκρίνονται στα ούρα και τη χολή. Μετά την από του στόματος χορήγηση των καθαρτικών ανθρακινόνης παρατηρείται βραδεία έναρξη της καθαρτικής δράσης 6 έως 12 ωρών. Η υστέρηση έναρξης της δράσης αντανακλά το χρονικό διάστημα που απαιτείται για τη μεταφορά των γλυκοζιτών ανθρακινόνης στο παχύ έντερο, καθώς και για την υδρόλυσή τους από τα ένζυμα της μικροβιακής χλωρίδας και την ελευθέρωση των αγλύκων ανθρακινόνης, στα οποία οφείλεται η τοπική καθαρτική δράση. Η σύσταση της εντερικής χλωρίδας κάθε ατόμου, και συνεπώς η ικανότητα υδρόλυσης των γλυκοζιτών ανθρακινόνης, σχετίζεται στενά με το ρυθμό και την έκταση (βιοδιαθεσιμότητα) απορρόφησης των δραστικών ελεύθερων ανθρακινονών και επομένως με το τελικό φαρμακολογικό αποτέλεσμα. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφερθεί στο μεταβολισμό των ανθρακινονών. Συγκεκριμένα, έχει αναφερθεί ότι η αλοεμοδίνη και η εμοδίνη υφίστανται εκτεταμένο μεταβολισμό πρώτης διόδου (first pass effect), ενώ η πολύ μικρή βιοδιαθεσιμότητα της φυσκιόνης οφείλεται στην εκτεταμένη απομεθυλίωσή της στον εντερικό σωλήνα [Shia et al, 2011]. Επίσης, οι σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις της ρεΐνης που επιτυγχάνονται μετά την από του στόματος χορήγηση παραγώγων ανθρακινόνης που συνυπάρχουν στο ρήο (ραβέντι) (Rhei rhizoma) εξηγούνται λόγω της παρουσίας πολλών παραγώγων ανθρακινόνης, όπως οι σεννοσίδες Α και Β, η αλοεμοδίνη και η χρυσοφανόλη, που μπορούν να μεταβολισθούν στο έντερο και να ελευθερώσουν ρεΐνη η οποία στη συνέχεια απορροφάται και εισέρχεται στη συστηματική κυκλοφορία. 18

Όπως έδειξαν κάποιες μελέτες και όπως απεικονίζεται αναλυτικά στο παρακάτω σχήμα 1.3, μετά την υδρόλυση των γλυκοζιτών της ανθρακινόνης παραμένουν τα άγλυκα όπου η χρυσοφανόλη, μέσω οξείδωσης με το κυτόχρωμα Ρ450, μεταβολίζεται προς αλοεμοδίνη που αποτελεί τον κύριο μεταβολίτη της [Muelle et al, 1998]. Ακολούθως, η αλοεμοδίνη μεταβολίζεται ταχέως προς ρεΐνη [Song et al., 2009], η οποία στη συνέχεια υφίσταται μεταβολισμόό φάσης ΙΙΙ και δίνει προϊόντα σύζευξης (γλυκουρονίδια και θειϊκούς εστέρες). Ο και C γλυκοζίτες ανθρακινονών χρυσοφανόλη αλοεμοδίνη ρεΐνη εμοδίνη φυσκιόνη γλυκουρονίδια ανθρακινονών + θειϊκοί εστέρες όπου R 1 = OSO 3 H Σχήμα 1.3 Υδρόλυση Ο και C γλυκοζιτών ανθρακινονών και βιομετατροπή των αγλύκων ανθρακινόνης. 19

1.3 Φυτά που περιέχουν ανθρακινόνες Οι ανθρακινόνες είναι ευρέως διαδεδομένες στο φυτικό βασίλειο. Απαντώνται στο φλοιό κασκάρας (Rhamnus purshiana), στο ρίζωμα ρήου (Rheum palmatum), στην αλόη (Aloe vera), στα φύλλα σέννας (Cassia angustifolia) και στο φλοιό φραγκούλας (Rhamnus framgula). 1.3.1 Φλοιός κασκάρας (Cascara sagrada): Τάξη Οικογένεια Υποοικογένεια Γένος Είδος Rosales Rhamnaceae Frangula Rhamnus purshiana Περιέχει τέσσερις βασικούς γλυκοζίτες (κασκαροσίδες A, B, C, D), Ο γλυκοζίτες της αλοεμοδίνης, εμοδίνης και χρυσοφανόλης και τις ελεύθερες ανθρακινόνες αλοεμοδίνη, εμοδίνη και χρυσοφανόλη. Είναι ήπιο καθαρτικό, πικρό τονωτικό και μπορεί να χρησιμοποιηθεί στη χρόνια δυσκοιλιότητα καθώς ενισχύει τις περισταλτικές κινήσεις και τονώνει τους χαλαρωμένους μύες του εντέρου. Συνδυάζεται με αρωματικά και ευστόμαχα φυτά όπως η γλυκύρριζα και χρησιμοποιείται ως αφέψημα ή βάμμα προ του ύπνου. Οι τυπικές δοσολογίες της κασκάρας είναι 1 g φλοιού, 2 έως 6 ml υγρού εκχυλίσματος ή 325 mg ξηρού εκχυλίσματος. Μακροχρόνια χρήση μπορεί να οδηγήσει σε χρόνια διάρροια και σε ηλεκτρολυτική ανισορροπία, ενώ πρέπει να αποφεύγεται η κατανάλωσή της κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης και του θηλασμού καθώς τα συστατικά της μπορεί να μεταφερθούν στο έμβρυο διαμέσου του πλακούντα ή να απεκκριθούν στο μητρικό γάλα. 1.3.2 Ρίζωμα ρήου (Rhubarb): Τάξη Οικογένεια Γένος Είδος Caryophyllales Polygonaceae Rheum palmatum 20

Λέγεται και ραβέντι, εκφύεται στις ορεινές περιοχές της δυτικής Κίνας και καλλιεργείται στην Ευρώπη [Schulz et al., 2001]. Περιέχει ελεύθερες ανθρακινόνες όπως αλοεμοδίνη, εμοδίνη, ρεΐνη, φυσκιόνη και χρυσοφανόλη, τους αντίστοιχους γλυκοζίτες τους, καθώς και σεννοσίδες Α και Β. Η ρίζα του ρήου, που αποτελεί τη δρόγη του φυτού, είναι γνωστή για τις ισχυρές καθαρτικές της ιδιότητες και χρησιμοποιείται στα αρχικά στάδια της δυσκοιλιότητας, στη δυσεντερία και σε άλλα εντερικά προβλήματα. Το ραβέντι θεωρείται ότι έχει αντικαρκινικές ιδιότητες, μειώνει την πίεση του αίματος και δρα ευεργετικά κατά της δυσπεψίας. Επίσης, διαθέτει αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις, αντιβακτηριδιακές κι αντιαλλεργικές ιδιότητες. Σε μία κλινική δοκιμή για τον έλεγχο ασθενών με νεφρική ανεπάρκεια σε τελικό στάδιο παρατηρήθηκε μία μείωση στους αρνητικούς δείκτες αίματος και μία γενική αύξηση στους θετικούς δείκτες μετά τη χορήγηση εκχυλίσματος rhubarb. Επίσης, σε μελέτες που διεξήχθησαν σε ποντίκια αποδείχθηκε ότι η εμοδίνη, το δραστικό συστατικό του ριζώματος ρήου, αναστέλλει τα λευχαιμικά κι άλλα καρκινικά κύτταρα [Tillotson, 2001]. Οι κυριότερες ανεπιθύμητες ενέργειες του ρήου περιλαμβάνουν ναυτία, έμετο και ιλίγγους [Lee, 2003]. Η ρίζα του ρήου μπορεί να χορηγηθεί ως αφέψημα μισή ή μία κουταλιά του τσαγιού ρίζα σε ένα φλιτζάνι νερό ή ως βάμμα 1 2 ml, τρεις φορές την ημέρα. Η Γερμανική Φαρμακοποιία περιγράφει ένα εκχύλισμα από ρίζωμα ρήου που παρασκευάζεται με 70% αλκοόλη. Το εκχύλισμα είναι καφέ, υγροσκοπικό, κονιοποιημένο υλικό με μία διακριτική οσμή και την πικρή γεύση του ριζώματος ρήου [Schulz et al., 2001]. 1.3.3 Αλόη: Τάξη Οικογένεια Υποοικογένεια Γένος Είδος Asparagales Xanthorrhoeaceae Asphodeloideae Aloe vera Περιέχει ως κύριο δραστικό συστατικό την αλοΐνη (C γλυκοζίτης ανθρακινόνης) [Schulz et al., 2001] και την ελεύθερη ανθρακινόνη αλοεμοδίνη. 21

Σήμερα κυκλοφορεί ένα μεγάλο εύρος προϊόντων στην αγορά που βασίζονται σε εκχυλίσματα αλόης τα οποία παρασκευάζονται από διάφορα είδη της και χρησιμοποιούνται ιδιαίτερα στην εναλλακτική θεραπευτική. Αυτά τα προϊόντα ποικίλουν από χυμούς αλόης έως γέλες, σκόνες, κάψουλες και κρέμες που χρησιμοποιούνται τόσο για εσωτερική όσο και για εξωτερική χρήση, καλύπτοντας ένα ευρύ φάσμα ενδείξεων [ElSohly et al, 2004]. Ο χυμός της αλόης είναι απαραίτητος για έναν υγιεινό τρόπο ζωής καθώς τα οφέλη του είναι άφθονα τόσο για τη διατροφή όσο και για την υγεία. Η αλόη βοηθά στην ανακούφιση από τη δυσφορία του πεπτικού συστήματος και συμβάλλει αποφασιστικά στην καλή λειτουργία της πέψης και των οργάνων που λαμβάνουν μέρος σε αυτή, συμπεριλαμβανομένου του οισοφάγου, του στομάχου, του λεπτού και του παχέος εντέρου. Επίσης, καταπολεμά με ήπιο τρόπο τη δυσκοιλιότητα, ενισχύει το ανοσοποιητικό σύστημα και βοηθά στην αποβολή των τοξινών βελτιώνοντας έτσι την υγεία και την εμφάνιση του δέρματος. Η γέλη που λαμβάνεται από τα φύλλα της αλόης χρησιμοποιείται εξωτερικά για την ανακούφιση μικρής σοβαρότητας εγκαυμάτων, πληγών και άλλων δερματικών παθήσεων όπως το έκζεμα, η ψωρίαση, ο έρπης των γεννητικών οργάνων και η μυκητίαση των ποδιών. Συγκεκριμένα για τα εγκαύματα φαίνεται ότι έχει την ικανότητα να διεισδύει στον ιστό και να τον αναισθητοποιεί όταν εφαρμόζεται στην τραυματισμένη περιοχή. Οι ευεργετικές ιδιότητες από τη χρήση της γέλης είναι σχεδόν άμεσες ενώ πιστεύεται ότι προστατεύει τις πληγές μειώνοντας σημαντικά την πιθανότητα μόλυνσής τους. Η έρευνα πάνω στη μακροχρόνια τοξικότητα και τη φαρμακοκινητική της αλόης είναι ακόμη ανεπαρκής [Schulz et al., 2001]. Πάντως σε κλινικές μελέτες που διεξήχθησαν σε ανθρώπους δεν αναφέρθηκαν σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες. Οι πιο κοινές παρενέργειες μετά από του στόματος χορήγηση της αλόης ήταν αλλεργικές αντιδράσεις και υπερευαισθησία, ενώ μετά από τοπική εφαρμογή δερματίτιδα εξ επαφής, αίσθημα καύσου και ήπιος κνησμός. Όλες οι ανεπιθύμητες ενέργειες ήταν αναστρέψιμες και η αλόη ήταν γενικά καλά ανεκτή από τους ασθενείς. Προσοχή απαιτείται κατά τη χορήγησή 22

της σε κατάσταση εγκυμοσύνης αλλά δεν υπάρχουν άλλες αντενδείξεις [Vogler και Ernst, 1999]. Μπορούν όμως να παρατηρηθούν αλληλεπιδράσεις με άλλα φάρμακα, όπως για παράδειγμα τα στεροειδή των οποίων αυξάνεται η απορρόφηση όταν εφαρμόζονται στο δέρμα υπό μορφή κρεμών σε συνδυασμό με την εφαρμογή αλόης στο δέρμα. Επίσης, η υποκαλιαιμία που προκαλείται από πιθανή κατάχρηση αλόης μπορεί να αυξήσει τη δράση των καρδιοτονωτικών γλυκοζιτών [EMA/HMPC, 2007], ενώ μπορεί ακόμη να μειώσει τα επίπεδα σακχάρου στο αίμα αλληλεπιδρώντας με τα από του στόματος χορηγούμενα υπογλυκαιμικά φάρμακα και την ινσουλίνη [Surjushe et al, 2008]. 1.3.4 Φύλλα σέννας ή φύλλα αλεξανδρείας (Cassia angustifolia): Τάξη Οικογένεια Υποοικογένεια Γένος Είδος Fabales Fabaceae Caesalpinioideae Senna alexandrina Περιέχει τους σεννοσίδες A, B, C και D, αλοεμοδίνη, ρεΐνη, χρυσοφανόλη και παλμιδίνη Α. Λόγω της φυτικής προέλευσης, της αποτελεσματικότητας και της χαμηλής τοξικότητάς της η σέννα χρησιμοποιείται ευρύτατα ως ισχυρό καθαρτικό στη θεραπεία της χρόνιας δυσκοιλιότητας με τη μορφή εγχύματος ή αφεψήματος [Morales et al, 2009]. Έχει αναφερθεί ότι οι σεννοσίδες Α και Β και τα προϊόντα του μεταβολισμού τους δρουν στο παχύ έντερο, επιταχύνοντας έτσι τη μεταφορά του περιεχομένου του εντέρου. Η σέννα δρα περίπου 8 10 ώρες μετά από τη λήψη της. Σε σύγκριση με άλλες συμβατικές θεραπείες για τη δυσκοιλιότητα, η σέννα φαίνεται να είναι πιο αποτελεσματική ως καθαρτικό. Μπορεί να προκαλέσει ήπιες κοιλιακές ενοχλήσεις και δε συνιστάται για παρατεταμένη χρήση αφού μπορεί να επηρεάσει το ισοζύγιο νερού και ηλεκτρολυτών. Δε θα πρέπει πάντως να λαμβάνεται από άτομα με εντερική απόφραξη (ειλεό) και η δοσολογία σε σεννοσίδες δε θα πρέπει να ξεπερνά τα 15 mg σε μία δόση [Bissett και Wichtl, 2001]. Πάντως δεν υπάρχουν σαφή δεδομένα 23

για την ασφάλειά της σε περιπτώσεις εγκυμοσύνης ή θηλασμού, ενώ δε συνιστάται η χρήση της σε παιδιά κάτω των 12 ετών. Η σέννα μπορεί να προκαλέσει υποκαλιαιμία η οποία με τη σειρά της μπορεί να οδηγήσει σε διαταραχές της καρδιακής λειτουργίας και μυϊκή αδυναμία κυρίως κατά τη συγχορήγηση με καρδιοτονωτικούς γλυκοζίτες, διουρητικά ή κορτικοστεροειδή [Blumenthal et al., 2000]. Επίσης, η προκαλούμενη διάρροια μετά από κατάχρηση της δρόγης μπορεί να μειώσει την απορρόφηση της βιταμίνης Κ στο έντερο, να ενισχύσει με αυτό τον τρόπο την αντιπηκτική δράση της βαρφαρίνης και να αυξήσει τον κίνδυνο αιμορραγίας [Kittisupamongkol et al., 2008]. 1.3.5 Φλοιός φραγκούλας (Frangula bark): Τάξη Οικογένεια Γένος Είδος Rosales Rhamnaceae Frangula alnus Περιέχει 3 7% παράγωγα ανθρακινονών, κυρίως υπό μορφή γλυκοζιτών. Τα κύρια συστατικά της είναι η φραγκουλίνη Α και Β που είναι γλυκοζίτες της εμοδίνης και η γλυκοφραγκουλίνη Α και Β που είναι διγλυκοζίτες της εμοδίνης. Επίσης, περιέχει παλμιδίνη C, γλυκοζίτες της χρυσοφανόλης, φυσκιόνης κι άλλες ελεύθερες ανθρακινόνες. Η φραγκούλα θεωρείται ότι κατέχει ήπιες καθαρτικές ιδιότητες και για αυτό το λόγο χρησιμοποιείται εδώ και χρόνια για την αντιμετώπιση της δυσκοιλιότητας. Η συνιστώμενη δοσολογία της είναι 0,5 2,5 g ξηρού φλοιού ή 2 5 ml υγρού εκχυλίσματος, τρεις φορές την ημέρα. Όπως και με όλα τα καθαρτικά, η κατάχρηση της φραγκούλας μπορεί να προκαλέσει διάρροια και απώλεια ηλεκτρολυτών που μπορεί να οδηγήσει σε υποκαλιαιμία, η οποία με τη σειρά της μπορεί να προκαλέσει καρδιακή και νευροσκελετική δυσλειτουργία, ιδίως αν λαμβάνονται ταυτόχρονα καρδιοτονωτικοί γλυκοζίτες, θειαζιδικά διουρητικά και διουρητικά της αγκύλης ή κορτικοστεροειδή. Τέλος, δε συνιστάται η χρήση της κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης και του θηλασμού [EMA/CPMP, 1994]. 24

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: Χρωματογραφικές Αναλυτικές Μέθοδοι 2.1 Χρωματογραφικές Μέθοδοι Η χρωματογραφία είναι μία αναλυτική μέθοδος που επιτυγχάνει το διαχωρισμό μιγμάτων ουσιών και στηρίζεται στη διαφορετική ισορροπία κατανομής δύο μη μιγνυόμενων φάσεων, μίας κινητής και μίας στατικής. Η κινητή φάση μπορεί να είναι αέριο ή υγρό ενώ η στατική φάση μπορεί να είναι ένα πορώδες υλικό υπό μορφή λεπτών κόκκων ή ένα λεπτό στρώμα υγρού που επικαλύπτει ένα αδρανές στερεό υπόστρωμα. Με βάση τη φύση της κινητής φάσης διακρίνονται δύο είδη χρωματογραφίας: α) η υγρή χρωματογραφία (Liquid Chromatography, LC) όταν η κινητή φάση είναι υγρό και β) η αέρια χρωματογραφία (Gas Chromatography, GC) όταν η κινητή φάση είναι αέριο. 2.1.1 Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) Η ανάπτυξη της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) επιτρέπει αποδοτικούς διαχωρισμούς πολύπλοκων μιγμάτων ουσιών ποικίλης προελεύσεως και μετρήσεις σε λίγα λεπτά. Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί σε διαχωρισμούς και ποσοτικές αναλύσεις μιγμάτων ουσιών μεγάλου μοριακού βάρους και υψηλής πολικότητας, πολυμερών και ιονικών ενώσεων. Η τεχνική αυτή αποτελεί σήμερα την τεχνική επιλογής σε πολλά προβλήματα φαρμακευτικής ανάλυσης κι αξιοποιείται για την ανάλυση βιολογικών δειγμάτων που εμπεριέχουν ενδογενείς ουσίες, τα χορηγούμενα φάρμακα και τους μεταβολίτες τους συνήθως σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις. Στην HPLC χρησιμοποιούνται στήλες με λεπτότατα τεμαχισμένο προσροφητικό υλικό μεγέθους τεμαχιδίων 3 10 μm και η έκλουση της κινητής φάσης επιτυγχάνεται με τη χρήση αντλιών υψηλής πίεσης. Μία συσκευή HPLC αποτελείται από πέντε βασικά τμήματα: i. το σύστημα παροχής κινητής φάσης ii. το σύστημα εισαγωγής του δείγματος 25

iii. τη στήλη iv. τον ανιχνευτή v. τον καταγραφέα. Η τεχνική HPLC μπορεί να χρησιμοποιηθεί για διαχωρισμούς βασισμένους σε προσρόφηση, κατανομή, ιονταλλαγή και μοριακό αποκλεισμό και για κάθε μία εφαρμογή διατίθενται από διάφορες παρασκευάστριες εταιρείες οι κατάλληλες στήλες, οι οποίες μπορούν να συμβάλλουν ουσιαστικά στην καλή απόδοση της χρωματογραφικής μεθόδου. Ο ανιχνευτής στην HPLC αποτελεί κρίσιμο στοιχείο του χρωματογραφικού συστήματος καθώς κάνει ορατό το διαχωρισμό των συστατικών του δείγματος που γίνεται στη στήλη και επιτρέπει την αξιοποίησή του στην ανάλυση. Ένας ιδανικός ανιχνευτής θα πρέπει να αποκρίνεται σε όλα τα συστατικά του μίγματος, να επιτρέπει χαμηλά όρια ανίχνευσης, να μην επηρεάζεται από μεταβολές της θερμοκρασίας και της ταχύτητας ροής της κινητής φάσης και να παρέχει γραμμική απόκριση στην περιοχή συγκεντρώσεων των διαχωριζόμενων συστατικών. Χρησιμοποιείται ένας μεγάλος αριθμός ανιχνευτών, οι κυριότεροι από τους οποίους είναι: 1. ανιχνευτής υπεριώδους ορατού (UV Vis) 2. διαφορικός ανιχνευτής δείκτη διάθλασης (μετρά διαφορές στο δείκτη διάθλασης της κινητής φάσης που προκαλούνται από την παρουσία των διαχωριζόμενων συστατικών του μίγματος) 3. ανιχνευτής φθορισμού (χρησιμοποιείται μόνο για φθορίζουσες ουσίες) 4. ανιχνευτής υπερύθρου (δεν είναι ευαίσθητος και έχει μικρή εκλεκτικότητα) 5. ηλεκτροχημικός ανιχνευτής 6. φασματόμετρο μάζας Η υγρή χρωματογραφία φασματομετρία μάζας (LC MS/MS) συνδυάζει την τεχνική της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης με τη φασματομετρία μάζας, χαρακτηρίζεται από εξαιρετική ευαισθησία, εξειδίκευση και ταχύτητα, και αποτελεί σήμερα την πιο αξιόπιστη τεχνική ταυτοποίησης και 26

ποσοτικού προσδιορισμού ουσιών σε πολύπλοκα βιολογικά δείγματα, το κόστος όμως των συστημάτων αυτών παραμένει πολύ υψηλό και η αγορά τους συχνά είναι ανέφικτη. 2.1.2 Αέρια χρωματογραφία Η αέρια χρωματογραφία (gas chromatography, GC) έχει αναπτυχθεί ως αναλυτική τεχνική τα τελευταία σαράντα χρόνια και χρησιμοποιείται ευρύτατα για την ποιοτική και ποσοτική ανάλυση πτητικών οργανικών ουσιών σε τρόφιμα, φάρμακα, προϊόντα πετρελαίου, κλπ. Η διάταξη ενός αέριου χρωματογράφου δίνεται στο παρακάτω σχήμα: Σχήμα 2.1 Διάταξη του αέριου χρωματογράφου Το φέρον αέριο αποτελεί την κινητή φάση και πρέπει να είναι χημικώς αδρανές έναντι του υλικού κατασκευής του αέριου χρωματογράφου και απαλλαγμένο από προσμίξεις. Το συνηθέστερο χρησιμοποιούμενο αέριο είναι το ήλιο, παρά το υψηλό του κόστος, επειδή έχει μεγάλη θερμική αγωγιμότητα και μικρή πυκνότητα που επιτρέπει τη χρησιμοποίηση μεγαλύτερων ταχυτήτων ροής αερίου με αντίστοιχη μείωση του χρόνου ανάλυσης. Το φέρον αέριο από τη φιάλη όπου βρίσκεται σε υψηλή πίεση διαβιβάζεται μέσα από το ρυθμιστή πίεσης και εν συνεχεία μέσω του ροόμετρου με το οποίο μετρείται με ακρίβεια η ταχύτητά του. Η εισαγωγή του δείγματος γίνεται με μικροσύριγγα στη βαλβίδα εισαγωγής δείγματος στην κορυφή της χρωματογραφικής στήλης. Τα διάφορα 27

συστατικά του δείγματος συμπαρασύρονται από το φέρον αέριο κατά μήκος της στήλης και διαχωρίζονται. Με τον ανιχνευτή γίνεται φανερή η παρουσία καθενός από τα συστατικά του μίγματος, τα οποία εξέρχονται από τη στήλη, και μετρείται η ποσότητα ή η συγκέντρωσή τους μέσα στο φέρον αέριο. Τα κυριότερα χαρακτηριστικά ποιότητας ενός ανιχνευτή είναι η ευαισθησία, η σταθερότητα, η περιοχή γραμμικότητας, ο χρόνος απόκρισης και η χημική του δραστικότητα. Οι συνηθέστερα χρησιμοποιούμενοι ανιχνευτές είναι: 1. ανιχνευτής θερμικής αγωγιμότητας (η λειτουργία του βασίζεται στο γεγονός ότι η ταχύτητα απώλειας θερμότητας από ένα θερμό σώμα εξαρτάται από τη θερμική αγωγιμότητα του αερίου που περιβάλλει το σώμα, επομένως και τη σύστασή του) 2. ανιχνευτής ιονισμού φλόγας (η λειτουργία του βασίζεται στο γεγονός ότι η ηλεκτρική αγωγιμότητα ενός αερίου είναι ανάλογη της συγκέντρωσης των φορτισμένων σωματιδίων μέσα σε αυτό και είναι ο πλέον χρησιμοποιούμενος στην ποσοτική ανάλυση) 3. ανιχνευτής σύλληψης ηλεκτρονίων (η λειτουργία του βασίζεται στη μεταβολή της αγωγιμότητας του αερίου που διέρχεται από αυτόν εξαιτίας των ιόντων που δημιουργούνται από ραδιενεργή πηγή που βρίσκεται μέσα στον ανιχνευτή και είναι εξαιρετικά ευαίσθητος). Το σήμα που προέρχεται από τον ανιχνευτή είναι πολύ ασθενές και πρέπει να ενισχυθεί πριν την καταγραφή του. Ενισχυτές στερεής κατάστασης επιτρέπουν την ενίσχυση του σήματος πρακτικώς σε οποιοδήποτε βαθμό ενώ για τη λήψη του χρωματογραφήματος απαιτείται καταγραφέας ταχείας απόκρισης και με υψηλό βαθμό σταθερότητας των ηλεκτρονικών. Οι περισσότεροι αέριοι χρωματογράφοι είναι εφοδιασμένοι με σύστημα ολοκληρωτή ώστε παράλληλα προς τις κορυφές που καταγράφονται να παρέχεται και το ολοκλήρωμά τους. 2.1.3 Αέρια χρωματογραφία φασματομετρία μάζας (GC MS) Ο αέριος χρωματογράφος μπορεί να συζευχθεί άμεσα με φασματόμετρο μάζας (mass spectrometer, ΜS) ταχείας σάρωσης. Το φάσμα μάζας της υπό 28

ανάλυση ουσίας που προκύπτει μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ποιοτική αναγνώρισή της [Douglas]. Η αρχή λειτουργίας της αέριας χρωματογραφίαςφασματομετρίας μάζας (GC MS) στηρίζεται στη δημιουργία θραυσμάτων ιόντων μιας ένωσης, το διαχωρισμό τους με βάση το λόγο της μάζας προς το φορτίο (m/z) και την καταγραφή τους. Με αυτόν τον τρόπο είναι δυνατό να προσδιοριστεί, εκτός των άλλων, και το μοριακό βάρος της ένωσης και ο τρόπος σύνδεσης των διαφόρων ομάδων μεταξύ τους. Το σύστημα αέριας χρωματογραφίας φασματομετρίας μάζας (GC MS) αποτελείται από: i. το σύστημα εισαγωγής του δείγματος ii. τον αέριο χρωματογράφο iii. την πηγή σχηματισμού ιόντων iv. τον αναλυτή μαζών v. τον ολοκληρωτή Ο χώρος όπου δημιουργούνται και επιταχύνονται τα ιόντα διατηρείται σε κατάσταση υψηλού κενού. Με το υψηλό κενό δημιουργούνται σε χαμηλές θερμοκρασίες ατμοί της προς προσδιορισμό ουσίας, χωρίς τη διάσπασή της, οι οποίοι οδηγούνται στο θάλαμο ιοντισμού. Επίσης απομακρύνονται τα μόρια της ουσίας και τα ουδέτερα προϊόντα διάσπασης από το χώρο της ανάλυσης μετά από κάθε μέτρηση. Ο συνηθέστερος τρόπος ιοντισμού είναι με βομβαρδισμό των αερίων μορίων της ένωσης με δέσμη ηλεκτρονίων μεγάλης ενέργειας (π.χ. 70 ev) όποτε αρχικά δημιουργείται το μοριακό ιόν [M + ], δηλαδή η κατιονική ρίζα της ένωσης η οποία προέρχεται από απώλεια ενός ηλεκτρονίου και στη συνέχεια διάφορα θραύσματα ιόντων που αντιστοιχούν σε συγκεκριμένα τμήματα του μορίου μετά τη διάσπαση των αντίστοιχων δεσμών, τα οποία προέρχονται από μετάθεση ατόμων υδρογόνου που πραγματοποιείται όποτε υπάρχουν οι κατάλληλες ενεργειακές και στερεοχημικές προϋποθέσεις. Οι κατιονικές αυτές ρίζες επιταχύνονται αρχικά με ηλεκτρικό πεδίο και στη συνέχεια κινούνται μέσα σε μαγνητικό πεδίο όπου εκτρέπονται και διαχωρίζονται με βάση το λόγο μάζα προς φορτίο (m/z). Η αέριος χρωματογραφία φασματομετρία μάζας (GC MS) αποτελεί μια από τις σημαντικότερες μεθόδους προσδιορισμού της δομής οργανικών ενώσεων κι 29

αποκτά ολοένα και περισσότερο ενδιαφέρον στις φαρμακευτικές επιστήμες τόσο για την ταυτοποίηση φαρμάκων, μεταβολιτών και τοξινών, όσο και για τον έλεγχο προσμίξεων και τον ποσοτικό προσδιορισμό ποικίλων ενώσεων φαρμακευτικού ενδιαφέροντος. 2.2 Προετοιμασία δείγματος 2.2.1 Εκχύλιση (extraction) και ανάκτηση (recovery) Η εκχύλιση αποτελεί μία τεχνική διαχωρισμού που βασίζεται στην ισορροπία κατανομής μιας ουσίας μεταξύ δύο φάσεων που αναμιγνύονται ελάχιστα μεταξύ τους. Η ευρύτητα στη χρήση της οφείλεται στην απλότητα της μεθοδολογίας, στην ταχύτητα, στην ευελιξία και στη δυνατότητα εφαρμογής της σε δείγματα που περιέχουν είτε ίχνη, είτε μεγάλες ποσότητες μιας ουσίας. Συνήθως με την εκχύλιση επιτυγχάνονται ποσοτικοί προσδιορισμοί. Η συνηθέστερη περίπτωση διαχωρισμού είναι η εκχύλιση υγρού υγρού (liquidliquid extraction, LLE), δηλαδή η εκχύλιση ενός διαλύματος ουσιών με ένα υγρό και βασίζεται στην κατανομή μιας διαλυμένης ουσίας μεταξύ των δύο υγρών, τα οποία πρακτικώς δεν αναμιγνύονται μεταξύ τους. Συνήθως η μια από τις δύο φάσεις είναι ένα υδατικό διάλυμα και η άλλη ένας οργανικός διαλύτης, οπότε τα μεν ανόργανα ιόντα κι οι πολικές οργανικές ενώσεις βρίσκονται κατά κύριο λόγο στην υδατική φάση, ενώ οι μη πολικές (λιπόφιλες) οργανικές ενώσεις στην οργανική φάση. Αποφασιστικός παράγοντας για την πληρότητα και την εκλεκτικότητα της εκχύλισης αποτελεί η επιλογή του κατάλληλου εκχυλιστικού μέσου. Σπάνια ένας διαλύτης ικανοποιεί όλα τα κριτήρια ώστε να θεωρείται ο καταλληλότερος, για αυτό χρησιμοποιείται συνήθως μίγμα οργανικών διαλυτών για τη βελτίωση της εκχύλισης. Η εκχύλιση υγρού υγρού αποτελεί έναν αποτελεσματικό τρόπο αρχικής κατεργασίας πολύπλοκων δειγμάτων σε βιολογικά υποστρώματα και συμβάλλει ουσιαστικά στην αύξηση της εκλεκτικότητας και της ευαισθησίας της βιοαναλυτικής μεθόδου. 30

Άλλες μέθοδοι εκχύλισης είναι η εκχύλιση στερεών με υγρό και η εκχύλιση στερεής φάσης. Η εκχύλιση στερεών αποτελεί ένα ενδιαφέρον και συνηθισμένο στάδιο στην παρασκευή φαρμακοτεχνικών παρασκευασμάτων. Τα εκχυλίσματα λαμβάνονται από φυτικές ή ζωικές δρόγες μετά από εκχύλιση με διάφορους διαλύτες. Χρησιμοποιείται ευρύτατα στη φαρμακευτική ανάλυση για τον προσδιορισμό των δραστικών συστατικών τόσο των ακατέργαστων δρογών όσο και των στερεών σκευασμάτων. Σε πολλές περιπτώσεις αρκεί η ανακίνηση μιας ζυγισμένης ποσότητας της δρόγης ή του κονιοποιημένου σκευάσματος με το διαλύτη. Μετά το τέλος της εκχυλίσεως, το στερεό που παραμένει απομακρύνεται με διήθηση ή φυγοκέντρηση και ένα κλάσμα του διηθήματος λαμβάνεται για ανάλυση. Εκτός από την απλή αυτή τεχνική, χρησιμοποιείται συχνά και η τεχνική της συνεχούς εκχυλίσεως σε ειδικούς εκχυλιστήρες (soxhlet) που επιτρέπει την εκχύλιση μεγάλων ποσοτήτων ουσιών με σχετικά μικρή ποσότητα διαλύτη. Στην εκχύλιση στερεής φάσης (solid phase extraction, SPE), η οποία αποτελεί μία από τις καλύτερες τεχνικές προκατεργασίας δειγμάτων, χρησιμοποιείται στερεό προσροφητικό υλικό που συνήθως είναι διοξείδιο του πυριτίου με χημικά συνδεδεμένες ομάδες ώστε να αποκτά διάφορες προσροφητικές ιδιότητες. Ανάλογα με τις δραστικές ομάδες που φέρει το προσροφητικό υλικό, μπορούν να γίνουν διάφορα είδη εκχυλίσεων όπως μη πολικές, πολικές, ομοιοπολικές, κατιονανταλλακτικές και ανιονανταλλακτικές εκχυλίσεις. Για την εκτέλεση μίας εκχύλισης στερεής φάσης ακολουθούνται τα εξής στάδια: i. εξισορρόπηση (προετοιμασία) με διαβίβαση ενός διαλύτη για την ενεργοποίηση των δραστικών ομάδων του προσροφητικού υλικού ii. διαβίβαση του διαλύματος του δείγματος, οπότε η επιθυμητή ουσία και ενδεχομένως και άλλες ουσίες του δείγματος κατακρατούνται στο υλικό προσρόφησης ενώ οι υπόλοιπες ουσίες εξέρχονται iii. έκπλυση με κατάλληλο διαλύτη για την απομάκρυνση των ανεπιθύμητων ουσιών που έχουν κατακρατηθεί στο υλικό 31

iv. εκλεκτική έκλουση της επιθυμητής ουσίας με κατάλληλο διαλύτη που δεν εκλούει τις άλλες ουσίες που ενδεχομένως να έχουν προσροφηθεί στο υλικό. Το έκλουσμα που λαμβάνεται περιέχει σχετικά καθαρή την επιθυμητή ουσία, συνήθως σε πολύ μεγαλύτερη συγκέντρωση από το αρχικό δείγμα, εάν επιλεγούν κατάλληλα οι όγκοι των διαλυμάτων του δείγματος και του υγρού έκλουσης. Οι διαλύτες που χρησιμοποιούνται εξαρτώνται από το είδος του προσροφητικόυ υλικού και της προς εκχύλιση ουσίας και δίνονται από τους κατασκευαστές των στηλών ή επιλέγονται πειραματικά για την αποδοτικότερη και εκλεκτικότερη εκχύλιση. Με την εκχύλιση στερεής φάσης είναι δυνατό να επιτευχθεί μια περισσότερο ολοκληρωμένη απομάκρυνση των ουσιών που συνυπάρχουν στο δείγμα της υπό ανάλυση ουσίας. Οι τεχνικές αυτές είναι οι πιο δημοφιλείς καθώς απαιτούνται μικρές ποσότητες οργανικού διαλύτη για την έκλουση, διατηρώντας κατά τον τρόπο αυτό υψηλή τη συγκέντρωση της υπό ανάλυση ουσίας [Qanaze, 2005]. Για τον έλεγχο της μεθόδου εκχύλισης και την εκτίμηση των απωλειών από τη διαδικασία της εκχύλισης προσδιορίζεται η ανάκτηση. Η ανάκτηση εκφράζει την αποτελεσματικότητα της εκχύλισης μιας αναλυτικής μεθόδου και αναφέρεται ως το % ποσοστό της ποσότητας της υπό ανάλυση ουσίας που ανακτάται και προσδιορίζεται ποσοτικά μέσω της εκχύλισης και της επεξεργασίας του δείγματος [Shah et al, 2000]. Η ανάκτηση μιας υπό ανάλυση ουσίας χαρακτηρίζει την απόκριση του ανιχνευτή (π.χ. εμβαδόν χρωματογραφικής κορυφής) που λαμβάνεται από μια συγκεκριμένη συγκέντρωση της προς ανάλυση ουσίας που προστίθεται και εκχυλίζεται από το βιολογικό υπόστρωμα, σε σύγκριση με την απόκριση του ανιχνευτή που λαμβάνεται από την πραγματική συγκέντρωση του καθαρού αυθεντικού προτύπου. Η ανάκτηση σχετίζεται με την εκχυλιστική ικανότητα μιας αναλυτικής μεθόδου εντός των ορίων μεταβλητότητας. Η μεγιστοποίηση της ανάκτησης μιας μεθόδου είναι απαραίτητη για την επίτευξη υψηλής ευαισθησίας και χαμηλού ορίου ανίχνευσης [Mehta, 1989]. Η ανάκτηση της υπό 32

ανάλυσης ουσίας δεν χρειάζεται να είναι 100%, αλλά ο βαθμός ανάκτησης της υπό ανάλυσης ουσίας και του εσωτερικού προτύπου θα πρέπει να είναι συνεπής και επαναλήψιμος. Για τον προσδιορισμό της ανάκτησης απαιτούνται τουλάχιστον 5 μετρήσεις των εκχυλισθέντων δειγμάτων για κάθε συγκέντρωση, για 3 διαφορετικές συγκεντρώσεις (χαμηλή, μεσαία και υψηλή) με μη εκχυλισθέντα πρότυπα που αντιπροσωπεύουν 100% ανάκτηση. 2.3 Καμπύλη βαθμονόμησης ή καμπύλη αναφοράς (calibration curve): Οι μετρήσεις των ενόργανων τεχνικών ανάλυσης απαιτούν τη βαθμονόμηση των οργάνων με πρότυπα διαλύματα παραπλήσιας συστάσεως με τα δείγματα που αναλύονται. Η καμπύλη βαθμονόμησης (καμπύλη αναφοράς) αναπαριστά τη σχέση της απόκρισης του οργάνου και γνωστών συγκεντρώσεων της υπό ανάλυση ουσίας. Μια χωριστή καμπύλη βαθμονόμησης θα πρέπει να κατασκευάζεται για κάθε υπό ανάλυση ουσία και ένας επαρκής αριθμός πρότυπων διαλυμάτων θα πρέπει να χρησιμοποιείται για να προσδιορισθεί επαρκώς η σχέση της συγκέντρωσης και της απόκρισης του οργάνου. Επειδή η ισχύς της καμπύλης αναφοράς είναι συνήθως περιορισμένης χρονικής διάρκειας, η μέτρηση των αγνώστων δειγμάτων δεν πρέπει να βραδύνει και μάλιστα είναι καλύτερα τα πρότυπα διαλύματα για την κατασκευή της καμπύλης βαθμονόμησης να μετρούνται ανάμεσα στα άγνωστα δείγματα. Η χρήση καμπυλών βαθμονόμησης που κατασκευάσθηκαν σε προηγούμενες ημέρες (φαινόμενο συνηθισμένο σε εργαστήρια ρουτίνας) είναι δυνατόν να δώσουν λανθασμένα αποτελέσματα. Κατά τη μέθοδο της καμπύλης βαθμονόμησης παρασκευάζονται πρότυπα διαλύματα της υπό ανάλυση ουσίας κατά το δυνατόν παρόμοιας σύστασης με τα διαλύματα των δειγμάτων και χρησιμοποιώντας το ίδιο βιολογικό υπόστρωμα, π.χ. πλάσμα ελεύθερο από την υπό ανάλυση ουσία. Η επιλογή των συγκεντρώσεων των πρότυπων διαλυμάτων θα πρέπει να γίνεται με βάση το εύρος των αναμενόμενων συγκεντρώσεων σε μια συγκεκριμένη μελέτη. Η καμπύλη βαθμονόμησης πρέπει να αποτελείται από ένα τυφλό δείγμα (blank sample, δείγμα υποστρώματος χωρίς την προσθήκη εσωτερικού προτύπου), ένα 33