ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ & ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ & ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ «Επίδραση Gram+ και Gram- βακτηρίων στην παραγωγή των κυτταροκινών INF-γ και TNF-α, από ανθρώπινα NK κύτταρα» ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΣΤΗΝ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΑΡΙΑ ΣΜΑΙΛΗ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ, ΙΟΥΛΙΟΣ 2012

ΜΕΛΗ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ ΕΓΚΡΙΣΗ ΜΕ ΥΠΟΓΡΑΦΕΣ Τα μέλη της Τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής ΒΑΝΤΑΡΑΚΗΣ ΑΠΟΣΤΟΛΟΣ ΜΟΥΖΑΚΗ ΑΘΑΝΑΣΙΑ ΡΟΣΜΑΡΑΚΗ ΕΛΕΥΘΕΡΙΑ Η Επιβλέπουσα Καθηγήτρια ΡΟΣΜΑΡΑΚΗ ΕΛΕΥΘΕΡΙΑ ii

Πρόλογος Ο πρόλογος αυτός περιέχει μόνο πολλά ευχαριστώ σε όλα τα άτομα που αφιέρωσαν πολύ χρόνο για μένα για να με εκπαιδεύσουν, να μου μεταδώσουν τις γνώσεις και να με στηρίξουν ψυχολογικά. Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω την επιβλέπουσα καθηγήτρια μου, κ. Ροσμαράκη, που δέχτηκε να με αναλάβει για την εκπόνηση της διπλωματικής μου εργασίας. Το ξέρω ότι δεν ήταν στα σχέδια της να αναλάβει κι άλλον μεταπτυχιακό φοιτητή, αλλά με δέχτηκε και ταυτόχρονα, μου έδωσε την ευκαιρία να προσπαθήσω να προσεγγίσω ένα καινούργιο τομέα για μένα, την Ανοσοβιολογία. Μέσα από αυτήν την διπλωματική έμαθα καινούργιες τεχνικές, είδα πρωτόγνωρα πράγματα, τα οποία ήταν τόσο ευχάριστα και ξέρω πως είναι πολύ δυνατά εφόδια για την πορεία που θέλω να ακολουθήσω στο άμεσο μέλλον. Θα συνεχίσω με τον κ. Βανταράκη, που δέχτηκε να πραγματοποιήσω μέρος της εργασίας μου στο δικό του εργαστήριο. Δεν θα ήθελα να παραλείψω να πω, πως αυτή η διπλωματική εργασία ξεκίνησε με τη συνεργασία των εργαστηρίων Περιβαλλοντικής Μικροβιολογίας και Ανοσοβιολογίας. Τέλος, οφείλω πολλά ευχαριστώ στην κ. Μουζάκη και στα παιδιά που ανήκουν στο εργαστήριο της. Σχεδόν όλο το πειραματικό μέρος πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο της Εργαστηριακής Αιματολογίας- Αιμοδοσίας. Η Μαρία Ρόδη, ο Γιάννης Παναγούλιας, η Παναγιώτα Σπανιδέα αφιέρωσαν πολύ από τον προσωπικό τους χρόνο σε μένα και την Πένυ και ένα απλό ευχαριστώ είναι λίγο. Η βοήθεια όλων τους ήταν πραγματικά πολύτιμη. Δεν μπορώ να παραλείψω την Πένυ Μιχαήλ, που ήταν δίπλα μου σε όλη τη διαδικασία, πραγματοποιώντας και αυτή τη δικιά της προπτυχιακή εργασία της. Της εύχομαι ολόψυχα καλή σταδιοδρομία και ό, τι καλύτερο στη ζωή της. Θα κλείσω αυτόν τον πρόλογο, με ένα τελευταίο ευχαριστώ στις συμφοιτήτριες μου για την αμέριστη συμπαράσταση τους, την Κατερίνα και τους γονείς μου. iii

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 6 ABSTRACT... 6 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ο... 7 ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 7 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΟ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ... 7 2. ΦΥΣΙΚΑ ΦΟΝΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ (NATURAL KILLERS CELLS)... 10 2.1. ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΩΝ ΝΚ ΚΥΤΤΑΡΩΝ... 12 2.2. ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΤΩΝ ΝΚ ΚΥΤΤΑΡΩΝ... 14 2.2.1. ΚΥΤΤΑΡΟΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ... 14 2.2.2. ΕΚΚΡΙΣΗ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΚΑΙ ΧΥΜΟΚΙΝΩΝ... 16 3. ΦΥΣΙΚΑ ΦΟΝΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ Τ (ΝΚΤ)... 19 4. Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ NK ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ... 20 5. ΣΚΟΠΟΣ... 25 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο... 26 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ... 26 1. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ... 26 1.1. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΟΝΟΠΥΡΗΝΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ (PBMCS) ΑΠΟ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟ ΑΙΜΑ... 27 1.2. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΝΚ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ PBMCS... 28 1.3. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ PBMCS KAI NK KYΤΤΑΡΩΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ Ή ΑΠΟΥΣΙΑ IL-2... 30 1.4. ΜΕΤΡΗΣΗ ΝΚ ΚΑΙ NKT ΟΜΟΙΩΝ (ΝΚΤ-LIKE) ΚΥΤΤΑΡΩΝ... 30 1.5. ΣΤΕΛΕΧΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ... 31 1.6. ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ IFN-Γ ΚΑΙ TNF-Α... 32 2. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ... 34 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ο... 35 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 35 1. ΜΕΤΡΗΣΗ ΝΚ ΚΑΙ ΝΚΤ-LIKE ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΑ PBMCS EX VIVO... 35 2. ΜΕΤΡΗΣΗ ΝΚ ΚΑΙ ΝΚΤ-LIKE ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΕΠΕΙΤΑ ΑΠΟ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΤΩΝ PBMCS... 38 3. ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ IFN-Γ ΚΑΙ TNF-Α... 43 3.1. ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ IFN-Γ... 43 3.2. ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ TNFA... 45 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ο... 46 ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 46 iv

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 50 I. ΞΕΝΟΓΛΩΣΣΗ... 50 II. ΕΛΛΗΝΙΚΗ... 57 III. ΕΙΚΟΝΕΣ... 57 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ... 58 I. ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΛΕΥΚΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΑΙ Ο ΡΟΛΟΣ ΣΤΟΥΣ ΣΤΙΣ ΑΝΟΣΠΟΙΗΤΙΚΕΣ ΑΠΟΚΡΙΣΕΙΣ... 58 II. ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΠΟΥ ΑΝΑΦΕΡΟΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΕΡΓΑΣΙΑ... 59 III. ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ... 61 IV. BD TM CYTOMETRIC BEAD ARRAY (CBA)... 62 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ... 64 v

ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ Τα φυσικά φονικά κύτταρα (NK) αποτελούν περίπου το 10% των κυκλοφορούντων λεμφοκυττάρων και παίζουν σημαντικό ρόλο στην πρώτη γραμμή άμυνας του ανοσοποιητικού συστήματος. Έχουν την ικανότητα να αναγνωρίζουν καρκινικά και μολυσμένα κύτταρα, τα οποία μπορούν να θανατώνουν απελευθερώνοντας κυτταροτοξικά κοκκία και κυτταροκίνες. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της έκκριση IFN-γ και TNF-α, από τα περιφερικά μονοπύρηνα (PBMCs) και ΝΚ κύτταρα, έπειτα από διέγερση με Gram θετικά και Gram αρνητικά βακτήρια (αναλογία ΝΚ κύτταρα προς βακτήρια 10:1), παρουσία ή απουσία εξωγενούς IL-2. Μικρή παραγωγή IFN-γ παρατηρήθηκε μόνο στα PBMCs, με μεγαλύτερη συγκέντρωση στις 20 ώρες έπειτα από διέγερση με L.monocytogenes, ενώ δεν παρατηρήθηκε παραγωγή TNF-α. Ο λόγος ΝΚ κύτταρα: βακτήρια (10:1) που χρησιμοποιήθηκε, η έλλειψη βοηθητικών κυττάρων και ο μικρός χρόνος διέγερσης, πιθανώς να ήταν και οι αιτίες που δεν παρήχθησαν καθόλου κυτταροκίνες από τα ΝΚ κύτταρα, ενώ η χαμηλή παραγωγή IFN-γ από τα PBMCs, πιθανώς να οφείλεται, είτε στην παραγωγή IL-10 από τα μακροφάγα είτε στο ότι το ερέθισμα διέγερσης δεν ήταν αρκετό, ώστε να ενεργοποιηθούν πλήρως. Περαιτέρω μελέτες χρειάζονται για την πλήρη κατανόηση της έκκρισης των κυτταροκινών από τα ΝΚ κύτταρα, παρουσία παθογόνων και δυνητικά παθογόνων μικροοργανισμών. ABSTRACT Natural killer (NK) cells comprise about 10% of all circulating lymphocytes and play crucial role to innate immune responses. NK cells can recognize tumor or infected cells and kill them by the release of cytotoxic molecules and cytokines. The aim of the study was to identify IFN-γ and TNF-α production from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and purified ΝΚ cells, after stimulation with Gram positive and Gram negative bacteria (in ratio 10 NK:1 bacteria), in the presence or the absence of exogenous IL-2. Only PBMCs produced IFN-γ, with greater amounts after 20 hours stimulation with L.monocytogenes, while no production of TNF-α was observed. The low ratio, the absence of accessory cells and the short time of stimulation, probably, were responsible for the fact that no cytokine were produced from NK cells, whereas the low production of IFN-γ from PBMCs was, probably, due to the production of IL-10 from macrophages Alternatively, it is possible that the ratio and the time points were not enough for the full stimulation of PBMCs. Additional studies are needed to demonstrate the NK cytokine profile pattern, in the presence of pathogens and potential pathogen microorganisms. 6

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΟ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Οι άνθρωποι και τα άλλα θηλαστικά ζουν σε έναν κόσμο παρουσία παθογόνων και μη παθογόνων μικροβίων, τοξικών και αλλεργιογόνων ουσιών που απειλούν τη φυσιολογική τους ομοιόσταση. Η κοινότητα των μικροβίων περιλαμβάνει τόσο υποχρεωτικούς παθογόνους, όσο και ευεργετικούς, συμβιωτικούς οργανισμούς, οι οποίοι είναι απαραίτητοι για τη διατήρηση της φυσιολογικής λειτουργίας των ιστών και των οργάνων. Τα παθογόνα μικρόβια έχουν πολλούς μηχανισμούς, με τους οποίους αναπαράγονται, εξαπλώνονται και απειλούν τις φυσιολογικές λειτουργίες των ξενιστών. Το ανοσοποιητικό σύστημα είναι αρμόδιο για την καταπολέμησή τους, αλλά ταυτόχρονα είναι αρμόδιο και για την προστασία του ίδιου του οργανισμού από αντιδράσεις που προκαλούν υπερβολική φθορά των ιστών και των ευεργετικών συμβιωτικών μικροβίων. Ένα γενικό χαρακτηριστικό γνώρισμα του ανοσοποιητικού συστήματος είναι ότι χρησιμοποιεί μηχανισμούς που βασίζονται στην ανίχνευση δομικών χαρακτηριστικών του παθογόνου παράγοντα ή της τοξίνης, επισημαίνοντας τα ως διαφορετικά στοιχεία από τα κύτταρα του οργανισμού. Οι μηχανισμοί τους οποίους χρησιμοποιεί το ανοσοποιητικό για την καταπολέμηση των παθογόνων και των βλαβερών ουσιών, χωρίζονται σε δύο κατηγορίες, στους μηχανισμούς της φυσικής ανοσίας (μη ειδική/έμφυτη) και της ειδικής ανοσίας (επίκτητη ανοσία). Στην πρώτη περίπτωση, τα μόρια της αναγνώρισης που χρησιμοποιούνται εκφράζονται, σε γενικές γραμμές, σε ένα μεγάλο αριθμό των κυττάρων, με αποτέλεσμα το σύστημα αυτό να είναι έτοιμο να ενεργήσει γρήγορα μετά από μια εισβολή παθογόνων μικροοργανισμών ή τοξινών και ως εκ τούτου αποτελεί την πρώτη γραμμή άμυνας. Στη δεύτερη περίπτωση, το σύστημα αποτελείται από έναν μικρό αριθμό κυττάρων, τα οποία παρουσιάζουν ειδικότητα για κάθε μεμονωμένο παθογόνο, τοξίνη ή αλλεργιογόνο. Τα κύτταρα αυτά, πολλαπλασιάζονται αφού συναντήσουν το αντιγόνο, ώστε να καταπολεμήσουν τον παθογόνο παράγοντα. Έτσι, χρονικά, η ειδική ανοσοαπόκριση, εκφράζεται μετά τη φυσική αντίδραση στην άμυνα του ξενιστή. Ένα βασικό χαρακτηριστικό της ειδικής απάντησης είναι ότι α) παράγει κύτταρα μεγάλου χρόνου ζωής, που εξακολουθούν να υπάρχουν σε μια φαινομενικά λανθάνουσα κατάσταση και β) μπορεί να τα 7

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ εκφράζει άμεσα έπειτα από μια άλλη συνάντηση με το ίδιο αντιγόνο (ανοσολογική μνήμη) (Chaplin, 2010). Η φυσική ανοσία περιλαμβάνει φυσικούς φραγμούς, όπως στρώματα επιθηλιακών κυττάρων που εκφράζουν μόρια προσκόλλησης κυττάρων (καντχερίνες, στενοδεσμούς κ.α), στρώματα εκκρινόμενης βλέννας, που καλύπτουν το βλεννογόνο του αναπνευστικού, πεπτικού και του ουροποιητικού συστήματος και τις επιθηλιακές βλεφαρίδες που απομακρύνουν την βλέννα. Επιπρόσθετα, περιλαμβάνει υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες και βιοενεργά μόρια, τα οποία είναι πάντα παρόντα στα βιολογικά υγρά (π.χ. πρωτεΐνες του συμπληρώματος), είτε απελευθερώνονται από τα κύτταρα που έχουν ενεργοποιηθεί (συμπεριλαμβανομένων των κυτταροκινών που ρυθμίζουν τη λειτουργία άλλων κυττάρων, των χημειοκινών που προσελκύουν φλεγμονώδη λευκοκύτταρα, των λιπιδικών μεσολαβητών της φλεγμονής, των βιοενεργών αμινών κ.α). Τέλος, στη φυσική ανοσία περιλαμβάνονται διαμεμβρανικοί υποδοχείς και κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες, οι οποίοι δεσμεύουν μοριακά μοτίβα στην επιφάνεια των εισερχόμενων παθογόνων παραγόντων. Από την άλλη μεριά, η ειδική ανοσία, όπως προαναφέρθηκε, είναι ειδική για το κάθε αντιγόνοστόχο. Ο μηχανισμός αυτός, οφείλεται κυρίως στους αντιγονο-ειδικούς υποδοχείς που βρίσκονται στην επιφάνεια των Τ και Β λεμφοκυττάρων, οι οποίοι κωδικοποιούνται από στοιχεία γονίδιων που υπόκεινται σε σωματικό διασκελισμό (Caligiuri, 2008). Μια άρτια ανοσολογική απόκριση περιλαμβάνει πολλούς τύπους λευκοκυττάρων. Οι διαφορετικοί υποπληθυσμοί μπορούν να διαχωριστούν μέσω διαφορετικών αντιγόνων που φέρουν στην επιφάνεια τους, τα οποία έχουν καθιερωθεί ως cluster of differentiation (CD). Ο πλήρης σχηματισμός των κυττάρων που συμμετέχουν στο ανοσοποιητικό σύστημα ξεκινά όταν πολυδύναμα αιμοποιητικά αρχέγονα κύτταρα διαφοροποιούνται στα μυελώδη (Myeloid Stem Cells) ή κοινά λεμφοποιητικά αρχέγονα κύτταρα (Common Lymphoid Progenitors, CLPs). Τα τελευταία, διαφοροποιούνται περαιτέρω σε τέσσερις κύριους πληθυσμούς, τα Τ και Β λεμφοκύτταρα, τα φυσικά φονικά κύτταρα (Natural Killer, ΝΚ) και τα ΝΚ- Τ κύτταρα (ΝΚΤ). Τα μυελώδη αρχέγονα κύτταρα δημιουργούν τους διαφορετικούς τύπους κοκκιοκυττάρων, τα αιμοπετάλια και τα ερυθρά αιμοσφαίρια. Τα κοκκιοκύτταρα έχουν εξέχοντα ρόλο στη λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος. Η ομάδα αυτή περιλαμβάνει τα μονοκύτταρα, τα μακροφάγα, τα ουδετερόφιλα, τα βασεόφιλα, τα ηωσινόφιλα και μαστοκύτταρα (mast cells) (Εικόνα 1.1) (Ροσμαράκη, 2010). Στην παρούσα διπλωματική εργασία γίνεται μια προσέγγιση ως προς τη λειτουργία, των ΝΚ κυττάρων. Στο Παράρτημα Ι αναφέρονται λεπτομέρειες για τους κυτταρικούς πληθυσμούς που λαμβάνουν μέρος στην έμφυτη και στην επίκτητη ανοσία. 8

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 1.1: Σχηματική παράσταση ανάπτυξης αιμοποιητικών κυττάρων 9

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ 2. ΦΥΣΙΚΑ ΦΟΝΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ (NATURAL KILLERS CELLS) Τα φυσικά φονικά κύτταρα, (ΝΚ) αποτελούν τον τρίτο μεγαλύτερο πληθυσμό λεμφοκυττάρων στα θηλαστικά και παίζουν σημαντικό ρόλο στην πρώτη γραμμή άμυνας του ανοσοποιητικού συστήματος (φυσική ανοσία) (Di Santo, 2008). Ανακαλύφθηκαν πριν από περισσότερα από 30 χρόνια, αλλά τις τελευταίες δύο δεκαετίες γίνονται προσπάθειες για την πλήρη κατανόηση του μηχανισμού δράσης και λειτουργίας τους (Caligiuri,2008). Τα κύτταρα αυτά, παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανοσολογική απόκριση έναντι παθογόνων μικροοργανισμών (βακτηρίων και ιών), καθώς και καρκινικών κυττάρων, ιδιαίτερα στα πρώτα στάδια της μόλυνσης ή της καρκινογένεσης, πριν την παραγωγή μεγάλου αριθμού ενεργοποιημένων κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων (Ροσμαράκη, 2010). Επίσης παίζουν σημαντικό ρόλο στις κλινικές μεταμοσχεύσεις, καθώς τα περισσότερα προβλήματα απόρριψης των οργάνων προκαλούνται από τα κυτταροτοξικά Τ και ΝΚ κύτταρα. Από ιστολογικής άποψης, τα ΝΚ είναι μεγάλα κοκκιώδη λεμφοκύτταρα (Large Granular Cell, LGC), με κυτταροτοξική δράση. Είναι κύτταρα που αναπτύσσονται στον μυελό των οστών από κοινά αρχέγονα λεμφοποιητικά κύτταρα και στη συνέχεια κυκλοφορούν στο αίμα, αποτελώντας περίπου το 10-15% των λεμφοκυττάρων (Chaplin, 2010). Εικόνα 1.2: Φυσικό φονικό κύτταρο Φαινοτυπικά, τα ανθρώπινα ΝΚ στερούνται την έκφραση του μορίου CD3 (χαρακτηριστική πρωτεΐνη των Τ λεμφοκυττάρων) και εκφράζουν στην επιφάνεια τους το μόριο CD56, το οποίο είναι η 140 kda ισομορφή N-CAM (μόριο κυτταρικής προσκόλλησης νευρικών κυττάρων, neural cell adhesion molecule). Βάσει της πυκνότητας του δείκτη CD56, τα ΝΚ χωρίζονται σε δύο κύριους υποπληθυσμούς: Τα CD56 dim και τα CD56 bright. Η πλειοψηφία (90%) των ΝΚ κυττάρων που 10

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ κυκλοφορούν στο αίμα, έχουν χαμηλή πυκνότητα έκφρασης του CD56 (CD56 dim ) και εκφράζουν υψηλά επίπεδα του υποδοχέα FcγRIII (CD16). Αντίθετα, το 10% περίπου των ΝΚ κυττάρων εκφράζουν σε υψηλά επίπεδα το CD56 (CD56 bright ), ενώ εκφράζουν σε χαμηλά επίπεδα ή καθόλου το δείκτη CD16 ( b Cooper et al., 2001). Οι δύο αυτοί υποπλυθησμοί έχουν διακριτή λειτουργία. Παρουσιάζουν διαφορές στην πρόκληση της κυτταροτοξικότητας και στην παραγωγή κυτταροκινών. Ειδικότερα, τα CD56 dim CD16 + που κυριαρχούν στο περιφερειακό αίμα και στους ιστούς με φλεγμονή, παρουσιάζουν υψηλή κυτταροτοξικότητα, αλλά χαμηλή παραγωγή κυτταροκινών. Αντίθετα, τα ΝΚ που εντοπίζονται σε μεγάλο βαθμό στους λεμφαδένες, CD56 bright CD16 -, εμφανίζουν μικρή κυτταρολυτική δραστηριότητα και έντονη παραγωγή κυτταροκινών (Moretta et al., 2008). Η διαφορά στη δράση των υποπληθυσμών των ΝΚ σχετίζεται με την έκφραση πληθώρα υποδοχέων στην κυτταρική τους επιφάνεια (Natural Killer Receptors, NKRs). Οι υποδοχείς αυτοί μπορούν να δράσουν είτε διεγερτικά είτε ανασταλτικά ως προς τη λειτουργία των ΝΚ κυττάρων (οι περισσότεροι δεν εκφράζονται μόνο στα ΝΚ κύτταρα, αλλά και σε ορισμένα Τ λεμφοκύτταρα). Εικόνα 1.3: Σχηματική απεικόνιση των ανθρώπινων ΝΚ κυτταρικών υποπληθυσμών 11

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ 2.1. ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΩΝ ΝΚ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Οι υποδοχείς των ΝΚ κυττάρων, κωδικοποιούνται στην αρχέγονη γραμμή και δεν υπόκεινται σε σωματικό διασκελισμό, όπως οι αντιγονικοί υποδοχείς των Τ και Β λεμφοκύτταρων. Παράλληλα, βρίσκονται σε μια ισορροπία, έτσι ώστε τα διεγερτικά και ανασταλτικά σήματα τους να καθορίζουν τη λειτουργία των ΝΚ (Moretta et al., 2001). Οι NKRs κατηγοριοποιούνται ως εξής: α) Τύπος C όμοιους της λεκτίνης (C-type lectine-like receptors) και περιλαμβάνει τις οικογένειες υποδοχέων CD94 και NKG2, οι οποίοι αναγνωρίζουν τα ανθρώπινα λευκοκυτταρικά αντιγόνα (Human Leukocyte Antigens) HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA- E και HLA-G (τα σωματικά κύτταρα εκφράζουν τα HLA A-Ε, ενώ τα HLA-G εντοπίζονται στον πλακούντα), β) μετάγραφα όμοια των ανοσοσφαιρινών (ILTs) ή υποδοχείς όμοιων των λευκοκυτταρικών ανοσοσφαιρινών (LILRs) και γ) υποδοχείς όμοιων των φονικών ανοσοσφαιρινών (KIRs), οι οποίοι κατά κύριο λόγο, αναγνωρίζουν τα HLA-B και HLA-C (Chávez-Galán et al., 2009; Moretta et al., 2008; b Cooper et al., 2001). Τα ανθρώπινα ΝΚ υποσύνολα διαφέρουν ως προς την έκφραση των NKRs, συμπεριλαμβανομένου των KIRs, το ετεροδιμερές CD94-NKG2A και το ILT-2. Τα CD56 bright έχουν χαμηλή έκφραση ή καθόλου των υποδοχέων KIRs και ILT-2 (ανασταλτικοί υποδοχείς), αλλά υψηλή πυκνότητα έκφρασης των υποδοχέων CD94-NKG2A (επίσης ανασταλτικοί υποδοχείς), ενώ ισχύει το αντίθετο για τα CD56 dim. Το διεγερτικό υποδοχέα NKG2D, ο οποίος αναγνωρίζει τις στρεσογόνες πρωτεΐνες MICA και MICB που παράγονται από το MHC τάξης I (Major Hystocompability Complex, MHC; Cell stress-induced MHC class I-related chain A and B, MIC proteins) και την UL- 16 (δεσμευτική πρωτεΐνη), τον εκφράζουν και τα δύο υποσύνολα. Στην κυτταρική επιφάνεια των ΝΚ εκφράζονται, επίσης, υποδοχείς κυτταροκινών και χυμοκινών. Όλα τα ΝΚ κύτταρα εκφράζουν έναν λειτουργικό ετεροδιμερή υποδοχέα της Ιντερλευκίνης 2 (IL-2Rβγ), με ενδιάμεση συγγένεια για την IL-2. Τα CD56 bright είναι ο μόνος υποπληθυσμός λεμφοκυττάρων που εκφράζει συστηματικά υψηλής συγγένειας ετεροτριμερών IL- 2R (IL-2Rαβγ). Το γεγονός αυτό επιτρέπει στα CD56 bright να ανταποκρίνονται στο ερέθισμα της IL-2 και να πολλαπλασιάζονται ακόμα και εάν αυτή βρίσκεται σε πάρα πολύ μικρές συγκεντρώσεις στον οργανισμό (picomolar). Επιπλέον, τα CD56 bright εκφράζουν συστηματικά και τον υποδοχέα c-kit, ο οποίος έχει δράση κινάσης τυρισίνης και ενισχύει το σήμα της IL-2 για πολλαπλασιασμό και επιβίωση. Αντίθετα, τα ανενεργά CD56 dim εκφράζουν μόνο τον υποδοχέα IL-2Rβγ, είναι c-kit - και δείχνουν να μην πολλαπλασιάζονται σε υψηλές δόσεις IL-2 (1-10nM) in vitro. Τέλος, στην επιφάνεια των ΝΚ βρίσκονται συστηματικά και υποδοχείς των κυτταροκινών, IL-1, IL-10, IL-12, 12

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ IL-15 και IL-18 ( b Cooper et al., 2001). Όσον αφορά την έκφραση υποδοχέων των χυμοκινών, οι υποπληθυσμοί των ΝΚ παρουσιάζουν, επίσης, διαφορές. Τα CD56 bright εκφράζουν το λειτουργικό CC υποδοχέα 7 (CCR7, CC-chemokine receptor 7), ένα μόριο το οποίο εμπλέκεται στην καθοδήγηση των Τ λεμφοκυττάρων προς τα δευτερογενή λεμφοειδή όργανα μέσω των ενδοθηλιακών φλεβιδίων, ενώ τα CD56 dim εκφράζουν έντονα τους CX3CR1 (CX3C-chemokine receptor 1) και CX3CR3, των οποίων η IL -18 και η φρακταλκίνη, αντίστοιχα, αποτελούν τους κύριους προσδέτες τους ( b Cooper et al., 2001). Πίνακας 1.1: Διαφορετική έκφραση αντιγόνων ανενεργών ανθρώπινων ΝΚ υποπληθυσμών 1 ( b Cooper et al., 2001) NKRS CD56 bright CD56 dim CD56 ++ β (+) γ CD56 /+ δ ++ Υποδοχείς ΝΚ KIR /+ ++ CD94 ++ /+ NKG2A + ε /+ ILT-2 στ + Υποδοχείς Κυτταροκινών και Χυμοκινών IL-2Rαβγ + - IL-2Rβγ + + c-kit + - IL-1RAcP + + IL-1RI + /+ IL-18R + ζ /+ CCR7 ++ - CXCR3 + /+ CXCR1 - ++ CX 3 CR1 - ++ Μόρια Προσκόλλησης CD2 ++ + L- selectin (CD62L) ++ /+ PEN5 PSGL-1 - + LFA-1 (+) ++ CD44 ++ + CD49e ++ + 1β Αναφέρεται υψηλή πυκνότητα έκφρασης γ Αναφέρεται χαμηλή πυκνότητα έκφρασης δ Αναφέρεται ποικίλη πυκνότητα έκφρασης ε Αναφέρεται πως η πλειοψηφία των μορίων εκφράζουν αυτό το μόριο στ Δεν εκφράζεται ζ Η έκφραση του IL-18R υπερεκφράζεται σε ενεργοποιημένα CD56 bright 13

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ 2.2. ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΤΩΝ ΝΚ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 2.2.1. ΚΥΤΤΑΡΟΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ Τα ΝΚ κύτταρα, όπως προαναφέρθηκε, έχουν την ικανότητα να θανατώνουν καρκινικά και προσβεβλημένα κύτταρα από ιούς και παράσιτα, αποτελώντας έτσι έναν σημαντικό μηχανισμό του εγγενούς ανοσοποιητικού συστήματος. Ο μηχανισμός δράσης τους ομοιάζει με αυτόν των Τ κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων, αλλά στερούνται, στην κυτταρική τους επιφάνεια, ειδικούς υποδοχείς αντιγόνων, όπως τα Τ και Β λεμφοκύτταρα. Από πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε μοντέλα ποντικών, έπειτα από απόρριψη μοσχεύματος του μυελού των οστών, προτάθηκε η άποψη ότι τα ΝΚ μπορούν να θανατώσουν οποιοδήποτε στόχο στερείται την έκφραση μορίων της τάξης Ι του κύριου συμπλόκου ιστοσυμβατότητας. Η υπόθεση αυτή είναι γνωστή ως «missing self» hypothesis (Caligiuri, 2008; Ljunggren & Karre, 1990; Cudkowicz & Bennett, 1971). Η ισορροπία των σημάτων που προέρχονται από τους ανασταλτικούς και διεγερτικούς υποδοχείς καθορίζει την έκβαση της λειτουργίας των ΝΚ κυττάρων. Στα υγιή κύτταρα, οι ανασταλτικοί υποδοχείς των ΝΚ κυττάρων αλληλεπιδρούν με τα αντιγόνα του MHC Ι, με αποτέλεσμα να αποτρέπεται η επίθεση των ΝΚ προς αυτά. Απώλεια των μορίων MHC Ι από τα κύτταρα, λόγω μόλυνσης ή καρκινικού μετασχηματισμού, μπορεί να οδηγήσει στην ενεργοποίηση των ΝΚ, όπως προτείνεται από την υπόθεση «missing self» υπό την προϋπόθεση, όμως ότι συμμετέχουν και οι ενεργοποιητικοί υποδοχείς (Moretta et al., 2008). Η κυτταροτοξική δράση επέρχεται με την απελευθέρωση κυτταροπλασματικών πρωτεϊνικών κοκκίων, όπως η περφορίνη, τα γκρανζένζυμα και η γρανολυσίνη (perforin, granzymes, granolysin). Κατά την έναρξη της διαδικασίας αυτής, καταγράφεται μια κινητοποίηση των μικροσωληνίσκων, όπου μεταφέρονται τα προσχηματισμένα κοκκία ή τα λυσοσώματα, από το εσωτερικό των ΝΚ προς το σημείο της ανοσολογικής σύναψης (Chávez-Galán et al., 2009). Η περφορίνη έχει ως στόχο να δημιουργήσει πόρους στην κυτταρική μεμβράνη των καρκινικών ή μολυσμένων από παθογόνους μικροοργανισμούς κύτταρων, έτσι ώστε τα κύτταρα στόχοι να οδηγηθούν στη λύση. Εντός των κυστιδίων, η περφορίνη απαντάται ως μονομερές. Μόλις πραγματοποιηθεί η ανοσολογική σύναψη, απελευθερώνεται με εξωκυττάρωση και από τη στιγμή που θα εντοπίσει την κυτταρική επιφάνεια του στόχου, αρχίζει τον πολυμερισμό της παρουσία ιόντων Ca 2+ (Voskoboinik et al., 2005; Chávez-Galán et al., 2009). Το αποτέλεσμα του πολυμερισμού της περφορίνης, είναι η δημιουργία κυλινδρικών πόρων, με εσωτερική διάμετρο 5-20 14

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ nm, εξυπηρετώντας αφενός, να εισχωρήσουν παθητικά στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου-στόχου οι πρωτεάσες (γκρανζένζυμα και γρανολυσίνη) και αφετέρου να δημιουργηθεί μια ωσμωτική ανισορροπία προερχόμενη από την ανταλλαγή ιόντων. Οι πρωτεάσες, οδηγούν το κύτταρο στο θάνατο μέσω της διαδικασίας της απόπτωσης (προγραμματισμένος θάνατος). Τα γρανζένζυμα Α και Β απαντώνται σε μεγάλες συγκεντρώσεις εντός των κυτταροτοξικών και απελευθερώνονται ως ένα πολυμοριακό σύμπλοκο, προκαλώντας απόπτωση στο κύτταρο-στόχο μέσω μονοπατιών εξαρτώμενων και μη των κασπασών (Chávez-Galán et al., 2009; Waterhouse et al.2006). Εικόνα 1.4: Σχηματική αναπαράσταση των υποδοχέων των ΝΚ κυττάρων και του τρόπου θανάτωσης των καρκινικών κυττάρων. Τα φυσιολογικά κύτταρα δεν θανατώνονται από τα ΝΚ κύτταρα λόγω ότι τα ανασταλτικά σήματα που δέχονται από τα αντιγόνα ιστοσυμβατότητας τάξης Ι (MHC class I) υπερισχύουν των σημάτων των ενεργοποιητικών υποδοχέων. Στην περίπτωση των καρκινικών ή μολυσμένων κυττάρων από μικροοργανισμούς, η μειωμένη έκφραση ή η αλλοίωση των αντιγόνων MHC Ι, διακόπτει τα ανασταλτικά σήματα, επιτρέποντας την ενεργοποίηση των ΝΚ κυττάρων και τη λύση των κυττάρων στόχων. 15

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ένας άλλος τρόπος που μπορούν να ενεργοποιηθούν τα ΝΚ και να καταστούν ικανά ώστε να θανατώσουν το κύτταρο-στόχο, είναι μέσω αντισωμάτων (ADCC, Antigen Depended Cell-mediated Cytotoxicity). Τα ΝΚ εκφράζουν στην επιφάνεια τους το CD16 (FcγRIII), ο οποίος είναι υποδοχέας Fc. Ο FcγRIII περιέχει στην κυτταροπλασματική του μεριά ένα ανοσολογικό ενεργοποιητικό μοτίβο τυροσίνης (ITAM, Immunotyrosine Activating Motif). Αυτός ο υποδοχέας, αναγνωρίζει και δεσμεύει, το τμήμα FC του αντισώματος, πχ ενός IgG, όπου έχει δεσμευτεί στην επιφάνεια ενός μολυσμένου κύτταρου-στόχου. Μόλις ο υποδοχέας FcγRIII συνδεθεί με το αντίσωμα, τα ΝΚ, άμεσα, ενεργοποιούνται με αποτέλεσμα να εκκρίνουν κυτταροκίνες όπως η IFN-γ και να εξωκυτταρώνουν τα κυτταροτοξικά κοκκία, οδηγώντας το κύτταρο στόχο στο θάνατο (Sondel & Alderson,2011). Εικόνα 1.5: Κυτταροτοξικότητα εξαρτώμενη από τα αντισώματα (ADCC) 2.2.2. ΕΚΚΡΙΣΗ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΚΑΙ ΧΥΜΟΚΙΝΩΝ Οι κυτταροκίνες είναι μικρού μοριακού βάρους, συχνά γλυκοζυλιωμένες πρωτεΐνες. Αν και δομικά παρουσιάζουν εξαιρετική ποικιλία μοιράζονται ορισμένα κοινά χαρακτηριστικά: α) συμμετέχουν στην εκτελεστική φάση τόσο της ειδικής όσο και της επίκτητης ανοσίας, β) κάθε κυτταροκίνη παράγεται από πολλαπλούς κυτταρικούς τύπους, γ) οι δράσεις τους είναι συχνά πλειοτροπικές και μη αποκλειστικές (με τον όρο πλειοτροπισμός, αναφέρεται η ικανότητα κάθε κυτταροκίνης να δρα σε ποικίλους διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους προκαλώντας διαφορετικές βιολογικές δράσεις), δ) 16

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ δρουν ανταγωνιστικά, προσθετικά ή συνεργικά και ε) η δράση τους είναι αυτοκρινής, ενδοκρινής ή παρακρινής (Abbas &, Lichtman, 2003). Οι χυμοκίνες αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια κυτταροκινών με χαρακτηριστική κοινή ιδιότητα την ικανότητα να προκαλούν χημειοταξία των κυττάρων που φέρουν τους υποδοχείς τους. Ανάλογα με τη δομή του μορίου τους (αριθμός καταλοίπων κυστεΐνης) κατατάσσονται σε 4 οικογένειες: στις C χυμοκίνες (ένας δισουλφιδικός δεσμός μεταξύ κυστεΐνών) π.χ. λυμφοτακτίνη, στις CC χυμοκίνες (δύο δισουλφιδικοί δεσμοί μεταξύ κυστεΐνών) π.χ. RANTES, MCP-1, 2, 3, 4 κ.ά., στις CXC χυμοκίνες (δύο δισουλφιδικοί δεσμοί μεταξύ κυστεΐνών, μεταξύ των γειτονικών καταλοίπων παρεμβάλλεται κατάλοιπο διαφορετικού αμινοξέος) π.χ. IL-8, SDF-1 κ.ά. και τέλος, στις CX3C χυμοκίνες (δύο δισουλφιδικοί δεσμοί μεταξύ κυστεΐνών, μεταξύ των γειτονικών καταλοίπων παρεμβάλλονται 3 κατάλοιπα διαφορετικού αμινοξέος) π.χ. η φρακταλκίνη (Moser et al. 2004) Σε μοριακό επίπεδο, οι κυτταροκίνες που απελευθερώνονται από τα ΝΚ, δρουν στους διαμεμβρανικούς υποδοχείς στην επιφάνεια των κυττάρων. Η δέσμευση της κυττταροκίνης στον υποδοχέα της, ενεργοποιεί μια ενδοκυττάρια μεταγωγή σήματος, η οποία επάγει τη μεταγραφή γονιδίων και τη σύνθεση νέων κυτταρικών πρωτεϊνών. Τα μονοπάτια των περισσότερων υποδοχέων κυτταροκινών χρησιμοποιούν κινάσες της οικογένειας Janus (Jak), οι οποίες δρουν στους μεταγωγείς του σήματος και στους μεταγραφικούς ενεργοποιητές, συγκεκριμένα στις πρωτεΐνες της οικογένειας STAT. Όταν ενεργοποιηθεί ο υποδοχέας, η Jak κινάση φωσφορυλιώνει τις αντίστοιχες πρωτεΐνες STAT, προκαλώντας το διμερισμό τους και τη μετατόπισή τους στον πυρήνα, όπου επάγεται νέα μεταγραφή γονιδίων. Ο ουσιαστικός ρόλος των Jak και STAT πρωτεϊνών στην ανοσορύθμιση παρατηρείται σε άτομα με κληρονομική ανεπάρκεια των μορίων αυτών (Chaplin, 2010). Τα ανενεργά ώριμα ΝΚ κύτταρα εκφράζουν συνεχώς μετάγραφα για συγκεκριμένες κυτταροκίνες, όπως η Ιντερφερόνης γ (Interferon γ, IFN-γ) και έχουν στο εσωτερικό τους προσχηματισμένα κυτταρολυτικά ένζυμα (γκρανζένζυμα και περφορίνη), δείχνοντας πως είναι έτοιμα για κάθε ενδεχόμενη επίθεση σε κύτταρο στόχο. Παρόλο την ετοιμότητά τους, χρειάζονται ένα εξωτερικό ερέθισμα, πχ από άλλες κυτταροκίνες ή προφλεγμονώδους παράγοντες, για να καταστούν πλήρως ενεργά. Για το λόγο αυτό, στην επιφάνεια τους εκφράζουν υποδοχείς για πολλούς τύπους κυτταροκινών και χυμοκινών, έτσι ώστε ανταποκρινόμενα σε μια διέγερση από τις κυτταροκίνες, τα ΝΚ να είναι ικανά να παράγουν μεγάλες ποσότητες IFN-γ και άλλων μορίων που προέρχονται από αυτά, σε ταχύτατους ρυθμούς (Lanier, 2008). Η παραγωγή της IFN-γ από τα ΝΚ, 17

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ διαμορφώνει την ανοσολογική απόκριση των Th1 2 κυττάρων (T helper 1), ενεργοποιεί τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα με σκοπό την περεταίρω υπερέκφραση των MHC I, ενεργοποιεί τα μακροφάγα να θανατώσουν τα ενδοκυτταρικά παθογόνα και έχει αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα ως προς τα μετασχηματισμένα ιικά ή καρκινικά κύτταρα (Caligiuri, 2008). Τα CD56 bright CD16 - ΝΚ κύτταρα, είναι η κύρια πηγή παραγωγής κυτταροκινών, όπως της IFN-γ, του παράγοντα νέκρωσης όγκων (Tumor Necrosis Factor,TNF), των Ιντερλευκινών 10 και 13 (Interleukine IL-10, IL-13) και του παράγοντα διέγερσης κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων (GM- CSF). Αντίθετα, η έκκριση των χυμοκινών MIP-1, MIP-1β, και RANTES είναι ίδια έως και μεγαλύτερη στα CD56 dim (Spits & Di Santo, 2011; Fauriat et al., 2010; b Cooper et al., 2001). Σε παλιότερη αναφορά του Peritt και των συνεργατών του (1998), πρότειναν τον διαχωρισμό των ΝΚ κυττάρων σε δύο πληθυσμούς, ΝΚ1 και ΝΚ2, πληθυσμοί, οι οποίοι ως προς το προφίλ έκκρισης κυτταροκινών μοιάζουν με τα Th1 και Th2 αντίστοιχα. Συγκεκριμένα, καλλιέργησαν ανθρώπινα ΝΚ κύτταρα, παρουσία IL-12 ή IL-4 και παρατήρησαν ότι οι κυτταρικοί πληθυσμοί απέκτησαν μοτίβα έκκρισης κυτταροκινών παρόμοια με αυτά των Th1 και Th2 κυττάρων. Τα ΝΚ που καλλιεργήθηκαν παρουσία IL-12 (NK1) παρήγαγαν IL-10 και IFN-γ, ενώ τα ΝΚ2 (παρουσία IL-4) παρήγαγαν IL-5 και IL-13. Τα CD56 bright χρειάζονται ουσιαστικά δύο σήματα για την παραγωγή IFN-γ. Το ένα από αυτά, περιλαμβάνει σχεδόν πάντα την IL-12, ενώ το δεύτερο μπορεί να οφείλεται στην IL-1, IL-2, IL-15 ή της IL-18, ή ακόμα σε έναν διεγερτικό υποδοχέα, όπως τον CD16 (FcγRIII a) ή τον NKG2D (Caligiuri, 2008; Cooper et al., 2001). Ενδιαφέρον προκαλεί το γεγονός ότι ο διαφορετικός συνδυασμός των παραπάνω μονοκινών οδηγεί σε διαφορετική ποσότητα έκκρισης των κυτταροκινών που παράγονται από τα ΝΚ. Για παράδειγμα, το ερέθισμα της IL-12 σε συνδυασμό με την IL-18 έχει ως αποτέλεσμα τη βέλτιστη παραγωγή IFN-γ, το ερέθισμα της IL-15 σε συνδυασμό με την IL-18 του παράγοντα GM-CSF, ενώ η συνεργασία της IL-12 και της IL-15 επάγει την έκφραση υψηλότερων επιπέδων της IL-10 ( a Cooper et al., 2001). Κάθε μία από αυτές τις κυτταροκίνες μπορεί να απελευθερωθεί από τα μονοκύτταρα, τα μακροφάγα και τα δενδριτικά, μαζί με την IL-12, γεγονός που υποδηλώνει την αλληλεπίδραση μεταξύ των αντιγονοπαρουσιαστικών και ΝΚ κυττάρων, τα οποία μπορεί να εμφανιστούν κατά την πρώιμη ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού 2 Τα Th αποτελούν υποπληθυσμό των Τ λεμφοκυττάρων, τα οποία διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στο ανοσοποιητικό σύστημα, ιδιαίτερα στο προσαρμοστικό ανοσοποιητικό σύστημα. Αυτά τα κύτταρα δεν έχουν καμία κυτταροτοξική ή φαγοκυτταρική δραστηριότητα, αντιθέτως ενεργοποιούν και κατευθύνουν άλλα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, όπως τα Β και τα Τ κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα, καθώς και αυξάνουν τη βακτηριοκτόνο δράση των φαγοκυτταρικών πληθυσμών, όπως των μακροφάγων. 18

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ συστήματος. Η παραγωγή των κυτταροκινών και χυμοκινών από ΝΚ κύτταρα συμβαίνει εντός ολίγων λεπτών από τη συνδιέγερση των μονοκινών, διαφοροποιώντας τα από την καθυστερημένη αντίδραση των Τ λεμφοκυττάρων. Ο διαφορετικός συνδυασμός μονοκινών που περιγράφηκε παραπάνω, υποδεικνύει ότι η ποιοτική και ποσοτική παραγωγή των μονοκινών μετά από μόλυνση ενός ξενιστή είναι πιθανόν να σημαντική για τον καθορισμό της ανοσολογικής απάντησης των CD56 bright ΝΚ κυττάρων. 3. ΦΥΣΙΚΑ ΦΟΝΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ Τ (ΝΚΤ) Τα ΝΚΤ κύτταρα (Natural Killers T) αποτελούν ένα μοναδικό πληθυσμό των Τ κυττάρων με συνέκφραση δεικτών των ΝΚ κυττάρων, όπως είναι το ΝΚ1.1 (NKRP1C, CD161) και το Ly49, στα ποντίκια και το CD56 στον άνθρωπο. Σε αντίθεση με τα CD4 + και τα CD8 + T κύτταρα, τα ΝΚΤ αναγνωρίζουν τα αντιγονικά λιπίδια μέσω του αντιγονοπαρουσιαστικού μορίου CD1d (όμοιου των μορίων MHC I) (Hus et al., 2011). Τα ΝΚΤ κύτταρα χωρίζονται σε δύο πληθυσμούς, τα invariant ΝΚΤ κύτταρα (iνκτ, Τύπος Ι) που εκφράζουν αμετάβλητους TCR υποδοχείς και τα variant ΝΚΤ (τύπου ΙΙ ΝΚΤ), τα οποία εκφράζουν ποικίλους TCRs. Τα CD56 + CD3 + (NKT-like) δεν είναι κλασσικά invariant NKT αλλά ομοιάζουν στον αρχικό πληθυσμό inkt (Hus et al., 2011). Αποτελούν το 5-15% των Τ περιφερικών λεμφοκυττάρων του αίματος και το 50% στο συκώτι (Golden-Mason et al.,2007). Τα ΝΚΤ κύτταρα, φαίνεται να παίζουν ρόλο σε πολλές αντιδράσεις του ανοσοποιητικού, συμπεριλαμβανομένης της προστασίας έναντι μικροβιακών παθογόνων παραγόντων και του έλεγχου των αυτοάνοσων νοσημάτων. Είναι κύτταρα που παράγουν συνεχώς το mrna της INF- γ, αλλά όχι και την πρωτεΐνη. Έπειτα από την ενεργοποίηση του TCR, όμως, παράγονται μεγάλες ποσότητες προ- και αντι-φλεγμονωδών κυτταροκινών, όπως: IL-2, IFN-γ, TNF και IL-4 (Brigl et al., 2011). 19

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ 4. Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ NK ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Ο προστατευτικός ρόλος των ΝΚ είναι γνωστός έναντι των ιικών και ενδοκυτταρικών παρασιτικών λοιμώξεων. Μελέτες από διάφορα εργαστήρια έδειξαν ότι οι ιογενείς λοιμώξεις οδηγούν στον πολλαπλασιασμό των NK κυττάρων και στη στρατολόγησή τους προς τους προσβεβλημένους ιστούς. Επίσης, έδειξαν ότι τα ΝΚ που απομονώθηκαν μετά από μόλυνση με διάφορους ιούς είχαν αυξήσει την κυτταρολυτική τους δραστηριότητα in vitro ενάντια στα κύτταρα στόχους (Lanier, 2008). Η πρώτη αναφορά σχετικά με το ρόλο των ΝΚ κυττάρων κατά τη διάρκεια βακτηριακής μόλυνσης, σχετίζονταν με την ικανότητά τους να θανατώνουν μολυσμένα με Shigella flexneri κύτταρα HeLa (Klimpel et al., 1986). Ανάλογα αποτελέσματα αναφέρονταν και σε άλλες μελέτες, όπου τα ΝΚ να σκότωναν προσβεβλημένα μονοκύτταρα με Legionella pneumophila και Mycobacterium avium (Katz et al., 1990; Blanchard et al., 1987). Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι τα κύτταρα NK μπορούν να βοηθήσουν τα μακροφάγα, ώστε να αναστέλλουν την ανάπτυξη ή να θανατώνουν ενδοκυτταρικούς βάκκιλους, καθώς και το Mycobacterium lepraemurium (Denis et al., 1991; Bermudez et al., 1990). Οι Lapaque et al. (2009) έδειξαν ότι τα ΝΚ κύτταρα ενεργοποιούνται από τα μακροφάγα, με αποτέλεσμα να εκκρίνουν IFN-γ και να θανατώνουν τα προσβεβλημένα κύτταρα με Salmonella enterica με την απελευθέρωση των κυτταρολυτικών κοκκίων. Το γεγονός αυτό, δείχνει ότι η ενεργοποίηση των ΝΚ κυττάρων από τα μακροφάγα και τα ουδετερόφιλα μπορεί να τα καταστήσει ικανά να παράγουν IFN-γ ή να εκτελούν κυτταρολυτική δραστηριότητα. Σύμφωνα με την τρέχουσα βιβλιογραφία, για την ενεργοποίηση των ανθρώπινων ΝΚ, έτσι ώστε να επιτεθούν σε μολυσμένα κύτταρα από παράσιτα ή ενδοκυττάρια βακτήρια, προτείνεται ότι είναι απαραίτητοι οι εξής παράγοντες, α) η αλληλεπίδραση των ΝΚ με βοηθητικά κύτταρα μέσω επαφής (μακροφάγα, δενδριτικά κτλ), β) η παρουσία της IL-2 ή IL-15 και γ) η έκκριση, IL-12 και IL-18 από τα μακροφάγα. Παρόμοια αποτελέσματα, όμως έχουν δειχθεί και για την εξάλειψη των εξωκυτταρικών βακτηριακών παθογόνων (Lodoen et al., 2006). Πράγματι, in vitro μελέτες έχουν δείξει ότι κατά την κυτταροφαγία των εξωκυτταρικών παθογόνων βακτηρίων όπως της Escherichia coli και του Staphylococcus aureus, τα ανθρώπινα μονοκύτταρα ενεργοποιούν τα ΝΚ (Tran et al., 2003; Haller et al., 2002). Από την άλλη μεριά, άλλες ερευνητικές ομάδες έχουν δείξει ότι τα ΝΚ κύτταρα μπορούν να ενεργοποιηθούν άμεσα από τα βακτήρια ή από παράγωγά τους. Ως αισθητήρες των παθογόνων 20

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ μικροβιακών παραγόντων, τα κύτταρα του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος, είναι σε θέση να αναγνωρίσουν μοριακά πρότυπα από ενδοκυτταρικές δομές ή από κυτταρικούς υποδοχείς (MAMPs: Microbial -Associated Molecular Patterns, PAMPs: Pathogen-Associated Molecular Patterns). Στην κατηγορία των PAMPs, συμπεριλαμβάνονται η ενδοτοξίνη των Gram αρνητικών βακτηρίων, οι λιποπολυσακχαρίτες, (LPS), το λιποτειχοϊκό οξύ των Gram θετικών βακτηρίων και πολλά άλλα συστατικά (π.χ. λιποπρωτεΐνες, πρωτεΐνες εξωτερικής μεμβράνης, μαστίγια, βλεφαρίδες κτλ). Επιπλέον, στην ίδια κατηγορία ανήκουν και προϊόντα, όπως θραύσματα από DNA, RNA και πρωτεΐνες, οι οποίες έχουν προέλθει έπειτα από λύση βακτηρίων. Ο Staphylococcus aureus ή οι τοξίνες που παράγει το βακτήριο αυτό (Small et al., 2008; D'Orazio et al., 1995; Yoshihara et al., 1993) μπορούν να προκαλέσουν την απευθείας ενεργοποίηση των ΝΚ. Η στρεπτοκοκκική πυρετογόνος εξωτοξίνη Α (SPEA) και η σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Β (SEB), επάγουν την αύξηση της κυτταροτοξικής δράσης και την in vivo παραγωγή της IFN-γ από τα ΝΚ (D'Orazio et al., 1995; Sacks et al., 1991; Cavaillon et al., 1982). Οι τοξίνες αυτές είναι γνωστές και ως «σουπεραντιγόνα. Σε αντίθεση όμως, με τη SEB, μελέτες δείχνουν ότι τα NK κύτταρα δεν ενεργοποιούνται άμεσα από σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Α (SEA) και την λιστεριολυσίνη O (τοξίνη που παράγεται από τη Listeria monocytogenes) (Ami et al., 2002; Nomura et al., 2002; Lando et al.,1991). Επιπλέον, η εξωτοξίνη A που παράγεται από την Pseudomonas aeruginosa (PEA), φάνηκε να ενεργοποιεί την κυτταροτοξικότητα των κυττάρων ΝΚ in vivo, ενώ in vitro σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs 3 ), ανακαλύφθηκε ότι ασκεί ανασταλτική δράση ως προς τη λειτουργία των ΝΚ κυττάρων, εμποδίζοντας παραγωγή της IFN-γ και της κυτταροτοξικότητας (Mühlen et al., 2004; Michalkiewicz et al., 1999). Σημαντικό ρόλο, στην ενεργοποίηση των ΝΚ, απουσία βοηθητικών κυττάρων, παίζει η παρουσία υποδοχέων αναγνώρισης προτύπων στην επιφάνεια των ΝΚ, οι οποίοι ειδικά εντοπίζουν τα PAMPs. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν οι υποδοχείς όμοιοι των Toll και Nod (Toll-like receptors, TLRs και Nod-like receptors, NLRs). Οι TLRs εκφράζονται είτε στην επιφάνεια των κυττάρων (TLR1, 2, 4, 5, 6) ή εντός των ενδοσωμάτων (TLR3, 7, 8, 9), ενώ οι NLRs είναι κυτταροπλασματικοί αισθητήρες. Εκτός από την παραγωγή κυτταροκινών, η αλληλεπίδραση των διαφόρων PAMPs με τους αντίστοιχους TLRs ή NLRs, οδηγεί στην έναρξη πολλών ενδοκυττάριων οδών σηματοδότησης, που έχουν ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού και τα γονίδια φλεγμονής, συμπεριλαμβανομένων των συνδιεγερτικών μόριων, τα μόρια προσκόλλησης και 3 Περιφερικό μονοπύρηνο κύτταρο (PBMC), ονομάζεται κάθε κύτταρο του αίματος, το οποίο έχει στρογγυλό πυρήνα. Στα PBMCs ανήκουν τα λεμφοκύτταρα (Τ, Β και ΝΚ), τα μονοκύτταρα/μακροφάγα, καθώς επίσης τα δενδριτικά (αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα) και τα βασεόφιλα (κοκκιοκύτταρα). 21

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ τους αντιμικροβιακούς μεσολαβητές (Souza-Fonseca-Guimaraes et al., 2012). Η παρουσία όλων των TLRs μπορεί να αποδειχθεί έμμεσα, από την ενεργοποίηση των ΝΚ κυττάρων από TLR αγωνιστές. Για παράδειγμα, η flagellin, το σήμα του TLR5, είναι σε θέση να ευνοήσει τη στρατολόγηση των ΝΚ στους λεμφαδένες και να ρυθμίζει την έκφραση του CD69 σε αυτούς, να προκαλεί τον πολλαπλασιασμό και παραγωγή IFN-γ (Tsujimoto et al., 2005). Τα ΝΚ κύτταρα ανταποκρίνονται, επίσης, σε αντιφλεγμονώδεις μεσολαβητές όπως είναι η IL- 4 (Brady et al.,2010), η IL-10 (Scott et al.2006), ο TGFβ (Horwitz et al., 1999), ουσίες που αναστέλλουν τη δράση των ΝΚ. Σε ποντίκια, in vivo, παρεμπόδιση της IL-10 επανέφερε τη μειωμένη κατάσταση ανταπόκρισης των ΝΚ κυττάρων στους πνεύμονες και το συκώτι (Lassen et al., 2010; Chiu et al., 2008). Σε ασθενείς με χρόνια Ηπατίτιδα Β, με πειράματα ex vivo, αποκαταστάθηκε η τροποποιημένη ικανότητα των ΝΚ να παράγουν ΙFN- γ παρεμποδίζοντας τη δράση της IL-10 ή του TGFβ (Peppa et al., 2010). Παρόλα αυτά η IL-10, δεν αποτελεί πάντα άμεσο αναστολέα των ΝΚ κυττάρων. Να σημειωθεί, πως τα υποσύνολα των ΝΚ κυττάρων δεν έχουν ισοδύναμη αντιβακτηριακή δράση. Για παράδειγμα, οι Batoni et al. (2005) απέδειξαν ότι σε απάντηση στο βακτήριο Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin (BCG), τα ανθρώπινα NK CD56 bright κύτταρα ήταν εκείνα που εμπλέκονταν κυρίως στη παραγωγή της IFN-γ, ενώ το υποσύνολο CD56 dim περιείχε υψηλότερα επίπεδα της περφορίνης και granzyme Α. Επιπλέον, η διαφοροποίηση των κυττάρων ΝΚ και η λειτουργία τους επηρεάζεται από το περιβάλλον ιστού. Υπάρχει ειδικό κυτταρικό και μοριακό περιβάλλον στη μήτρα, το ήπαρ, το σπλήνα, τους πνεύμονες και στο αίμα που μπορεί να επηρεάζει τον ακριβή χαρακτήρα των ΝΚ κυττάρων. Επίσης, διαφορές έχουν παρατηρηθεί και μεταξύ των ειδών. Ωστόσο, πρέπει να αναφερθεί ότι οι περισσότερες μελέτες του ανθρώπου και των ΝΚ κυττάρων ποντικού προέρχονται από διαφορετικά τμήματα. Οι περισσότερες πληροφορίες για τα ανθρώπινα ΝΚ έχουν αποκτηθεί από το αίμα, ενώ για τα ΝΚ κύτταρα του ποντικού, ως επί το πλείστον, προέρχονται από τη σπλήνα. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι το περιβάλλον του αίματος στα ποντίκια και στον άνθρωπο είναι πολύ διαφορετικά. Το πλάσμα του ποντικού ευνοεί την ανθεκτικότητα των ζώων αυτών σε βακτηριακή λοίμωξη (Warren et al., 2010). 22

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 1.5: Ενεργοποίηση των ΝΚ κυττάρων από βακτηριακά PAMPs. Τα NK ενεργοποιούνται μέσα από ένα δίκτυο βοηθητικών κυττάρων, τα οποία ανιχνεύουν το παθογόνο βακτήριο συνδεόμενο με τα μοριακά μοντέλα (PAMPs). Η ενεργοποίηση των βοηθητικών κυττάρων οδηγεί στην παραγωγή των κυτταροκινών, οι οποίες συμβάλλουν στη λειτουργική ενεργοποίηση των ΝΚ κυττάρων, ενώ η άμεση αλληλεπίδραση των ΝΚ κυττάρων με τα PAMPs ενισχύει περαιτέρω τη δραστικότητά τους. Όλες οι κυτταροκίνες έχει αποδειχθεί ότι ενισχύουν τη δραστικότητα των ΝΚ, είτε μεμονωμένα είτε σε συνέργεια. Επιπλέον, αρνητικά σήματα μπορούν να επηρεάσουν τα ΝΚ, ώστε να ανασταλεί η λειτουργία τους είτε απευθείας π.χ. μέσω της IL-10 και του TGF ¾ που παράγονται από τα ρυθμιστικά Τ-κύτταρα (Tregs), των προσταγλανδινών και των γλυκοκορτικοειδών, είτε έμμεσα αναστέλλοντας τη λειτουργία των βοηθητικών κυττάρων. 23

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο : ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πίνακας1. 2: Δράση των ΝΚ κυττάρων παρουσία μικροοργανισμών (Τροποποιημένο από Souza-Fonseca-Guimaraes et al., 2012), MØ: Μονοκύτταρα ή μακροφάγα, Π: Ποντίκι, Α: Άνθρωπος ΒΑΚΤΗΡΙΑ Ή ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΑ PAMPs ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΕΙΔΟΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΑΣ ΝΚ ΚΥΤΤΑΡΩΝ/ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ L.pneumonophila MØ or IL-2 Π Κυτταροτοξικότητα/Παραγωγή IFN-γ Blanchard et al., Infect. Immun. 1988, 56, 1187 LPS PBMC Α Κυτταροτοξικότητα Conti et al., J. Immunol. 1991, 73, 450 S.aureus PBMC Α Παραγωγή IFN-γ/ Έκφραση CD25, CD69 Yoshihara et al.,1993 L.monocytogenes SCID σπληνοκύτταρα + περιτοναϊκά MØ Π Παραγωγή IFN-γ Tripp et al., PNAS 1993, 90, 3725 L.monocytogenes In vivo Π Παραγωγή IFN-γ Thäle et al., Immunobiol. 2005, 210, 673 Mycobacterium bovis BCG Κύτταρα σπλήνας Π Παραγωγή IFN-γ Yang et al., J. Immunol. 1995, 155, 5728 E.coli, Lactobacillus + MØ Α Παραγωγή IFN-γ/ Έκφραση CD25, CD69/ Haller et al.,2000 Πολλαπλασιασμός Flagellin in vivo, Π Παραγωγή IFN-γ Tsujimoto et al., 2005 in vitro ± DC Lactobacillus casei + MØ ή IL-12 Α Κυτταροτοξικότητα Takeda et al., Clin. Exp. Immunol. 2006, 146, 109 M. tuberculosis IL-12 και επαφή με APC Α Παραγωγή IFN-γ Schierloh et al., Intern. Immunol. 2008, 20, 1155 Helicobacter pylori IL-12 Α Παραγωγή IFN-γ Lindgren et al., Innate Immun. 2010, 17, 191 Lactobacillus acidophilus PBMC Α Κυτταροτοξικότητα/ εξωκυττάρωση κοκκιοκυτάρων Cheon et al., Immunol. Let. 2011, 136, 171

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ 5. ΣΚΟΠΟΣ Οι περισσότερες μελέτες για τη λειτουργία των ΝΚ κυττάρων παρουσία ενδοκυτταρικών και εξωκυτταρικών μικροοργανισμών έχουν πραγματοποιηθεί σε ποντίκια. Λίγες πληροφορίες έχουν αποκτηθεί για τη δράση των ΝΚ σε ανθρώπινο αίμα. Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να μελετηθεί η έκκριση των κυτταροκινών, IFN-γ και TNF-α, από τα ανθρώπινα ΝΚ κύτταρα και να συγκριθεί με την έκκριση των ίδιων ουσιών από τα PBMCs, παρουσία ή απουσία IL-2, έπειτα από διέγερση με Gram θετικά και Gram αρνητικά βακτήρια, διαφορετικής μολυσματικότητας, σε χρονικό διάστημα 4 και 20 ωρών. 25

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 1. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Για το σκοπό της παρούσας διπλωματικής εργασίας πραγματοποιήθηκαν τα εξής πειραματικά πρωτόκολλα, εν συντομία. Στη συνέχεια του κεφαλαίου, αναλύονται διεξοδικά. Περιφερικό αίμα, συλλέχθηκε από έξι εθελοντές υγιείς δότες, σε ειδικά σωληνάκια ηπαρίνης. Τα δείγματα μεταφέρθηκαν, άμεσα, στο εργαστήριο, όπου έγινε η επεξεργασία τους. Τα περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα (PBMCs) απομονώθηκαν σε βαθμίδωση φικόλλης και ακολούθησε καλλιέργεια των κυττάρων σε συγκέντρωση 10 6 κύτταρα/ml, παρουσία ή απουσία IL-2 για 18 ώρες. Επιπλέον, καθαρός πληθυσμός ΝΚ κυττάρων απομονώθηκε με κυτταρομετρία ροής δύο χρωμάτων και ακολούθησαν καλλιέργειες των κυττάρων σε συνθήκες ίδιες με τα PBMCs. Στη συνέχεια, ακολούθησε διέγερση των κυττάρων με διάφορα στελέχη μικροοργανισμών σε αναλογία κυττάρων 10:1 (ως προς τα ΝΚ κύτταρα) για 4 και 20 ώρες. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και προσδιορίστηκε η έκκριση των κυτταροκινών IFN-γ και TNF-α με τη μέθοδο CBA (Cytometric Bead Array). 26

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ 1.1. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΟΝΟΠΥΡΗΝΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ (PBMCS) ΑΠΟ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟ ΑΙΜΑ Πίνακας 2.1: Υλικά για την απομόνωση των μονοπύρηνων κυττάρων από το περιφερειακό αίμα και καθαρού πληθυσμού ΝΚ κυττάρων ΥΛΙΚΟ-ΑΝΑΛΩΣΙΜΟ Διάλυμα Φικόλλης Καλλιεργητικό υλικό RPMI 1640 (2mΜ L-glutamine,10mM HEPES) Πλήρες καλλιεργητικό υλικό Καλλιεργητικό υλικό RPMI 1640 (2mΜ L- glutamine,10mm HEPES) 10% FBS 5x10-5 molar 2-Mercaptethanol Διάλυμα PBS Διάλυμα PBS 2% FBS Mouse Anti-Human CD56:RPE Mouse Anti-Human CD3:RPE-Cy5 ΚΩΔΙΚΟΣ-ΕΤΑΙΡΕΙΑ L6113 (Biochrom, 100ml) FG 1385 (Biochrom, 500ml) FG 1385 (Biochrom, 500ml) F0113 (Biochrom, 100ml) Applicem, 25ml 524650 (Calbiochem) 524650 (Calbiochem) F0113 (Biochrom, 100ml) MCA1435PE (AbD serotec, 1ml) MCA463C (AbD serotec, 1ml) Η απομόνωση των μονοπύρηνων κυττάρων από το περιφερειακό αίμα έγινε με φυγοκέντρηση σε βαθμίδωση φικόλλης. Σε αποστειρωμένους σωλήνες τύπου Falcon, προστέθηκε διάλυμα φικόλλης, σε όγκο τέτοιο ώστε να αποτελεί το 1/3 του συνολικού όγκου αίματος και ακολούθησε η προσθήκη του αίματος με πολύ αργές και απαλές κινήσεις. Στη συνέχεια, το δείγμα φυγοκεντρήθηκε στις 2500 rpm για 30 min χωρίς φρένο 4. Με αποστειρωμένες πιππέτες Pasteur, απομακρύνθηκε, όσον το δυνατόν περισσότερος όγκος πλάσματος, και προσεχτικά συλλέχθηκε το στρώμα με τα περιφερειακά μονοπύρηνα. Τα περιφερειακά μονοπύρηνα μεταφέρθηκαν σε καινούργιους αποστειρωμένους σωλήνες τύπου Falcon και απομακρύνθηκε το εναπομένον δείγμα (φικόλλη- ερυθρά αιμοσφαίρια) σε ειδικό κάδο μολυσματικών απορριμμάτων. Ακολούθησαν δύο πλύσεις με διάλυμα PBS ( 4 Σημείωση: Το αποτέλεσμα της φυγοκέντρησης χωρίς τη χρήση φρένου, είναι η δημιουργία στρωμάτων των συστατικών του αίματος διαφορετικής πυκνότητας (layers). Τα στρώματα που προκύπτουν είναι αντίστοιχα από πάνω προς τα κάτω: Πλάσμα και αιμοπετάλια- περιφερειακά μονοπύρηνα - Φικόλλη - ερυθρά αιμοσφαίρια (με κοκκιοκύτταρα), όπως φαίνονται στην Εικόνα 2.1. 27

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ φυγοκέντρηση στις 1800 rpm για 10 min με φρένο). Τέλος, απομακρύνθηκε το υπερκείμενο και το ίζημα αναδιαλύθηκε σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό RPMI 1640, όπου ο αριθμός κυττάρων εκτιμήθηκε με τη χρήση του αιματοκυτταρόμετρου. Το πλήρες καλλιεργητικό μέσο, το οποίο περιείχε τα μονοπύρηνα, στη συνέχεια διαμοιράστηκε σε ίσους όγκους σε τρυβλία 24 κελιών, με επιθυμητή συγκέντρωση των μονοπύρηνων κυττάρων ανά κελί 10 6 κύτταρα/ ml. Επειδή ο σκοπός της εργασίας μας ήταν να μετρηθεί η παραγωγή κυτταροκινών, δεν προστέθηκαν στην καλλιέργεια αντιβιοτικά. Εικόνα 2.1: Απομόνωση Περιφερικών Μονοπύρηνων κυττάρων μετά από φυγοκέντρηση σε βαθμίδωση Φικόλλης Εικόνα 2.2: Χρήση αιματοκυτταρόμετρου. Για τη μέτρηση των κυττάρων απαιτούνται 10 λ δείγματος. Με τη χρήση μικροσκοπίου έγινε η μέτρηση των κυττάρων στα 25 κεντρικά τετράγωνα, Ο αριθμός των κυττάρων, στη συνέχεια πολλαπλασιάστηκε με το 10 4 κύτταρα/ ml. 1.2. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΝΚ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ PBMCS Η απομόνωση του καθαρού πληθυσμού των ΝΚ πραγματοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής δύο χρωμάτων (Βλ. Αρχή της μεθόδου στο Παράρτημα ΙΙΙ). Αρχικά συλλέχθηκαν 30 ml περιφερικού αίματος. Ακολούθησε απομόνωση των μονοπύρηνων κυττάρων με φυγοκέντρηση σε βαθμίδωση φικόλλης, όπως προαναφέρθηκε στην παράγραφο 1.1. με την εξής τροποποίηση. Το ίζημα μετά τις πλύσεις επαναιωρήθηκε σε διάλυμα PBS, σε όγκο τέτοιο ώστε η μέγιστη συγκέντρωση κυττάρων να ήταν 10 7 κύτταρα/ ml. Το δείγμα, φυγοκεντρήθηκε, στις 2500 rpm για 7 min και αναδιαλύθηκε σε 100λ PBS. Έπειτα, ακολούθησε η διαδικασία χρώσης των κυττάρων με μονοκλωνικά αντισωμάτα 28

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ CD56 RPE και CD3 RPE-Cy5, στο σκοτάδι για 20 min. Ακολούθησε πλύση με διάλυμα PBS 2% FBS. Ο διαχωρισμός των πληθυσμών πραγματοποιήθηκε στον κυτταρομετρητή FACSVantage S.E. με το πρόγραμμα Cell Quest, με καθαρότητα του κυτταρικού πληθυσμού CD56 + CD3 - μεγαλύτερη του 90%. Τέλος ακολούθησε πλύση κυττάρων και επανααιώρηση σε πλήρες καλλιεργητικό μέσο RPMI 1640, απουσία αντιβιωτικών. Εικόνα 2.3: Ενδεικτική εικόνα καθαρότητας απομονωμένου πληθυσμού ΝΚ κυττάρων από PBMCs, με κυτταρομετρία ροής δύο χρωμάτων (CD56 RPE, CD3 RPE-Cy5). Ο διαχωρισμός των κυττάρων πραγματοποιήθηκε στον κυτταρομετρητή FACSVantage S.E. με το πρόγραμμα Cell Quest 29

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ 1.3. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ PBMCS KAI NK KYΤΤΑΡΩΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ Ή ΑΠΟΥΣΙΑ IL-2 Πίνακας 2.2: Υλικά για καλλιέργειες μονοπύρηνων κυττάρων ΥΛΙΚΟ-ΑΝΑΛΩΣΙΜΟ Πλήρες καλλιεργητικό υλικό Καλλιεργητικό υλικό RPMI 1640 (2mΜ L- glutamine,10mm HEPES) 10% FBS 5x10-5 molar 2-Mercaptethanol Ανθρώπινη ανασυνδυασμένη Ιντερλευκίνη 2 ΚΩΔΙΚΟΣ-ΕΤΑΙΡΕΙΑ FG 1385 (Biochrom, 500ml) F0113 (Biochrom, 100ml) Applicem, 25ml PHP-042A (AbD Serotec, 10mg) Σε τρυβλία των 24 κελιών, προστέθηκαν σε κάθε κελί, 10 6 περειφερικά μονοπύρηνα κύτταρα ανά ml πλήρους καλλιεργητικού μέσου RPMI 1640. Σε τρυβλια των 96 κελιών, προστέθηκαν σε κάθε κελί 10 5-10 4 περειφερικά μονοπύρηνα κύτταρα ανά 200λ πλήρους καλλιεργητικού μέσου RPMI 1640. Στα μισά κελιά, προστέθηκε ποσότητα ανθρώπινης ανασυνδυασμένης Ιντερλευκίνης 2 με ενεργότητα 10 3 U/ml. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 o C και ατμόσφαιρα 5% CO 2 για 18-24 ώρες, έτσι ώστε να μπορέσουν να πολλαπλασιαστούν και να εκτιμηθούν ποσοτικά την επόμενη ημέρα. 1.4. ΜΕΤΡΗΣΗ ΝΚ ΚΑΙ NKT ΟΜΟΙΩΝ (ΝΚΤ-LIKE) ΚΥΤΤΑΡΩΝ Πίνακας 2.3:Υλικά για τη μέτρηση ΝΚ και ΝΚΤ κυττάρων με κυτταρομετρία ροής ΥΛΙΚΟ-ΑΝΑΛΩΣΙΜΟ Mouse Anti-Human CD56:RPE Mouse Anti-Human CE3:RPE-Cy5 Διάλυμα PBS Διάλυμα PBS 2% FBS ΚΩΔΙΚΟΣ-ΕΤΑΙΡΕΙΑ MCA1435PE (AbD serotec, 1ml) MCA463C (AbD serotec, 1ml) 524650 (Calbiochem) 524650 (Calbiochem) F0113 (Biochrom, 100ml) 30

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Τα ποσοστά των ΝΚ και ΝΚΤ-like κυττάρων, αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα έναντι των επιφανειακών δεικτών CD56 και CD3. Αρχικά, συλλέχθηκε ποσότητα από τη καλλιέργεια των περιφερικών μονοπύρηνων κυττάρων (PBMCs), σε σωλήνες τύπου eppendorf χωρητικότητας 1,5 ml και το δείγμα φυγοκεντρήθηκε στις 2.500 rpm για 7 min. Το υπερκείμενο φυλάχθηκε στους -70 o C για τον μετέπειτα ποσοτικό προσδιορισμό των κυτταροκινών. Το ίζημα αναδιαλύθηκε σε 1 ml PBS, μεταφέρθηκε σε σωλήνες τύπου RIA και φυγοκεντρήθηκε ξανά. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και επαναδιαλύθηκε σε 100 λ PBS. Ακολούθησε χρώση με μονοκλωνικά αντισώματα CD56 PE και CD3 PC5, στο σκοτάδι για 20 min. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε πλύση με PBS και φυγοκέντρηση στις 2500 rpm για 7 min. Μετά την επαναδιάλυση του δείγματος σε PBS, ακολούθησε μέτρηση των κυττάρων στον κυτταρομετρητή (COULTER EpicsXL. MCL) και ερμηνεία των αποτελεσμάτων με το λογισμικό πρόγραμμα FlowJo 7.6.5. Δέκα με είκοσι χιλιάδες συμβάντα αποκτήθηκαν για τον προσδιορισμό των CD56 + CD3 - και των CD56 + CD3 + κυττάρων. 1.5. ΣΤΕΛΕΧΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Πίνακας 4: Στελέχη μικροοργανισμών που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία και υλικά αναζωογόνησης ΥΛΙΚΟ-ΑΝΑΛΩΣΙΜΟ ΚΩΔΙΚΟΣ-ΕΤΑΙΡΕΙΑ Escherichia coli NCTC 9001 (HPA), 1.43 Pseudomonas aeruginosa NCTC 10662 (HPA) Staphylococcus aureus NCTC 6571 (HPA) Listeria monocytogenes NCTC 11994 (HPA) Peptone Saline (Bacteriological Peptone, LP0037, LP0005 (OXOID) Sodium chloride) PBS 524650 (Calbiochem) 31

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν οι μικροοργανισμοί Escherichia coli (EC), Pseudomonas aeruginosa (PA), Staphylococcus aureus (SA) και Listeria monocytogenes (LM). Οι μικροοργανισμοί προμηθεύτηκαν από το HPA (Health Protection Agency) και αποτελούν μικροβιολογικά πρότυπα αναφοράς, γνωστής συγκέντρωσης. Τα βακτήρια αναζωογονήθηκαν σε αποστειρωμένο μη εκλεκτικό ισότονο διάλυμα (Peptone Saline) για 15 min. Ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 3000 στροφές/λεπτό και πλύση με διάλυμα PBS. Τέλος, επαναδιαλύθηκαν σε 500λ πλήρους RPMI θρεπτικού υλικού. Τέλος, προστέθηκαν στις καλλιέργειες των PBMCs και των ΝΚ κυττάρων, σε αναλογία 10:1 (ΝΚ: Βακτήρια) ώστε να πραγματοποιηθεί διέγερση για 4 και 20 ώρες. 1.6. ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ IFN-Γ ΚΑΙ TNF-Α Πίνακας 2. 5: Υλικά για τον ποσοτικό προσδιορισμό κυτταροκινών με τη μέθοδο CBA ΥΛΙΚΟ-ΑΝΑΛΩΣΙΜΟ Human IFN-γ Flex Set Human TNF Flex Set Human Soluble Protein Master Bufffer Kit ΚΩΔΙΚΟΣ-ΕΤΑΙΡΕΙΑ 560111 (BD) 558273 (BD) 558264 (BD) Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των κυτταροκινών IFN-γ και TNF-α, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος CBA. Η αρχή της μεθόδου αναφέρεται στο Παράρτημα (Παράγραφος ΙV). Τα υπερκείμενα, τα οποία είχαν συλλεχθεί κατά τη διάρκεια των καλλιεργειών, χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνών (Παράγραφος 1.3 και 1.4). Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, ίσος όγκος δείγματος και σφαιριδίων, ειδικά για τις κυτταροκίνες IFN-γ και TNF-α, αναμίχθηκαν και επωάστηκαν για μία ώρα. Ακολούθησε προσθήκη διαλύματος φθορίζουσας χρωστικής και επώαση για 2 ώρες. Στη συνέχεια, προστέθηκε Wash buffer και ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 3000 rpm για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο, απομακρύνθηκε με πολύ προσοχή και το ίζημα επανδιαλύθηκε σε 300 μl Wash Buffer. Τα δείγματα αναλύθηκαν στον κυτταρομετρητή ροής (COULTER EpicsXL.MCL) και η ερμηνεία των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό πρόγραμμα FlowJo 7.6.5., όπου υπολογίστηκε η διάμεση τιμή του εκπεμπόμενου φθορισμού (Median Fluorescence Intensity, MFI). Η ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης της κάθε κυτταροκίνης έγινε βάση μιας πρότυπης καμπύλης 32