Άσκηση 2 Αµινοξέα 2. 1 Σκοπός της άσκησης 2. 2 Εισαγωγή-Θεωρητικό Μέρος 2. 2. 1 Γενικά περί αµινοξέων 2. 2. 2 Κατάταξη των αµινοξέων 2. 2. 3 Χηµικές ιδιότητες-γενικές αντιδράσεις των αµινοξέων 2. 2. 3. 1 Αντιδράσεις καρβοξυλοµάδας 2. 2. 3. 2 Αντιδράσεις αµινοµάδας 2. 2. 3. 3 Αντιδράσεις πλευρικής αλυσίδας 2. 2. 4 Διαχωρισµός αµινοξέων 2. 2 Εισαγωγή-Θεωρητικό Μέρος 2. 2. 1 Γενικά περί αµινοξέων Με τον όρο αµινοξέα χαρακτηρίζουµε µια σειρά χηµικών ενώσεων που έχουν σαν κοινό χαρακτηριστικό γνώρισµα την ύπαρξη στο µόριό τους µιας αµινοµάδας και µιας καρβοξυλοµάδας ενωµένες µε το άτοµο του άνθρακα. Μοναδική εξαίρεση αποτελεί το αµινοξύ προλίνη το οποίο έχει ιµινοµάδα αντί για αµινοµάδα. 1
Όλα τα αµινοξέα µπορούν να παρασταθούν από τον παραπάνω τύπο. Τα διάφορα αµινοξέα διαφέρουν µεταξύ τους ως πρός την πλευρική οµάδα R. Από βιολογική άποψη, τα αµινοξέα είναι ενώσεις µε µεγάλη σπουδαιότητα για τη λειτουργία του κυττάρου, αφού αποτελούν τους δοµικούς λίθους των πρωτεινών. Υπάρχουν βέβαια και άλλες χηµικές ενώσεις που σύµφωνα µε τον παραπάνω ορισµό είναι αµινοξέα, πλην όµως δεν εµφανίζονται στις φυσικές πρωτεΐνες (π.χ. ορνιθίνη). 2. 2. 2 Κατάταξη των αµινοξέων Τα αµινοξέα που απαντούν στις πρωτεΐνες µπορούν να ταξινοµηθούν µε διάφορους τρόπους. Ένας τρόπος ταξινόµησης είναι π.χ. σε όξινα, βασικά και ουδέτερα, ανάλογα µε το πόσες καρβοξυλικές και πόσες αµινιικές οµάδες έχει στο µόριο του το κάθε αµινοξύ. Τα διάφορα αµινοξέα που συναντούµε στις διάφορες πρωτεΐνες µπορούν να καταταχθούν σε ουδέτερα, όξινα, βασικά, µεγάλα, µικρά, αρωµατικά, αλειφατικά, θειούχα κλπ. Μια άλλη διάκριση γίνεται ανάλογα µε τη φύση της πλευρικής οµάδας. Σύµφωνα µε την ταξινόµιση αυτή τα αµινοξέα µπορούν να διακριθούν σε αρωµατικά, αλειφατικά, θειούχα κλπ. καθώς επίσης και σε πολικά ή µη πολικά. 2
Κανόνες αρίθµησης των C των αµινοξέων Λόγω της ύπαρξης ασύµµετρου ατόµου C τα αµινοξέα είναι οπτικά ενεργές ενώσεις και ταξινοµούνται σε D και L ανάλογα µε τη θέση που έχει η αµινική οµάδα ως προς το ασύµµετρο άτοµο του άνθρακα, όταν η καρβοξυλική οµάδα είναι τοποθετηµένη προς τα πάνω στο επίπεδο του κειµένου. Έτσι εάν η αµινική οµάδα βρίσκεται αριστερά, ως προς το επίπεδο του κειµένου, του ασύµµετρου ατόµου του άνθρακα τότε έχουµε την L-µορφή του αµινοξέος. Αντίθετα, εάν η αµινική οµάδα βρίσκεται δεξιά του ασύµµετρου ατόµου του άνθρακα έχουµε την D-µορφή. Κανόνας αποµνηµόνευσης της διάταξης των ατόµων σε αµινοξύ L-µορφής Πρέπει να σηµειωθεί ότι όλα τα αµινοξέα εκτός της γλυκίνης (η οποία δεν έχει ασύµµετρο άτοµο άνθρακα) διακρίνονται σε L και D-µορφή. Όλα τα αµινοξέα όµως που απαντούνται στις πρωτεΐνες είναι της L-µορφής. Ένας τρόπος διάκρισης των αµινοξέων καθαρά λειτουργικός είναι η ταξινόµισή τους σε απαραίτητα και µη απαραίτητα. 3
Με τον όρο απαραίτητα χαρακτηρίζουµε τα αµινοξέα εκείνα τα οποία δεν είναι δυνατόν να συντεθούν από τον οργανισµό και πρέπει να χορηγούνται έτοιµα από τις τροφές. Αντίθετα, µη απαραίτητα λέγονται τα αµινοξέα εκείνα που µπορούν να συντεθούν από τον οργανισµό µε διάφορους µεταβολικούς δρόµους. Εδώ πρέπει να σηµειωθεί ότι τα απαραίτητα αµινοξέα ποικίλουν για κάθε οργανισµό. Για τον άνθρωπο π.χ. τα απαραίτητα αµινοξέα είναι οκτώ (βαλίνη, λευκίνη, ισολευκίνη, φαινυλαλανίνη, τρυπτοφάνη, λυσίνη, µεθειονίνη και θρεονίνη). Για τον επίµυα ένα επιπλέον απαραίτητο αµινοξύ είναι η ιστιδίνη. Αµινοξέα µε αλειφατικές πλάγιες αλυσίδες Αµινοξέα µε αρωµατικές πλάγιες αλυσίδες 4
Αµινοξέα µε βασικές πλάγιες αλυσίδες Αµινοξέα µε όξινες πλάγιες αλυσίδες 5
Αµινοξέα µε πλάγιες αλυσίδες που περιέχουν S Αµινοξέα µε αλειφατικές πλάγιες αλυσίδες που περιέχουν OH 6
Αµινοξέα µε ειδικές περιπτώσεις πλαγίων αλυσίδων 2. 2. 3 Χηµικές ιδιότητες και γενικές αντιδράσεις των αµινοξέων Οι κύριες ιδιότητες των αµινοξέων οφείλονται στο γεγονός ότι τα αµινοξέα είναι αµφολύτες, µπορούν δηλαδή να συµπεριφέρονται άλλοτε σαν οξέα και άλλοτε σαν βάσεις. Οι οξεοβασικές ιδιότητες των αµινοξέων αναφέρονται στην άσκηση 1. Στο σηµείο αυτό θα αναφέρουµε τις κυριότερες αντιδράσεις των αµινοξέων, πολλές από τις οποίες χρησιµεύουν για την αναγνώριση των αµινοξέων σε µίγµατα (π.χ. σε ένα πρωτεϊνικό υδρόλυµα) ή για τη σύνθεση πεπτιδίων. 2. 2. 3. 1 Αντιδράσεις καρβοξυλοµάδας Μέσω της καρβοξυλοµάδας το αµινοξύ µπορεί να σχηµατίσει: αµίδια αλογονίδια εστέρες άλατα Μία σηµαντική αντίδραση της καρβοξυλοµάδας που χρησιµοποιείται για την ανίχνευση του καρβοξυ-τελικού άκρου των πρωτεινών είναι η αναγωγή µε βορουδρίδιο του λιθίου (LiBH4) και παραγωγή του αντίστοιχου αλογονούχου παραγώγου του αµινοξέος. 7
2. 2. 3. 2 Αντιδράσεις αµινοµάδας Eκτός από τις γνωστές αντιδράσεις των αµινοξέων, η α-αµινοµάδα των αµινοξέων αντιδρά: Με χλωρανθρακικό βενζόλιο και σχηµατίζει το αντίστοιχο καρβοβενζόξυπαράγωγο. Η αντίδραση χρησιµοποιείται για την προστασία της α-αµινοµάδας κατά τη σύνθεση πεπτιδίων. Με φθορο-δίνιτρο-βενζόλιο και σχηµατίζει το αντίστοιχο δινιτροφαινυλπαράγωγο το οποίο έχει κίτρινο χρώµα. Η αντίδραση χρησιµοποιείται για την αναγνώριση του αµινο-τελικού άκρου των πρωτεινών. Με ισοθειοκυανικό φαινύλιο. Η αντίδραση χρησιµοποιείται για την αναγνώριση του αµινο-τελικού άκρου των πρωτεινών. Με αλδεΰδες και σχηµατίζει ασθενείς βάσεις (βάσεις Schiff).Οι βάσεις Schiff συναντώνται σαν ενδιάµεσα προιόντα σε µια σειρά ενζυµικών αντιδράσεων. Με νινυδρίνη σχηµατίζοντας ένα έγχρωµο παράγωγο. Η αντίδραση αυτή χρησιµοποιείται για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισµό των αµινοξέων. 2. 2. 3. 3 Αντιδράσεις πλευρικής αλυσίδας Τα αµινοξέα, µέσω των πλευρικών οµάδων R δίνουν χαρακτηριστικές αντιδράσεις µε έγχρωµα συνήθως προιόντα. Το αρωµατικό αµινοξύ τυροσίνη µέσω της φαινολικής οµάδας αντιδρά µε νιτρικό υδράργυρο παρουσία νιτρικού οξέος και ιχνών νιτρώδους οξέος (αντίδραση Millon) και προκύπτει κόκκινο χρώµα. Τα αρωµατικά αµινοξέα τυροσίνη και ιστιδίνη δίνουν κόκκινο χρώµα όταν αντιδράσουν σε αλκαλικό περιβάλλον µε σουλφανυλικό οξύ που έχει διαζωτωθεί (αντίδραση Pauly). Η τρυπτοφάνη δίνει ερυθροιώδες χρώµα όταν αντιδράσει µε π-διµεθυλαµινοβενζαλδεύδη (αντίδραση Ehrlich). Το θειούχο αµινοξύ κυστείνη, λόγω της σουλφυδρυλοµάδας της, δίνει κόκκινο παράγωγο όταν αντιδράσει µε νιτροπρωσσικό νάτριο σε αραιή αµµωνία (αντίδραση Arnold). Το βασικό αµινοξύ αργινίνη, λόγω της παρουσίας της γουανιδίνης που περιέχει στη πλευρική της αλυσίδα δίνει ένα κόκκινο παράγωγο όταν αντιδράσει µε 8
ναφθόλη και υποχλωριώδες νάτριο σε αλκαλικό περιβάλλον (αντίδραση Sakaguchi). Από βιολογική άποψη, η σηµαντικότερη αντίδραση των αµινοξέων είναι η αντίδραση της αµινοµάδας ενός αµινοξέος µε την καρβοξυλοµάδα ενός άλλου αµινοξέος µε δηµιουργία ενός πεπτιδικού δεσµού και σχηµατισµό ενός διπεπτιδίου (βλέπε 3η άσκηση). 2. 2. 4 Διαχωρισµός αµινοξέων Ο διαχωρισµός των διαφόρων αµινοξέων γίνεται συνήθως µε χρωµατογραφικές ή ηλεκτροφορητικές µεθόδους. Η χρωµατογραφία κατανοµής σε χαρτί στηρίζεται στην αρχή ότι τα διάφορα αµινοξέα προχωρούν µε διαφορετική ταχύτητα στο χαρτί, υπό την επήρεια τριχοειδών φαινοµένων, όταν κάποιος διαλύτης παρασύρει το δείγµα είτε κάθετα προς τα πάνω, είτε κάθετα προς τα κάτω. Στην ίδια αρχή στηρίζεται και η χρωµατογραφία λεπτής στιβάδας. Και στις δυο µεθόδους, µετά το τέλος της χρωµατογραφίας, τα αµινοξέα ανιχνεύονται µε ψεκασµό του χαρτιού ή της πλάκας µε νινυδρίνη και αναγνωρίζονται µε βάση το Rf. Rf ορίζεται το πηλίκο της απόστασης που έχει διατρέξει το αµινοξύ προς την απόσταση που έχει διατρέξει το µέτωπο του διαλύτη στο χρωµατογράφηµα και είναι ένας απλός αριθµός. Οι τιµές Rf είναι χαρακτηριστικές για κάθε αµινοξύ σε δεδοµένο σύστηµα χρωµατογραφίας. 9
Εικόνα 2.1 Χρωµατογραφία λεπτής στιβάδας Στη χρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής, τα διαφορετικά αµινοξέα δεσµεύονται όλα στο υλικό της στήλης σε συγκεκριµένο ph και στη συνέχεια, µε µεταβολή του ph και αλλαγή της συγκέντρωσης του ρυθµιστικού διαλύµατος, εκλούονται σταδιακά από την στήλη, ανάλογα µε το pk a του καθενός. 10
Εικόνα 2.2 Διαχωρισµός αµινοξέων µε χρωµατογραφία Τέλος, τα αµινοξέα διαχωρίζονται και µε ηλεκτροφόρηση, η οποία στηρίζεται στην διαφορετική κινητικότητα των αµινοξέων ανάλογα µε το φορτίο τους σε διαφορετικό ph, όταν υποβάλονται σε ηλεκτρικό φορτίο. 11
ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΤΜΗΜΑ Πείραµα 1ον 2. 3 Αύξηση της οξύτητας ενός αµινοξέος µετά από δέσµευση της αµινοµάδας 2. 3. 1 Σκοπός πειράµατος Με την προσθήκη της φορµαλδεύδης (HCH=O) η αµινοµάδα των αµινοξέων αντικαθίσταται από την οµάδα -N=CH 2 δίνοντας βάση του Schiff της µορφής HOOC-RHC-N=CH 2 απελευθερώνοντας H +. 2. 3. 2 Εκτέλεση Μέσα σε µια µικρή κωνική φιάλη τοποθετούµε διάλυµα λευκίνης, απεσταγµένο νερό και φαινολοφθαλείνη, στις ποσότητες που αναγράφονται στον πίνακα αντιδράσεων 2.2. Με τη βοήθεια υάλινου σιφωνίου pasteur, προσθέτουµε σταγόνα-σταγόνα 0.1 Ν NaOH µέχρις ότου το χρώµα του διαλύµατος γίνει ερυθρό. Το ποσό του NaOH που καταναλώθηκε αντιστοιχεί στην οξύτητα της λευκίνης. Στη συνέχεια προσθέτουµε στο διάλυµα 5 ml διαλύµατος 1% φορµαλδεύδης. Το µόριο του αµινοξέος γίνεται πιο όξινο µε αποτέλεσµα να εξαφανίζεται το ερυθρό χρώµα της φαινολοφθαλείνης. Υπολογίσατε την αύξηση της οξύτητας του αµινοξέος κάνοντας πάλι τιτλοδότηση µε 0.1 N NaOH µέχρι να επανεµφανισθεί το ερυθρό χρώµα του δείκτη. Πίνακας αντιδράσεων 2.1 Λευκίνη H2O Φαινολοφθαλείνη Ογκος φορµαλδεύδη Ογκος 1% 0.1N NaOH 1% 0.1N NaOH 5 ml 10 ml 2 σταγόνες 5 ml Παρατηρήσεις 12
Πείραµα 2ον 2. 4 Χαρακτηριστικές αντιδράσεις ανίχνευσης αµινοξέων 2. 4. 1 Αντίδραση Νινυδρίνης 2. 4. 1. 1 Σκοπός πειράµατος Η νινυδρίνη είναι ένας ισχυρός οξειδωτικός παράγοντας που αντιδρά µε όλα τα α-αµινοξέα στην περιοχή ph 4-8, σχηµατίζοντας ενώσεις ιώδους χρώµατος σύµφωνα µε την αντίδραση. Πρέπει να σηµειωθεί ότι την αντίδραση νινυδρίνης δίνουν επίσης οι πρωτοταγείς αµίνες και η αµµωνία χωρίς όµως απελευθέρωση CO 2. Στη περίπτωση αµινοξέων (προλίνη, υδροξυπρολίνη), κατά την αντίδραση νινυδρίνης σχηµατίζονται παράγωγα κίτρινου χρώµατος. Αντίδραση νινυδρίνης 13
2. 4. 1. 2 Εκτέλεση Σε 5 µεγάλους δοκιµαστικούς σωλήνες, αναµείξατε τα διαλύµατα όπως φαίνεται στον παρακάτω πίνακα 2.3. Τοποθετείστε τους σε ζέον υδατόλουτρο για 5 λεπτά ή µέχρι να εµφανιστεί ένα ζωηρό ιώδες χρώµα. Πίνακας αντιδράσεων 2.2 Αριθµός σωλήνα Διαλύµατα 0.2% Παρατηρήσεις νινυδρίνη 1 απεσταγµ. H2O 2 0.2% τυροσίνη 3 0.2% γλυκίνη 4 0.2% τρυπτοφάνη 5 1% ωβαλβουµίνη 1 2 3 4 5 Παρατηρήσεις 14
Bιοχηµεία 2013-2014 2. 4. 2 Αντίδραση Ξανθοπρωτεΐνης 2. 4. 2. 1 Σκοπός πειράµατος Τα αρωµατικά αµινοξέα σχηµατίζουν µε θέρµανση, παρουσία νιτρικού οξέως, νιτροπαράγωγα µε κίτρινο χρώµα. Τα άλατα των νιτροπαραγώγων αυτών που σχηµατίζονται µε προσθήκη αµµωνίας έχουν κίτρινο χρώµα. 2. 4. 2. 2 Εκτέλεση Σε 5 δοκιµαστικούς σωλήνες, αναµείξατε τα διαλύµατα που περιγράφονται στον παρακάτω πίνακα 2.3. Θερµαίνουµε µέχρι βρασµού, οπότε εµφανίζεται ένα ζωηρό κίτρινο χρώµα. Πίνακας αντιδράσεων 2.3 Αριθµός σωλήνα Διαλύµατα Πυκνό νιτρικό οξύ 1 Παρατηρήσεις Απεσταγµ. H2O 2 0.2% τυροσίνη 3 0.2% τρυπτοφάνη 4 0.2% γλυκίνη 5 0.2% αργινίνη 1 2 3 4 5 Παρατηρήσεις 15
2. 4. 3 Αντίδραση Κυστείνης (Arnold) 2. 4. 3. 1 Σκοπός πειράµατος Παρουσία αµµωνίας,οι σουλφυδρυλοµάδες της κυστείνης αντιδρούν µε το νιτροπρωσσικό νάτριο [Fe((CN)3NO)Na2] και σχηµατίζουν σύµπλοκο που έχει καστανέρυθρο χρώµα. 2. 4. 3. 2 Εκτέλεση Σε 4 µικρούς δοκιµαστικούς σωλήνες αναµείξατε τα διαλύµατα που περιγράφονται στον παρακάτω πίνακα 2.5. Πίνακας αντιδράσεων 2.4 Αριθµός Διαλύµατα Νιτροπρωσσικό Διάλυµα αµµωνίας Παρατηρήσεις σωλήνα νάτριο 5% 1 2 ml 4 σταγόνες 1-2 σταγόνες 0.3% κυστείνη 2 2 ml 4 σταγόνες 1-2 σταγόνες 0.3% κυστίνη 3 2 ml 4 σταγόνες 1-2 σταγόνες 0.2% γλυκίνη 4 4 σταγόνες 1-2 σταγόνες 1% ωβαλβουµίνη 1 2 3 4 Παρατηρήσεις 16
2. 4. 4 Αντίδραση Αργινίνης (Sakaguchi) 2. 4. 4. 1 Σκοπός πειράµατος Σε αλκαλικό περιβάλλον, παρουσία α-ναφθόλης και υποχλωριώδους νατρίου, η αργινίνη και άλλες ενώσεις µε γουανιδυλικές οµάδες σχηµατίζουν σύµπλοκα µε κόκκινο χρώµα σύµφωνα µε την εξής αντίδραση: 2. 4. 4. 2 Εκτέλεση Μέσα σε 3 δοκιµαστικούς σωλήνες, αναµείξατε τα διαλύµατα όπως φαίνεται στον παρακάτω πίνακα 2.5. Πίνακας Αντιδράσεων 2.5 Αριθµός Διάλυµα 5% NaOH 5% 10% υπο- Παρατηρήσεις Σωλήνα α-ναφθόλη χλωριώδες νάτριο 1 2 ml H 2 0 2 2 ml 0.2% αργινίνη 3 2 ml 1% ζελατίνη 4 2 ml 1% ωβαλβουµίνη 10 σταγόνες 2 σταγόνες 3 σταγόνες 10 σταγόνες 2 σταγόνες 3 σταγόνες 10 σταγόνες 2 σταγόνες 3 σταγόνες 10 σταγόνες 2 σταγόνες 3 σταγόνες 17
Bιοχηµεία 2013-2014 1 2 3 4 2. 4. 5 Αντίδραση Τρυπτοφάνης (Hopkin-Cole) 2. 4. 5. 1 Σκοπός πειράµατος Ο ινδολυκός δακτύλιος της τρυπτοφάνης αντιδρά µε το γλυοξυλικό οξύ, παρουσία πυκνού θεικού οξέος, σχηµατίζοντας ένα σύµλοκο µε ιώδες χρώµα. 2. 4. 5. 2 Εκτέλεση Ετοιµάστε 4 δοκιµαστικούς σωλήνες. Κάθε σωλήνας να περιέχει τα παρακάτω διαλύµατα: (1) Η2Ο και 1ml γλυοξυλικού οξέος; (2) 1ml 0.2% τρυπτοφάνη και 1ml γλυοξυλικού οξέος (3) 1% ζελατίνη και 1ml γλυοξυλικού οξέος και (4) 1% ωαλβουµίνη και 1ml γλυοξυλικού οξέος. Στη συνέχεια µεταφέρετε τους σωλήνες στον απαγωγό και προσεκτικά αφήστε να εισρεύσει πολύ οµαλά 1ml πυκνού θειικού οξέος σε κάθενα που τον κρατάτε σε ελαφριά κλίση. Στη ζώνη επαφής του διαλύµατος µε το θειικό οξύ εµφανίζεται ένας δακτύλιος (2). 1 2 3 4 Παρατηρήσεις 18
Πείραµα 2ο 2. 5 Διαχωρισµός µείγµατος αµινοξέων σε χρωµατογραφία στήλης 2. 5. 1 Γενικά Για το διαχωρισµό των αµινοξέων χρησιµοποιούνται κατιοανταλλάκτες που διαθέτουν ασθενείς όξινες οµάδες (π,χ, καρβοξυλοµάδες) ή ισχυρές όξινες (π.χ. σουλφονικές οµάδες). Οι ισχυροί κατιοντοανταλλάκτες παρουσιάζουν τη µεγαλύτερη ιονοανταλλακτική ικανότητα σε όλες σχεδόν τις τιµές του ph, µια και οι οµάδες τους στη πράξη είναι πάντα ιονισµένες. Στην άσκηση θα χρησιµοποιήσουµε σαν ισχυρό κατιοντοανταλλάκτη τη ρητίνη Dowex-50W, που διαθέτει -SO -2 2 σαν ιονιζόµενη οµάδα. Μίγµα γλουταµινικού οξέος και αργινίνης θα προστεθεί στη στήλη και στη συνέχεια θα γίνει έκλουση των αµινοξέων που προσδέθηκαν αυξάνοντας το ph του ρυθµιστικού διαλύµατος από 3.8 σε 12.5. Ο µηχανισµός λειτουργίας της στήλης φαίνεται στο παρακάτω σχήµα. Έκλουση γλουταµινικού Κλάσµατα 1-7 To γλουταµινικό εκλούεται συνήθως στα κλάσµατα 2-3 Έκλουση αργινίνης Κλάσµατα 8-11 Η αργινίνη εκλούεται συνήθως στo κλάσµα 9 19
Με την τεχνική αυτή θα διαχωρίσουµε το όξινο γλουταµινικό οξύ από το βασικό αµινοξύ αργινίνη. Η παρουσία των αµινοξέων στα κλάσµατα της έκλουσης θα πιστοποιηθεί µε την αντίδραση της νινυδρίνης. Η τελική αναγνώριση των αµινοξέων θα γίνει µε την αντίδραση της αργινίνης. 2. 5. 2 Προετοιµασία της ρητίνης και της στήλης (έχει γίνει από τον υπεύθυνο της άσκησης) 7 γραµµάρια ρητίνης κατεργάζονται µε 70ml 4N HCl για 5 λεπτά. Η κατεργασία επαναλαµβάνεται 3 φορές. Κάθε φορά αποµακρύνουµε προσεκτικά το υπερκείµενο, αφού αφήσουµε τη ρητίνη να καθιζάνει. Ξεπλένουµε τη ρητίνη µε επαναιώρηση σε απεσταγµένο νερό τρείς φορές διαδοχικά. Η ρητίνη επαναιωρείται σε 70ml 1N NaOH και θερµαίνεται στο υδατόλουτρο για 30 λεπτά. Στη συνέχεια η ρητίνη κατεργάζεται µε θερµό 1N NaOH για δυο ακόµη φορές και στο τέλος ξεπλένεται µε απεσταγµένο νερό. Κατά τη διάρκεια του τελικού πλυσίµατος ελέγχουµε το ph του διαλύµατος απο τα πλυσίµατα και σταµατάµε, όταν το ph είναι ουδέτερο. Η επεξεργασµένη ρητίνη αιωρείται στο ρυθµιστικό διάλυµα µε ph 3.8 και τοποθετείται στη στήλη όπου και εξισορροπείται µε 5-10 όγκους στήλης του ίδιου ρυθµιστικού διαλύµατος. 2. 5. 3 Εκτέλεση χρωµατογραφίας όπως σχηµατικά περιγράφεται σε επόµενη σελίδα Προετοιµάστε 2 οµάδες από 11 δοκιµαστικούς σωλήνες και αριθµήστε τους από το 1-11 µε υαλογραφικό µαρκαδόρο στο άνω άκρο του σωλήνα. Τοποθετείστε τους σε 2 διαφορετικά stateu. Ανοίξτε τη στήλη και αφήστε να περάσουν 10ml ρυθµιστικού διαλύµατος ph 3.8. Προσέξτε να µη στεγνώσει η επιφάνεια της στήλης και µε µεγάλη προσοχή προσθέστε µε τη βοήθεια πιπέτας pasteur από το µείγµα των αµινοξέων (όλη τη ποσότητα που υπάρχει στο πλαστικό Eppendorf). Όταν το µίγµα περάσει στη ρητίνη προσθέτουµε (προσέχοντας να µην στεγνώσει η ρητίνη και να µην ανακατευθεί η επιφάνειά της) 5ml ρυθµιστικού διαλύµατος ph 3.8 και αρχίζουµε τη συλλογή κλασµάτων, που το καθένα θα έχει όγκο 3.5 ml. Τα κλάσµατα θα συλλεγχθούν σε δοκιµαστικούς σωλήνες, οι οποίοι θα είναι καθαροί και θα έχουν νούµερα από 1-7. 20
Ο συνολικός όγκος του διαλύµατος ph 3.8 που θα περάσει από τη στήλη θα είναι 24.5 ml, δηλαδή 7 κλάσµατα. Αφού αφήσετε να περάσει όλο το ρυθµιστικό διάλυµα ph 3.8 από τη στήλη, χωρίς να στεγνώσει η άνω επιφάνειά της, προσθέτουµε προσεκτικά 0.1N NaOH και συνεχίζουµε να συλλέγουµε άλλα 4 κλάσµατα µε προσθήκη 0.1Ν NaOH µέχρι να συλλέξουµε και το 11o κλάσµα. Ο συνολικός όγκος του διαλύµατος ph 12.5 που θα περάσει από τη στήλη θα είναι 14.0 ml, δηλαδή 4 κλάσµατα. Αφού τελειώσει η χρωµατογραφία ξεπλύνετε τη στήλη µε 10ml οξικού ρυθµιστικού διαλύµατος 0.1M και ph 3.8, αµέσως. 2. 5. 3. 1 Προσδιορισµός αµινοξέων Αφού τελειώσει η χρωµατογραφία θα πρέπει να ανιχνεύσουµε (i) (ii) σε ποιά κλάσµατα υπάρχει αµινοξύ και ποιό αµινοξύ προσδέθηκε στη στήλη και ποιό δεν προσδέθηκε. Ο προσδιορισµός των αµινοξέων θα γίνει µε την αντίδραση της νινυδρίνης. Από κάθε έναν από τους σωλήνες µε νούµερο 1-11 µεταφέρατε 1ml και τοποθετείστε το σε καθαρούς σωλήνες που έχουν ακριβώς το ίδια νούµερα. Σε όλους τους σωλήνες τοποθετείστε 1ml διαλύµατος νινυδρίνης. Στους καινούργιους σωλήνες µε νούµερο 8-11 προσθέστε, πρίν την νινυδρίνη, 0.5ml 1M οξικού οξέος µε σκοπό να εξουδετερώσουµε το NaOH. Σε αλκαλικό ph η αντίδραση νινυδρίνης δεν λαµβάνει χώρα. Εαν δεν εξουδετερώσετε το ph η αντίδραση θα δώσει κίτρινο χρώµα. Τοποθετήστε τους σωλήνες σε θερµαντικό στοιχείο ρυθµισµένο στους 100 C για να ολοκληρωθεί η αντίδραση νινυδρίνης (περίπου 5 λεπτά). Στους σωλήνες που δίνουν θετική αντίδραση νινυδρίνης και µόνο, ελέγξατε το είδος του αµινοξέος µε την αντίδραση Sakaguchi, όπως περιγράφεται στην παράγραφο 2.4.4. 21
24.5ml acetate ph 3.8 14 ml NaOH ph 12.5 3.5 ml ml Εικόνα 2.3 Σχηµατική παράσταση της πειραµατικής διαδικασίας διαχωρισµού αµινοξέων 22
Εικόνα 2.4 Αυτόµατος αναλυτής αµινοξέων 23