Ειδικά Κεφάλαια Βιοχηµείας

Ειδικά Κεφάλαια Βιοχηµείας ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ-ΠΡΩΤΕΟΣΩΜΑ Δρ. Κ. Ε. Βοργιάς Καθηγητής Βιοχηµείας Τµήµα Βιολογίας 2009 Περιεχόµενα Σελίδα 1. Εισαγωγή 2 2. Τα πρωτεολυτικά ένζυµα συµµετέχουν στην ανακύκλωση των πρωτεινών 3 3. Ειδικότητα της αποικοδόµησης πρωτεινών 6 4. Μηχανισµοί αποικοδόµησης πρωτεινών 8 5. Λυσοσώµατα 9 6. Δοµή και λειτουργία της ουβικουιτίνης 10 7. Δοµή και λειτουργία του πρωτεοσώµατος 17 8. Η ηµιζωή των πρωτεινών καθορίζεται µερικώς από τη φύση του Ν-τελικού αµινοξέος 20 9. Σύνδεση αποικοδόµησης και αναδίπλωσης πρωτεϊνών 20 10. Βιβλιογραφία 22 1

Αποικοδόµηση πρωτεινών-πρωτεόσωµα 1. Εισαγωγή Η πρωτοποριακή έρευνα των Henry και Rudolf Schoenheimer την δεκαετία του 1940 έφερε στο φως την έννοια της ανακύκλωσης των υποκυτταρικών συστατικών. Συγκεκριµένα έδειξε ότι οι πρωτείνες ανακυκλώνονται συνεχώς µε διαφορετικούς ρυθµούς. Ως χρόνος ηµιζωής µιας πρωτείνης ορίζεται ώς η χρονική εκείνη διάρκεια που απαιτείται για να ανακυκλωθεί το 50% του συνολικού πληθυσµού ενός πρωτεινικού µορίου. Ο χρόνος ηµιζωής µιας πρωτείνης µπορεί να κυµανθεί από µερικά λεπτά µέχρι µήνες και ίσως χρόνια. Σε κάθε περίπτωση τα κύτταρα συνεχώς συνθέτουν πρωτείνες από αµινοξέα και τις αποικοδοµούν πάλι σε µικρά βιολογικά ενεργά πεπτίδια και αµινοξέα. Η διαδικασία της ανακύκλωσης πρωτεϊνών είναι πολύπλοκη και πολυέξοδη. Έχει όµως δύο σηµαντικά πλεονεκτήµατα για τις κυτταρικές διαδικασίες. (α) Δίνει τη δυνατότητα στα κύτταρα να καταστρέφουν τις πρωτείνες που για κάποιο λόγο δεν µπορούν να λειτουργήσουν φυσιολογικά και η πιθανή συσσωρευσή τους θα δηµιουργούσε σηµαντικές δυσλειτουργίες στην κυτταρική µηχανή και (β) επιτρέπει στους ρυθµιστικούς µηχανισµούς του κυττάρου να ελέγχουν και να ρυθµίζουν τις ποσότητες διαφόρων πρωτείνων στα επίπεδα που απαιτούν οι εκάστοτε φυσιολογικές συνθήκες. 2. Τα πρωτεολυτικά ένζυµα συµµετέχουν στην ανακύκλωση των πρωτεινών Οι περισσότερες µελέτες που αφορούν την αποικοδόµηση πρωτεινών έχουν εστιαστεί στα πρωτεολυτικά ένζυµα επειδή η υδρόλυση πρωτεινών σε αµινοξέα φαίνεται να έχει γενικό χαρακτήρα. Ένα πλήθος πρωτεασών, µε µεγάλη ποικιλία στην ειδικότητά τους, εµφανίζεται να συµµετέχει στην αποικοδόµηση πρωτεινών που έχουν σχέση µε κάποιες ασθένειες όπως µυική δυσµορφία, αρθρίτιδα, κακοήθεια και αναπνευστικές και γαστροεντερικές δυσλειτουργίες. Πολύ γνωστές πρωτεάσες είναι η κολλαγενάση και η ελαστάση που αποικοδοµούν τις δοµικές πρωτείνες κολλαγόνο και ελαστίνη, αντίστοιχα. 2

Πολλά κύτταρα έχουν την πρωτεάση καλπαίνη που ενεργοποιείται από Ca 2+. Η καλπαίνη επιστεύετο ότι συµµετέχει στην µη ειδική αποικοδόµηση πρωτεϊνών, τώρα όµως φαίνεται ότι καταλύει τη ρύθµιση της διάσπασης ειδικών πρωτεϊνών. Υπάρχουν επίσης πρωτεάσες που είναι ειδικές για συγκεκριµένες πρωτείνες που περιέχουν προσθετικές οµάδες, όπως φωσφορική πυριδοξάλη και NAD +, αλλά οι πρωτεάσες αυτές είναι ικανές να αποικοδοµούν µόνο το αποένζυµο (του ενζύµου χωρίς την προσθετική οµάδα). 3. Ειδικότητα της αποικοδόµησης πρωτεϊνών Η αποικοδόµηση των πρωτεϊνών εµφανίζει ειδικότητα. Όπως αναφέρθηκε τα κύτταρα έχουν την δυνατότητα να αναγνωρίζουν και να αποικοδοµούν µια πρωτείνη που δεν είναι φυσική. Η αποικοδόµηση αυτή είναι ανεξάρτητη απο τον κανονικό ρυθµό ανακύκλωσης µιας πρωτείνης αλλά σχετίζεται µε τον ποιοτικό έλεγχο των πρωτεινών. Χαρακτηριστικό παράδειγµα της ειδικότητητας αποικοδόµησης είναι η αιµοσφαιρίνη. Η αιµοσφαιρίνη είναι γνωστό ότι στα ερυθροκύτταρα έχει χρόνο ηµιζωής 120 ηµέρες. Σε πειράµατα σύνθεσης αιµοσφαιρίνης σε σύστηµα πρωτεινοσύνθεσης εκτός κυττάρου, από εκχύλισµα της πρωτεινοσυνθετικής µηχανής, βρέθηκε ότι εάν αντικαταστήσουµε το αµινοξύ βαλίνη µε το αναλογό του α-αµινο-βχλωροβουτυρικό, ο χρόνος ηµιζωής της νεοσυντηθέµενης αιµοσφαιρίνης µειώνεται σε 10 λεπτά. Το φαινόµενο αυτό συναντάται στη φύση και σε διάφορες ασθένειες όπου πχ. η παραγωγή µη λειτουργικών µορίων αιµοσφαιρίνης, λόγω µεταλλαγών ή άλλων παραγόντων, µειώνει το χρόνο ηµιζωής της σηµαντικά µε αποτέλεσµα να έχουµε αιµολυτική αναιµία. Χρυσός κανόνας είναι ότι πρωτείνες που έχουν χαµηλό χρόνο ηµιζωής ή υψηλούς ρυθµούς ανακύκλωσης είναι κυρίως ρυθµιστικές πρωτείνες. Σε αντίθεση µε τις δοµικές πρωτείνες που ακολουθούν το ρυθµό ανάπτυξης του κυττάρου και έχουν χρόνους ηµιζωής που αντιστοιχούν στο χρόνο του κύκλου ζωής του κυττάρου. Οι φυσικές ενδοκυτταρικές πρωτείνες αποικοδοµούνται µε ρυθµούς που εξαρτώνται από την ταυτοτητά τους. Ο χρόνος ηµιζωής διαφόρων ενζύµων σε δεδοµένο ιστό ποικίλει σηµαντικά όπως φαίνεται στον Πίνακα Ι. Ο ρυθµός αποικοδόµησης πρωτεινών των κυττάρων ποικίλει επίσης ανάλογα µε την ορµονική και τροφική κατάσταση των κυττάρων. Υπό συνθήκες ασητείας, τα κύτταρα αυξάνουν το ρυθµό αποικοδόµησης πρωτεινών µε σκοπό να τροφοδοτήσουν τις πλέον αδιαπραγµάτευτες κυτταρικές διαδικασίες. 3

Ένζυµο Χρόνος ηµιζωής (min) Αποκαρβοξυλάση της ορνιθίνης 0.2 RNA πολυµεράση I 1.3 Αµινοτρανσφεράση της Τυροσίνης 2.0 Αφυδρατάση της Σερίνης 4.0 PEP Καρβοξυλάση 5.0 Αλδολάση 118 GAPDH 130 Κυτόχρωµα b 130 LDH 130 Κυτόχρωµα c 130 Πίνακας Ι Χαρακτηριστικά παραδείγµατα χρόνου ηµιζωής διαφόρων ενζύµων στο συκώτι αρουραίου. 4. Μηχανισµοί αποικοδόµησης πρωτεινών Δύο είναι οι βασικοί µηχανισµοί αποικοδόµησης πρωτεινών µη επιλεκτική αποικοδόµηση που λαµβάνει χώρα στα λυσοσώµατα επιλεκτική αποικοδόµηση µέσω του συστήµατος της ουβικουιτίνης Οι µηχανισµοί αυτοί συνοψίζονται στο παρακάτω διάγραµµα 1. Κυτταροπλασµατικές πυρηνικές πρωτείνες Λυσοσώµατα Μη φυσικές, µικρού χρόνου ηµιζωής,και µεγάλου χρόνου ηµιζωής πρωτείνες ATP±ουβικουϊτίνη Πρωτεόσωµα Πεπτίδια Αµινοξέα Μεµβρανικές και εξωκυτταρικές πρωτείνες Ενδοκύττωαη Διάγραµµα 1. Λυσοσώµατα 4

5. Λυσοσώµατα Τα λυσοσώµατα είναι ενδοκυτταρικά οργανίδια που σχηµατίζονται από µεµβράνες υπό µορφή κυστιδίων και περιέχουν περίπου 50 υδρολυτικά ένζυµα συµπεριλαµβανοµένης µιας ποικιλίας πρωτεασών γνωστών ως καθεψινών. Τα λυσοσώµατα διατηρούν εσωτερικό ph περίπου 5 και όλα τα ένζυµα που περιέχουν εργάζονται άριστα στο ph αυτό. Τα λυσοσωµατικά ένζυµα είναι ανενεργά σε κυτταροπλασµατικό ph µε αποτέλεσµα το κύτταρο να αυτοπροστατεύεται από πιθανή διάχυση λυσοσωµικών ενζύµων στο κυτταρόπλασµα. Τα λυσοσώµατα ανακυκλώνουν ενδοκυτταρικά συστατικά µε τη βοήθεια µεµβρανικών κυστιδίων γνωστά ως αυτοφαγικά κυστίδια. Τα αυτοφαγικά κυστίδια εγκλείουν τα πρός αποικοδόµηση κυτταρικά συστατικά και τα διοχετεύουν στο λυσόσωµα πρός αποικοδόµηση. Με τον ίδιο µηχανισµό αποικοδοµούνται συστατικά εντός κυττάρου που παραλαµβάνονται από το περιβάλλον µέσω ενδοκύττωσης. Τα λυσοσώµατα έχουν επίσης έναν επιλεκτικό δρόµο αποικοδόµησης πρωτεινών που ενεργοποιείται µόνο µετά από µακρά ασητεία. Ο µηχανισµός αυτός είναι ειδικός για αποικοδόµηση πρωτεινών που περιέχουν το πενταπεπτίδιο Lys-Phe-Glu-Arg-Gln (KFERQ) ή πολύ οµόλογη ακολουθία. Οι πρωτείνες KFERQ αποικοδοµούνται ειδικά σε θηλαστικά υπό αυστηρή νηστεία και σε ιστούς που αντιδρούν µε ατροφία υπό συνθήκες στρες (συκώτι-νεφρά) αλλά όχι σε ιστούς που δεν αντιδρούν, όπως εγκέφαλος, όρχεις κλπ. 6. Δοµή και λειτουργία της ουβικουιτίνης Ο µηχανισµός ουβικουιτίνης είναι ο πιό καλά µελετηµένος µηχανισµός αποικοδόµησης ενδοκυτταρικών πρωτεινών µε σηµαντική φυσιολογική σηµασία. Βασική αρχή του µηχανισµού αυτού είναι η ύπαρξη ενός ενδιαµέσου σταδίου ελέγχου αποικοδόµησης κατά το οποίο η ουβικουιτίνη δένεται οµοιοπολικά στην πρωτείνη που πρόκειται να αποικοδοµηθεί. Τα µέχρι σήµερα δεδοµένα του µηχανισµού αποικοδόµησης µέσω ουβικουιτίνης θα αναπτυχθούν παρακάτω στις βασικές του γραµµές. Η ουβικουιτίνη είναι µια µικρή πρωτείνη µε 76 αµινοξέα και η στερεοδοµή της έχει προσδιοριστεί τόσο µε κρυσταλλογραφία ακτίνων-χ σε κρύσταλλο όσο και στο διάλυµα µε NMR. H παρακάτω εικόνα 1 παρουσιάζει τη δοµή ενός µορίου ουβικουιτίνης που έχει τα ακόλουθα χαρακτηριστικά. 5

Το µόριο της ουβικουιτίνης έχει πολύ συµπαγή δοµή και αποτελείται από 4 πτυχωτές επιφάνειες και µία α-έλικα. Lys48 Εικόνα 1 Στερεοδοµή της πρωτείνης ουβικουινίνης µε το Ν και C-άκρο. Η Lys48 που σχετίζεται µε το διαµοριακό δεσµό µεταξύ µορίων ουβικουιτίνης φαίνεται χαρακτηριστικά. Τα τρία καρβοξυτελικά αµινοξέα, Arg-Gly-Gly, έχουν ευέλικτη διαµόρφωση και προεκτείνονται στο διάλυµα. Το καρβοξυτελικό άκρο του τελευταίου αµινοξέος που είναι Gly µπορεί να δεθεί οµοιοπολικά µε άλλες πρωτείνες µέσω αµιδικών δεσµών των α- και ε- αµινοµάδων τους. Όταν ένα µόριο ουβικουιτίνης συνδέεται µε ένα άλλο µόριο ουβικουιτίνης, τότε η α-καρβοξυλοµάδα του ενός µορίου συνδέεται οµοιοπολικά µε αµιδικό δεσµό στην ε- αµινοµάδα της Lys48 του άλλου µορίου ουβικουιτίνης. Η ουβικουιτίνη ευρίσκεται σε σηµαντικές ποσότητες σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισµούς, όπως άλλωστε φαίνεται από το ονοµά της. Σηµαντικό είναι ότι η πρωτείνη ουβικουιτίνη εµφανίζει το χαµηλότερο ρυθµό εξελικτικής ποικιλοµορφίας που έχει µετρηθεί µέχρι σήµερα. Για παράδειγµα, 6

υπάρχουν µόνο τρείς διαφορές στην πρωτοταγή δοµή µεταξύ των µορίων ουβικουιτίνης από τον άνθρωπο µέχρι τη ζύµη. Είναι λοιπόν σαφές ότι η λειτουργία της ουβικουιτίνης είναι πολύ συντηρηµένη κατά τις εξελικτικές διαδικασίες και ότι όλα τα αµινοξέα της φαίνεται να είναι σηµαντικά στη λειτουργία της. Τα στάδια που µεσολαβούν στην αποικοδόµηση πρωτεινών που ρυθµίζεται µέσω του συστήµατος ουβικουιτίνης περιγράφονται παρακάτω και συνοψίζονται στο εικόνα 3. Το πρώτο βήµα στο δέσιµο της ουβικουιτίνης µε την πρωτείνη στόχο είναι η ενεργοποίηση της τελικής καρβοξυλοµάδα της και το δέσιµό της µέσω θειοεστερικού δεσµού στο ένζυµο ενεργοποιητή γνωστό ως E 1 (Ubiquitin activating enzyme) (εικόνα 2). Κατά την αντίδραση αυτή η τελική καρβοξυλική οµάδα ενεργοποιείται µέσω του αδενυλιωµένου ενδιαµέσου της µε την κατανάλωση ATP, όπως συµβαίνει συχνά µε διαδικασίες ενεργοποίησης. Η πρωτείνη Ubiquitin activating enzyme) E 1 είναι µια οµοδιµερής πρωτείνη µε συνολικό µοριακό βάρος 210 kda. Η ενεργοποιηµένη ουβικουιτίνη µεταφέρεται από το E 1 σε άλλο ένζυµο που ονοµάζεται E 2. Τα διάφορα E 2 ένζυµα (Ubiquiting conjugating enzyme) (εικόνα 3) περιέχουν ένα πυρήνα από 150 αµινοξέα που περιέχει στο ενεργό κέντρο του µια Cys. Διάφορες µορφές της πρωτείνης E 2 µεταφέρουν την ουβικουιτίνη στις α- και ε- αµινοµάδες διαφόρων πρωτεινών. Τέτοιες πρωτείνες, όπως οι ιστόνες είναι γνωστό ότι δένονται αντιστρεπτά στην ουβικουιτίνη και επηρεάζουν την λειτουργία τους χωρίς όµως να αποικοδοµούνται. Σε περίπτωση που η πρωτείνη θα αποικοδοµηθεί συµπλέκεται πρώτα µε ένα από το ένζυµα γνωστά ως E 3. Η πρωτείνη E 3, λιγάση της ουβικουιτίνης (Ubiquitin protein ligase) είναι µια πρωτείνη µε µοριακό βάρος 180 kda και µεταφέρει την ενεργοποιηµένη ουβικουιτίνη από το ένζυµο E 2 στην ε-αµινοµάδα µια λυσίνης της πρωτείνης στόχος που σχηµατίζει ισοπεπτιδικό δεσµό (isopeptide bond) (εικόνα 3). Η E 3 παίζει σηµαντικό ρόλο στην επιλογή των πρωτεινών που θα αποικοδοµηθούν. Ο µεγάλος αριθµός των διαφόρων E 2 πρωτεινών στα κύτταρα δείχνει ότι οι πρωτείνες αυτές συµµετέχουν στην επιλογή των πρωτεινών στόχων. Χαρακτηριστικό είναι ότι κάποιες E 2 πρωτείνες µεταφέρουν την ουβικουιτίνη κατευθείαν στις πρωτείνες στόχους (εικόνα 3). Επιπροσθέτως, 50 και πλέον µόρια υοβικουιτίνης µπορούν να συνδεθούν περιοδικά σχηµατίζοντας µια αλυσίδα πολυ-ουβικουιτίνης στην οποία η Lys48 κάθε µορίου ουβικουιτίνης σχηµατίζει έναν ισοπεπτιδικό δεσµό µε το καρβοξυτελικό άκρο του επόµενου µορίου ουβικουιτίνης. Η δηµιουργία της 7

αλυσίδας πολυ-ουβικουιτίνης που καταλύεται από διάφορα µόρια Ε 2, εµφανίζεται να είναι αναγκαία για την αποικοδόµηση τουλάχιστον µερικών πρωτεινών. Η ουβικουιτίνη µεταφέρεται από ένα από τα E 2 ένζυµα στην πρωτείνη στόχος ως σύµπλοκο µε την Ε 3. Πολλαπλά µόρια ουβικουιτίνης προσδένονται στην πρωτείνη στόχο και µάλιστα συχνά στην ίδια περιοχή. Τα µόρια της ουβιουιτίνης δένονται µεταξύ τους υπό µορφή αλυσίδας µέσω των αµιδικών δεσµών µεταξύ της α- καρβοξυλοµάδας του ενός µορίου µε την Lys48 του άλλου µορίου. Η δηµιουργία αυτού του συµπλέγµατος είναι απαραίτητη προυπόθεση για την αποικοδόµηση της πρωτείνης από το σύστηµα. Οι ουβικουιτινιοµένες πρωτείνες είναι δυναµικές οντότητες όπου τα µόρια της ουβικουιτίνης µπορούν να συνδεθούν ή αποκοπούν µέσω ειδικών ισοπεπτιδασών της ουβικουιτίνης. Η πρωτείνη στόχος αποικοδοµείται από ένα πολύ µεγάλο σύµπλεγµα πρωτεάσης που απαιτεί ATP, µε µοριακό βάρος 1.5Χ10 3 kda, που είναι ειδικό για συµπλέγµατα ουβικουιτίνης-πρωτείνης στόχου. Το πρωτεόσωµα είναι τµήµα αυτού του συµπλέγµατος. Η ουβικουιτίνη ελευθερώνεται από την πρωτείνη στόχο και µπορεί να επαναχρησιµοποιηθεί. Η ελευθέρωση αυτή γίνεται µε την βοήθεια αρκετών ενζύµων που κόβουν ειδικά τον οµοιοπολικό δεσµό µεταξύ του C-άκρου της ουβικουιτίνης και της άλλης πρωτείνης. Ένα βασικό ερώτηµα στο σύστηµα αυτό είναι µε πιό τρόπο αναγνωρίζονται και επιλέγονται οι πρωτείνες που πρόκειται να αποικοδοµηθούν. Τα Ε 3 ένζυµα φαίνεται να παίζουν ένα κεντρικό ρόλο στη διαδικασία αυτή επειδή η Ε 3 πρώτη αναγνωρίζει την επιλεγµένη πρωτείνη και δένεται µαζί της σε ειδική περιοχή. 8

Cys8 8 Εικόνα 2 Δοµή της πρωτείνης E 2 από Arabidopsis. Το αµινοξύ Cys88 όπου δένεται οµοιοπολικά η ουβικουιτίνη φαίνεται ενδεικτικά. Eικόνα 3 Σχηµατική παράσταση των σταδίων που µεσολαβούν στην αποικοδόµηση πρωτεινών που ρυθµίζονται από την ουβικουιτίνη (Ubiquitin) UB-COOH συµβολίζει την ουβικουιτίνη µε την α-καρβοξυλική της οµάδα. Ε 1, Ε 2 και Ε 3 είναι πρωτείνες που συµµετέχουν στην ενεργοποίηση (Uboquitin activating enzyme) και µεταφορά ουβικουιτίνης στην πρωτείνη που πρόκειται να αποικοδοµηθεί. Μια πρωτείνη που συµπλέκεται µε την Ε 3 είναι συνδεδεµένη µε ένα µεγάλο αριθµό µορίων ουβικουιτίνης. Δεν είναι γνωστό πότε η Ε 3 αποµακρύνεται από το σύµπλεγµα µε την πρωτείνη που έχει ήδη δεθεί µε την(ις) ουβικουιτίνη(ες). Ενεργοποιηµένη ουβικουιτίνη µπορεί 9

επίσης να µεταφερθεί από ειδικά Ε 2 ένζυµα σε πρωτείνες που δεν αποικοδοµούνται όπως οι ιστόνες. 7. Δοµή και λειτουργία του πρωτεοσώµατος Όπως αναφέρθηκε σε προηγούµενη παράγραφο, πολλά µόρια ουβικουιτίνης συνδέονται µε την πρωτείνη στόχο. Συγκεκριµένα, 50 ή και περισσότερα µόρια ουβικουιτίνης δένονται διαδοχικά στην πρωτείνη-στόχο και δηµιουργούν ένα σύµπλεγµα πολυ-ουβικουιτίνης. Στην αλυσίδα αυτή η Lys-48 από κάθε µόριο ουβικουιτίνης δηµιουργεί ένα ισοπεπτιδικό δεσµό µε την καρβοξυλική οµάδα του C- άκρου του επόµενου µορίου ουβικουιτίνης και ούτω καθ' εξής. Η δηµιουργία πολυ-ουβικουιτίνης που συντίθεται µε τη βοήθεια πολλών διαφορετικών µορίων Ε 2, είναι απαραίτητη προυπόθεση για την αποικοδόµηση τουλάχιστων µερικών πρωτεινών. Η ουβικουιτινιοµένη πρωτείνη αποικοδοµείται πρωτεολυτικά µε µία διαδικασία που απαιτείται κατανάλωση ATP µε τη µεσολάβηση ενός µεγάλου σύµπλεγµατος πρωτεινών µε συνολικό µοριακό βάρος της τάξεως των 2.000 kda, ή 26S και ονοµάζεται 26S πρωτεόσωµα. Το 26S προτεόσωµα που βρίσκεται τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασµα συνίσταται από 20 τουλάχιστον διαφορετικές υποµονάδες και περιέχει 10 τουλάχιστον διαφορετικές πολυπεπτιδικές αλυσίδες µοριακού βάρους 22-34 kda καθώς επίσης και 5 τουλάχιστον διαφορετικές ενζυµικές ενεργότητες που είναι ειδικές να αποικοδοµούν πεπτιδικούς δεσµούς στο C-άκρο βασικών, υδρόφοβων και όξινων αµινοξέων. Η πρωτεολυτική διαδικασία πιστεύεται ότι λαµβάνει χώρα στο εσωτερικό του βαρελιού του πρωτεοσώµατος, γεγονός που της επιτρέπει να είναι εκτενής και γρήγορη ενώ παράλληλα αποκλείει τη µη ειδική πρωτεολυτική αποικοδόµηση άλλων κυτταρικών συστατικών ή δοµών (εικόνα 4). Η χρήση ATP από το σύστηµα, ρυθµίζει την πρωτεολυτική ενεργότητα αυτού του συµπλέγµατος. Είναι σηµαντικό να εξασφαλισθεί ότι οι πρωτεάσες είναι σε ενεργό µορφή µετά την αλληλεπίδραση τους µε το κατάλληλο υπόστρωµα-πρωτείνη που προορίζεται να αποικοδοµηθεί. Σε αντίθεση περίπτωση η παρουσία στο κυτταρόπλασµα των πρωτεασών που θα µπορούσαν να αποικοδοµήσουν φυσικές πρωτείνες θα είχε σαν αποτέλεσµα να µετατρέψει το κυτταρόπλασµα σε ένα σάκκο µε αµινοξέα. Τέλος, το µέγεθος και η πολυπλοκότητα του πρωτεολυτικού συστήµατος που µοιάζει µε το ριβόσωµα είναι ενδεικτικό της µεγάλης σηµασίας της κεντρικής 10

αποικοδοµητικής µηχανής στο χρόνο ηµιζωής των πρωτεινών των ευκαρυωτικών κυττάρων. Κάθετη όψη Πλάγια όψη Εικόνα 4 Ανασυσταµένο είδωλο της δοµής του 26S πρωτεοσώµατος από κύτταρα Xenopus, µε διακριτικότητα 25 Å. Το σύµπλεγµα των πρωτεινών του 26S πρωτεοσώµατος έχει διαστάσεις 450x190 Å και µοριακό βάρος της τάξης των 1.500 kda. 8. Η ηµιζωή των πρωτεινών εν µέρει καθορίζεται από τη φύση του Ν-τελικού αµινοξικού καταλοίπου Τα δοµικά χαρακτηριστικά βάσει των οποίων τουλάχιστον οι φυσικές πρωτείνες επιλέγονται για αποικοδόµηση ίσως είναι εντυπωσιακά πολύ απλά. Η ηµιζωή των κυτταροπλασµατικών πρωτεινών ποικίλει ανάλογα µε την ταυτότητα του Ν-τελικού αµινοξικού καταλοίπου της πρωτείνης, όπως παρατηρήθηκε από τον Alexander Varshavsky και συνοψίζεται στον Πίνακα ΙΙ. Σε ένα σύνολο 208 κυτταροπλασµατικών πρωτεινών, µε µεγάλο χρόνο ηµιζωής, όλες έχουν ένα σταθεροποιητικό αµινοξύ στο Ν-άκρο τους. Τα αµινοξέα αυτά είναι: Μεθειονίνη, Σερίνη, Αλανίνη, Θρεονίνη, Βαλίνη, Γλυκίνη και Κυστείνη. Η παρατήρηση αυτή είναι γνωστή σαν ο κανόνας του Ν-τελικού άκρου (N-end rule) και ισχύει για τις προκαρυωτικές και ευκαρυωτικές πρωτείνες. Το γεγονός αυτό προτείνει ότι ο µηχανισµός επιλογής πρωτεινών για αποικοδόµηση είναι κοινός στα ευκαρυωτικά και 11

προκαρυωτικά κύτταρα, παρά το γεγονός ότι τα προκαρυωτικά κύτταρα στερούνται ουβικουιτίνης. Ν-τελικό αµινοξύ Χρόνος ηµιζωής (ώρες) Μεθειονίνη >20 Σερίνη >20 Αλανίνη >20 Θρεονίνη >20 Βαλίνη >20 Γλυκίνη >20 Ισολευκίνη ~0.5 Γλουταµινικό ~0.5 Τυροσίνη ~0.17 Γλουταµίνη ~0.17 Φαινυλαλανίνη ~0.05 Λευκίνη ~0.05 Ασπαρτικό ~0.05 Λυσίνη ~0.05 Αργινίνη ~0.03 Πίνακας ΙΙ Συσχέτιση του χρόνου ηµιζωής αρκετών κυτταροπλασµατικών ενζύµων µε τη φύση των Ν-τελικών αµινοξέων Επίσης είναι γνωστό ότι πολύ πιό πολύπλοκα σήµατα είναι εξίσου σηµαντικά για την επιλογή των πρωτεινών που πρόκειται να αποικοδοµηθούν. Για παράδειγµα, πρωτείνες µε περιοχές πλούσιες σε προλίνη (P), γλουταµινικό (E), σερίνη (S) και θρεονίνη (T), γνωστές ώς PEST-πρωτείνες αποικοδοµούνται πολύ γρήγορα. Ακόµη δεν είναι γνωστό µε πιό τρόπο οι πρωτείνες αυτές αναγνωρίζονται και ποιά είναι η φυσιολογίκή σηµασία. 9. Σύνδεση αποικοδόµησης και αναδίπλωσης Η διαδικασία αναδίπλωσης και αποικοδόµησης πρωτεϊνών είναι στενά συνδεδεµένες όπως φαίνεται στο παρακάτω διάγραµµα 2. Φαίνεται καθαρά ότι ένα 12

πλέγµα µηχανισµών που ελέγχουν τόσο την σωστή αναδίπλωση πρωτεϊνών όσο και την αποµάκρυνση των αδίπλωτων ή κακώς διπλωµένων ή συσσωρευµένων πολυπεπτιδικών αλυσίδων. Βιοσύνθεση πρωτεινών Διπλωµένες πρωτείνες-σταθερές Τυχαία ή µέσω τσαπερονίων αναδίπλωση Καταστροφή-στρες Αδίπλωτες πρωτείνες Αποδιάταξη µέσω τσαπερονίων και απελευθέρωση Τυχαία αναδίπλωση Αδίπλωτες πρωτείνες Διπλωµένες πρωτείνες- µη σταθερές Κακοδιπλωµένες πρωτείνες Αποσυσσωµάτωση µέσω τσαπερονίων Πρωτεόλυση εξαρτώµενη από ATP Συσσωµατώµατα Συσσωµατώµατα Μέσω τσαπερονίων Αποικοδοµηµένες πρωτείνες Πρωτεϊνικά συσσωµατώµατα ανθεκτικά σε πρωτεάσες Έκγλυστα σωµατίδια Πρίονς Διάγραµµα 2 13

10. Βιβλιογραφία 1. The ubiquitin system: functions and mechanisms. Finlay, D., and Varshavsky, A. Trends Biochem. Sci. 10, 343-347. (1985). 2. Ubiquitin-mediated pathways for intracellular proteolysis. Rechsteiner, M. Ann. Rev. Cell. Biol. 3, 1-30 (1987). 3. Ubiquitin-mediated protein degradation. Hershko, A. J. Biol. Chem. 263, 15237-15240 (1988). 4. The degradation signal in a short-lived protein. Bachmair A., and Varshavsky, A. Cell 56, 1019-1032 (1989). 5. New perspecives on the structure and function of ubiquitin. Monia, B.P., et al. Bio/Technology 8, 209-215 (1990). 6. Ubiquitin-conjugating enzymes: novel regulators of eucaryotic cells. Jentsch, S., et al. Trends Biochem. Sci. 15, 195-198 (1990). 7. Inhibition of the N-end rule pathway in living cells. Baker, R.T. and Varshavsky, A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1090-1094 (1991). 8. Peptide sequences that target cytosolic proteins for lysosomal proteolysis. Dice, F. Trends Biochem. Sci 15, 305-309 (1990). 9. Proteolysis proteasomes and antigen presentation. Goldberg, A.L., and Rock, K.L. Nature 357, 375-379 (1992). 10. The ubiquitin system for protein degradation. Hershko, A., and Ciechanover, A. Annu. Rev. Biochem. 61, 761-807 (1992). 11. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Ciechanover, A. Cell 79, 13-21 (1994). 12. Ubiquitin and intracellular protein degradation. Hochstrasser, M. Curr. Opin. Cell Biol. 4, 1024-1031 (1992). 13. The ubiquitin-conjugation system. Jentsch, S. Annu. Rev. Genet. 26, 179-207 (1992). 14. The multicatalytic and 26 S proteases. Rechsteiner, M., Hoffman, L., and Dubiel, W. J. Biol. Chem. 268, 6065-6068 (1993). 15. Proteasomes: multicatalytic proteinase complexes. Rivett, A.J. Biochem. J. 291, 1-10 (1993). 16. The N-end rule. Varshavsky, A. Cell 69, 725-735 (1992). 14