ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΝΘΡΩΠΟΥ & ΖΩΩΝ ΜΕΛΕΤΗ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΣΕ ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΕΣ ΠΕΡΙΟΧΕΣ ΜΥΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΤΗΝ ΠΟΣΗ ΥΔΑΤΙΚΟΥ ΑΦΕΨΗΜΑΤΟΣ ΤΟΥ Sideritis clandestina subsp. cyllenea Ερευνητική εργασία για την απόκτηση Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης της Λιναρδάκη Ζαχαρούλας Πάτρα 2007
2
Τριμελής Επιτροπή Μαργαρίτη Μαριγούλα, Λέκτορας του Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών (επιβλέπουσα). Ιατρού Γρηγόρης, Αναπληρωτής Καθηγητής του Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών. Λάμαρη Φωτεινή, Λέκτορας του Τμήματος Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών. 3
Αφιερωμένο στους αγαπημένους μου γονείς και στον αδελφό μου <<Εν γαρ τω μαθειν ένεστιν ηυλάβεια των ποιουμένων>>. (Μέσα στη μάθηση υπάρχει ο σεβασμός για την πράξη) ΣΟΦΟΚΛΗΣ 4
Ευχαριστίες Η ερευνητική αυτή εργασία πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, για την κατεύθυνση «Βιολογική Τεχνολογία». Εκπονήθηκε στο εργαστήριο Φυσιολογίας Ανθρώπου και Ζώων του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών υπό την επίβλεψη της Λέκτορος κ. Μαργαρίτη Μαριγούλας. Τα μέλη της τριμελούς επιτροπής, εκτός από την ανωτέρω επιβλέπουσα, ήταν η Λέκτορας του Τμήματος Φαρμακευτικής κ. Λάμαρη Φωτεινή και ο Αναπληρωτής καθηγητής του Τμήματος Βιολογίας κ. Ιατρού Γρηγόρης. Για την πραγματοποίηση και ολοκλήρωση αυτής της ερευνητικής εργασίας συνέβαλαν αρκετοί άνθρωποι τους οποίους και θα ήθελα να ευχαριστήσω έστω και μέσα από αυτές τις λίγες γραμμές. Θα ήθελα να εκφράσω τις ειλικρινείς μου ευχαριστίες στην καθηγήτριά μου κ. Μαργαρίτη Μαριγούλα, η ουσιαστική και συνεχής υποστήριξη, οι υποδείξεις, η εμπιστοσύνη και η εκτίμηση της οποίας, απετέλεσαν σημαντικό επιστημονικό υπόβαθρο στην προετοιμασία και την περάτωση αυτής της εργασίας. Επίσης θα ήθελα να την ευχαριστήσω για τις πολύτιμες συμβουλές και την καθοδήγησή της στα πολύπλοκα ζητήματα της βιολογίας του εγκεφάλου, αλλά και για τις συνεχείς υποδείξεις της για την επιτυχή πραγματοποίηση των πειραμάτων μου και την ορθή ανάλυση και εξήγηση των αποτελεσμάτων. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω την κ. Λάμαρη Φωτεινή, Λέκτορα του Τμήματος Φαρμακευτικής, για τις συνεχείς συμβουλές και υποδείξεις της, που μου παρείχε απλόχερα, σε όλη τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας. Επιπλέον, να ευχαριστήσω τον κ. Ιατρού Γρηγόρη, Αναπληρωτή καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας, για την ταυτοποίηση όλων των φυτικών δειγμάτων που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Θερμές ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω και στην κ. Κλάπα Μαρία, Εντεταλμένη Ερευνήτρια, Υπεύθυνη Εργαστηρίου Μεταβολικής Μηχανικής & Συστημικής Βιολογίας, του Ινστιτούτου Χημικής Μηχανικής & Χημικών Διεργασιών Υψηλής Θερμοκρασίας, του Ιδρύματος Τεχνολογίας και Έρευνας 5
(ΙΤΕ/ΕΙΧΗΜΥΘ) (Πάτρα) & του Τμήματος Χημικής Μηχανικής, Παν. Maryland, USA, για την ευκαιρία που μου έδωσε να αποτελέσω για αυτό το διάστημα μέλος της ερευνητικής της ομάδας και να γνωρίσω νέες τεχνολογίες και πεδία της επιστήμης, άγνωστα μέχρι τότε σ εμένα. Θα ήθελα επιπλέον να την ευχαριστήσω για τη συνεχή βοήθειά της, ώστε να ξεπεράσω όλες της δυσκολίες για την κατανόηση του επιστημονικού πεδίου της Μεταβολομικής και για την σωστή ανάλυση των δεδομένων μου. Ιδιαίτερες ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω στην αγαπημένη μου φίλη και πολύτιμη συνεργάτιδα, Παπανδρέου Μάγδα, Μεταπτυχιακή φοιτήτρια για την απόκτηση Διδακτορικού, του Εργαστηρίου Φυσιολογίας Ανθρώπου και Ζώων, του Τμήματος Βιολογίας, για τις ανεκτίμητες επιστημονικές εμπειρίες που είχαμε, την αμέριστη υποστήριξή της και την ενεργή συμμετοχή της, καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων μου. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω την Κωνσταντίνου Κατερίνα και τον Χρυσανθόπουλο Παναγιώτη, από το Εργαστήριο Μεταβολικής Μηχανικής & Συστημικής Βιολογίας, του Ιδρύματος Τεχνολογίας και Έρευνας (ΙΤΕ/ΕΙΧΗΜΥΘ, Πάτρα), για την καλή συνεργασία μας στα πειράματα Μεταβολομικής Ανάλυσης. Να ευχαριστήσω επίσης όλους τους καθηγητές και συναδέλφους Μεταπτυχιακούς φοιτητές των εργαστηρίων Μοριακής Βιολογίας, Γενετικής και Φυσιολογίας Φυτών, του Τμήματος Βιολογίας, για την παροχή εργαστηριακού εξοπλισμού, όποτε τον χρειάστηκα. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους καθηγητές και φοιτητές του Εργαστηρίου Φυσιολογίας Ανθρώπου και Ζώων, για την αρμονική συνεργασία μας καθ όλη τη διάρκεια της πειραματικής μου μελέτης. Τέλος, θα ήθελα περισσότερο να ευχαριστήσω τους γονείς μου κυρίως για την ηθική, αλλά και οικονομική υποστήριξή τους, όχι μόνο κατά το διάστημα της περάτωσης αυτής της εργασίας, αλλά καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών μου. 6
Περιεχόμενα Εισαγωγή... 10 Κεφάλαιο 1: Οξειδωτικό στρες και μηχανισμοί άμυνας του εγκεφάλου 1.1. Δομή και φυσιολογία του εγκεφαλικού φλοιού, του μεσεγκεφάλου και της παρεγκεφαλίδας... 11 1.2. Αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί άμυνας του οργανισμού. 14 1.3. Αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί άμυνας του εγκεφάλου.. 18 1.4. Εμπλοκή του οξειδωτικού στρες στη παθογένεση των νευροεκφυλιστικών νόσων 21 Κεφάλαιο 2: Γένος Sideritis: «Τσάι του βουνού» Γενικά 27 Κεφάλαιο 3: Χημική σύσταση των φυτών του γένους Sideritis 3.1. Αιθέρια έλαια 30 3.1.1 Γενικά χαρακτηριστικά των φυτικών αιθέριων ελαίων... 30 3.1.2 Χημική σύσταση των αιθέριων ελαίων του γένους Sideritis. 35 3.1.3 Βιολογικές ιδιότητες των αιθέριων ελαίων του γένους Sideritis. 37 3.2. Διτερπένια 38 3.2.1 Χημική σύσταση και βιολογικές ιδιότητες των διτερπενίων του γένους Sideritis 38 3.3. Πολυφαινόλες 41 3.3.1 Χημική δομή, κατηγορίες και διατροφικές πηγές των πολυφαινολών..42 3.3.2 Παράγοντες που επηρεάζουν το πολυφαινολικό περιεχόμενο των φυτών.46 3.3.3 Μεταβολισμός και Βιοδιαθεσιμότητα των πολυφαινολών..49 3.3.4 Πολυφαινολική σύσταση των ειδών του γένους Sideritis..52 3.3.5 Βιολογικές ιδιότητες των φυτικών πολυφαινολών...54 3.3.5.1 Αντιοξειδωτική δράση του γένους Sideritis in vitro..54 7
3.3.5.2 Αντιοξειδωτική δράση του τσαγιού in vivo.. 57 3.3.5.3 Βιολογικές επιδράσεις των φυτικών πολυφαινολών ως συνέπεια της αντιοξειδωτικής τους ικανότητας 61 3.3.6 Αρνητικές επιδράσεις των φυτικών πολυφαινολών 63 3.3.6.1 Τοξικές δράσεις των φλαβονοειδών..63 3.3.6.2 Ασφαλής κατανάλωση φλαβονοειδών..65 Κεφάλαιο 4: Μεταβολομική 4.1. Μεταβολική ανάλυση σε περιπτώσεις διαταραχών του εγκεφάλου.66 4.2. Μεταβολομική: ένα αναδυόμενο μετα-γενωμικό επιστημονικό πεδίο..68 4.3. Πειραματικές διαδικασίες και αναλυτικές τεχνολογίες κατά τη μεταβολομική ανάλυση.71 4.3.1 Φασματοσκοπία NMR (Nuclear magnetic resonance spectroscopy).73 4.3.2 Φασματομετρία μάζας (Mass spectrometry, MS).74 4.4. Εφαρμογές της Μεταβολομικής..80 4.4.1 Μελέτη της λειτουργίας των γονιδίων 80 4.4.2 Τοξικολογία και ανακάλυψη φαρμάκων 81 4.4.3 Μηχανισμοί και διάγνωση ασθενειών 82 4.4.4 Μεταβολομική ανάλυση και διατροφή 84 Κεφάλαιο 5: Σκοπός της εργασίας.86 Κεφάλαιο 6: Υλικά και Μέθοδοι 6.1. Πειραματική πορεία για τη μελέτη των αντιοξειδωτικών ιδιοτήτων των φυτικών και εγκεφαλικών δειγμάτων 87 6.1.1 Φυτικά δείγματα και προετοιμασία των εκχυλισμάτων τους.87 6.1.2 Πειραματόζωα και προετοιμασία των εγκεφαλικών δειγμάτων.88 6.1.3 Μέθοδοι προσδιορισμού της πολυφαινολικής σύστασης και της αντιοξειδωτικής ικανότητας.88 6.2. Πειραματική πορεία για τη μεταβολομική ανάλυση των εγκεφαλικών δειγμάτων. 92 6.2.1 Διαδικασία εκχύλισης των μεταβολιτών από τα δείγματα του εγκεφάλου 92 8
6.2.2 Διαδικασία παραγώγισης των δειγμάτων και ανάλυση με το όργανο GC-MS 93 Κεφάλαιο 7: Αποτελέσματα 7.1. Επίδραση της πόσης του αφεψήματος του είδους Sideritis clandestina subsp. cyllenea στην αντιοξειδωτική ικανότητα του εγκεφάλου 95 7.1.1 Πολυφαινολική σύσταση και αντιοξειδωτικές ιδιότητες διαφορετικών πληθυσμών του είδους Sideritis clandestina..95 7.1.2 Αντιοξειδωτική ικανότητα του εγκεφάλου ενηλίκων μυών μετά την πόση του αφεψήματος του Sideritis clandestina subsp. cyllenea..100 7.2. Επίδραση της πόσης του αφεψήματος του είδους Sideritis clandestina subsp. cyllenea στο μεταβολικό προφίλ της παρεγκεφαλίδας και του φλοιού ενηλίκων μυών...106 Κεφάλαιο 8: Συζήτηση Συμπεράσματα 8.1. Πολυφαινολική σύσταση και αντιοξειδωτικές ιδιότητες διαφορετικών πληθυσμών του είδους Sideritis clandestina.115 8.2. Αντιοξειδωτική ικανότητα διαφορετικών εγκεφαλικών περιοχών ενηλίκων μυών 118 8.3. Επίδραση της πόσης του αφεψήματος του είδους Sideritis clandestina subsp. cyllenea στην αντιοξειδωτική ικανότητα εγκεφαλικών περιοχών ενηλίκων μυών 120 8.4. Προοπτικές.126 8.5. Επίδραση της πόσης του αφεψήματος του είδους Sideritis clandestina subsp. cyllenea στο μεταβολικό προφίλ της παρεγκεφαλίδας και του φλοιού ενηλίκων μυών..127 Βιβλιογραφία...135 9
Εισαγωγή Η χρησιμοποίηση των φυτών ως φάρμακα έχει μακρά και σημαντική ιστορία. Απόδειξη αυτού αποτελούν τα ευρήματα σε τάφο, στο βόρειο Ιράκ, ενός ανθρώπου του Νεάντερταλ, θαμμένου 60.000 χρόνια πριν. Ανάλυση του εδάφους γύρω από τα οστά, αποκάλυψε ίχνη φυτών με φαρμακευτική αξία. Επίσης, το παλαιότερο γνωστό ιατρικό έγγραφο, είναι μια πήλινη πλάκα από τη Σαμάρεια, 4000 ετών, με καταγεγραμμένα φυτικά φάρμακα για ποικίλες ασθένειες. Κατά τη διάρκεια του αρχαίου Αιγυπτιακού πολιτισμού, μεγάλος όγκος πληροφοριών υπήρχε ήδη για τα φαρμακευτικά φυτά. Η αρχαία Κίνα και η Ινδία αποτελούν επίσης μια σημαντική πηγή πληροφοριών, σχετικά με τη φαρμακευτική αξία πολλών φυτών (Kong et. al., 2003). Σε όλα τα μέρη του κόσμου οι άνθρωποι ανακάλυψαν και ανέπτυξαν τις θεραπευτικές χρήσεις των ενδημικών φυτών, όμως η ιατρική με χρήση βοτάνων της αρχαίας Ελλάδας, οδήγησε στη θεμελίωση της ιατρικής της Δύσης. Ο Έλληνας γιατρός Ιπποκράτης (460-377 π.χ.), που θεωρείται και πατέρας της Ιατρικής, πίστευε ότι η κάθε ασθένεια είχε φυσική αιτία και χρησιμοποιούσε ποικίλα βότανα στις θεραπείες του. Οι αρχαίοι Ρωμαίοι, επίσης, επηρέασαν την ανάπτυξη της Δυτικής Ιατρικής, και ιδιαίτερα το έργο του Διοσκουρίδη (1 ος αιώνας μ.χ.). Αν και Έλληνας από τη γέννησή του, ο Διοσκουρίδης ήταν Ρωμαίος στρατιωτικός γιατρός και τα ταξίδια του με το στρατό τον έφεραν σε επαφή με πολλά χρήσιμα φυτά. Με τις πληροφορίες αυτές συνέταξε το έργο του, γνωστό με τη λατινική ονομασία "De Materia Medica", το οποίο περιείχε πάνω από 600 είδη φυτών με φαρμακευτική αξία (Kong et. al., 2003). Το έργο του περιελάμβανε περιγραφές των φυτών, καθώς και οδηγίες για τις χρήσεις και παρενέργειές τους. Στις μέρες μας πολλά φάρμακα ευρείας κατανάλωσης, είναι φυτικής προέλευσης. Πράγματι το 25% των φαρμάκων που παρασκευάζονται στις Ηνωμένες Πολιτείες, περιέχουν τουλάχιστον ένα ενεργό συστατικό φυτικής προέλευσης. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αποτελούν το σαλικυλικό οξύ, η βινκριστίνη, η μορφίνη, η κωδείνη και η ταξόλη, φάρμακα που προέρχονται 10
από ποικίλα φυτά (www.herbpalace.com/alternative-medicine/herbalmedicine.html). Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας, υπολογίζει ότι σήμερα το 80% περίπου του πληθυσμού παγκοσμίως, χρησιμοποιεί τα βότανα ως ένα είδος πρωταρχικής ιατρικής περίθαλψης. Επιπλέον, εκτιμάται ότι από τα 119 φυτικής προέλευσης φάρμακα, το 74% χρησιμοποιείται στη σύγχρονη Ιατρική με τρόπο ανάλογο της παραδοσιακής τους χρήσης (www.herbpalace.com/alternative-medicine/herbal-medicine.html). Παρά τον πολύ μεγάλο αριθμό φυτών που υπάρχουν πάνω στη γη, πάνω από 750.000, ένα πολύ μικρό ποσοστό αυτών έχει επιστημονικά μελετηθεί σήμερα. Η περισσότερη έρευνα εστιάζεται στη ταυτοποίηση και απομόνωση ενεργών συστατικών από τα φυτά, παρά στη μελέτη των φαρμακευτικών ιδιοτήτων ολόκληρου του φυτού. Οι βοτανολόγοι, πάντως, πιστεύουν ότι η φαρμακευτική αξία ενός φυτού βασίζεται στην αλληλεπίδραση όλων των συστατικών του. Οι ανακαλύψεις της παραδοσιακής Ιατρικής με χρήση φυτών, καθοδηγούμενες από σύγχρονες θεωρίες και τεχνικές, αναμένεται να συμβάλλουν σημαντικά στην εξέλιξη της σύγχρονης Ιατρικής. 1. Οξειδωτικό στρες και μηχανισμοί άμυνας του εγκεφάλου 1.1. Δομή και φυσιολογία του εγκεφαλικού φλοιού, του μεσεγκεφάλου και της παρεγκεφαλίδας Ο εγκεφαλικός φλοιός, που αποτελεί το εξωτερικό στρώμα των εγκεφαλικών ημισφαιρίων, συνίσταται από τη φαιά ουσία, που τη συγκροτούν κυρίως τα σώματα των νευρικών κυττάρων, ενώ στις υπο-φλοιικές δομές υπάρχει λευκή ουσία, που την αποτελούν κυρίως οι νευρικές ίνες των κυττάρων του φλοιού που φεύγουν προς την περιφέρεια (κινητικές ή 11
φυγόκεντρες) και οι νευρικές ίνες που έρχονται από την περιφέρεια προς τα κύτταρα του φλοιού (αισθητικές ή κεντρομόλες). Εικόνα 1: Απεικόνιση του εγκεφάλου και της θέσης των περιοχών του φλοιού (cerebrum), της παρεγκεφαλίδας (cerebellum) & του μεσεγκεφάλου (midbrain). Η εξωτερική επιφάνεια των εγκεφαλικών ημισφαιρίων έχει πολλαπλές αυλακώσεις, τις αύλακες, και προεξοχές ανάμεσα στις αύλακες, που λέγονται έλικες. Έτσι αυξάνει κατά πολύ η επιφάνεια του φλοιού των ημισφαιρίων. Οι πιο βαθιές αύλακες χωρίζουν κάθε ημισφαίριο σε τέσσερις λοβούς: το μετωπιαίο, το βρεγματικό, τον ινιακό και το κροταφικό λοβό. Κάθε περιοχή του φλοιού των ημισφαιρίων είναι εντελώς εξειδικευμένη για ορισμένη λειτουργία και αποτελεί το κέντρο αυτής της λειτουργίας. Ο μετωπιαίος λοβός εμπλέκεται στο σχεδιασμό και την εκτέλεση των κινήσεων. Σ αυτόν υπάρχουν το κινητικό κέντρο, από το οποίο δίνονται οι εντολές για όλες τις εκούσιες κινήσεις και το προκινητικό κέντρο που είναι σημαντικό για τις πνευματικές λειτουργίες και τον καθορισμό της προσωπικότητας του ατόμου. Στο βρεγματικό λοβό εντοπίζονται τα αισθητικά κέντρα για τις γενικές αισθήσεις (αφή, πίεση, πόνο, θερμοκρασία) και για τη γεύση. Στον ινιακό λοβό εντοπίζεται το κέντρο της όρασης, ενώ στον κροταφικό λοβό εντοπίζεται το κέντρο της ακοής. Ο μεσεγκέφαλος βρίσκεται βαθιά μέσα στον εγκέφαλο και αποτελείται από δύο τμήματα, την οροφή (tectum) και το κάλυμμα (tegmentum). Επιπλέον, περιέχει ένα κεντρικά τοποθετημένο κανάλι, που συνδέει την τρίτη και την τέταρτη κοιλία του εγκεφάλου. Η οροφή (tectum) σχηματίζει το ραχιαίο ή οπίσθιο τμήμα του μεσεγκεφάλου. Το τμήμα αυτό αποτελείται από έναν αριθμό δομών, με κυριότερα τα άνω και κάτω διδύμια. Αυτές εμφανίζονται σαν τέσσερα εξογκώματα στο εγκεφαλικό στέλεχος. Τα άνω διδύμια λαμβάνουν αισθητικές εισόδους από τους οφθαλμούς, μέσω του θαλάμου, και 12
εμπλέκονται στον έλεγχο της κίνησης των ματιών, ενώ τα κάτω διδύμια λαμβάνουν εισόδους από το αυτί. Το κάλυμμα (tegmentum) του μεσεγκεφάλου βρίσκεται στο πρόσθιο τμήμα της οροφής και αποτελεί μια πολύπλοκη δομή, που περιέχει πολλούς πυρήνες. Ορισμένοι από αυτούς τους πυρήνες εμπλέκονται στον έλεγχο των κινήσεων. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η μέλαινα ουσία. Το ραβδωτό σώμα, που είναι πυρήνας των βασικών γαγγλίων, λαμβάνει μια σημαντική ντοπαμινεργική προβολή από τη μέλαινα ουσία. Εκφυλισμός αυτής της οδού έχει σαν αποτέλεσμα την εμφάνιση της ασθένειας του Parkinson. Το κάλυμμα περιέχει επίσης το δικτυωτό σχηματισμό, που αποτελεί μια διάχυτη περιοχή, η οποία επεκτείνεται μέχρι τον οπίσθιο εγκέφαλο. Ο δικτυωτός σχηματισμός λαμβάνει αισθητικές πληροφορίες από το σώμα και τις μεταβιβάζει στον εγκεφαλικό φλοιό ή στο θάλαμο. Επιπλέον, παίζει σημαντικό ρόλο στο κύκλο ύπνου/αφύπνισης και στη ρύθμιση των κινήσεων. Η παρεγκεφαλίδα είναι μια μεγάλη περιοχή, που βρίσκεται πίσω και κάτω από τον υπόλοιπο εγκέφαλο. Αποτελείται από το σκώληκα στη μέση και από τα ημισφαίρια της παρεγκεφαλίδας. Όπως στα ημισφαίρια του εγκεφάλου, έτσι και στη παρεγκεφαλίδα, περιφερικά βρίσκεται η φαιά ουσία (φλοιός της παρεγκεφαλίδας), που σχηματίζει και εδώ έλικες, ενώ εσωτερικά βρίσκεται λευκή ουσία και πυρήνες. Η παρεγκεφαλίδα λαμβάνει προβολές από τους οφθαλμούς, το αυτί και από τους σωματοαισθητικούς υποδοχείς του σώματος. Οι πληροφορίες στη συνέχεια μεταβιβάζονται σε άλλες περιοχές, που εμπλέκονται στον έλεγχο των κινήσεων, και ιδιαίτερα στον εγκεφαλικό φλοιό. Επιπλέον, η παρεγκεφαλίδα λαμβάνει πληροφορίες από τον κινητικό φλοιό. Οι λειτουργίες, επομένως, της παρεγκεφαλίδας που δεν είναι συνειδητές και δεν υπάγονται στη θέλησή μας, είναι: α) διατήρηση του μυϊκού τόνου, β) συντονισμός της συνεργασίας των μυών στις διάφορες κινήσεις και γ) διατήρηση της ισορροπίας του σώματος. Σε βλάβες της παρεγκεφαλίδας εμφανίζεται μυϊκή αδυναμία, μη συντονισμός των μυών για την εκτέλεση των διαφόρων κινήσεων, τρέμουλο και τάση του ατόμου να πέφτει προς τη μια πλευρά κατά τη στάση ή τη βάδιση (παρεγκεφαλιδική αταξία). 13
1.2. Αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί άμυνας του οργανισμού Οι αντιδράσεις οξείδωσης αποτελούν ένα αναπόσπαστο τμήμα του μεταβολισμού, καθώς το οξυγόνο είναι ο τελικός αποδέκτης ηλεκτρονίων, στο σύστημα ροής ηλεκτρονίων που παράγει ΑΤΡ. Προβλήματα μπορούν να προκύψουν όταν η ροή e - και η παραγωγή ενέργειας παραμένουν αδέσμευτα, και έτσι παράγονται ελεύθερες ρίζες οξυγόνου, γνωστές ως ενεργές μορφές οξυγόνου (ROS). Στη πραγματικότητα, ενεργές μορφές οξυγόνου παράγονται συνεχώς μέσα στο κύτταρο, ως αποτέλεσμα των διαδικασιών μεταφοράς e - στα μιτοχόνδρια ή ως παράγωγα της δράσης των ενζύμων, οξειδάση της ξανθίνης, λιποξυγενάσες και κυκλοξυγενάσες. Επιπλέον, ενεργές μορφές οξυγόνου μπορούν να δημιουργηθούν ως αποτέλεσμα του ενδοκυτταρικού μεταβολισμού ξένων ενώσεων, τοξινών ή φαρμάκων, από το κυτόχρωμα Ρ450 και τις μονοξυγενάσες, ή λόγω της έκθεσης σε περιβαλλοντικούς παράγοντες όπως, περίσσεια αλάτων σιδήρου ή υπεριώδης ακτινοβολία. Άλλες πηγές ενεργών μορφών οξυγόνου είναι τα μακροφάγα και τα ουδετερόφιλα, τα οποία περιέχουν ένζυμα όπως το σύμπλοκο της ΝADPH οξειδάσης, ικανό να παράγει ρίζες υπεροξειδίου και υπεροξείδιο του υδρογόνου. Οι ενεργές μορφές οξυγόνου, λοιπόν, παίζουν διαφορετικούς θετικούς ρόλους in vivo, καθώς εμπλέκονται στη παραγωγή ενέργειας, στη φαγοκυττάρωση, στη κυτταρική ανάπτυξη και στη ρύθμιση της διακυτταρικής μεταγωγής σήματος. Ωστόσο, οι ενεργές μορφές οξυγόνου μπορούν επίσης να γίνουν αρκετά καταστροφικές, στοχεύοντας βιολογικά μακρομόρια όπως, τα λιπίδια, τις πρωτεΐνες και το DNA, επάγοντας οξείδωση και εν συνεχεία προκαλώντας μεμβρανική καταστροφή, απενεργοποίηση ενζύμων και καταστροφή του DNA. Για τη διατήρηση της ισορροπίας μεταξύ της παραγωγής και της απομάκρυνσης των ελευθέρων ριζών, τα κύτταρα έχουν αναπτύξει ειδικούς μηχανισμούς. Αυτοί οι προστατευτικοί μηχανισμοί είτε καταστρέφουν τις ελεύθερες ρίζες και εμποδίζουν τη παραγωγή τους ή απομακρύνουν τα μέταλλα μετάπτωσης, που είναι η πηγή των ελευθέρων ριζών. Στους μηχανισμούς αυτούς περιλαμβάνονται ενζυμικοί και μη ενζυμικοί αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί άμυνας, που παράγονται στον οργανισμό, και είναι 14
γνωστοί ως ενδογενείς, αλλά περιλαμβάνονται και άλλοι, που παρέχονται μέσω της διατροφής και ονομάζονται εξωγενείς (Masella et al., 2005). Τα εξωγενή αντιοξειδωτικά δεν είναι άλλα από τις γνωστές πολυφαινόλες, των οποίων η αντιοξειδωτική δράση θα μελετηθεί εκτεταμένα παρακάτω. Όσο αφορά τα ενδογενή αντιοξειδωτικά, υπάρχει μια πληθώρα αντιοξειδωτικών ενζύμων, που μετατρέπουν τις ενεργές μορφές οξυγόνου, σε λιγότερο επιβλαβείς ενώσεις, όπως για παράδειγμα η υπεροξειδική δισμουτάση (SOD), η καταλάση (CAT), η ρεδουκτάση της θειορεδοξίνης και η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPx) (Masella et al., 2005). Γενικά, αυτά τα ένζυμα ανήκουν στη πρώτη γραμμή άμυνας, ενάντια στα υπεροξείδια και το υπεροξείδιο του υδρογόνου. Παίζουν σημαντικό ρόλο στο περιορισμό των προκαλούμενων από ενεργές μορφές οξυγόνου, βλαβών στα βιολογικά μακρομόρια, όμως δεν είναι 100% αποτελεσματικά, διότι ορισμένες ενώσεις, που δημιουργούνται από την αλληλεπίδραση των ενεργών μορφών οξυγόνου με τα μακρομόρια, είναι αρκετά ενεργές. Είναι επομένως απαραίτητο, να απομακρυνθούν αυτά τα δευτερογενή προϊόντα, έτσι ώστε να παρεμποδιστεί η περαιτέρω ενδοκυτταρική καταστροφή, η αποικοδόμηση των κυτταρικών συστατικών και τελικά ο κυτταρικός θάνατος. Εικόνα 2: Μηχανισμοί δράσης των αντιοξειδωτικών ενζύμων ενάντια στις ελεύθερες ρίζες. 15
Αυτή η δεύτερη γραμμή άμυνας, ενάντια στις ενεργές μορφές οξυγόνου, παρέχεται από ένζυμα όπως, η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης, η γλουταθειόνη S-τρανσφεράση και η αλδευδική αφυδρογονάση (Masella et al., 2005). Οι λιγότερο επιβλαβείς μεταβολίτες, που παράγονται από αυτά τα ένζυμα, απομακρύνονται από το κύτταρο, μέσω αντλιών όπως για παράδειγμα ο συζευγμένος με γλουταθειόνη S-μεταφορέας. Από τα παραπάνω, φαίνεται ξεκάθαρα ο κεντρικός ρόλος της ανηγμένης γλουταθειόνης (GSH), στο ενδοκυτταρικό ενδογενές αντιοξειδωτικό σύστημα, καθώς το μόριο αυτό εμπλέκεται σε όλες τις γραμμές άμυνας ενάντια στις ενεργές μορφές οξυγόνου. Το τριπεπτίδιο γλουταμινικό οξύ-κυστείνη-γλυκίνη ή αλλιώς γλουταθειόνη (GSH), είναι ο κύριος μη ενζυμικός ρυθμιστής της ενδοκυτταρικής οξειδοαναγωγικής κατάστασης, που απαντάται σε όλους τους κυτταρικούς τύπους, σε συγκεντρώσεις της τάξης των mm. Το τριπεπτίδιο αυτό υπάρχει είτε στην ανηγμένη (GSH), είτε στην οξειδωμένη του (GSSG) μορφή και συμμετέχει σε αντιδράσεις οξειδοαναγωγής, μέσω της αντιστρέψιμης οξείδωσης της ενεργής του θειόλης. Κάτω από φυσιολογικές κυτταρικές συνθήκες, η μεγαλύτερη αναλογία αυτού του ρυθμιστή, βρίσκεται στην ανηγμένη του μορφή και κατανέμεται στο πυρήνα, στο ενδοπλασματικό δίκτυο και στα μιτοχόνδρια. Επιπλέον, η ανηγμένη μορφή μπορεί να δεσμεύεται σε πρωτεΐνες, και να δρα ως συνένζυμο διαφόρων ενζύμων, που εμπλέκονται στην άμυνα του κυττάρου. Επομένως, η γλουταθειόνη μπορεί με αυτό τον τρόπο άμεσα να εκκαθαρίζει ελεύθερες ρίζες ή να δρα ως υπόστρωμα των ενζύμων, υπεροξειδάση της γλουταθειόνης και γλουταθειόνη S-τρανσφεράση, κατά τη διάρκεια της αποτοξίνωσης του υπεροξειδίου του υδρογόνου, των λιπιδικών υδρουπεροξειδίων και άλλων ηλεκτρονιόφιλων ενώσεων. Οι υπεροξειδάσες της γλουταθειόνης συνιστούν μια ομάδα ενζύμων, τα οποία είναι ικανά να ανάγουν μια πληθώρα οργανικών και ανόργανων υδρουπεροξειδίων, προς τις αντίστοιχες υδροξυ-ενώσεις, χρησιμοποιώντας την ανηγμένη γλουταθειόνη ή και άλλα αντίστοιχα αναγωγικά μόρια. Υπάρχουν πολλές ιστο-ειδικές υπεροξειδάσες της γλουταθειόνης, που επιδεικνύουν επίσης ιστο-ειδικές δράσεις. Όλες οι μορφές είναι σεληνοπρωτείνες και η βασική λειτουργία τους είναι να αντιμετωπίζουν 16
καταστάσεις οξειδωτικού στρες. Κατά τη διάρκεια του καταλυτικού κύκλου, το σελήνιο οξειδώνεται από το υδρουπεροξείδιο, προς σεληνενικό οξύ. Εν συνεχεία το ενδιάμεσο αυτό ανάγεται από τον δότη e -. Στη περίπτωση που χρησιμοποιείται η ανηγμένη γλουταθειόνη, σχηματίζεται ένα σεληνοδισουλφίδιο, το οποίο διασπάται από ένα δεύτερο μόριο GSH, οπότε και αναγεννάται η ενεργός μορφή του ενζύμου. Οι γλουταθειόνη S-τρανσφεράσες αποτελούν τρείς ενζυμικές οικογένειες, τη κυτταροπλασματική, τη μιτοχονδριακή και τη μικροσωμική, οι οποίες αποτοξινώνουν ηλεκτρονιόφιλα ξενοβιωτικά, όπως χημικά καρκινογόνα, περιβαλλοντικούς παράγοντες μόλυνσης και αντι-ογκογόνους παράγοντες. Επιπλέον, προστατεύουν από ενεργές ενώσεις, που παράγονται in vivo σε περίπτωση οξειδωτικού στρες, απενεργοποιώντας ενδογενείς ακόρεστες αλδεΰδες, κινόνες, εποξείδια και υδρουπεροξείδια. Οι τρανσφεράσες αυτές ασκούν τις προστατευτικές τους επιδράσεις, διότι είναι ικανές να καταλύουν τη σύζευξη της ανηγμένης γλουταθειόνης, με τελικά προϊόντα οξείδωσης. Τόσο η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης όσο και η γλουταθειόνη S-τρανσφεράση, με τη δράση τους μειώνουν τελικά τα επίπεδα της συνολικής ενδοκυτταρικής ανηγμένης γλουταθειόνης. Πέρα από τη γλουταθειόνη, κάποια άλλα μη ενζυμικά μόρια, που συμβάλουν στην αντιοξειδωτική άμυνα του οργανισμού είναι το ασκορβικό οξύ (βιταμίνη C), η βιταμίνη E, το ουρικό οξύ και η χολερυθρίνη (L. Stryer, Βιοχημεία, Έκδοση 1997). Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η χολερυθρίνη, που αποτελεί ενδιάμεσο παράγωγο του καταβολισμού της αίμης, είναι ένα πολύ δραστικό αντιοξειδωτικό. Με δέσμευση δύο υδρουπεροξυλ-ριζών, η χολερυθρίνη οξειδώνεται προς χολοπρασίνη, που αποτελεί επίσης ενδιάμεσο παράγωγο του καταβολισμού της αίμης. Σε μοριακή βάση, η χολερυθρίνη που δεσμεύεται στην αλβουμίνη είναι περίπου δέκα φορές πιο δραστική από το ασκορβικό οξύ, στο να παρέχει προστασία έναντι υδατοδιαλυτών υπεροξειδίων. Στις μεμβράνες, η χολερυθρίνη είναι ένα πολύ ισχυρό αντιοξειδωτικό, συναγωνιζόμενη, από αυτή την άποψη, τη βιταμίνη Ε. Η χολερυθρίνη, το ουρικό οξύ και το ασκορβικό οξύ είναι τα τρία κύρια αντιοξειδωτικά στο πλάσμα. Το ουρικό οξύ είναι ένας πολύ αποδοτικός εκκαθαριστής των υψηλής δραστικότητας και βλαβερότητας ειδών οξυγόνου, δηλαδή ριζών υδροξυλίου, 17
ανιόντων υπεροξειδίου, ατομικού οξυγόνου και οξυγονωμένων ενδιαμέσων αίμης με τον Fe σε υψηλή οξειδωτική κατάσταση (+4 και +5). Πράγματι, το ουρικό οξύ ως αντιοξειδωτικό, είναι περίπου το ίδιο δραστικό όπως και το ασκορβικό. Στη περίπτωση του ουρικού, όπως και στη χολερυθρίνη, βλέπουμε μια έκφραση της αρχής ότι μερικά τελικά προϊόντα αποικοδόμησης των μεταβολικών πορειών, παίζουν σημαντικό ρόλο ως προστατευτικοί παράγοντες. 1.3. Αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί άμυνας του εγκεφάλου Ο εγκέφαλος είναι ιδιαίτερα ευάλωτος στις ελεύθερες ρίζες, λόγω του υψηλού μεταβολικού του ρυθμού, του υψηλού περιεχομένου σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, της υψηλής συγκέντρωσης σιδήρου σε ορισμένες εγκεφαλικές περιοχές και των μέτριων επιπέδων των αντιοξειδωτικών. Από πολλές βιβλιογραφικές αναφορές διαπιστώνουμε την ύπαρξη ιστο-ειδίκευσης όσον αφορά την αντιοξειδωτική ισχύ των διαφόρων εγκεφαλικών περιοχών, καθώς επίσης και την ύπαρξη διαφορετικής απόκρισης των διαφορετικών εγκεφαλικών περιοχών στο οξειδωτικό στρες. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η εργασία των Feoli et al. (2006), όπου παρατηρήθηκαν διαφορές σε ορισμένους δείκτες της οξειδωτικής κατάστασης εγκεφαλικών περιοχών, φυσιολογικών επίμυων. Συγκεκριμένα, η παρεγκεφαλίδα έδειξε μεγαλύτερη υπεροξείδωση λιπιδίων από τον εγκεφαλικό φλοιό, ενώ το περιεχόμενο των ελευθέρων ριζών ήταν ελαφρώς υψηλότερο στο φλοιό. Επιπλέον, η ενεργότητα του ενζύμου της υπεροξειδάσης της γλουταθείονης ήταν πολύ ισχυρότερη στον εγκεφαλικό φλοιό απ ότι στη παρεγκεφαλίδα, σε αντίθεση με τα ένζυμα υπεροξειδική δισμουτάση και καταλάση, όπου είχαν σχεδόν την ίδια ενεργότητα και στις δύο εγκεφαλικές περιοχές. Τέλος, η συνολική αντιοξειδωτική ικανότητα ήταν υψηλότερη στο φλοιό σε σχέση με τη παρεγκεφαλίδα των επίμυων. Ομοίως στην εργασία των Srivastava et al. (2005), προσδιορίστηκαν διάφοροι οξειδωτικοί δείκτες σε διαφορετικές εγκεφαλικές περιοχές φυσιολογικών επίμυων και επιπλέον αξιολογήθηκε η απόκριση των περιοχών αυτών στο οξειδωτικό στρες. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε ένα 18
μοντέλο οξειδωτικού στρες, επαγόμενο από το ισχυρά νευροτοξικό εντομοκτόνο εξαχλωρο-κυκλοεξάνιο (HCH). Ο μεσεγκέφαλος των φυσιολογικών επίμυων επέδειξε τη μεγαλύτερη λιπιδική υπεροξείδωση, ακολούθησε ο εγκεφαλικός φλοιός και τελευταία η παρεγκεφαλίδα. Η ενεργότητα της υπεροξειδικής δισμουτάσης ήταν ισχυρότερη στη παρεγκεφαλίδα των φυσιολογικών επίμυων, με το φλοιό και το μεσεγκέφαλο να ακολουθούν. Επιπλέον, ο μεσεγκέφαλος στα ζώα-μάρτυρες παρουσίασε την ισχυρότερη ενεργότητα στα ένζυμα καταλάση, ρεδουκτάση και τρανσφεράση της γλουταθειόνης, ενώ ο φλοιός τη χαμηλότερη, με ενδιάμεση ενεργότητα η παρεγκεφαλίδα. Η ενεργότητα της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης ήταν υψηλότερη στο μεσεγκέφαλο και χαμηλότερη στη παρεγκεφαλίδα των φυσιολογικών ζώων, ενώ ο φλοιός και ο μεσεγκέφαλος παρουσίασαν σχεδόν ίσα και μικρότερα επίπεδα της ανηγμένης γλουταθειόνης, από τη παρεγκεφαλίδα. Όσον αφορά την ευαισθησία των εγκεφαλικών περιοχών στο οξειδωτικό στρες, αύξηση της υπεροξείδωσης των λιπιδίων παρατηρήθηκε γενικά σε όλες τις εγκεφαλικές περιοχές, με υψηλότερη αύξηση στο φλοιό και τη παρεγκεφαλίδα, σε σχέση με το μεσεγκέφαλο. Η επίδραση της νευροτοξίνης HCH στα αντιοξειδωτικά ένζυμα, παρουσίασε επίσης ιστο-ειδίκευση. Γενικά η ενεργότητα της υπεροξειδικής δισμουτάσης μειώθηκε στον εγκέφαλο των HCH-μοντέλων επίμυων, με τη μεγαλύτερη μείωση να παρατηρείται στο φλοιό. Αντίθετα, το οξειδωτικό στρες προκάλεσε σημαντική επαγωγή της ενεργότητας των ενζύμων καταλάση, υπεροξειδάση, ρεδουκτάση και τρανσφεράση της γλουταθειόνης σε όλες τις εγκεφαλικές περιοχές. Η αύξηση της ενεργότητας αυτών των ενζύμων ήταν υψηλότερη στο φλοιό, ακολούθως στη παρεγκεφαλίδα και χαμηλότερη στο μεσεγκέφαλο. Τέλος, σημαντική μείωση στα επίπεδα της ανηγμένης γλουταθειόνης παρατηρήθηκαν στα HCH-μοντέλα επίμυων, με τη μέγιστη μείωση στον εγκεφαλικό φλοιό. Ομοίως, ιστο-ειδίκευση ως προς τη κατανομή των ενζυμικών και μη ενζυμικών αντιοξειδωτικών, αλλά και ως προς τον βαθμό ευαισθησίας στο οξειδωτικό στρες, παρατηρήθηκε στον εγκεφαλικό φλοιό και στη παρεγκεφαλίδα φυσιολογικών επίμυων, αλλά και μοντέλων οξειδωτικού στρες, επαγόμενο από την τοξίνη καινικό οξύ (Candelario-Jalil et al., 2001). Ο φλοιός των φυσιολογικών επίμυων παρουσίασε μεγαλύτερη λιπιδική 19
υπεροξείδωση και ενεργότητα της υπεροξειδικής δισμουτάσης, σε σύγκριση με τη παρεγκεφαλίδα, ενώ τα επίπεδα της ανηγμένης γλουταθειόνης ήταν σχεδόν τα ίδια στις δύο εγκεφαλικές περιοχές. Το καινικό οξύ προκάλεσε σημαντική μείωση στα επίπεδα της ανηγμένης γλουταθειόνης στη παρεγκεφαλίδα, σε αντίθεση με το φλοιό, όπου δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αλλαγή. Ως προς την υπεροξείδωση των λιπιδίων, το οξειδωτικό στρες οδήγησε σε στατιστικά σημαντική αύξηση, μόνο στη περιοχή της παρεγκεφαλίδας, ενώ δεν προκάλεσε καμία αλλαγή στην ενεργότητα της υπεροξειδικής δισμουτάσης και στις δύο περιοχές. Ένα τελευταίο παράδειγμα της διαφοράς στην αντιοξειδωτική ικανότητα μεταξύ των εγκεφαλικών περιοχών, αποτελεί η μελέτη των Manikandan et al. (2005). Στα ζώα-μάρτυρες ο εγκεφαλικός φλοιός και η παρεγκεφαλίδα, έδειξαν την ίδια και μεγαλύτερη από το μεσεγκέφαλο υπεροξείδωση λιπιδίων. Όσον αφορά τα ένζυμα υπεροξειδική δισμουτάση, καταλάση και υπεροξειδάση της γλουταθειόνης, η παρεγκεφαλίδα των φυσιολογικών επίμυων παρουσίασε την υψηλότερη ενεργότητα, ακολούθησε ο μεσεγκέφαλος, ενώ η χαμηλότερη ενεργότητα παρατηρήθηκε στο φλοιό. Διαφορές επίσης, υπήρχαν και στη κατανομή των επιπέδων των μη ενζυμικών αντιοξειδωτικών στις διάφορες εγκεφαλικές περιοχές των ζώων-μαρτύρων. Υψηλότερα επίπεδα ανηγμένης γλουταθειόνης και των βιταμινών C και Ε, παρατηρήθηκαν στο φλοιό, με το μεσεγκέφαλο και τη παρεγκεφαλίδα να ακολουθούν. Από τα παραπάνω παραδείγματα διαπιστώνουμε επομένως, ότι όλες οι εγκεφαλικές περιοχές δεν παρουσιάζουν την ίδια αντιοξειδωτική ικανότητα και ούτε έχουν την ίδια ευαισθησία σε καταστάσεις οξειδωτικού στρες. Οι λόγοι στους οποίους οφείλεται αυτή η ιστο-ειδίκευση δεν είναι ακόμα πλήρως γνωστοί. Η διαφορετική απόκριση στο οξειδωτικό στρες πιθανότατα να οφείλεται στο γεγονός ότι ορισμένες εγκεφαλικές περιοχές έχουν μεγαλύτερο οξειδωτικό φορτίο ή χαμηλότερη αντιοξειδωτική προστασία, χωρίς όμως να ισχύει πάντοτε αυτό, όπως αποδείχτηκε σε ορισμένα από τα πιο πάνω παραδείγματα. Επιπλέον, η βιοχημική βάση για την ιστο-ειδίκευση που παρατηρείται ως προς τα επίπεδα υπεροξείδωσης των λιπιδίων, δεν είναι ξεκάθαρη. Οι διαφορές στη σύσταση σε λιπαρά οξέα των εγκεφαλικών περιοχών, ίσως εξηγεί το πρότυπο της λιπιδικής υπεροξείδωσης (Srivastava et al., 2005). 20