Νανοσωματίδια Αργύρου ως Επικαλύψεις σε Πολυμερικά Ικριώματα για Εφαρμογές σε Ορθοπεδικά Εμφυτεύματα

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΥΣΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΛΕΠΤΩΝ ΥΜΕΝΙΩΝ, ΝΑΝΟΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΝΑΝΟΜΕΤΡΟΛΟΓΙΑΣ (LTFN) ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΝΑΝΟΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΚΑΙ ΝΑΝΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΕΣ» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Νανοσωματίδια Αργύρου ως Επικαλύψεις σε Πολυμερικά Ικριώματα για Εφαρμογές σε Ορθοπεδικά Εμφυτεύματα ΠΕΡΛΗ ΜΑΡΙΑ - ΔΑΝΑΗ Διπλ. Χημικός Μηχανικός Επιβλέπων καθηγητής: Στέργιος Λογοθετίδης, Καθηγητής, Διευθυντής ΔΠΜΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ ΙΟΥΛΙΟΣ 2017 1

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε στο «Εργαστήριο Λεπτών Υμενίων Νανοσυστημάτων και Νανομετρολογίας LTFN» του τμήματος Φυσικής, της σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης στα πλαίσια του διατμηματικού μεταπτυχιακού προγράμματος σπουδών «Νανοεπιστήμες και Νανοτεχνολογίες», κατά την ακαδημαϊκή περίοδο 2015 2017. Για αυτό λοιπόν, θα ήθελα αρχικά να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στον κ. Λογοθετίδη Στέργιο, Καθηγητή του τμήματος Φυσικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης και διευθυντή του Διατμηματικού Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών Νανοεπιστήμες και Νανοτεχνολογίες (ΔΠΜΣ & ΝΝ) τόσο για την ευκαιρία που μου έδωσε για την ανάληψη της συγκεκριμένης εργασίας, όσο και για την καθοδήγηση και επίβλεψη του καθόλη τη διάρκεια εκπόνησής της. Θέλω επίσης να ευχαριστήσω την κ. Βαρβάρα Καραγκιοζάκη, Μεταδιδακτορική ερευνήτρια και Καρδιολόγο, για τις συμβουλές και την καθοδήγησή της καθόλη τη διάρκεια των πειραμάτων. Θερμές ευχαριστίες στην ομάδα του Εργαστηρίου, με πρώτη τη Φωτεινή Παππά για τις γνώσεις που μου μετέδωσε και την αμέριστη βοήθειά της καθόλη τη διάρκεια των πειραμάτων, τους κ. Χριστόφορο Γραβαλίδη, μεταδιδάκτορα ερευνητή του LTFN για τις μετρήσεις Περίθλασης Ακτινών Χ, τον Αλέξανδρο Ζαχαριάδη, απόφοιτο του μεταπτυχιακού προγράμματος, για τις μετρήσεις Διαπερατότητας καθώς και τον Γιάννη Μούτσιο, μεταπτυχιακό φοιτητή για τις μετρήσεις Ατομικής Μικροσκοπίας Δυνάμεων AFM, καθώς και την ομάδα της Αναπληρώτριας Καθηγήτριας κ. Παυλίδου Ελένης του τμήματος Φυσικής του Α.Π.Θ για τις μετρήσεις Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Σάρωσης SEM. Θέλω επίσης να ευχαριστήσω τις μεταπτυχιακές φοιτήτριες και φίλες μου Βερονίκη Μπακόλα και Ραφαηλία Αικατερίνη Τσιάπλα, για την πολύτιμη βοήθεια τους και στήριξή τους καθόλη τη διάρκεια της εκπόνησης αυτής της εργασίας, τις όμορφες στιγμές που περάσαμε μαζί αλλά και όλη την ομάδα του εργαστηρίου μας, Μαρίνα Γιαννούλη, Παναγιώτα Γκέρτσιου και Ζωή Δαρδάνη τόσο για τη βοήθειά τους, όσο και για το όμορφο και ευχάριστο κλίμα συνεργασίας. 2

Ακόμη, θα ήθελα να ευχαριστήσω την κ. Δωροθέα Καπουκρανίδου, επίκουρη καθηγήτρια Φυσιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης και την κ. Μελίνα Καχριμανίδου επίκουρη καθηγήτρια Μικροβιολογίας, επίσης της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ, για τη συνεισφορά τους στις αντιμικροβιακές μελέτες των δειγμάτων, καθώς και την υποψήφια Διδάκτορα κ. Μαρία Πίτου και την κ. Ελισάβετ Παπαδοπούλου για την πολύτιμη βοήθειά τους στις μελέτες κυτταροσυμβατότητας των δειγμάτων. Τέλος, θα ήθελα ιδιαιτέρως να ευχαριστήσω τον πατέρα μου και κυρίως την αδελφή μου για την υπομονή τους και τη πίστη τους σε εμένα διότι μου έδιναν κουράγιο και θέληση όταν εγώ η ίδια δεν μπορούσα και δεν ήθελα να πιστέψω στον εαυτό μου. Τους είμαι ευγνώμων και τους αγαπώ πολύ. Μαρία Δανάη Περλή, Θεσσαλονίκη Ιούλιος 2017 3

Στη μνήμη της πολυαγαπημένης μου μητέρας που της χρωστάω πάρα πολλά. 4

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η παρούσα διπλωματική εργασία έχει ως αντικείμενο μελέτης τη σύνθεση νανοσωματιδίων αργύρου, την επικάλυψή τους με χιτοζάνη και εν τέλει, την ενσωμάτωση τους σε νανοϊνώδη ικριώματα πολυκαπρολακτόνης (PCL) τα οποία αναπτύχθηκαν με τη μέθοδο της Ηλεκτροστατικής Ινοποίησης (Electrospinning System). Το αντικείμενο αυτής της μελέτης έχει ως σκοπό την εφαρμογή των ορθοπεδικών εμφυτευμάτων, στα πλαίσια της Αναγεννητικής Ιατρικής και της Ιστικής Μηχανικής για αξιοποίηση τόσο των νανοσωματιδίων όσο και των φυσικών πολυμερών στην αναγέννηση οστού. Ο άργυρος είναι γνωστός από αρκετές δεκαετίες πριν, για τις αντιμικροβιακές και βακτηριοκτόνες δράσεις του. Ειδικότερα, τα νανοσωματίδια αργύρου ενισχύουν αυτή την αντιμικροβιακή ευαισθησία, διότι όσο μικρότερο το μέγεθος τόσο μεγαλύτερη η επιφάνεια επαφής τους με αποτέλεσμα την καλύτερη πρόσδεση του αντιμικροβιακού παράγοντα με τον παθογόνο μικροοργανισμό. Από την άλλη πλευρά, η πολυκαπρολακτόνη είναι ένα συνθετικό, ημικρυσταλλικό βιοδιασπώμενο πολυμερές με αργό ρυθμό απελευθέρωσης. Τα χαρακτηριστικά αυτά, μαζί με τις μηχανικές ιδιότητες της σκληρότητας και ευκαμψίας καθιστούν το πολυμερές αυτό ιδανικό για κατασκευή ικριωμάτων που είναι άριστοι υποψήφιοι για ορθοπεδικές εφαρμογές και κατασκευή εμφυτευμάτων. Ο συνδυασμός των νανοσωματιδίων αργύρου και του πολυμερούς της πολυκαπρολακτόνης καθίσταται πολλά υποσχόμενος για τις παραπάνω εφαρμογές, καθώς τα νανοσωματίδια αυξάνουν την τραχύτητα και τη διαβρεξιμότητα των ικριωμάτων του πολυμερούς, και τα διαποτίζουν με την αντιμικροβιακή τους δράση. Συνεπώς, τα ικριώματα της πολυκαπρολακτόνης μαζί με τον άργυρο σε νανοφάση αποτελούν μια καινούργια προοπτική στον τομέα της Ιστικής Μηχανικής και της Αναγεννητικής Ιατρικής. Σκοπός της διπλωματικής αυτής είναι αρχικά η σύνθεση νανοσωματιδίων αργύρου με τη μέθοδο της νανοκαταβύθισης (nanoprecipitation) η οποία είναι μια μέθοδος γρήγορη και εύκολη στην εφαρμογή της κατά την οποία απομακρύνεται το επφανειδραστικό και γίνεται συλλογή των νανοσωματιδίων σε μορφή ιζήματος. Χρησιμοποιήθηκε ο νιτρικός άργυρος ως κύρια ουσία, ως επιφανειοδραστικό αλλά 5

και ως σταθεροποιητικό παράγοντα την πολυβινυλοπυρρολιδόνη και ως αναγωγικό μέσο το βοροϋδρίδιο νατρίου (NaBH 4 ). Το μέγεθος των νανοσωματιδίων μετρήθηκε με Ατομική Μικροσκοπία Δυνάμεων (AFM), ενώ η ταυτοποίηση της ύπαρξης του αργύρου στα νανοσωματίδια αξιολογήθηκε με Περίθλαση Ακτινών Χ (XRD) καθώς και με μετρήσεις Διαπερατότητας (Transmittance Measurements). Στη συνέχεια, έγινε επικάλυψη των νανοσωματιδίων με χιτοζάνη. Η χιτοζάνη είναι ένα γραμμικό κρυσταλλικό πολυμερές, η οποία σε συνδυασμό με τις ευέλικτες ιδιότητές της ως προς την κυτταρική πρόσφυση και την έκφραση του φαινοτύπου την καθιστούν ενδιαφέρουσα περίπτωση για ιατρικές εφαρμογές. Στην προκειμένη περίπτωση, χρησιμοποιήθηκε η χιτοζάνη χαμηλού μοριακού βάρους σε υδατικό διάλυμα οξικού οξέος για επικάλυψη των νανοσωματιδίων αργύρου. Αυτή η επικάλυψη συμβάλλει στην σταθεροποίηση των νανοσωματιδίων, στην αποτροπή συσσωμάτωσης και στην ελεγχόμενη απελευθέρωση του αντιμικροβιακού τους φορτίου. Κατόπιν, έγινε βελτιστοποίηση αυτής της επικάλυψης, δοκιμάζοντας τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις της χιτοζάνης. Έγινε διαπίστωση και επιβεβαίωση της επικάλυψης με Ατομική Μικροσκοπία Δυνάμεων όπου μετρήθηκε το μέγεθος των νεοσυντιθέμενων νανοσωματιδίων, με μετρήσεις Διαπερατότητας, με Περίθλαση Ακτινών Χ καθώς και με μετρήσεις ph. Στο δεύτερο σκέλος της διπλωματικής αυτής εργασίας μελετήθηκε η ανάπτυξη των νανοϊνωδών ικριωμάτων της πολυκαπρολακτόνης (PCL) 25% σε μίγμα χλωροφορμίου : μεθανόλης σε αναλογία 3:1 με τη μέθοδο της Ηλεκτροστατικής Ινοποίησης (Electrospinning System). Ο χαρακτηρισμός της μορφολογίας των ικριωμάτων έγινε τόσο με Ατομική Μικροσκοπία Δυνάμεων (AFM) όσο και με Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM) καθώς και Οπτικό Μικροσκόπιο και Γωνία Επαφής (Contact Angle). Στη συνέχεια έγινε ενσωμάτωση των νανοσωματιδίων αργύρου στα ικριώματα της πολυκαπρολακτόνης με τρεις διαφορετικές μεθόδους. Η πρώτη μέθοδος είναι η Drop Castingμε απευθείας χύτευση του διαλύματος των νανοσωματιδίων αργύρου με τη χρήση πιπέτας πάνω στα ικριώματα. Η δεύτερη μέθοδος αφορά τη χρήση της Ηλεκτροστατικής Ινοποίησης (Electrospinning System) με τη χρήση μιας σύριγγας όπου τοποθετήθηκε το διάλυμα των νανοσωματιδίων και με ρύθμιση των κατάλληλων παραμέτρων τάσης και ταχύτητας έγινε εναπόθεση των νανοσωματιδίων (Ηλεκτροψεκασμός) πάνω στις ίνες PCL. Η μελέτη της μορφολογίας των νέων ικριωμάτων μελετήθηκε 6

επίσης με Ατομική Μικροσκοπία Δυνάμεων (AFM) όσο και με Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM) καθώς και Οπτικό Μικροσκόπιο και Γωνία Επαφής (Contact Angle). Η τρίτη μέθοδος αφορά τη χρήση διπλής σύριγγας Ηλεκτροστατικής Ινοποίησης (Dual Syringe Electrospraying System) όπου στη μια σύριγγα τοποθετείται το διάλυμα των νανοσωματιδίων αργύρου και στην άλλη το διάλυμα της πολυκαπρολακτόνης 25%. Με ρύθμιση των κατάλληλων παραμέτρων έγινε ταυτόχρονη εναπόθεση και δημιουργία νανοσωματιδίων και ινών πάνω στο υπόστρωμα. Η αξιολόγηση των τελικών ικριωμάτων έγινε με Περίθλαση Ακτινών Χ (XRD), Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM) και με Γωνία Επαφής (Contact Angle). Τελικά, γίνεται σύγκριση των αναπτυχθέντων ικριωμάτων από τις τρεις αυτές μεθόδους. Επιλέχτηκε η μέθοδος Drop Casting ως βέλτιστη λόγω της εύκολης εφαρμογής της και λόγω της καλύτερης εναπόθεσης των νανοσωματιδίων πάνω στις ίνες για μελέτη των αντιμικροβιακών ιδιοτήτων των ικριωμάτων χωρίς να επηρεάζεται το δίκτυο και η καλή μορφολογία των ινών του πολυμερούς. Εφαρμόστηκε η μέθοδος Contact Angle για μελέτη της υδροφιλικότητας ή υδροφοβικότητας των ικριωμάτων της πολυκαπρολακτόνης σε συνδυασμό με τον εμπλουτισμό τους με τα νανοσωματίδια αργύρου με τις τρεις διαφορετικές προαναφερθείσες τεχνικές. Κατόπιν τα νανοσωματίδια αργύρου όσο και εκείνα με επικάλυψη με χιτοζάνη συντέθηκαν χρησιμοποιώντας μια μέση και μια υψηλή συγκέντρωση η οποία αφορά ουσιαστικά τη μέγιστη συγκέντρωση των νανοσωματιδίων που μπορεί να σκοτώσει βακτήρια. Ως βακτήρια ή αλλιώς παθογόνοι μικροοργανισμοί, επιλέχθηκαν ως Gram θετικό ο Σταφυλόκοκκος (Staphylococcus aureus) και ως Gram αρνητικό η Escherichia coli. Η μελέτη της αντιμικροβιακότητας των νανοσωματιδίων έγινε με δύο διαφορετικές μεθόδους, χρησιμοποιώντας στην πρώτη στερεό θρεπτικό υλικό LB (Luria Bertani) και στην δεύτερη υγρό θρεπτικό LB καθώς και TSB (Trisodium broth). Στη πρώτη περίπτωση η μελέτη της αποτελεσματικότητας παρατηρείται οπτικά, ενώ στη δεύτερη μετράται η απορρόφηση με φασματοφωτόμετρο UV Vis σε σταθερό μήκος κύματος στα 600 nm μετά από επώαση σε κλίβανο στους 37 ο C και λήψη τιμών ανά μια ώρα σε διάστημα 24 ωρών. Τα αποτελέσματα έδειξαν αναστολή της καλλιέργειας και των δύο μικροοργανισμών ειδικότερα στην περίπτωση υγρού θρεπτικού υλικού και μάλιστα στη χρήση του LB με ενσωμάτωση των νανοσωματιδίων αργύρου μέσης και υψηλής συγκέντρωσης (2 mm και 5 mm αντίστοιχα). Από την άλλη πλευρά, τα 7

νανοσωματίδια αργύρου με επικάλυψη με χιτοζάνη ανταποκρίθηκαν κι εκείνα στην επιβράδυνση της ανάπτυξης των βακτηριακών στελεχών, σε μέση και υψηλή συγκέντρωση αλλά με πιο αργό ρυθμό με σταδιακή απελευθέρωση του φορτίου τους. Τέλος, μελετήθηκε η κυτταροσυμβατότητα των ικριωμάτων της πολυκαπρολακτόνης με ενσωματωμένα τα νανοσωματίδια αργύρου, καθώς και η κυτταροσυμβατότητα μόνο των νανοσωματιδίων αργύρου, με δύο διαφορετικές μεθόδους, τη βιοχημική μέθοδο Κυτταροτοξικότητας ΜΤΤ (MTT assay), καθώς και με τη μέθοδο Χρώσης με Κυανό του Μεθυλενίου (Methylene Blue) χρησιμοποιώντας ινοβλάστες ποντικού (κυτταρική σειρά L929). Τα αποτελέσματα έδειξαν αυξημένο πολλαπλασιασμό και πρόσφυση των κυττάρων στην επιφάνεια των ικριωμάτων, καθιστώντας τα με αυτό τον τρόπο εξαιρετικά κυτταροσυμβατά και κατάλληλα για εφαρμογή στην Ιστική Μηχανική και στην Αναγεννητική Ιατρική. Συμπεραίνεται λοιπόν, πως η χημική σύνθεση, το μέγεθος, το σχήμα των νανοσωματιδίων, το είδος και η συγκέντρωση του πολυμερούς για επικάλυψη τους είναι καθοριστικής σημασίας για την όσο το δυνατόν καλύτερη αξιοποίηση σε ιατρικές εφαρμογές. Επίσης, σημαντικό ρόλο παίζει και η μέθοδος εναπόθεσης των νανοσωματιδίων στην πολυμερική μήτρα, μαζί με τον κατάλληλο σχεδιασμό των διαφόρων παραμέτρων και μεταβλητών που επηρεάζουν την διαδικασία φόρτωσης. 8

ABSTRACT This thesis studies the synthesis of silver nanoparticles being coated with chitosan and ultimately being integrated into nanofibrous scaffolds of polycaprolactone (PCL), which are developed by the process of electrostatic spinning (Electrospinning System). The object of this study aims at the application of those scaffolds in orthopedic implants in the field of Regenerative Medicine and Tissue Engineering for bone regeneration. Silver is known since several decades ago for its antimicrobial and bactericidal actions. Specifically, the silver nanoparticles enhance this antimicrobial sensitivity because the smaller the size the larger the contact surface resulting in better binding of the antimicrobial agent with the pathogenic microorganism. On the other hand, the polycaprolactone is a synthetic, semi-crystalline biodegradable polymeric with a slow release rate. These features, in combination with the mechanical properties of hardness and flexibility make this polymer ideal for construction of scaffolds that are excellent candidates for orthopedic applications and production of implants. The combination of the silver nanoparticles and polycaprolactone is an ideal candidate for these applications, because the nanoparticles increase the roughness and wettability of the polymer scaffolds, and enhance them with their antimicrobial action. Therefore, the nanofibers of polycaprolactone with nanosilver form a new perspective in the field of the Tissue Engineering and Regenerative Medicine. The purpose of this thesis is initially to synthesize silver nanoparticles via nanoprecipitation which is a method easy while the surfactant is removed and the nanoparticles are collected as a precipitate. Silver nitrate is used as the main ingredient, polyvinylpyrrolidone as a surfactant and a stabilizing agent, and sodium borohydride (NaBH 4 ) as a reducing agent. The size of the nanoparticles was measured by Atomic Force Microscopy (AFM), while the identification of the existence of the silver nanoparticles was evaluated by X-ray diffraction (XRD) and with Transmittance Measurements. Then the nanoparticles were overlapped with chitosan. Chitosan is a linear crystalline polymer, which in combination with its flexible properties to cell adhesion and expression of the phenotype make it an 9

interesting case for medical applications. In this case, low molecular weight chitosan was diluted in an aqueous acetic acid solution and used for coating the silver nanoparticles. This coating provides the stability of the nanoparticles the prevention of aggregation and a controlled release of the antimicrobial load. Then there was an optimization of this coating by testing three different concentrations of chitosan. The detection and confirmation of the coating was evaluated via Atomic Force Microscopy which measured the size of the newly synthesized nanoparticles, with Permeability measurements, X-ray diffraction and with ph measurement. In the second part of this thesis, the development of nanofibrous scaffolds of polycaprolactone (PCL) 25% in a mixture of chloroform: methanol in a ratio of 3: 1 by the method of electrostatic spinning (Electrospinning System) was made. The characterization of the morphology of these scaffolds was made by Atomic Force Microscopy (AFM), Scanning Electron Microscopy (SEM), Optical microscope and Contact Angle (Contact Angle). Then was an incorporation of the silver nanoparticles in the polycaprolactone scaffolds with three different methods. The first method is the Drop Casting method, with direct casting of the silver nanoparticles solution with a pipe onto the surface of the scaffolds. The second method involves the use of electrostatic spinning (Electrospinning System) using a syringe which was filled with the solution of nanoparticles and regulating the Speed and Voltage parameters for the deposition of the nanoparticles onto PCL fibers. The morphology of the loaded scaffolds was also studied via Atomic Force Microscopy (AFM), Scanning Electron Microscopy (SEM), Optical microscope and Contact Angle (Contact Angle). The third method involves the use of dual syringe electrostatic spinning (Dual Syringe Electrospraying System) where the one syringe was filled with a solution of silver nanoparticles and the other syringe was filled with a solution of 25% polycaprolactone. By regulating the appropriate Speed and Voltage parameters there was a simultaneous deposition and creation of nanoparticles and fibers on the glass and aluminum substrate. The evaluation of the final scaffolds was made with X-ray diffraction (XRD), Scanning Electron Microscopy (SEM) and Contact Angle. Finally, a comparison of the developed scaffolds of these three methods was made. Drop Casting method was chosen as optimum because of its easy implementation, and due to better deposition of 10

nanoparticles on the fibers because there is the ability to study the antimicrobial properties of the scaffolds as the network of the fibers is not affected by the deposition of the nanoparticles. Contact Angle method was then applied in order to study the hydrophilicity or hydrophobicity of polycaprolactone scaffolds in combination with their enrichment with silver nanoparticles with the above three different techniques. Therefore, the silver nanoparticles and those coated with chitosan were synthesized using a medium and a high concentration which is substantially the maximum concentration of nanoparticles that can kill bacteria. Staphylococcus (Staphylococcus aureus) was selected as a gram positive bacterium and Escherichia coli as a Gram negative bacterium. The antimicrobial activity of the nanoparticles was evaluated by two different methods using firstly, solid nutrient LB (Luria broth) and secondly, liquid nutrient LB and TSB (Trisodium broth). In the first case the study of the effectiveness is measured optically and in the second the absorption was measured by UV - Vis spectrophotometer at 600 nm after incubation in an incubator at 37 C for 24 hours. The results of the absorption in liquid medium showed that the silver nanoparticles of medium and high concentration (2 mm and 5 mm, respectively) had the greatest effectiveness against the microorganisms when are instilled in liquid nutrient LB. While in LB solid nutrient only nanoparticles coated with chitosan of middle and high concentration showed deceleration and slowdown of the culture of the bacterium E. coli. In the first case the evaluation of the effectiveness is measured optically, and the second measured absorbance with UV spectrophotometer Vis at 600 nm after incubation in an oven at 37oC and receive price per hour over 24 hours. Finally, we studied the cytocompatibility of polycaprolactone scaffolds with incorporated silver nanoparticles and the cytocompatibility of silver nanoparticles only, with two different methods, the biochemical method Cytotoxicity MTT (MTT assay), and the staining method with methylene blue ( Methylene Blue) using mouse fibroblasts (cell line L929). The results showed increased proliferation and adhesion of cells to the scaffold surface, making thus extremely cytocompatible and suitable for application in Tissue Engineering and Regenerative Medicine. It is concluded that the chemical composition, size and shape of nanoparticles, the type and concentration of the polymer in the coating is essential for the best possible 11

use in medical applications. Moreover, the method of deposition of nanoparticles in the polymeric matrix is essential too, with the appropriate design of the various parameters and variables that affect the loading process. Πίνακας Περιεχομένων Ι. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... 17 Κεφάλαιο 1 ο :Ορθοπεδικά Εμφυτεύματα και Αρθρικός Χόνδρος... 18 1.1 Αρθρικός Χόνδρος... 18 1.1.1 Εισαγωγή... 18 1.1.2 Δομή και Σύνθεση του Αρθρικού Χόνδρου... 19 1.1.3 Βλάβεςτου ΑρθρικούΧόνδρου Η θεωρία των τριών σταδίων... 21 1.2 Οστεοαρθρίτιδα... 22 1.3 Ορθοπεδικά Εμφυτεύματα... 23 1.4 Ο ρόλος της Νανοϊατρικής στα Ορθοπεδικά Εμφυτεύματα... 27 Κεφάλαιο 2 ο : Νανοτεχνολογία, Νανοσωματίδια και Εφαρμογές τους στον τομέα της Ιατρικής Επιστήμης... 30 2.1 Ορισμός της Νανοτεχνολογίας... 30 2.2 Νανοϊατρική... 32 2.3 Νανοσωματίδια... 34 2.4 Εφαρμογές των νανοσωματιδίων... 35 - Εφαρμογές στη Βιομηχανία και στα Υλικά... 35 - Εφαρμογές στο περιβάλλον... 35 - Εφαρμογές στην ενέργεια και στα ηλεκτρονικά... 36 2.5 Μεταλλικά Νανοσωματίδια... 36 2. 6 Νανοσωματίδια Αργύρου... 37 2.6.1 Ιστορική αναδρομή... 37 2.6.2 Τα νανοσωματίδια Αργύρου σήμερα Βιοϊατρικές εφαρμογές... 39 2.7 Μέθοδοι σύνθεσης μεταλλικών νανοσωματιδίων... 39 12

2.7.1 Ηλεκτροχημική Αναγωγή... 39 2.7.2 Ραδιολυτική Αναγωγή... 40 2.7.3 Θερμική Αποσύνδεση Οργανομεταλλικών Ενώσεων... 40 2.7.4 Σύνθεση υποβοηθούμενη από Μικροκύματα... 41 2.7.5 Σονόλυση... 42 2.7.6 Βιολογική Σύνθεση... 42 2.7.7 Υδροθερμική / Σολβοθερμική Μέθοδος... 43 2.8 Μέθοδοι σύνθεσης νανοσωματιδίων Αργύρου... 43 2.8.1 Ραδιολυτική Αναγωγή... 43 2.8.2 Σύνθεσηυποβοηθούμενη από Μικροκύματα... 43 2.8.3 Μέθοδος πολυόλης... 44 2.8.4 Βιολογική Σύνθεση... 45 Κεφάλαιο 3 o : Βιοδιασπώμενα Πολυμερή και Δημιουργία 3DΙκριωμάτων... 45 3.1 Εισαγωγή... 45 3.2 Βιοδιασπώμενα Πολυμερή για Ιστική Αναγέννηση... 46 3.3 Βιοδιασπώμενα Πολυμερή για Ιστική Μηχανική Οστού... 48 3.4 Βιοδιασπώμενα πολυμερή που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία... 49 3.4.1 Χιτοζάνη... 49 3.4.2 Πολυκαπρολακτόνη (PCL)... 50 Κεφάλαιο 4 ο : Κύτταρα, Παθογόνοι μικροοργανισμοί και Καλλιέργειες... 51 4.1 Κύτταρο... 51 4.2 Παθογόνοι μικροοργανισμοί... 52 4.3Κυτταρικές καλλιέργειες... 53 4.4 Μικροβιακές καλλιέργειες... 54 4.5 Άργυρος και Αντιμικροβιακή Δράση... 56 4.5.1 Μηχανισμός δράσης AgNO 3 / Ag +... 57 4.5.2 Μηχανισμός δράσης νανοσωματιδίων Αργύρου... 57 ΙΙ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... 59 Κεφάλαιο5 ο : Τεχνικές Χαρακτηρισμού που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία... 60 5.1 Ατομική Μικροσκοπία Δυνάμεων (Atomic Force Microscopy)... 60 13

5.2 Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (Scanning Electron Microscope)... 61 5.3 Γωνία Επαφής (Contact Angle)... 62 5.4 ΠερίθλασηΑκτινώνΧ (X RayDiffraction)... 64 5.5 Μέθοδος Ηλεκτροστατικού Ψεκασμού για Δημιουργία Νανοσωματιδίων (Electrospraying System)... 64 5.6 Σύστημα Ηλεκτροστατικής Ινοποίησης για Δημιουργία Ινών (ElectrospinningSystem)... 65 5.7 Μέθοδος Διαπερατότητας και Επιφανειακά Πλασμόνια (Transmittance Method and Surface Plasmon) για την περίπτωση υμενίων Αργύρου... 68 5.8 Μελέτες Κυτταροτοξικότητας... 71 5.8.1 Κυτταρική σειρά L929... 71 5.8.2 Βιοχημική Μέθοδος Εκτίμησης Κυτταροτοξικότητας ΜΤΤ... 72 5.8.3 Χρώση MethyleneBlue... 73 5.9 Πρωτόκολλα Ανακαλλιέργειας κυττάρων, MTTassay και Methylene Blue... 74 5.9.1 Πρωτόκολλο Ανακαλλιέργειας Κυτταρικής Σειράς L929... 74 5.9.2 Πρωτόκολλο βιοχημικής μεθόδου εκτίμησης κυτταροτοξικότητας MTT... 76 5.9.3 Πρωτόκολλο χρωματισμού κυττάρων με MethyleneBlue... 77 Κεφάλαιο 6 o : Πρωτόκολλα Διαδικασιών... 78 6.1 Μέθοδος Σύνθεσης Νανοσωματιδίων Αργύρου... 78 6.1.1 Υλικά... 78 6.1.2 Περιγραφή πειραματικής διαδικασίας... 78 6.2 Μέθοδος Χιτοζάνης... 80 6.2.1 Υλικά... 80 6.2.2 Περιγραφή πειραματικής διαδικασίας... 81 6.3 Μέθοδος παρασκευής διαλύματος PCL... 82 6.3.1 Υλικά... 82 6.3.2 Περιγραφή πειραματικής διαδικασίας... 83 6.3.3 Μέθοδος Ηλεκτροστατικού Ψεκασμού Ινών με PCL... 83 Κεφάλαιο 7 ο : Μελέτη Φυσικών και Μορφολογικών χαρακτηριστικών νανοσωματιδίων και ικριωμάτων - Αποτελέσματα... 84 7.1 Σύνθεση νανοσωματιδίων αργύρου... 84 7.1.1 Μικροσκοπία Ατομικών Δυνάμεων (AFM)... 84 14

7.1.2 Περίθλαση ακτινών Χ (XRD)... 85 7.1.3 Μετρήσεις Διαπερατότητας... 86 7.2 Σύνθεση νανοσωματιδίων με τη μέθοδο της χιτοζάνης... 88 7.2.1 Μικροσκοπία Ατομικών Δυνάμεων (AFM)... 88 7.2.2 Μετρήσεις Διαπερατότητας... 94 7.2.3 Μετρήσεις ph... 95 7.2.4 Μετρήσεις XRD... 96 7.3 Δημιουργία 3D Ικριωμάτων PCL... 97 7.3.1 Ατομική Μικροσκοπία Δυνάμεων... 97 7.3.2 Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης... 98 7.3.3 Οπτικό Μικροσκόπιο... 100 7.4 Σύνθεση 3D Ικριωμάτων PCLενσωματωμένων με Νανοσωματίδια Αργύρου Τεχνικές Εναπόθεσης... 101 7.4.1 Drop Casting Method... 102 7.4.1.1 Οπτικό Μικροσκόπιο... 104 7.4.1.2 Ατομική Μικροσκοπία Δυνάμεων... 105 7.4.2 ElectrospinningSystem... 107 7.4.2.1 Ατομική Μικροσκοπία Δυνάμεων (AFM)... 107 7.4.2.2 Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης... 109 7.4.3 Dual Syringe Electrospraying System... 110 7.4.3.1 Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM)... 111 7.5 Γωνία Επαφής (Contact Angle)... 113 Κεφάλαιο 8 ο : Αντιμικροβιακές Μελέτες... 119 8.1Γενικά για Staphylococcus aureus και Escherichia coli... 119 8.2 Προετοιμασία δειγμάτων... 121 8.2.1 Μέθοδος στερεού θρεπτικού υλικού με ταυτόχρονη ενσωμάτωση νανοσωματιδίων και εμβολιασμός του μικροοργανισμού... 124 8.2.2 Μέθοδος υγρού θρεπτικού υλικού LB και TSB και μέτρηση απορρόφησης συναρτήσει του χρόνου... 127 9. Μελέτες Κυτταροσυμβατότητας (Cytocompatibility studies)... 130 9.1 Βιοχημική Μέθοδος Εκτίμησης Κυτταροτοξικότητας MTT assay... 131 9.2 Χρώση Methylene Blue... 134 15

10. Συμπεράσματα Προτάσεις για μελλοντική έρευνα... 138 11. Βιβλιογραφία... 144 16

Ι. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 17

Κεφάλαιο 1 ο :Ορθοπεδικά Εμφυτεύματα και Αρθρικός Χόνδρος 1.1 Αρθρικός Χόνδρος 1.1.1 Εισαγωγή Ο αρθρικός χόνδρος είναι ο υψηλής εξειδίκευσης συνδετικός ιστός μεταξύ των διαρθρωτικών αρθρώσεων. Η κύρια λειτουργία του είναι να παρέχει μια ομαλή, λεία και λιπασμένη επιφάνεια για την άρθρωση καθώς και να διευκολύνει τη μεταφορά των φορτίων με χαμηλό συντελεστή τριβής (Εικόνα 1.1). [50] Ο αρθρικός χόνδρος στερείται αιμοφόρων αγγείων, λεμφαγγείων και νεύρων και υπόκειται σε σκληρό εμβιομηχανικό περιβάλλον. Το πιο σημαντικό, ο αρθρικός χόνδρος έχει περιορισμένη ικανότητα για εγγενή επούλωση και επισκευή. Συναφώς, η διατήρηση και η υγεία του αρθρικού χόνδρου είναι υψίστης σημασίας για την υγεία των αρθρώσεων. [1] Ο τραυματισμός στον αρθρικό χόνδρο αναγνωρίζεται ως αιτία σημαντικής μυοσκελετικής νοσηρότητας. [50] Η μοναδική και πολύπλοκη δομή του αρθρικού χόνδρου καθιστά την θεραπεία και επισκευή ή αποκατάσταση των ατελειών πρόκληση για τον ασθενή, τον χειρουργό και τον φυσικοθεραπευτή. Η διατήρηση του αρθρικού χόνδρου εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη διατήρηση της οργάνωσης της αρχιτεκτονικής δομής του. 18

Εικόνα 1.1:Φωτογραφία υγιούς αρθρικού χόνδρου σε ανθρώπινο γόνατο ενηλίκου [1] 1.1.2 Δομή και Σύνθεση του Αρθρικού Χόνδρου Ο αρθρικός χόνδρος είναι υαλώδης χόνδρος πάχους 2 με 4 mm. Σε αντίθεση με τους περισσότερους ιστούς, ο αρθρικός χόνδρος δεν έχει όπως προαναφέρθηκε αιμοφόρα αγγεία, νεύρα ή λεμφαγγεία. Αποτελείται από μια πυκνή εξωκυττάρια μήτρα (ECM) με αραιή διανομή υψηλής εξειδίκευσης κυττάρων που ονομάζονται χονδροκύτταρα.[52] Η ECMαποτελείται κυρίως από νερό, κολλαγόνο και πρωτεογλυκάνες, μαζί με άλλες μη κολλαγονούχες πρωτεΐνες και σε μικρότερο ποσοστό γλυκοπρωτεΐνες. Μαζί, αυτά τα στοιχεία αυτά βοηθούν στη συγκράτηση του νερού εντός της ECM, η οποία είναι κρίσιμη για τη διατήρηση των μηχανικών ιδιοτήτων του. [2] (Εικόνα 1.2). 19

Εικόνα 1.2: a) Συστατικά χόνδρου, b) Δομή του στερεού συστατικού της εξωκυττάριας μήτρας (ECM) στον υαλώδη χόνδρο. [2] Το κολλαγόνο αντιπροσωπεύει την κύρια πρωτεΐνη της ECM. Αποτελεί το μόνο ινώδες συστατικό του χόνδρου. Μάλιστα, το 80% του υαλώδους αρθρικού χόνδρου είναι κολλαγόνο τύπου ΙΙ. Ο Benninghoff ήταν ο πρώτος που εξήγησε το μοτίβο το οποίο εξηγεί τη τρισδιάστατη οργάνωση των ινών κολλαγόνου που βρίσκονται ενσωματωμένες στην ασβεστοποιημένη ζώνη και κάθετα προς την αρθρική επιφάνεια, λοξά προσανατολισμένες στη μεταβατική ζώνη και παράλληλες προς την αρθρική επιφάνεια στην εφαπτομενική ζώνη όπως θα εξηγηθεί και παρακάτω. [53] (Εικόνα 1.3) Εικόνα 1.3: Η τρισδιάστατη οργάνωση του κολλαγόνου στον αρθρικό χόνδρο [2] 20

1.1.3 Βλάβες του Αρθρικού Χόνδρου Η θεωρία των τριών σταδίων Η έκταση της βλάβης του αρθρικού χόνδρου εξαρτάται από την σοβαρότητα του τραυματισμού. Με την αύξηση της σοβαρότητας του τραυματισμού, το αποτέλεσμα μπορεί να κυμαίνεται από μαρμαρυγή στην ανάπτυξη οστεοχονδρικού ελαττώματος. Παρόλα αυτά τραύματα χαμηλής ενέργειας έχουν αναφερθεί ότι τραυματίζουν τα χονδροκύτταρα, θέτοντας σε κίνδυνο τη μεταβολική τους ικανότητα για επιδιόρθωση, γεγονός που οδηγεί σε μειωμένη συγκέντρωση πρωτεογλυκανών, αυξημένη ενυδάτωση (Εικόνα 1.4 [1]) και τροποποιημένη οργάνωση των ινιδίων κολλαγόνου. Αυτό καταλήγει σε μαλάκωση του χόνδρου εξαιτίας του αυξημένου ποσοστού νερού και σε διαπερατότητα και περαιτέρω σε αυξημένη μετάδοση δύναμης στο υποκείμενο υποχόνδριο οστό, το οποίο με τη σειρά του θα αυξήσει την ακαμψία του (Εικόνα 1.4 [2]) και κατά συνέπεια προκαλεί την ευκολότερη μετάδοση των κρουστικών φορτίων στον μερικώς κατεστραμμένο χόνδρο (Εικόνα 1.4 [3]). Αυτός ο φαύλος κύκλος πιστεύεται ότι συμβάλλει στην πρόοδο των μερικού πάχους τραυματισμών χόνδρου σε ατέλειες πλήρους πάχους και στην εμφάνιση οστεοαρθρίτιδας. [2] Εικόνα 1.4: Σχηματική Αναπαράσταση των τριών σταδίων βλάβης του χόνδρου ξεκινώντας από τραύμα χαμηλής ενέργειας και καταλήγοντας σε ανάπτυξη οστεοαρθρίτιδας. [2] 21

1.2 Οστεοαρθρίτιδα Η οστεοαρθρίτιδα είναι κυρίως μια ασθένεια του χόνδρου που τελικά οδηγεί σε τοπική απόκριση ιστού, συνήθως αποτελούμενη από φλεγμονή και κατά συνέπεια σε μηχανικές αλλαγές που καταλήγουν στην αποτυχία αυτών των δομών να λειτουργήσουν κανονικά. Πρόκειται για μια ετερογενή ασθένεια με πολυπαραγοντική ασθένεια: αυτοί οι παράγοντες περιλαμβάνουν βιοχημικές ανωμαλίες που αλληλεπιδρούν με μηχανικές αλλαγές και ανοσολογικές αντιδράσεις. [54] Χαρακτηρίζεται κλινικά κυρίως από επιδράσεις στις αρθρώσεις που συγκρατούν βάρος και κατανέμονται με ασύμμετρο τρόπο. Μόλις η οστεοαρθρίτιδα αναγνωρισθεί στον οργανισμό, μπορεί να υπάρχει σχετιζόμενη φλεγμονή χαμηλού βαθμού αλλά τυπικά υπάρχουν λίγες συστηματικές επιπτώσεις. Γενικά, η διαδικασία της οστεοαρθρίτιδας είναι αποτέλεσμα είτε εγγενώς ανώμαλων ιστών που φέρουν φορτίο, είτε γενετικών ανωμαλιών χόνδρου ή οστού, ή φυσιολογικού χόνδρου που υποβάλλεται σε μη φυσιολογικά φορτία. [3] Στην παρακάτω εικόνα (Εικόνα 1.5) παρουσιάζεται η διαδικασία ανάπτυξης ΟΑ στο γόνατο, το οποίο είναι από τις αρθρώσεις που επηρεάζονται περισσότερο από την ΟΑ και παρατίθενται τα στάδια ανάπτυξής της. 22

Εικόνα 1.5: Τα τέσσερα στάδια ανάπτυξης της ΟΑ στο γόνατο [4] 1.3 Ορθοπεδικά Εμφυτεύματα Η εμφάνιση πολλών μυοσκελετικών ασθενειών και ανωμαλιών, οι οποίες περιλαμβάνουν όλους τους τύπους ασθενειών των οστών και των αρθρώσεων, θεωρούνται ότι είναι η πρωταρχική αιτία αναπηρίας στο μεγαλύτερο τμήμα του πληθυσμού παγκοσμίως. Εκτιμάται ότι στις περισσότερο αναπτυγμένες χώρες, περισσότερο από το ήμισυ του συνόλου των χρόνιων παθήσεων με μυοσκελετικά προβλήματα αφορούν άτομα άνω των 50 ετών. Το βάρος αυτών των ασθενειών των οστών και των αρθρώσεων είναι τεράστιο και οι οικονομικές επιπτώσεις για το κόστος της υγειονομικής περίθαλψης είναι επίσης πολύ υψηλό. Επιπλέον, η αύξηση της γήρανσης του πληθυσμού και ο καθιστικός τρόπος ζωής έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του αριθμού των ατόμων που υποφέρουν από διάφορες μυοσκελετικές παθήσεις και οι οποίοι χρειάζονται ιατρική φροντίδα, με συνέπεια την περαιτέρω αύξηση στο κόστος της περίθαλψης. [5] Η πολυπλοκότητα των εμφυτευμάτων και προσθέσεων στα τελευταία χρόνια έχει τοποθετήσει μια αυξανόμενη ζήτηση για χρήση κατάλληλων υλικών στα 23

εμφυτεύματα. Όσο μεγαλύτερη είναι η πολυπλοκότητα της συναρμολόγησης ενός εμφυτεύματος, τόσο πιο αυστηρές είναι οι απαιτήσεις για το υλικό κατασκευής, και είναι ολοφάνερο πως η επιτυχία ή η αποτυχία οποιασδήποτε συσκευής εξαρτάται από την επιλογή του υλικού καθώς και από το σχέδιο διαμόρφωσης και λειτουργίας. [55] Γενικά, οι προϋποθέσεις που πρέπει να πληρούν τα σύγχρονα εμφυτεύματα διακρίνονται σε τρεις κατηγορίες, όπως φαίνεται στην Εικόνα 1.6 Η συμβατότητα μεταξύ του υλικού και του περιβάλλοντος γύρω από αυτό Οι μηχανικές και φυσικές ιδιότητες που είναι απαραίτητες για την επίτευξη της επιθυμητής λειτουργίας του εμφυτεύματος. Η σχετική ευκολία της κατασκευής και η προμήθεια των επιθυμητών συστατικών. [6] Εικόνα 1.6: Σχηματική αναπαράσταση των προϋποθέσεων που απαιτούνται για το υλικό κατασκευής των εμφυτευμάτων [6] Από άποψη λειτουργικότητας, τα οστικά εμφυτεύματα θα μπορούσαν να διαιρεθούν σε δύο ομάδες: Τα εμφυτεύματα της πρώτης ομάδας αντικαθιστούν ιστό ή / και χρησιμοποιούνται γενικά όπου υπάρχει έλλειψη οστικού οστού, όπως για παράδειγμα σε περιπτώσεις αφαίρεσης τμημάτων οστού λόγω όγκων, π.χ. ισχίο (Εικόνα 1.7), γόνατο, δόντι, μέρη προσώπου, ενώ εκείνα της δεύτερης ομάδας χρησιμοποιούνται ως εργαλεία για την χειρουργική αποκατάσταση ιστού (οστεοσύνθεση), ο οποίος έχει υποστεί βλάβες, εξαιτίας ατυχήματος ή ασθένειας 24

(π.χ. βίδες, λάμες, ήλοι). Τα οστικά εμφυτεύματα πρώτου τύπου είναι μόνιμες συσκευές, ενώ τα υποστηρικτικά οστικά εμφυτεύματα δεύτερου τύπου είναι προσωρινά ενθέματα και είτε απομακρύνονται μετά από μια συγκεκριμένη χρονική περίοδο, είτε αποικοδομούνται και αποσυντίθενται με την πάροδο του χρόνου. Τα προσωρινά εμφυτεύματα θα πρέπει να αποτρέπουν τη σταθερή συγκόλληση με το οστό. Σε αντίθετη περίπτωση, κατά την εξαγωγή τους απομακρύνεται νεοσχηματιζόμενο οστό, προκαλώντας μια παρατεταμένη περίοδο επούλωσης. [7] Εικόνα 1.7: Σχηματική αναπαράσταση διαδικασίας τοποθέτησης εμφυτεύματος σε άρθρωση ισχίου [8] Όταν ένα υλικό εισέρχεται σε ένα βιολογικό σύστημα, ένα από τα πρώτα και πιο σημαντικά γεγονότα είναι η προσρόφηση πρωτεϊνών στην επιφάνειά του. Η προσρόφηση πρωτεϊνών στις επιφάνειες βιοϋλικών από το αίμα είναι μια δυναμική διαδικασία, κατά την οποία πρωτεΐνες μπορούν να προσδεθούν, να αναδιευθετηθούν και να αποκολληθούν. Οι πρωτεΐνες προσροφούνται σε διαφορετικές ποσότητες, πυκνότητες, διαμορφώσεις και προσανατολισμούς, ανάλογα με τις φυσικές και 25

χημικές ιδιότητες της επιφάνειας. [56] Η ποσότητα, η σύνθεση και η διαμόρφωση των προσροφημένων πρωτεϊνών επηρεάζουν όλες τις επακόλουθες βιολογικές αποκρίσεις στο υλικό, όπως η απόκριση του ανοσοποιητικού συστήματος, η προσκόλληση και ανάπτυξη των κυττάρων και η θρόμβωση. Μια περιληπτική σύνοψη της διαδικασίας ενσωμάτωσης εμφυτεύματος σε οστό παρουσιάζεται στον Πίνακα 1.1 [7] Πίνακας 1.1:Η διαδικασία ενσωμάτωσης εμφυτεύματος σε οστό [12] Χρόνος 0 2 ημέρες 2 3 ημέρες 3 10 ημέρες Διαδικασία Σχηματισμός θρόμβου Σταθεροποίηση αιματώματος Οργάνωση αιματώματος Στρατολόγηση μεσεγχυματικών κυττάρων Παραγωγή ρυθμιστικών παραγόντων Αυτόκρινη και παράκρινη ρύθμιση διάλυσης αιματώματος Σύνθεση οστεοειδών Εμπλεκόμενα κύτταρα Αιμοπετάλια Κύτταρα ανοσοποιητικού συστήματος Πολυδύναμα Μεσεγχυματικά κύτταρα Οστεοχονδροπρόδρομα κύτταρα Προ-οστεοβλάστες Οστεοβλάστες 1 3 εβδομάδες Ωρίμανση οστεοειδών Ασβεστοποίηση Οστεοβλάστες 3 4 εβδομάδες Οστική ωρίμανση Οστεοκύτταρα 4+ εβδομάδες Οστική αναδόμηση Οστεοκύτταρα Οστεοβλάστες Οστεοκλάστες Σημαντικοί παράγοντες για την «επιβίωση» ενός εμφυτεύματος, είναι ο αριθμός των ποικίλου μεγέθους παραγόμενων σωματιδίων που είναι βιολογικά δραστικά, καθώς 26

και το φορτίο των παραχθέντων σωματιδίων σε μια συγκεκριμένη ιστική περιοχή. Τα σωματίδια προϊόντα τριβής προκαλούν μια κοκκιωματώδη χρόνια φλεγμονή, με σημαντικό αριθμό ενεργοποιημένων μακροφάγων και γιγάντιων κυττάρων τύπου ξένου σώματος, τα οποία εμπλέκονται στην απομάκρυνση θραυσμάτων και ενισχύουν την περιοπροσθετική οστεόλυση. Επιπρόσθετοι παράγοντες που επιδρούν στην οστεοενσωμάτωση περιλαμβάνουν τον τύπο και τα επιφανειακά χαρακτηριστικά του εμφυτεύματος, την κατάσταση της θέσης εμφύτευσης του δέκτη, τη χειρουργική τεχνική και τις συνθήκες μηχανικής φόρτισης. Όλοι αυτοί οι παράγοντες πρέπει να ελέγχονται ταυτόχρονα, ώστε να επιτυγχάνεται επιτυχής οστική στερέωση. Ο σχεδιασμός ενός εμφυτεύματος και η επιφάνεια του, είναι επίσης πολύ σημαντικοί παράγοντες για την επιτυχή ενσωμάτωση του εμφυτεύματος. Για παράδειγμα, ανωμαλίες της επιφάνειας επηρεάζουν σε πολύ μεγάλο βαθμό και μάλιστα αυξάνουν την κυτταρική προσκόλληση στο εμφύτευμα. Σε οδοντικές εφαρμογές, εμφυτεύματα με σπειρώματα βίδας φαίνεται πως έχουν μεγαλύτερη καταλληλότητα, σε βάθος χρόνου, σε σχέση με λείες κυλινδρικές επιφάνειες. Γυαλισμένες, λείες επιφάνειες απλά δεν υποστηρίζουν την κατάλληλη κυτταρική προσκόλληση. Από την άλλη μεριά, ένα η επιφανειακή τραχύτητα είναι πολύ μεγάλη, τότε μπορεί να προκύψουν προβλήματα, όπως η αυξημένη απελευθέρωση μεταλλικών ιόντων. Πρωτογενής στερέωση του εμφυτεύματος μπορεί να επιτευχθεί με την τοπογραφική τροποποίηση της επιφάνειάς του και αποτελεί προϋπόθεση για την αρχική ανάπτυξη άωρου (woven) οστού και την επακόλουθη μηχανική αλληλοσύνδεση με ώριμο (lamellar) οστό, το οποίο αντέχει στη μηχανική φόρτιση. [7] 1.4 Ο ρόλος της Νανοϊατρικής στα Ορθοπεδικά Εμφυτεύματα Στην προχωρημένη οστεοαρθρίτιδα στην οποία έχουμε αναφερθεί λεπτομερώς στις προηγούμενες παραγράφους, και συγκεκριμένα στην οστεοαρθρίτιδα των αρθρώσεων, η χειρουργική αποτελεί την καταλληλότερη επιλογή θεραπείας. Χειρουργικοί καθαρισμοί ή διορθωτικές οστεοτομίες της παθούσας άρθρωσης εφαρμόζονται περιστασιακά. Η πιο κοινή θεραπεία για ασθενείς με σοβαρή βλάβη των αρθρικών αρθρώσεων είναι η ολική αντικατάσταση της άρθρωσης, ή αλλιώς αρθροπλαστική. Υπάρχουν πολλοί διαφορετικοί τύποι αντικαταστάσεων 27

αρθρώσεων. Στην αρθροπλαστική ισχίου, το ορθοπεδικό προσθετικό εμφύτευμα θα μπορούσε να είναι μέταλλο σε πολυαιθυλένιο, μέταλλο - μέταλλο, κεραμικό κεραμικό, κεραμικό σε πολυαιθυλένιο, κλπ. Το συστατικό του πολυαιθυλενίου συνδέεται με το εμφύτευμα με σταυροδεσμούς. Το ακρυλικό οστικό τσιμέντο χρησιμοποιείται επίσης για να προσαρμόσει τα προσθετικά οστά στο οστό του ασθενούς. Τα εμφυτεύματα σε αυτή την περίπτωση, έρχονται σε άμεση επαφή με το οστό και μόνο η διεπιφάνεια οστού εμφυτεύματος υπάρχει. Τα περισσότερα από αυτά τα εμφυτεύματα που χρησιμοποιούνται συντίθενται από τιτάνιο, κοβάλτιο ή χρώμιο. Ένα ιδανικό ορθοπεδικό εμφύτευμα είναι εκείνο το οποίο διαρκεί για μεγάλο χρονικό διάστημα, δεν χαλαρώνει και δεν παράγει τοξικά θραύσματα ή προκαλεί φθορά των μεταλλικών συστατικών του εμφυτεύματος. Υπάρχει εκτεταμένη ανάγκη για εμφυτεύματα τα οποία είναι λιγότερο τοξικά στον ανθρώπινο οργανισμό καθώς και ανθεκτικά σε διάφορους τύπους μικροοργανισμών. Για να επιτευχθεί αυτό, θα πρέπει πρώτον να κατανοηθεί η σχέση μεταξύ του εμφυτεύματος και του οστού και δεύτερον, να μελετηθεί η κυτταρική συμπεριφορά του οστού. Με άλλα λόγια, χρειαζόμαστε προσθετικά εμφυτεύματα που να είναι περισσότερο βιοσυμβατά. [5], [57] 28

Εικόνα 1.8: Αποτυχία σωστής ολικής αρθροπλαστικής ισχίου. Το μακρύ βέλος δείχνει τη θραύση του υλικού της μηριαίας πρόσθεσης η οποία μπορεί να είναι αποτέλεσμα χαλάρωσης του μηριαίου προσθετικού εμφυτεύματος. Το μικρό βέλος δείχνει τα σημεία οστεόλυσης μεταξύ του προσθετικού μοσχεύματος και του οστού. [5] Ο φυσικός ιστός του οστού θεωρείται πως είναι ένα νανοσύνθετο υλικό. Τα κύτταρα του οστού αλληλεπιδρούν με νανοδομές. Η εξωκυττάρια μήτρα (ECM) σε ένα φυσικό οστικό ιστό αποτελείται κυρίως από ελικοειδείς αλυσίδες ινιδίων κολλαγόνου 10 500 nm σε μήκος, υδροξυαπατίτη που βρίσκεται σε μορφή νανοκρυστάλλων μήκους 20 80 nm, και από πρωτεογλυκάνες. [57] Το ερώτημα είναι, τι είδους νανοβιοϋλικά χρειαζόμαστε για να ληφθεί μια ιδανική επιφάνεια εμφυτεύματος που να είναι βιοσυμβατή με τον ιστό του οστού και να προσχωρήσει ώστε να συνδεθεί φυσιολογικά με το οστό; Χρειαζόμαστε νανοβιοϋλικά με φυσικοχημικές ιδιότητες που θα μπορούσαν να καταστήσουν τη μεταλλική επιφάνεια περισσότερο αποδεκτή στα κύτταρα των οστών ώστε να αναγνωρίζει και να διαχειρίζεται σωστά αυτά τα κύτταρα. Με άλλα λόγια, χρειαζόμαστε νανοβιοϋλικά τα οποία επιτρέπουν την αύξηση της πρόσφυσης των οστεοβλαστών και αναστέλλουν ή μειώνουν τη λειτουργία των ινοβλαστών. Ένα νανοβιοσυμβατό ορθοπεδικό τεχνητό μέλος θα πρέπει να είναι κατασκευασμένο από κατάλληλη τραχύτητα επιφάνειας, κατάλληλη επιφανειακή χημεία και κατάλληλη διαβρεξιμότητα. [5] Η τραχύτητα της επιφάνειας του εμφυτεύματος όταν βρίσκεται σε κλίμακα νανομέτρων αυξάνει την αποτελεσματικότητα του. Μελέτες έχουν δείξει πως αυξάνεται η απορρόφηση των οστεοβλαστών όταν γίνεται σε πολυμερή εκμαγεία ινών άνθρακα που βρίσκονται σε νανοφάση, σε σύγκριση με εκμαγεία συμβατικών ινών άνθρακα. Ένα τέτοιο παράδειγμα φαίνεται στην Εικόνα 1.9, όπου παρουσιάζεται μια επιφάνεια τιτανίου και συγκρίνεται η φύση του υλικού αυτού στη μικροκλίμακα με τη νανοκλίμακα. Το τιτάνιο είναι όπως προαναφέρθηκε, διαδεδομένο υλικό για κατασκευή εμφυτευμάτων αρθρώσεων. [9] 29

Εικόνα 1.9: Εικόνες Ατομικής Μικροσκοπίας Δυνάμεων A) Η νανοκλίμακα και β) η μικροκλίμακα (η συμβατική) του τιτανίου. Οι μοναδικές επιφανειακές ιδιότητες της νανοκλίμακας ενισχύουν τη λειτουργία των κυττάρων των οστών. [9] Κεφάλαιο 2 ο : Νανοτεχνολογία, Νανοσωματίδια και Εφαρμογές τους στον τομέα της Ιατρικής Επιστήμης 2.1 Ορισμός της Νανοτεχνολογίας Η Νανοεπιστήμη και Νανοτεχνολογία αποτελούν έναν διεπιστημονικό τομέα, που προέρχεται από συνδυασμούς επιστημών, όπως η επιστήμη των υλικών, η φυσική, η χημεία, η βιολογία, η ιατρική καθώς και η μηχανική, καλύπτοντας ένα ευρύ και ποικίλο φάσμα συσκευών, με τη μία τουλάχιστον διάστασή τους να κυμαίνεται μεταξύ 1 100 nm. Η Νανοτεχνολογία αποτελεί έναν τεχνολογικό τομέα με μεγάλο δυναμικό, δεδομένου ότι μπορεί να εφαρμοστεί σε όλες σχεδόν τις πτυχές της σύγχρονης καθημερινής ζωής. Δεν είναι ένας ανεξάρτητος κλάδος, αλλά ένας νέος τρόπος προσέγγισης που βρίσκει εφαρμογή σε πολλούς επιστημονικούς κλάδους, όπως στη 30

φυσική, τη χημεία, την ιατρική. Ο χαρακτήρας της νανοτεχνολογίας είναι διεπιστημονικός, και περιλαμβάνει τη συγχώνευση και αλληλεπίδραση πολλών και διαφορετικών επιστημών. [10] Εικόνα 2.1:Κλίμακα μεγέθους για τις νανοσυσκευές. Οι νανοσυσκευές είναι περίπου 100 με 10.000 φορές μικρότερες από τα ανθρώπινα κύτταρα. Είναι παρόμοια σε μέγεθος με τα μεγάλα βιολογικά μόρια, ή βιομόρια, όπως ένζυμα και υποδοχείς. [11] Ο πρωταρχικός στόχος της Νανοτεχνολογίας είναι ο χειρισμός, η σύνθεση, ο χαρακτηρισμός και η παραγωγή νέων υλικών, με χαρακτηριστικά της νανοκλίμακας, με καλύτερες ιδιότητες των υλικών, στοχεύοντας με αυτό τον τρόπο σε πιο απαιτητικές εφαρμογές. Με βάση τις διαδικασίες που εμπλέκονται στην κατασκευή των νανοδομών, υπάρχουν δύο βασικές προσεγγίσεις. Η προσέγγιση top down (Εικόνα 2.2), η οποία είναι μια τεχνική που χρησιμοποιεί εργαλεία νανοκατασκευής, ξεκινώντας από μεγαλύτερες διαστάσεις για τη δημιουργία δομών στην νανοκλίμακα ή συσκευές με επιθυμητού σχήματος και τάξεως. Από την άλλη πλευρά, η προσέγγιση bottom up περιλαμβάνει τη χρήση της μοριακής αυτό συναρμολόγησης / αυτό οργάνωσης για την επίτευξη λειτουργικών συστημάτων από την ελεγχόμενη εναπόθεση ατόμων η μορίων. [10] 31

Εικόνα 2.2:Σχηματική αναπαράσταση των δύο προσεγγίσεων Bottom up και Top down [12] 2.2 Νανοϊατρική Η Νανοϊατρική αποτελεί την εφαρμογή της νανοτεχνολογίας στην υγεία και είναι ένας από τους πιο υποσχόμενους κλάδους της Βιοϊατρικής έρευνας, δημιουργώντας έναν καινοτόμο κόσμο με την ενσωμάτωση των αρχών των παραδοσιακών κλάδων (δηλαδή της φυσικής, χημείας βιολογίας και μηχανικής).η Νανοϊατρική έχει τη δυνατότητα να δώσει έξυπνες λύσεις σε πολλά από τα τρέχοντα ιατρικά προβλήματα, ανοίγοντας έτσι το δρόμο σε μια νέα γενιά προηγμένων συστημάτων χορήγησης φαρμάκων, βελτιωμένων διαγνωστικών συστημάτων (in vitro και in vivo) καθώς και νέων μεθόδων και υλικών για την αναγεννητική ιατρική. Τα κυριότερα πεδία λοιπόν, των σημερινών και μελλοντικών εφαρμογών της Νανοϊατρικής είναι η νανοδιαγνωστική, η αναγεννητική ιατρική και τα στοχευμένα συστήματα χορήγησης. (Εικόνα 2.3) [5] 32

Εικόνα 2.3:Οι τρεις κύριοι πυλώνες της Νανοϊατρικής [5] Σε αυτή την κατεύθυνση, η εφαρμογή της νανοτεχνολογίας στην ιατρική και τη βιολογία υπόσχεται πολλά για την αποτελεσματική αντιμετώπιση ασθενειών που δεν έχουν προς το παρόν θεραπεία. Η Νανοϊατρική λοιπόν, μπορεί να οριστεί ως η επιστήμη και η τεχνολογία της παρακολούθησης, επιδιόρθωσης, κατασκευής και ελέγχου των ανθρώπινων βιολογικών συστημάτων σε μοριακό επίπεδο, προκειμένου να διατηρήσει και να βελτιώσει την υγεία του ανθρώπου. Ο καρκίνος, για παράδειγμα, είναι μια θανατηφόρα ασθένεια που στερείται θεραπείας σε πολλές περιπτώσεις. Πράγματι, σημερινές εκτεταμένες μελέτες για την κατανόηση του μηχανισμού πίσω από τον όγκο και την κυτταρική βιολογία δείχνουν ότι η στοχευόμενη θεραπεία μπορεί να είναι πολύ πιο ελπιδοφόρα σε σύγκριση με την συμβατική χημειοθεραπεία. Εκτός από αυτό, οι δραματικές αλλαγές που λαμβάνουν χώρα στην διαγνωστική και στην απεικόνιση, υπόσχονται μεγάλα οφέλη για τη Νανοϊατρική. [58] Τα νανοσωματίδια και οι κβαντικές τελείες (QDs) μπορούν να εφαρμοστούν για την έγκαιρη in vitro και in vivoδιάγνωση, καθώς χρησιμοποιούνται ως ιχνηθέτες ή ως παράγοντες αντίθεσης. Η Νανοϊατρική λοιπόν αισιοδοξεί για την επισκευή, αντικατάσταση ή αναγέννηση σε κύτταρα, ιστούς και όργανα, ανοίγοντας νέες δυνατότητες στην ιατρική, οδηγώντας σίγουρα σε τεράστια οφέλη για την υγεία, εξασφαλίζοντας μακροζωία και παρέχοντας καλύτερο βιοτικό επίπεδο στους ασθενείς της. [5] 33

2.3 Νανοσωματίδια Τα υλικά που βρίσκονται στη νανοκλίμακα, δηλαδή από 1 100 nm, ορίζονται ως νανοϋλικά. Ο όρος νάνο προέρχεται από την ελληνική λέξη νάνος και δηλώνει το μικρό μέγεθος των νανοϋλικών. Τέτοιες δομές με διαστάσεις νανομέτρου, έχουν νέες ή και βελτιωμένες φυσικές και χημικές ιδιότητες που δεν παρουσιάζονται στα ίδια υλικά μεγαλύτερων διαστάσεων και εξαρτώνται από συγκεκριμένα χαρακτηριστικά, όπως το μέγεθός τους, τη μορφολογία ή και τη φάση τους. Τα νανοσωματίδια αποτελούν τη θεμελιώδη συνιστώσα στην κατασκευή μιας νανοδομής. Ένα νανοσωματίδιο είναι ένα μικροσκοπικό σωματίδιο του οποίου το μέγεθος μετράται σε νανόμετρα (nm). Ορίζεται ως ένα νανοσωματίδιο με μια τουλάχιστον διάσταση μικρότερη από 100 nm. Τα νανοσωματίδια έχουν κατακλύσει τη ζωή μας και βρίσκουν πληθώρα εφαρμογών. Παρακάτω παρατίθενται ορισμένα παραδείγματα εφαρμογών των νανοσωματιδίων σε διάφορους τομείς. [13] Εικόνα 2.4:Κλίμακα μεγέθους για τα νανοσωματίδια (π.χ. λιποσώματα, δενδριμερή, νανοπεριβλήματα χρυσού, κβαντικές τελείες και φουλερένια) σε σύγκριση με άλλα υλικά. [13] 34

2.4 Εφαρμογές των νανοσωματιδίων - Εφαρμογές στην Ιατρική Τα πολυμερικά μικυκλικά νανοσωματίδια χρησιμοποιούνται για χορήγηση φαρμάκων στους όγκους προς θεραπεία του καρκίνου. Η χρήση νανοσωματιδίων οξειδίου του σιδήρου επικαλυμμένων με πολυμερές προκειμένου να διασπάσουν συστάδες βακτηρίων, επιτρέποντας με αυτό τον τρόπο πιο αποτελεσματική θεραπεία έναντι χρόνιων βακτηριδιακών μολύνσεων. Η αλλαγή της επιφάνειας των νανοσωματιδίων που αποτελούνται από πρωτεΐνες έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζει την ικανότητα του νανοσωματιδίου να διεγείρει ανοσολογικές αποκρίσεις. Το γεγονός αυτό λαμβάνεται σοβαρά υπόψη από τους ερευνητές για χρήση σε εισπνεόμενα εμβόλια. Τα νανοσωματίδια οξειδίου του δημητρίου ενεργούν ως αντιοξειδωτικά για την απομάκρυνση των ελεύθερων ριζών οξυγόνου που είναι παρούσες στο αίμα ασθενούς μετά από τραυματική κάκωση. [14], [59] - Εφαρμογές στη Βιομηχανία και στα Υλικά Τα κεραμικά νανοσωματίδια καρβιδίου του πυριτίου όταν διασπείρονται σε μαγνήσιο, παράγουν ένα ισχυρό, ελαφρύ υλικό, που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε εγκαύματα. Ένα συνθετικό δέρμα, που μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην προσθετική, έχει αποδειχθεί ότι έχει τόσο ικανότητα αυτοθεραπείας όσο και ικανότητα ανίχνευσης της πίεσης. Τα πυριτικά νανοσωματίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να παρέχουν ένα φράγμα προς τα αέρια (π.χ. οξυγόνο) ή για να παρέχουν υγρασία σε πλαστικές συσκευασίες προς διατήρηση των προϊόντων και ως εκ τούτου να επιβραδύνουν τη διαδικασία αλλοίωσης ή στεγνώματος. Τέλος, τα νανοσωματίδια αργύρου χρησιμοποιούνται στο ύφασμα για να σκοτώσουν τα βακτήρια, καθιστώντας τα είδη ένδυσης ανθεκτικά σε οσμές. [15] - Εφαρμογές στο περιβάλλον Ερευνητές χρησιμοποιούν φωτοκαταλυτικά νανοσωματίδια οξειδίου του βολφραμίου και του χαλκού για να διασπάσουν το πετρέλαιο προς βιοδιασπώμενες ενώσεις. Τα νανοσωματίδια βρίσκονται σε ένα πλέγμα που παρέχει πλέγμα 35

επιφάνειας μεγάλου εμβαδού για την πραγματοποίηση της αντίδρασης και το οποίο ενεργοποιείται από το ηλιακό φως και μπορεί να λειτουργήσει σε νερό, καθιστώντας έτσι τα νανοσωματίδια χρήσιμα για τον καθαρισμό των πετρελαιοκηλίδων. Τα νανοσωματίδια σιδήρου χρησιμοποιούνται για τον καθαρισμό της ρύπανσης των υπόγειων υδάτων από ουσίες τετραχλωράνθρακα. Πέρα από τα παραπάνω, γίνεται χρήση και των νανοσωματιδίων οξειδίου του σιδήρου για τον καθαρισμό πηγαδιών νερού από αρσενικό. [16] - Εφαρμογές στην ενέργεια και στα ηλεκτρονικά Νανοσωματίδια οξειδίου του τιτανίου χρησιμοποιούνται μαζί με νανοσωματίδια διοξειδίου του άνθρακα για την ανάπτυξη ηλεκτροδίων χαμηλού κόστους για κυψέλες καυσίμων. Αυτό το ηλεκτρόδιο μπορεί να αντικαταστήσει την ακριβή πλατίνα που χρησιμοποιείται ως καταλύτης στις κυψέλες καυσίμου. Ο συνδυασμός νανοσωματιδίων χρυσού με οργανικά μόρια δημιουργεί έναν τρανζίστορ, γνωστό ως NOMFET (Nanoparticle Organic Memory Field Effect Transistor). Αυτός ο τρανζίστορ είναι καινοτόμος, με την έννοια ότι μπορεί να λειτουργήσει με τρόπο παρόμοιο με τις συνάψεις στο νευρικό σύστημα. Έχει δειχθεί επίσης, ότι το ηλιακό φως, που συγκεντρώνεται στα νανοσωματίδια, μπορεί να παράγει ατμό με υψηλή ενεργειακή απόδοση. Αυτή η συσκευή, γνωστή ως «ηλιακή συσκευή ατμού» προορίζεται για χρήση σε περιοχές των αναπτυσσόμενων χωρών που δεν έχουν ηλεκτρικό ρεύμα, για εφαρμογές όπως καθαρισμός νερού ή απολύμανση οδοντιατρικών οργάνων. Νανοσωματίδια πυριτίου χρησιμοποιούνται ως επικαλύψεις σε ηλεκτρόδια ανόδου σε μπαταρίες λιθίου, προς αύξηση της ισχύος της μπαταρίας και μείωση του χρόνου επαναφόρτισής τους. Νανοσωματίδια παλλαδίου χρησιμοποιούνται σε αισθητήρες υδρογόνου. Όταν το υδρογόνο απορροφάται, τα νανοσωματίδια παλλαδίου διογκώνονται, επιφέροντας το σπάσιμό τους. Αυτά τα σπασίματα μειώνουν την αντίσταση του στρώματος παλλαδίου. [17] 2.5 Μεταλλικά Νανοσωματίδια Η φύση προ αμνημόνευτων χρόνων, κατέστησε τα μέταλλα αναπόσπαστο μέρος της καθημερινότητάς μας. Η σύνθεση των μεταλλικών νανοσωματιδίων ειδικότερα, είναι 36

μια ενεργή περιοχή ακαδημαϊκής και κυρίως, περιοχή εφαρμογών, στη νανοτεχνολογία. Τα μεταλλικά νανοσωματίδια βρίσκουν αντίκτυπο σε πολλούς τομείς, όπως στην ηλεκτρονική, στα καλλυντικά, στις επικαλύψεις, στις τεχνικές συσκευασίας καθώς και στη βιοτεχνολογία. [60] Τυπικά, τα νανοσωματίδια διαθέτουν ένα μήκος κύματος κάτω από κρίσιμο μήκος κύματος του φωτός. Αυτή η ιδιότητα τα καθιστά διαφανή, μια ιδιότητα που τα καθιστά πολύ χρήσιμα για εφαρμογές σε καλλυντικά, επιχρυσώσεις και στην συσκευασία. Τα μεταλλικά νανοσωματίδια μπορούν να προσδεθούν στους απλούς κλώνους του DNAχωρίς να τους καταστρέφουν. Αυτό ανοίγει νέες προοπτικές για εφαρμογές στην ιατρική, και συγκεκριμένα στην ιατρική διαγνωστική. Τα κυριότερα νανοσωματίδια μετάλλων προέρχονται από χρυσό και άργυρο. Παρακάτω παρατίθενται εκτενέστερα τα νανοσωματίδια αργύρου, τα οποία αποτελούν και αντικείμενο της παρούσας διπλωματικής εργασίας. [18] Εικόνα 2.5: Παραδείγματα διαλυμάτων νανοσωματιδίων αργύρου, χρυσού, ρουθηνίου και πλατίνας. [18] 2. 6 Νανοσωματίδια Αργύρου 2.6.1 Ιστορική αναδρομή Ο άργυρος έχει χρησιμοποιηθεί από τα αρχαία χρόνια σε πολλούς τομείς. Τα νανοσωματίδια χρυσού αργύρου ευθύνονται για το χρώμα στο κύπελλο του Λυκούργου (Εικόνα 2.6). Ωστόσο, η κυριότερη χρήση του αργύρου ιστορικά, βρισκόταν στον ιατρικό τομέα και ως αντιμικροβιακός / απολυμαντικός παράγοντας. Ασημένια αγγεία χρησιμοποιούνταν στην αρχαία Ελλάδα για να διατηρήσουν το νερό και άλλα υγρά καθαρά και φρέσκα Αν και οι περισσότεροι αρχαίοι πολιτισμοί δεν είχαν πλήρη επίγνωση των αντιβακτηριδιακών ιδιοτήτων του αργύρου, ήταν ευρέως αποδεκτό ότι η προσθήκη αργύρου στο νερό αύξανε τη διαύγεια, την καθαρότητα, μείωνε τις οσμές και βελτίωνε τη γεύση. Σε αρχαίους πολιτισμούς ο 37

άργυρος χρησιμοποιήθηκε σε ποίκιλες εφαρμογές λόγω των ιατρικών, συντηρητικών και επανορθωτικών του δυνάμεων. Πριν ανακαλυφθούν τα σύγχρονα μικροβιοκτόνα και αντιβιοτικά, οι αρχαίοι πολιτισμοί είχαν επίγνωση οι ασθένειες που προκαλούνταν από παθογόνους οργανισμούς δεν υφίσταται παρουσία αργύρου. Εικόνα 2.6: Το κύπελλο του Λυκούργου, ένα δισκοπότηρο ηλικίας 1600 ετών, το οποίο είναι υπαρκτό παράδειγμα μιας από τις πρώτες μορφές νανοτεχνολογίας, και ειδικότερα των νανοσωματιδίων Au Ag με διάμετρο 50 nm.αλλάζει χρώμα από πράσινο σε κόκκινο, ανάλογα με την οπτική γωνία που το βλέπουμε. Ο άργυρος βρήκε επίσης εφαρμογές σε πολλές άλλες ιατρικές θεραπείες και συσκευές, συμπεριλαμβανομένης της οστικής πρόσθεσης, της οφθαλμολογικής χειρουργικής, των θεραπειών για αφροδίσια νοσήματα και στην κτηνιατρική. Η χρήση ακίδων αργύρου για την ασφάλεια των οστών, ασημένια ράμματα για πληγές, άργυρος σε σκόνη για εξελκώσεις και χρήση αλουμινόχαρτου για προστασία των πληγών έναντι μολύνσεων από βακτήρια και παθογόνους μικροοργανισμούς αναφέρθηκαν από αρχαίους χειρούργους. Το 1884 ο Crede, ένας Γερμανός μαιευτικός διέδωσε τη χορήγηση 1% διαλύματος νιτρικού αργύρου στα νεογέννητα μωρά για την πρόληψη οφθαλμολογικών παθήσεων. Πέρα από τα παραπάνω, ο τομέας της κατάλυσης είναι ένας άλλος τομέας όπου βρήκε εφαρμογή ο άργυρος στις αρχές του 20 ου αιώνα. Λίγα παραδείγματα όπου τα ευγενή μέταλλα χρησιμοποιήθηκαν ως καταλύτες περιλαμβάνουν την κατάλυση της μεθανόλης σε φορμαλδεΰδη μέσω αργύρου καθώς και αιθυλενίου σε οξείδιο του αιθυλενίου. [19] 38

2.6.2 Τα νανοσωματίδια Αργύρου σήμερα Βιοϊατρικές εφαρμογές Τα νανοσωματίδια αργύρου, λόγω των μοναδικών ιδιοτήτων τους, βρίσκουν χρήση σε πολλές καθημερινές εφαρμογές στη ζωή του ανθρώπου. Ορισμένα παραδείγματα περιλαμβάνουν την προσθήκη τους σε χημικά οικιακής χρήσεως, σε καθαριστικά υφάσματος, σε επιστρώσεις ανακλαστικών, για βελτίωση της μεταφοράς θερμότητας από τους συλλέκτες ηλιακής ενέργειας στις δεξαμενές καυσίμων για παραγωγή υψηλής απόδοσης ηλεκτρονικών και για χιλιάδες άλλες εφαρμογές. Το νανομέγεθος των σωματιδίων αυξάνει το δυναμικό διείσδυσης των σωματιδίων αργύρου και ως εκ τούτου βοηθά στην καλύτερη εκμετάλλευση των μεταλλικών ιδιοτήτων. Βάση του μεγέθους των σωματιδίων μόνο, τα νανοσωματίδια έχουν την ικανότητα να διαπερνούν το κυκλοφοριακό σύστημα και να μετατοπίζουν ακόμη και το φράγμα αίματος εγκεφάλου στο ανθρώπινο σύστημα. [61] Η αντιμικροβιακή φύση των νανοσωματιδίων αργύρου αποτελεί τη μεγαλύτερη εκμετάλλευση της φύσης των νανοσωματιδίων αυτών στην ιατρική, αν και η αντιφλεγμονώδης δράση θεωρείται εξίσου σημαντική στον ιατροφαρμακευτικό τομέα. Μελέτες έχουν προτείνει ότι η επιτάχυνση της επούλωσης πληγών παρουσία νανοσωματιδίων οφείλεται στη μείωση της δραστηριότητας της μεταλλοπρωτεϊνάσης της τοπικής μήτρας (Matrix Metallo Proteinase) και στην αύξηση της απόπτωσης των ουδετερόφιλων εντός της πληγής. Έχει προταθεί ότι η ΜΜΡ μπορεί να προκαλέσει φλεγμονή και ως εκ τούτου να μη μπορούν να επουλωθούν οι πληγές. Η μείωση των επιπέδων των προ φλεγμονωδών κυτοκινών αποδείχθηκε σε μοντέλο ποντικιού με εγκαύματα με την εισαγωγή νανοσωματιδίων αργύρου. Βρέθηκε επίσης ότι τα νανοσωματίδια αυτά μπορούν να αναστείλουν τις δραστηριότητες της γ ιντερφερόνης καθώς και του παράγοντα νέκρωσης όγκου οι οποίοι εμπλέκονται στη φλεγμονή. Οι αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις που προκαλούνται από τον νανοσίδηρο τον καθιστούν άριστο υποψήφιο για χρήση ως αντιφλεγμονώδη παράγοντα για χρήση σε διάφορες θεραπείες. [20] 2.7 Μέθοδοι σύνθεσης μεταλλικών νανοσωματιδίων 2.7.1 Ηλεκτροχημική Αναγωγή 39

Η ηλεκτροχημική αναγωγή είναι μια μέθοδος όπου το μέταλλο διαλύεται στην άνοδο και το μεταλλικό ιόν που σχηματίζεται ανάγεται στην κάθοδο. Για να αποφευχθεί η εναπόθεση των σχηματιζόμενων νανοσωματιδίων στην κάθοδο (οδηγώντας σε ηλεκτρολυτική επιμετάλλωση), η όλη διαδικασία πραγματοποιείται υπό την παρουσία ενός σταθεροποιητή. Τα νανοσωματίδια του παλλαδίου διαμέτρου 4.8 nmσυντίθενται με αυτή τη μέθοδο ρεύμα 0.1 ma σε τάση 1 Vσε διάλυμα βρωμιούχου τετραοκτυλαμμωνίου με χρήση ακετονιτριλίου και τετραϋδροφουρανίου (THF) ως διαλύτες. Τα νανοσωματίδια που προκύπτουν και τα οποία καταβυθίζονται, θα μπορούσε να γίνει επαναδιασπορά τους σε THFή τολουόλιο. Μια παρόμοια μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για τη σύνθεση νανοσωματιδίων αργύρου όπως θα αναφερθεί λεπτομερώς παρακάτω. [19] 2.7.2 Ραδιολυτική Αναγωγή Η αναγωγή κάτω από διάφορες ακτινοβολίες όπως το Ορατό, το Υπεριώδες (UV), ακτίνες χ και γ, είναι μια άλλη μέθοδος για τη σύνθεση μεταλλικών νανοσωματιδίων. Τα διαλύματα μεταλλικών αλάτων υφίστανται ακτινοβολία παρουσία σταθεροποιητικών παραγόντων. Στη περίπτωση της φωτοαναγωγής με ακτίνες γ, διάφορα είδη δημιουργούνται στο μέσο, ανάλογα με την ενέργεια των φωτονίων που απορροφάται. Το αναγώμενο μέταλλο και η φορμαλδεΰδη είναι τα τελικά προϊόντα της αντίδρασης και αν το διαλυμένο ηλεκτρόνιο μπορεί να χρησιμοποιηθεί, η αντίδραση γίνεται πιο ισχυρή. Νανοσωματίδια χρυσού, χαλκού, κοβαλτίου έχουν συντεθεί με αυτή τη μέθοδο, καθώς και αργύρου όπως θα σχολιαστεί παρακάτω. Η ραδιόλυση γίνεται σε ένα μίγμα μεταλλικού νανοσωματιδίου και υδατικού μεταλλικού ιόντος χρησιμοποιώντας μια πηγή 60 ο C. Η επιφάνεια των μεταλλικών νανοσωματιδίων φορτίζεται λόγω μεταφοράς ηλεκτρονίων από τις παραγόμενες ρίζες. Έτσι, τα νανοσωματίδια αυτά μειώνουν τα μεταλλικά ιόντα που έχουν εναποτεθεί στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων, καταλήγοντας στη δημιουργία γεωμετρίας πυρήνα κελύφους. [19] 2.7.3 Θερμική Αποσύνδεση Οργανομεταλλικών Ενώσεων 40

Η αποσύνθεση του αντίστοιχου καρβονυλίου του μετάλλου μέσω θέρμανσης σε έναν αδρανή διαλύτη σε υψηλή θερμοκρασία παρουσία κατάλληλου παράγοντα σταθεροποίησης είναι ένας άλλος τρόπος για την παραγωγή μεταλλικών νανοσωματιδίων. Για παράδειγμα, θέρμανση του Co 2 (CO) 8 σε δεκαλίνη στους 130 170 ο Cμπορεί να οδηγήσει στη δημιουργία νανοσωματιδίων Co. Συνήθως, τα πολυμερή που περιέχουν άζωτο χρησιμοποιούνται ως σταθεροποιητές στην αντίδραση. Είναι γνωστό ότι ο σταθεροποιητής θα σχηματίσει μακρομόρια που αποτελούνται από συμπλέγματα μετάλλου, όπου τα πολυμερή αυτά δρουν ως παράγοντες συμπλοκοποίησης. Το μέγεθος των σωματιδίων μπορεί να καθοριστεί μεταβάλλοντας τη λειτουργικότητα του πολυμερούς. Διάφορα νανοσωματίδια όπως σιδήρου, αζώτου, χρωμίου και βολφραμίου καθώς και νανοσωματίδια κραμάτων έχουν συντεθεί με τη χρήση διαφόρων πολυμερών. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι συνδέτες (ligands) θα πρέπει να επιλέγονται με προσοχή καθώς πρέπει να είναι σταθεροί σε υψηλές θερμοκρασίες. Μια νέα μετασταθής φάση κοβαλτίου (ε Co) λαμβάνεται μέσω αυτής της μεθόδου. Ο σταθεροποιητής που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μέθοδο ήταν το οξείδιο της τριοκτυλοφωσφίνης. Διάφοροι συνδέτες όπως διβενζυλιδένιο και κυκλοοκτενύλιο έχουν χρησιμοποιηθεί σε διάφορες συνθέσεις. [19] 2.7.4 Σύνθεση υποβοηθούμενη από Μικροκύματα Η μέθοδος της σύνθεσης μεταλλικών νανοσωματιδίων υποβοηθούμενης από μικροκύματα έχει χρησιμοποιηθεί αφθόνως στη σύνθεση μιας ποικιλίας οργανικών και ανόργανων υλικών. Αυτή η μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί τόσο σε περιπτώσεις σύνθεσης και επεξεργασίας. Αυτή η μέθοδος παρουσιάζει το πλεονέκτημα ότι είναι λιγότερο χρονοβόρα και η θέρμανση επιτυγχάνεται εντός. Συνήθως το μίγμα που πρόκειται να υποστεί ακτινοβολία τοποθετείται σε ένα φούρνο μικροκυμάτων ο οποίος τίθεται σε συχνότητα 2450 ΜHzκαι το μίγμα αναδεύεται. Στην περίπτωση των μετάλλων, το μεταλλικό ιόν και το αναγωγικό μέσο σε ένα κατάλληλο διαλύτη τοποθετούνται στον φούρνο και ειδικότερα στην περίπτωση του χρυσού και του αργύρου, αυτή η προσέγγιση είναι γνωστό ότι σχηματίζει δείγματα νανοσωματιδίων υψηλής μονοδιασποράς (σε σύγκριση με τη θερμική αναγωγή). Οι πολυόλες είναι από τα πιο αποτελεσματικά αναγωγικά μέσα για τα μεταλλικά ιόντα 41

χρησιμοποιώντας ακτινοβολία με μικροκύματα και η διαδικασία αυτή αναφέρεται συχνά ως διαδικασία πολυόλης μικροκυμάτων. [19] 2.7.5 Σονόλυση Ακτινοβολία με υπερήχους (τυπικά σε 20 khz) του μίγματος αντίδρασης εφαρμόζεται για τη σύνθεση των νανοσωματιδίων σε αυτή τη μέθοδο. Εδώ, ο σχηματισμός νανοσωματιδίων ορίζεται ως σπηλαίωση, η οποία περιλαμβάνει την διάσπαση των κοιλοτήτων σε πολύ μικρές διαστάσεις σε χρονικά διαστήματα νανοδευτερολέπτων. Αυτό με τη σειρά του οδηγεί στο σχηματισμό τοπικών θερμικών σημείων πολύ υψηλής θερμοκρασίας στην περιοχή των 5000 Κ. Το αντιδραστήριο (μια πρόδρομη ουσία όπως μια οργανομεταλλική ουσία) παγιδεύεται στα σημεία αυτά και κατόπιν αποσυντίθεται σε υψηλή θερμοκρασία. Τα προϊόντα αποσβένονται ακαριαία με το μέσο του διαλύτη που τα περιβάλλει, καταλήγοντας στο σχηματισμό άμορφων νανοσωματιδίων. Μια ποικιλία νανοσωματιδίων μεταβατικών μετάλλων (μετάλλων μετάπτωσης) έχει συντεθεί χρησιμοποιώντας αυτή τη στρατηγική. [19] 2.7.6 Βιολογική Σύνθεση Ως εναλλακτική λύση στη χρήση χημικών, η βιολογική σύνθεση προτάθηκε ως μια ασφαλής και φιλική προς το περιβάλλον προσέγγιση για τη σύνθεση μεταλλικών νανοσωματιδίων. Εδώ, τα νανοσωματίδια συντίθενται χρησιμοποιώντας οργανισμούς που κυμαίνονται από βακτήρια έως μύκητες, διάφορα τμήματα φυτών, βιολογικά εκχυλίσματα κλπ. Ένα σημαντικό πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι αποδίδει νανοσωματίδια καλυμμένα με βιολογικές οντότητες, οι οποίες κατά συνέπεια βελτιώνουν τη βιοσυμβατότητα και έτσι μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε πολλές βιοϊατρικές εφαρμογές. Νανοσωματίδια ευγενών μετάλλων διαφόρων σχημάτων όπως τρίγωνα, σύρματα, σφαίρες, πλάκες κλπ έχουν συντεθεί με αυτή τη μέθοδο. Ένα κλασσικό παράδειγμα αποτελεί η υψηλής απόδοσης σύνθεση λεπτών, επίπεδων, μονοκρυσταλλικών χρυσών νανοτριγώνων (TNPs) με την αναγωγή υδατικών τετραχλωροχρυσικών ιόντων (AuCl 4 ) χρησιμοποιώντας εκχύλισμα λεμονόχορτου (Cymbopogon flexuosus). Ο αναγωγικός παράγοντας σε αυτή την περίπτωση βρέθηκε ότι είναι αλδόζες (αναγωγικά σάκχαρα) που υπάρχουν στο εκχύλισμα του λεμονόχορτου.[19] 42

2.7.7 Υδροθερμική / Σολβοθερμική Μέθοδος Αυτή η μέθοδος περιλαμβάνει τη σύνθεση νανοσωματιδίων σε ένα διαλύτη σε αυξημένες θερμοκρασίες υπό υψηλή πίεση σε μια αεροστεγή λέβη βρασμού. Ο διαλύτης (στις περισσότερες περιπτώσεις νερό) δρα τόσο σαν καταλύτης όσο και περιστασιακά σαν συστατικό στερεών φάσεων. Η μέθοδος αυτή περιλαμβάνει και τη χρήση κι άλλων διαλυτών πέραν του νερού. Σε αυτή τη μέθοδο, οι αρχικές ιδιότητες του νερού μπορούν να τροποποιηθούν εισάγοντας πρόσθετα. Αυτή είναι μια ευπροσάρμοστη στρατηγική όπου ποίκιλα συστήματα διαλύτη, όπως πολικοί διαλύτες (π.χ. υδατικά διαλύματα που περιέχουν HF, ή άλλα οξέα και βάσεις για τη ρύθμιση του ph) ή μη πολικοί διαλύτες (π.χ. καθαροί υπερκρίσιμοι) χρησιμοποιούνται για τη διαδικασία διάλυσης ανακρυστάλλωσης. Διάφορες νανοδομές έχουν συντεθεί χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο. Επίσης, έχουν συντεθεί τεχνολογικά σημαντικές νανοδομές που συντίθενται από Pdκαι Cd κατέχοντας υψηλή ικανότητα αποθήκευσης υδρογόνου. [19] 2.8 Μέθοδοι σύνθεσης νανοσωματιδίων Αργύρου 2.8.1 Ραδιολυτική Αναγωγή Σε αυτή τη μέθοδο, γίνεται σύνθεση νανοσωματιδίων αργύρου, μέσω πραγματοποίησης ακτινοβολίας νιτρικού αργύρου με ακτίνες γ. Συγκεκριμένα, ο νιτρικός άργυρος διαλύεται σε τρεις διαφορετικούς διαλύτες, αποσταγμένο νερό, αιθανόλη και υδατικό διάλυμα C 12 H 25 NaSO 4. Κατάλληλες ποσότητες AgNO 3 διοχετεύονται στους παραπάνω διαλύτες. Κατόπιν τα διαλύματα αυτά υφίστανται σε ακτινοβολία με ακτίνες γ. Τα διαλύματα με τους δυο πρώτους διαλύτες παράγουν ιζήματα χρώματος γκρι και μαύρου αντίστοιχα ενώ το διάλυμα με διαλύτη C 12 H 25 NaSO 4 μετατρέπεται σε καφεκόκκινο κολλοειδές. Αποτέλεσμα της παραπάνω διαδικασίας ήταν η σύνθεση μεταλλικών νανοσωματιδίων Agμε διαφορετικούς βαθμούς διασποράς και διαφορετικό μέγεθος. Από την άλλη πλευρά, στη περίπτωση του C 12 H 25 NaSO 4 τα νανοσωματίδια σχηματίζουν διακλαδίζουσα ελικοειδή δομή με απουσία κέντρου. [21] 2.8.2 Σύνθεση υποβοηθούμενη από Μικροκύματα 43

Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, η ακτινοβολία με μικροκύματα είναι μια από τις νέες καινοτόμες τεχνολογίες που αναπτύχθηκαν τα τελευταία χρόνια για τη σύνθεση στερεών υλικών. Το κύριο πλεονέκτημά της είναι η παραγωγή ομοιόμορφης θέρμανσης του διαλύματος και κατά συνέπεια επίτευξη λιγότερου χρόνου κρυστάλλωσης σε σύγκριση με την κλασσική θέρμανση. Για αυτό καθίσταται μια άριστη τεχνική για τη σύνθεση μεταλλικών κολλοειδών διαλυμάτων μονοδιασποράς. Σε αυτή τη μέθοδο γίνεται σύνθεση νανοσωματιδίων αργύρου μέσω μείωσης των ιόντων Ag + μέσω διμεθυλφορμαμίδης (DMF) παρουσία πολυβινυλπυρρολιδόνης (PVP). Η αναγωγή των Ag + μπορεί να πραγματοποιηθεί αποτελεσματικά είτε με αναρροή είτε με ακτινοβολία με μικροκύματα. Ειδικότερα, η χρήση με μικροκύματα παρέχει έναν επιπλέον βαθμό ελέγχου της διαδικασίας αναγωγής. Η χρήση της PVPμε διαφορετικό μήκος αλυσίδων οδηγεί σε σωματίδια με παρόμοιο μέγεθος αν και με διαφορετικό βαθμό σταθερότητας. Η πρόδρομη ουσία που χρησιμοποιείται σε αυτή τη περίπτωση είναι ο υπερχλωρούχος άργυρος (AgClO 4 ) ενώ η διμεθυλφορμαμίδη χρησιμοποιείται ως διαλύτης και ως παράγοντας αναγωγής. Με αυτή την μέθοδο, ευνοείται η διαδικασία συμπλοκοποίησης των ιόντων με τις αλυσίδες του πολυμερούς, έτσι ώστε η αναγωγή να λαμβάνει μέρος στις αλυσίδες του PVPκαι όχι στο διάλυμα. Τα νανοσωματίδια που σχηματίζονται παραμένουν στις αλυσίδες του πολυμερούς και μειώνεται η ικανότητά τους να προσροφούν ιόντα. [22] 2.8.3 Μέθοδος πολυόλης Η μέθοδος αυτή είναι κατάλληλη για τη σύνθεση μετάλλων σε κλίμακα νανομέτρων ή για οξείδια μετάλλων διαφόρων σχημάτων. Συγκεκριμένα, έχει εφαρμοστεί άπειρες φορές στη σύνθεση νανοσωματιδίων αργύρου με υψηλό βαθμό πολυδιασποράς. Η γενική μέθοδος περιλαμβάνει τη διάλυση ενός προστατευτικού παράγοντα ή σταθεροποιητή σε ένα μέσο πολυόλης. Ο απαιτούμενος πρόδρομος άργυρος προστίθεται κατόπιν στο διάλυμα. Ως πρόδρομη ουσία χρησιμοποιείται ο νιτρικός άργυρος, ο οποίος διαλύεται σε αιθυλενογλυκόλη μαζί με πολυμερέςpvp, το οποίο προστατεύει τα σχηματιζόμενα νανοσωματίδια από συσσωμάτωση. Το διάλυμα έπειτα αναδεύεται συνεχώς και θερμαίνεται σε θερμοκρασίες 100 150 o C. Μετά το πέρας της αντίδρασης το διάλυμα αφήνεται για ψύξη σε θερμοκρασία δωματίου και κατόπιν τα σωματίδια αργύρου διαχωρίζονται από το υπερκείμενο 44

υγρό με φυγοκέντρηση. Ακολουθούνται πολλαπλές πλύσεις με αιθανόλη και τέλος τα σωματίδια αφήνονται προς ξηρασία σε θερμοκρασία δωματίου. [23] 2.8.4 Βιολογική Σύνθεση Όπως έχει ήδη αναφερθεί παραπάνω, τα νανοσωματίδια αργύρου έχουν εξαιρετική αντιμικροβιακή δραστηριότητα ενάντια σε βακτήρια. Αν και ο μηχανισμός με τον οποίο προσβάλλουν τα βακτήρια είναι μερικώς κατανοητός, ένας μηχανισμός που έχει προταθεί αναφέρει ότι τα ιόντα του αργύρου αλληλεπιδρούν με ενώσεις που ανήκουν στην ομάδα των θειολών σε ζωτικά ένζυμα των βακτηρίων και τα απενεργοποιούν. Εκτός από τη μέχρι τώρα χρήση των νανοσωματιδίων αργύρου σε ιατρικά αναλώσιμα, γίνονται έρευνες τα τελευταία χρόνια και για την πιθανή χρήση τους σε συνδυασμό με αντιβιοτικά ώστε να αυξηθεί η δράση τους. [24] Πιο συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε ερευνητικά αύξηση της δραστηριότητας των αντιβιοτικών penicillin G, amoxicillin, erythromycin, clindamicyn και vancomycin εναντίον τωνβακτηρίων S. aureus και E. coli με τη μέθοδο διάχυσης δίσκων, παρουσία νανοσωματιδίων αργύρου τα οποία είχαν παραχθεί μετά από αλληλεπίδραση διαλύματος AgNO3 με συγκέντρωση 10-3 M με καλλιέργεια υπερκείμενου K. Pneumoniae. Εκτός από τη χρήση βακτηρίων, έχουν χρησιμοποιηθεί σε πειράματα σύνθεσης νανοσωματιδίων αργύρου και διάφορα είδη μυκήτων, αποδεικνύοντας με αυτό τον τρόπο τις αντιμυκητικές τους ιδιότητες. Για παράδειγμα, ο Klaus Joerger και οι συνεργάτες του έχουν αποδείξει ότι το βακτήριο Pseudomonas stutzeri το οποίο απομονώνεται από κοίτασμα αργύρου, όταν τοποθετείται σε πυκνό υδατικό διάλυμα AgNO 3, είναι ικανό να μειώνει τα ιόντα Ag + και σχηματίζει νανοσωματίδια αργύρου καλά καθορισμένου σχήματος και διακριτής μορφολογίας εντός του περιπλασμικού χώρου των βακτηρίων. [66] Κεφάλαιο 3 o : Βιοδιασπώμενα Πολυμερή και Δημιουργία 3DΙκριωμάτων 3.1 Εισαγωγή Η μετάβαση από τα βιοσταθερή πολυμερή στα βιοδιασπώμενα πολυμερή για εφαρμογές που απαιτούν την προσωρινή ύπαρξη υλικών στο ανθρώπινο σώμα μπορεί να θεωρηθεί ως ένα κβαντικό άλμα στην επιστήμη των βιοϋλικών. Τα 45

βιοδιασπώμενα πολυμερή είναι εκείνα τα οποία αποικοδομούνται in vitro και in vivo είτε σε προϊόντα τα οποία είναι φυσιολογικοί μεταβολίτες του σώματος, είτε σε προϊόντα τα οποία μπορούν να εξαλειφθούν τελείως από το σώμα, με ή χωρίς περαιτέρω μεταβολικές μετατροπές. [62] Τα βασικά κριτήρια επιλογής ενός βιοδιασπώμενου πολυμερούς ως βιοϋλικό είναι ότι τα προϊόντα της αποικοδόμησής του θα πρέπει να είναι μη τοξικά, και ο ρυθμός αποικοδόμησης καθώς και οι μηχανικές ιδιότητες του υλικού θα πρέπει να ταιριάζουν με το σκοπό της εφαρμογής. Όπως είναι προφανές, τα πλεονεκτήματα των βιοαποικοδομήσιμων πολυμερών σε σύγκριση με τα βιοσταθερή πολυμερή είναι ότι μόλις εμφυτεύονται, αποτρέπουν την ανάγκη για δεύτερη χειρουργική διαδικασία, καθώς και εξαλείφουν το ζήτημα της μακροχρόνιας βιοσυμβατότητας. Επιπροσθέτως, η βιοδιάσπαση μπορεί να προσφέρει και άλλα πλεονεκτήματα σε πολλές βραχυπρόθεσμες ιατρικές εφαρμογές. Έτσι, σε ορθοπεδικές εφαρμογές μηχανικώς ασύμβατα εμφυτεύματα, όπως μεταλλικά εμφυτεύματα μπορούν να μεταφέρουν με αργό βαθμό το φορτίο τους, καθώς το πολυμερές αποικοδομείται. [26] 3.2 Βιοδιασπώμενα Πολυμερή για Ιστική Αναγέννηση Η ιστική βλάβη ή απώλεια λόγω συγγενούς ασθένειας, τραύματος ή ατυχήματος καθώς και οι αποτυχίες οργάνων τελικού σταδίου είναι δύο κύριες αιτίες ασθενειών και θανάτου παγκοσμίως. Οι συμβατικές μέθοδοι θεραπείας που χρησιμοποιούνται είναι η μεταμόσχευση ιστών και οργάνων (αυτομόσχευμα / αλλομόσχευμα ) ή η χρήση μηχανικών βοηθητικών συσκευών. Παρόλο που αυτές οι προσεγγίσεις βοηθούν σημαντικά στη βελτίωση της ποιότητας ζωής των ασθενών και μειώνουν τη θνησιμότητα, εντούτοις παρουσιάζουν σοβαρούς περιορισμούς. Τα αυτομοσχεύματα (ιστός που έχει απομονωθεί από τον ίδιο τον ασθενή) παρουσιάζουν περιορισμούς όπως η νοσηρότητα του δότη καθώς και ο σχετικός κίνδυνος μόλυνσης αλλά και διαθεσιμότητας. Τα αλλομοσχεύματα (ιστός ή όργανο που έχει απομονωθεί από άλλο άτομο του ίδιο είδους) και τα ξενομοσχεύματα (ιστός ή όργανο που απομονώθηκε από άλλο είδος) θέτουν κι εκείνα σοβαρούς περιορισμούς λόγω της ανοσοσυμβατότητας, η οποία υποχρεώνει τους ασθενείς να υποβάλλονται σε δια βίου θεραπεία ανοσοκαταστολής. Η ιστική μηχανική έχει αναδυθεί ως μια καινοτόμη θεραπευτική στρατηγική για την επισκευή ή ανακατασκευή 46

κατεστραμμένων ιστών και οργάνων. Η ιστική μηχανική ορίζεται ως η εφαρμογή αρχών της Βιολογίας, Χημείας και Μηχανικής για επισκευή, αποκατάσταση ή αναγέννηση ζωντανών ιστών χρησιμοποιώντας βιοϋλικά, κύτταρα και αυξητικούς παράγοντες. [62] Οι φυσικοί ιστοί είναι τρισδιάστατες δομές (3D) που συντίθενται από κύτταρα τα οποία περιβάλλονται από την εξωκυττάρια μήτρα (ECM). Η ECM σχηματίζει τη μήτρα υποστήριξης για την παραμονή των κυττάρων και οι επαφές κυττάρου κυττάρου και κυττάρου ECM παίζουν σημαντικό ρόλο στην κυτταρική διαφοροποίηση και λειτουργία. Οι προσεγγίσεις της ιστικής μηχανικής χρησιμοποιεί κυρίως μια δομή κυττάρου μήτρας για την ανάπτυξη λειτουργικών ιστών. Εκτεταμένη έρευνα έχει γίνει για την ανάπτυξη υλικών τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βιώσιμα ικριώματα για Ιστική Μηχανική. Η πρωταρχική λειτουργία ενός ικριώματος είναι η παροχή δομικής υποστήριξης για την καλλιέργεια κυττάρων καθώς και ενός τρισδιάστατου περιβάλλοντος για τον σχηματισμό νέου ιστού. Προκειμένου να υπάρχει δομική υποστήριξη, το υλικό θα πρέπει να κατέχει κατάλληλες μηχανικές ιδιότητες για την συγκεκριμένη εφαρμογή και για το συγκεκριμένο χρονικό διάστημα της εφαρμογής. Στις περισσότερες εφαρμογές μια μήτρα που έχει κατασκευαστεί με τις αρχές της Ιστικής Μηχανικής θα πρέπει να υποβληθεί σε in vivo αποικοδόμηση ώστε να αντικατασταθεί από μια νέα μήτρα η οποία συντίθεται από εξωγενή κύτταρα ή από ενδογενή κύτταρα τα οποία έχουν μεταναστεύσει. Για αυτό το λόγο, τα βιοδιασπώμενα πολυμερή προτιμούνται περισσότερο για την ανάπτυξη κατασκευασμάτων Ιστικής Μηχανικής. Σε κάθε περίπτωση, ο ρυθμός αποικοδόμησης της μήτρας θα πρέπει να είναι υψηλότερος από τη σύνθεση της εξωκυττάριας μήτρας σε βιολογικό περιβάλλον [26] 47

Εικόνα 3.1: Σχηματική αναπαράσταση που δείχνει διαφορετικές στρατηγικές Ιστικής Μηχανικής [27] 3.3 Βιοδιασπώμενα Πολυμερή για Ιστική Μηχανική Οστού Το οστό είναι ένα σύνθετο, υψηλής οργάνωσης, ζωντανό όργανο που σχηματίζει το δομικό πλαίσιο του σώματος και αποτελείται από μια ανόργανη ορυκτή φάση υδροξυαπατίτη (60%) και μια οργανική φάση που αποτελείται κυρίως από κολλαγόνο τύπου Ι. Οι συμβατικές θεραπείες για τραυματισμούς οστών που προκαλούνται από τραύμα ή ασθένεια, περιλαμβάνουν χειρουργική αποκατάσταση, μεταμόσχευση και τεχνητή πρόσθεση. Η Ιστική Μηχανική έχει αναπτύξει μια εναλλακτική θεραπεία για την λύση του προβλήματος της απώλειας οστού. Όπως στην περίπτωση άλλων οργάνων, η Ιστική Μηχανική των οστών χρειάζεται κυτταρικά συστατικά, κυρίως οστεοβλάστες, ένα τρισδιάστατο ικρίωμα για την προσάρτηση, πολλαπλασιασμός και κυτταρική διαφοροποίηση των κυττάρων των οστεοβλαστών και αυξητικούς παράγοντες που ρυθμίζουν την κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση. Το πρωταρχικό κριτήριο για την επιλογή υλικών για Ιστική Μηχανική οστών είναι ότι θα πρέπει να είναι οστεοσυμβατά. Επίσης τα πολυμερικά υλικά θα πρέπει να έχουν υψηλή ικανότητα χύτευσης ώστε να μπορούν να 48

ενσωματωθούν σε πορώδη ικριώματα τα οποία με τη σειρά τους επιτρέπουν τη διάχυση θρεπτικών συστατικών και αποβλήτων. Τα πολυμερικά υλικά επιπλέον πρέπει να παρουσιάζουν μηχανικές ιδιότητες παρόμοιες με εκείνες του οστού. Αρκετά συνθετικά και φυσικά βιοδιασπώμενα πολυμερή έχουν ερευνηθεί ως μήτρες για Ιστική Μηχανική Οστού. Επιπλέον, τα συστατικά αυτών των πολυμερών με ανόργανα ορυκτά όπως ο υδροξυαπατίτης έχουν μελετηθεί εκτενέστερα. Μεταξύ των συνθετικών βιοδιασπώμενων πολυμερών οι αλειφατικοί πολυεστέρες (PLA / PLAGA) έχουν ερευνηθεί για ποίκιλες εφαρμογές. Άλλα πολυμερή όπως τα πολυφωσφαζένια, οι πολυφωσφοεστέρες, τα πολυανθρακικά και οι πολυεστεροουρεθάνες, καθώς και φυσικά πολυμερή όπως το κολλαγόνο, το υαλουρονικό οξύ και η χιτοζάνη μελετώνται ως κατάλληλες μήτρες κυρίως για εφαρμογές που φέρουν χαμηλό φορτίο. [26] 3.4 Βιοδιασπώμενα πολυμερή που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία 3.4.1 Χιτοζάνη Η χιτοζάνη είναι ένα ημικρυσταλλικό γραμμικό πολυμερές (1 4) που αποτελείται από β δεσμούς καταλοίπων γλυκοσαμίνης με κάποιες τυχαίως κατανεμημένες ομάδες Ν ακετυλο γλυκοσαμίνης (Εικόνα 3.2). Η χιτοζάνη διαλύεται πλήρως σε υδατικά διαλύματα με ph μικρότερο του 5, δηλαδή όξινα. Υφίσταται βιοαποικοδόμηση ενζυματικά in vivo με λυσοζύμη σε μη τοξικά προϊόντα. Ο ρυθμός αποικοδόμησης της χιτοζάνης εξαρτάται αντιστρόφως από το βαθμό ακετυλίωσης και κρυσταλλικότητας του πολυμερούς. Η εύκολη δυνατότητα επεξεργασίας της χιτοζάνης σε συνδυασμό με τις ευέλικτες ιδιότητές της την καθιστά ως ένα ελκυστικό υλικό για διάφορες ιατρικές εφαρμογές. [63] Η χιτοζάνη έχει ερευνηθεί ποικιλοτρόπως για ως υλικό επιθεμάτων για τραύματα και εγκαύματα, λόγω της εύκολης εφαρμογής, διαπερατότητας οξυγόνου, απορροφητικότητας νερού, αιμοστατικής ιδιότητας και ικανότητας να επάγει την ιντερλευκίνη από ινοβλάστες, η οποία εμπλέκεται στην μετανάσταση των ινοβλαστών και των ενδοθηλιακών κυττάρων. Η ενσωμάτωση αντιβακτηριακών παραγόντων σε αυτά τα επιθέματα τραυμάτων βελτιώνει σημαντικά την απόδοση της χιτοζάνης. Ο σκοπός της 49

δημιουργίας πορωδών ικριωμάτων μπορεί να διευκολύνει την χρήση σε ευρείες εφαρμογές για αυτό το πολυμερές στην Ιστική Μηχανική. Ειδικότερα, για την Ιστική Μηχανική οστών, η χιτοζάνη είναι κατάλληλος υποψήφιος, διότι υποστηρίζει το κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την έκφραση του φαινότυπου. [26] Εικόνα 3.2: Δομή της χιτοζάνης [26] 3.4.2 Πολυκαπρολακτόνη (PCL) Η πολυκαπρολακτόνη είναι ένας αλειφατικός πολυεστέρας που συντίθενται από επαναλαμβανόμενες ομάδες εξανίου. Είναι ένα ημικρυσταλλικό πολυμερές με βαθμό κρυσταλλικότητας που μπορεί να αγγίξει το 69%. Οι φυσικές, χημικές και μηχανικές ιδιότητές του PCL εξαρτώνται από το μοριακό βάρος και το βαθμό κρυσταλλικότητας. Σε θερμοκρασία δωματίου, το PCL είναι σε υψηλό βαθμό διαλυτό σε χλωροφόρμιο, διχλωρομεθάνιο, τετραχλωράνθρακα, βενζένιο, τολουένιο, και ελαφρώς διαλυτό στην ακετόνη, στη 2 βουτανόνη και ακετονιτρίλιο. Το PCL αποικοδομείται σε διάστημα από μερικούς μήνες έως μερικά χρόνια ανάλογα με το μοριακό βάρος και το βαθμό κρυσταλλικότητας. Επίσης, βρίσκει διάφορες εφαρμογές, όπως στην Ιστική Μηχανική, στη δημιουργία ικριωμάτων και σε συστήματα μακροχρόνιας χορήγησης φαρμάκων. Η ευρεία ικανότητα εφαρμογών του καθώς και οι ενδιαφέρουσες ιδιότητές του (ελεγχόμενη αποικοδόμηση, αναμιξιμότητα με άλλα πολυμερή, βιοσυμβατότητα και δυνατότητα κατασκευής από μονομερή που προέρχονται από ανανεώσιμες πηγές) καθιστά το PCL ένα πολύ χρήσιμο πολυμερές εάν οι ιδιότητές του μπορούν να ελεγχθούν και μπορεί να παρασκευαστεί με οικονομικά προσιτό τρόπο. [28], [63] 50

Εικόνα 3.3: Δομή της πολυκαπρολακτόνης [28] Κεφάλαιο 4 ο : Κύτταρα, Παθογόνοι μικροοργανισμοί και Καλλιέργειες 4.1 Κύτταρο Το κύτταρο αποτελεί τη θεμελιώδη μονάδα της ζωής και μπορεί να οριστεί ως μια συστηματικά οργανωμένη μονάδα μορίων που βρίσκεται σε υψηλή αλληλεπίδραση. Τα κύτταρα περιέχουν μοριακά και βιοχημικά συστήματα υψηλού βαθμού οργάνωσης τα οποία έχουν την ικανότητα να αποθηκεύουν πληροφορίες, και να μεταφράζουν αυτές τις πληροφορίες και να συνθέτουν κυτταρικά μεγαλομόρια. [29] Για την επιτέλεση αυτών των λειτουργιών αυτών τα κύτταρα χρησιμοποιούν διάφορες ενεργειακές πηγές. Επίσης τα κύτταρα μπορούν να μετακινηθούν και έχουν την ικανότητα να μεταβάλλουν τις εσωτερικές βιοχημικές αντιδράσεις τους για να προσαρμοστούν σε περιβαλλοντικές αλλαγές. Τα κύτταρα αναδιπλασιάζονται και μεταβιβάζουν στα νέα κύτταρα τις γενετικές πληροφορίες, τα μοριακά και βιοχημικά συστήματά τους. [65] Οι διαστάσεις των κυττάρων ποικίλλουν από τα βακτήρια, τα οποία έχουν μια μέση διάμετρο 0.5 μmκαι είναι πολύ δύσκολο να παρατηρηθούν στο οπτικό μικροσκόπιο, μέχρι τα αυγά κότας που έχουν διάμετρο μερικά εκατοστόμετρα. Σε μερικούς πολυκύτταρους ζωικούς οργανισμούς τα κύτταρα έχουν διάμετρο μεταξύ 10 και 30 μmενώ στα φυτά η διάμετρος των κυττάρων κυμαίνεται από 10 μmμέχρι μερικές εκατοντάδες μm. Ένα τυπικό ανθρώπινο ηπατοκύτταρο, π.χ., έχει διάμετρο περίπου 20 μmενώ κύτταρο ανά φύλλο καπνού έχει διάμετρο 30 40 μ m(εικόνα 4.1). 51

Εικόνα 4.1: Η οργάνωση του κυττάρου [30] 4.2 Παθογόνοι μικροοργανισμοί Μικρόβια ή μικροοργανισμοί χαρακτηρίζονται εκείνοι οι οργανισμοί τους οποίους δεν μπορούμε να δούμε με γυμνό οφθαλμό, γιατί έχουν μέγεθος μικρότερο από 0.1 mm. Οι μικροοργανισμοί διακρίνονται σε παθογόνους, μη παθογόνους και δυνητικά παθογόνους. Οι παθογόνοι μικροοργανισμοί είναι εκείνοι που προκαλούν ασθένειες στον άνθρωπο και απειλούν τη δημόσια υγεία. Μη παθογόνοι καλούνται εκείνοι που δεν είναι επικίνδυνοι για τον άνθρωπο και συνήθως η ύπαρξή τους είναι ωφέλιμη για τη ζωή, ενώ οι δυνητικά παθογόνοι άλλοτε συμπεριφέρονται ως παθογόνοι και άλλοτε ως μη παθογόνοι. [31] 52

Εικόνα 4.2: Όλα τα βακτήρια έχουν κοινά χαρακτηριστικά της απουσίας πυρήνα, της ύπαρξης κυκλικού DNA καθώς και μικρότερων ριβοσωμάτων. Διαφέρουν όμως όσον αφορά το μέγεθος, τη σύσταση του κυτταρικού τοιχώματος και τα τροφικά μοτίβα. Στην εικόνα παρατίθενται διάφορες κατηγορίες βακτηρίων [32] 4.3Κυτταρικές καλλιέργειες Οι κυτταροκαλλιέργειες αφορούν τις in vitro καλλιέργειες κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες (διατήρηση ή πολλαπλασιασμός) των κυττάρων, ιστών ή και οργάνων. Οι κυτταροκαλλιέργειες διακρίνονται συνεπώς στις τρεις παραπάνω κατηγορίες των κυττάρων, ιστών και οργάνων. Στις ιστοκαλλιέργειες γίνεται in vitroδιατήρηση ή ανάπτυξη κυττάρων ιστών ή οργάνων για περισσότερες από 24 ώρες. Στις κυτταροκαλλιέργειες τα κύτταρα δεν διατηρούν τη χαρακτηριστική οργάνωση του ιστού από τον οποίο προέρχονται ενώ στις οργανοκαλλιέργειες υποστηρίζεται η διατήρηση διαφοροποίησης ή δομής ή λειτουργίας. Οι καλλιέργειες αυτές είναι ζωτικής σημασίας για την πραγματοποίηση επιστημονικών ερευνών, διότι μας δίνουν τη δυνατότητα να μελετήσουμε τη συμπεριφορά και τις διεργασίες των κυττάρων σε διαφορετικά περιβάλλοντα, περιορίζοντας με αυτό τον τρόπο τη χρήση των πειραματόζωων. Επίσης, μας 53

βοηθούν να μελετάμε τις μεταλλαγμένες πρωτεΐνες και να τις συγκρίνουμε με τις φυσιολογικές ώστε να κατανοήσουμε τη λειτουργία τους. Οι καλλιέργειες των κυττάρων όμως, πέρα από τα παραπάνω, συμβάλλουν στην παραγωγή φαρμακευτικών ουσιών και συγκεκριμένα την παραγωγή ορμονών, ενζύμων και άλλων ουσιών με θεραπευτική δράση. Τα θρεπτικά υλικά που χρησιμοποιούνται στις κυτταροκαλλιέργειες διακρίνονται σε στερεά και υγρά. Τα υγρά θρεπτικά υλικά περιέχουν θρεπτικές ουσίες για την ανάπτυξη μικροοργανισμών (κυρίως πηγές άνθρακα όπως είναι η γλυκόζη ή λακτόζη), αμινοξέα, ATP. Το phτων θρεπτικών υλικών σταθεροποιείται σε συγκεκριμένη τιμή και αντιβιοτικά (για την αποφυγή επώασης ανεπιθύμητων μικροοργανισμών). Από την άλλη πλευρά, τα στερεά θρεπτικά υλικά έχουν τα ίδια χαρακτηριστικά με τα υγρά, με τη διαφορά ότι στο θρεπτικό υλικό ή ζωμό προστίθεται στερεοποιητικό υλικό, ο λεγόμενος πολυσακχαρίτης άγαρ που στερεοποιείται σε θερμοκρασίες κάτω από 45 o C. Τα πιο γνωστά θρεπτικά υλικά που χρησιμοποιούνται είναι τα ΒΜΕ, ΜΕΜ και το Μ199, τα Earle s και Hank s τα οποία είναι εμπλουτισμένα σε αμινοξέα, βιταμίνες και άλλα προϊόντα (αυξητικοί παράγοντες) Η διαδικασία της κυτταροκαλλιέργειας ξεκινά με τη διαδικασία του εμβολιασμού κατά την οποία με ένα αποστειρωμένο στυλεό «βαπτίζουμε» τη υγρή ή στερεή καλλιέργειά μας. Ο στυλεός περιέχει ένα μικρό αριθμό κυττάρων τα οποία θέλουμε να καλλιεργήσουμε δηλαδή να πολλαπλασιάσουμε και κατόπιν τοποθετούμε τα τρυβλία με το θρεπτικό υλικό και τα κύτταρα στον επωαστήρα για επώαση. 4.4 Μικροβιακές καλλιέργειες Τα μικρόβια για να αναπτυχθούν και να πολλαπλασιαστούν έχουν ανάγκη από θρεπτικές ουσίες και κατάλληλη θερμοκρασία και ατμόσφαιρα. Από τη μεταβολική τους δραστηριότητα τα μικρόβια αλλοιώνουν το θρεπτικό υπόστρωμα και μεταβάλλουν την αρχική του όψη (θόλωση, παραγωγή αερίου, διάσπαση σακχάρων, μεταβολή ph). Έτσι παίρνουμε πολύτιμα στοιχεία για τις ιδιότητες γενικά των μικροβίων. Τα θρεπτικά υλικά χρησιμοποιούνται στη μικροβιολογία για την ανάπτυξη και ανεύρεση των παθογόνων μικροβίων μέσα σε φυσιολογικά ή παθογόνα εκκρίματα του ανθρώπινου οργανισμού. Αυτό επιτυγχάνεται με τη σπορά των εκκριμάτων π.χ. ούρων, πύου, φαρυγγικού εκκρίματος κ.ά., στα κατάλληλα 54

θρεπτικά υλικά στα οποία γίνεται η ανάπτυξη των παθογόνων μικροβίων και επομένως η απομόνωση τους και η ταυτοποίησή τους. Ένα εργαστήριο πρέπει να έχει οπωσδήποτε τα κοινά θρεπτικά ή συνήθη θρεπτικά υλικά: Θρεπτικό ζωμό. Παρασκευάζεται από εκχύλισμα κρέατος μοσχαριού, πεπτόνη και χλωριούχο νάτριο, που διαλύονται σε απεσταγμένο νερό. Θρεπτικό άγαρ. Περιέχει τα ίδια συστατικά με το ζωμό και άγαρ σε αναλογία 1,5-2 gr% Πεπτονούχο ύδωρ. Περιέχει πεπτόνη και χλωριούχο νάτριο σε απεσταγμένο νερό. Οι πεπτόνες είναι προϊόντα υδρολύσεως πρωτεϊνών και τις παίρνουμε κυρίως από το κρέας, τα ψάρια, το γάλα και εκχυλίσματα ζυμομυκήτων. Αιματούχο άγαρ: αναπτύσσονται όλα τα αερόβια μικρόβια. Για να πραγματοποιηθεί μια μικροβιακή καλλιέργεια, γίνεται τοποθέτηση του θρεπτικού υλικού σε τρυβλία, και κατόπιν με μια διαδικασία που λέγεται εμβολιασμός ή ενοφθαλμισμός ή σπορά, γίνεται η τοποθέτηση του παθογόνου υλικού στο θρεπτικό υλικό. Ακολουθείται, ανάλογα με το θρεπτικό υλικό που έχουμε και το σκοπό που θέλουμε να πετύχουμε, συγκεκριμένη τεχνική διαδικασία για να πετύχουμε καλύτερη απομόνωση των μικροβίων, εξασφαλίζοντας παράλληλα άσηπτες συνθήκες. Ο ενοφθαλμισμός στα θρεπτικά υλικά γίνεται όταν θέλουμε να εμβολιάσουμε μικρή ποσότητα υλικού ή όταν γίνεται ανακαλλιέργεια από στερεό υλικό. Γίνεται συνήθως με τη βοήθεια ενός κρίκου αλλά μπορεί επίσης στις πρωτοκαλλιέργειες να γίνει με βαμβακοφόρο στειλεό και με πιπέτα όταν θέλουμε να εμβολιάσουμε μεγαλύτερη ποσότητα μικροβιακού εναιωρήματος. [33] 55

Εικόνα 4.3: Τρυβλία με θρεπτικό άγαρ για καλλιέργεια αποικιών Gramαρνητικών βακτηρίων [34] 4.5 Άργυρος και Αντιμικροβιακή Δράση Είναι ευρέως γνωστό πως τα ιόντα αργύρου καθώς και οι ενώσεις που βασίζονται σε άργυρο, όπως και τα αντίστοιχα άλατα έχουν ισχυρές αντιμικροβιακές δράσεις και πολλοί ερευνητές εστιάζουν το ενδιαφέρον τους στην χρήση αυτού του υλικού σε αντιμικροβιακά και αντιβακτηριακά τεστ. Ο άργυρος καθώς και άλλα ανόργανα μεταλλικά στοιχεία παρουσιάζουν σημαντικά πλεονεκτήματα στη νανοκλίμακα έναντι των συμβατικών χημικών αντιμικροβιακών παραγόντων. Συγκεκριμένα, το πιο σημαντικό πρόβλημα που προκαλείται από τους χημικούς αυτούς παράγοντες είναι η ανθεκτικότητα τους σε πολλά φάρμακα. Γενικά, ο αντιμικροβιακός μηχανισμός των χημικών παραγόντων εξαρτάται από την ειδική σύνδεση και με την επιφάνεια και τον μεταβολισμό των παραγόντων στο εσωτερικό των μικροοργανισμών. Διάφοροι μικροοργανισμοί έχουν επιδείξει αντίσταση σε φάρμακα σε πολλές γενεές. Αυτοί οι αντιμικροβιακοί παράγοντες που βασίζονται σε χημικές ουσίες έχουν αποδειχθεί αποτελεσματικοί για θεραπεία. Ωστόσο, υπάρχει περιορισμός τους στη χρήση ιατρικών συσκευών και για την προφύλαξη στις αντιμικροβιακές εγκαταστάσεις. 56

Για αυτό το λόγο, μια εναλλακτική λύση για να ξεπεραστεί το πρόβλημα της ανθεκτικότητας των μικροοργανισμών είναι επιτακτικής ανάγκης, ειδικά στις ιατρικές συσκευές. Τα ιόντα αργύρου και τα άλατά τους έχουν χρησιμοποιηθεί επί δεκαετίες ως αντιμικροβιακοί παράγοντες σε πολλούς τομείς λόγω της ικανότητας αναστολής ανάπτυξης των μικροοργανισμών. [35] 4.5.1 Μηχανισμός δράσης AgNO 3 / Ag + Ο ακριβής μηχανισμός δράσης του αργύρου στα μικρόβια δεν είναι ακόμη απόλυτα κατανοητός. Ωστόσο, έχει προταθεί πιθανός μηχανισμός του μεταλλικού αργύρου, των ιόντων του καθώς και των νανοσωματιδίων αργύρου. Πιο αναλυτικά, ο μηχανισμός δράσης του νιτρικού αργύρου / ιόντων αργύρου βασίζεται στο γεγονός πως όταν τα μόρια του DNAβρίσκονται σε κατάσταση χαλάρωσης, μπορεί να γίνει διπλασιασμός του DNA. Όμως, όταν το DNA βρίσκεται συμπτυσμένο, χάνει την ικανότητα διπλασιασμού και έτσι, όταν τα ιόντα του αργύρου διεισδύουν στο βακτηριακό κύτταρο το μόριο DNAμετατρέπεται στην συμπτυσμένη μορφή του χάνοντας με αυτό τον τρόπο την ικανότητα διπλασιασμού, καταλήγοντας στην απόπτωση. Επίσης, έχει προταθεί πως τα βαρέα μέταλλα αντιδρούν με πρωτεΐνες μέσω της πρόσδεσης με τις ομάδες θειολών και οι πρωτεΐνες μετουσιώνονται και κατά συνέπεια καταστρέφονται. [36] 4.5.2 Μηχανισμός δράσης νανοσωματιδίων Αργύρου Τα νανοσωματίδια αργύρου δείχνουν αποτελεσματικές αντιμικροβιακές ιδιότητες σε σύγκριση με άλλα υλικά, εξαιτίας της εξαιρετικά μεγάλης επιφανειακής περιοχής, η οποία παρέχει καλύτερη επαφή με τους μικροοργανισμούς. Τα νανοσωματίδια προσδένονται στην κυτταρική μεμβράνη και επίσης διεισδύουν μέσα στα βακτήρια. Η βακτηριακή μεμβράνη περιέχει θειούχες πρωτεΐνες και τα νανοσωματίδια αργύρου αλληλεπιδρούν με αυτές τις πρωτεΐνες στο κύτταρο καθώς και με τις φωσφορούχες ενώσεις όπως το DNA. Όταν τα νανοσωματίδια αργύρου εισάγονται στο βακτηριακό κύτταρο, αυτό σχηματίζει μια περιοχή χαμηλού μοριακού βάρους στο κέντρο του βακτηρίου. Το υλικό του βακτηρίου συγκεντρώνεται σε αυτή την περιοχή, με σκοπό να προστατέψει το DNAαπό τα νανοσωματίδια. Αυτά κατά προτίμηση επιτίθενται στην αλυσίδα αναπνοής και στην κυτταρική διαίρεση με τελικό αποτέλεσμα τον κυτταρικό θάνατο. Τα νανοσωματίδια απελευθερώνουν ιόντα αργύρου στο 57

εσωτερικό του βακτηριακού κυττάρου, ιδιότητα που ενισχύει την αντιβακτηριδιακή τους δράση. [36] Εικόνα 4.4: Εικόνες ΤΕΜ κυττάρου E. Coli, στο οποίο έχει γίνει επεξεργασία με νανοσωματίδια αργύρου σε θρεπτικό υλικό LB (Luria Bertani). Δεξιά γίνεται μεγαλύτερη ανάλυση όπου τα βέλη δείχνουν την πρόσδεση των νανοσωματιδίων στην κυτταρική μεμβράνη. [37] 58

ΙΙ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 59

Κεφάλαιο5 ο : Τεχνικές Χαρακτηρισμού που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία 5.1 Ατομική Μικροσκοπία Δυνάμεων (Atomic Force Microscopy) Το σύστημα Ατομικής Μικροσκοπίας Δυνάμεων έχει εξελιχθεί σε ένα εργαλείο χρήσιμο για άμεσες μετρήσεις διαμοριακών δυνάμεων με χαρακτηρισμό ατομικής ανάλυσης, το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε ένα ευρύ φάσμα εφαρμογών όπως ηλεκτρονικά, ημιαγωγοί, υλικά και κατασκευές, πολυμερή, βιολογία και βιοϋλικά. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 13, ένα τυπικό σύστημα AFM αποτελείται από έναν μικρό μηχανικό ανιχνευτή (probe) και μια αιχμηρή άκρη (tip) η οποία τοποθετείται σε έναν πιεζοηλετρικό (PZT) ενεργοποιητή και μια θέση ευαισθησίας σε ανίχνευση του φωτός για λήψη μιας δέσμης λέιζερ η οποία αντικατοπτρίζεται από το τελικό σημείο της δέσμης για την παροχή αντανάκλασης. Η αρχή λειτουργίας του AFM είναι να ανιχνεύσει την άκρη (tip) πάνω από την επιφάνεια του δείγματος με μηχανισμούς ανάδρασης οι οποίοι επιτρέπουν στους σαρωτές PZT να διατηρούν την άκρη σε μια σταθερή δύναμη, ή σταθερό ύψος πάνω από την επιφάνεια του δείγματος. Καθώς η άκρη σαρώνει την επιφάνεια του δείγματος, που κινείται πάνω και κάτω με το περίγραμμα της επιφάνειας, η δέσμη λέιζερ που αντανακλάται από το έλασμα παρέχει μετρήσεις της διαφοράς στις εντάσεις του φωτός μεταξύ των άνω και κάτω ανιχνευτών φωτογραφίας. Η ανατροφοδότηση από το σήμα διαφοράς φωτοδιόδου, μέσω ελέγχου του λογισμικού του υπολογιστή, επιτρέπει στην άκρη να διατηρήσει σταθερή είτε τη δύναμη, είτε το ύψος πάνω στο δείγμα. Στη λειτουργία σταθερής δύναμης, ο μετατροπέας του PZT ανιχνεύει την απόκλιση του ύψος σε πραγματικό χρόνο, ενώ στη λειτουργία σταθερού ύψους, καταγράφεται η δύναμη απόκλισης στο δείγμα. [38] 60

Εικόνα 5.1: Σχηματική αναπαράσταση της βασικής λειτουργίας του AFM (αριστερά), και της δέσμης λέιζερ (δεξιά). [38] 5.2 Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (Scanning Electron Microscope) Το μικροσκόπιο ηλεκτρονικής σάρωσης (SEM) είναι ένας τύπος ηλεκτρονικού μικροσκοπίου το οποίο παράγει εικόνες ενός δείγματος με σάρωση του με εστιασμένη δέσμη ηλεκτρονίων. Τα ηλεκτρόνια αλληλεπιδρούν με άτομα στο δείγμα, παράγοντας διάφορα σήματα τα οποία περιλαμβάνουν πληροφορίες για την τοπογραφία της επιφάνειας του δείγματος και τη σύνθεσή του. Η δέσμη ηλεκτρονίων γενικά σαρώνεται σε ένα πρότυπο ράστερ σάρωσης, και η θέση της δέσμης συνδυάζεται με το ανιχνευόμενο σήμα ώστε να παράγει μια εικόνα. Με SEM μπορεί να επιτευχθεί ανάλυση καλύτερη από ένα νανόμετρο. Τα δείγματα μπορούν να παρατηρηθούν σε υψηλό ή χαμηλό κενό, σε υγρές συνθήκες (περιβαλλοντική SEM) και σε ένα ευρύ φάσμα κρυογονικών ή υψηλότερων θερμοκρασιών. Η πιο κοινή λειτουργία της SEM είναι η ανίχνευση δευτεροταγών ηλεκτρονίων που εκπέμπονται από άτομα τα οποία διεγείρονται από τη δέσμη ηλεκτρονίων. Ο αριθμός των δευτεροταγών αυτών ηλεκτρονίων που μπορούν να ανιχνευθούν, εξαρτάται μεταξύ άλλων, και από τη τοπογραφία του δείγματος. Με τη σάρωση του δείγματος και τη συλλογή των δευτεροταγών ηλεκτρονίων που διεγείρονται χρησιμοποιώντας 61

έναν ειδικό ανιχνευτή, δημιουργείται μια εικόνα που εμφανίζει την τοπογραφία της επιφάνειας. Για τη συμβατική απεικόνιση στο SEM, τα δείγματα πρέπει να είναι ηλεκτρικά αγώγιμα, τουλάχιστον στην επιφάνεια, και ηλεκτρικά γειωμένα ώστε να αποτρέψουν την συσσώρευση ηλεκτροστατικού φορτίου στην επιφάνεια. Τα μεταλλικά αντικείμενα απαιτούν λίγο ιδιαίτερη προετοιμασία για SEM, εκτός από τον καθαρισμό και την τοποθέτηση στο στέλεχος δείγματος. [40] Εικόνα 5.2: Αριστερά: Αρχή λειτουργίας SEM. Δεξιά: Θάλαμος εισαγωγής δείγματος [40] 5.3 Γωνία Επαφής (Contact Angle) Η γωνία επαφής είναι η γωνία, που συμβατικά μετριέται μέσω του υγρού, όπου μια διεπιφάνεια υγρού αερίου συναντά μια στερεή επιφάνεια. Μετράει ποσοτικά τη διαβρεξιμότητα μιας στερεάς επιφάνειας από ένα υγρό μέσω της εξίσωσης Young. Ένα δεδομένο σύστημα στερεού, υγρού και αερίου σε μια συγκεκριμένη θερμοκρασία και πίεση έχει μια μοναδική γωνία επαφής ισορροπίας. Ωστόσο, στην πράξη παρατηρείται υστέρηση στη γωνία επαφής που κυμαίνεται από τη λεγόμενη γωνία προώθησης (μέγιστη επαφή) έως την γωνία υποχώρησης (ελάχιστη επαφή). Η επαφή ισορροπίας εντάσσεται μεταξύ αυτών των δύο ακραίων τιμών και μπορεί να υπολογιστεί από αυτές. Η γωνία επαφής ισορροπίας αντανακλά τη σχετική ισχύ του υγρού, στερεού και τη μοριακή αλληλεπίδραση του ατμού. [41] Η θεωρητική περιγραφή της επαφής προκύπτει από την εξέταση μιας θερμοδυναμικής ισορροπίας μεταξύ των τριών φάσεων: την υγρή φάση (L), τη στερεά φάση (S) και την αέρια (G) (η οποία θα μπορούσε να είναι ένα μίγμα από ατμόσφαιρα περιβάλλοντος και μια συγκέντρωση ισορροπίας του υγρού ατμού). Εάν η διεπιφανειακή ενέργεια στερεού ατμού συμβολίζεται με γ SG, η διεπιφανειακή 62

ενέργεια στερεού υγρού με γ SL και η διεπιφανειακή ενέργεια υγρού ατμού με γ LG, τότε η γωνία επαφής ισορροπίας θ προσδιορίζεται από τις τρεις παραπάνω ποσότητες σύμφωνα με την εξίσωση του Young: γ SG - γ SL - γ LG cosθ c = 0 Εικόνα 5.3: Σχηματική αναπαράσταση μιας σταγόνας υγρού πάνω σε μια επιφάνεια με τις τρεις προαναφερθείσες διεπιφανειακές ενέργειες [41] Εάν τα μόρια του υγρού έλκονται ισχυρά από τα μόρια του στερεού, τότε η σταγόνα του υγρού θα απλωθεί εντελώς πάνω στην στερεά επιφάνεια, που αντιστοιχεί σε γωνία επαφής 0 ο. Αυτό ισχύει συχνά για την περίπτωση σταγόνας νερού πάνω σε μια γυμνή μεταλλική ή κεραμική επιφάνεια αν και η παρουσία ενός στρώματος οξειδίου ή προσμίξεων στην στερεή επιφάνεια μπορεί να αυξήσει σημαντικά τη γωνία επαφής. Γενικά αν η γωνία επαφής του νερού είναι μικρότερη από 90 ο, η στερεά επιφάνεια θεωρείται υδρόφιλη, ενώ αν είναι μεγαλύτερη από 90 ο, θεωρείται υδρόφοβη. Πολλά πολυμερή εμφανίζουν υδρόφοβες επιφάνειες. Εικόνα 5.4: Αριστερά: εικόνα από κάμερα οργάνου μέτρησης της γωνίας επαφής, με σταγόνα νερού να πέφτει σε γυάλινη επιφάνεια. Δεξιά: Σταγόνα νερού πάνω σε επιφάνεια φύλλου λοτού με γωνία επαφής 147 ο [41] 63

5.4 Περίθλαση Ακτινών Χ (X Ray Diffraction) Τεχνική για τη μελέτη των κρυσταλλικών δομών και την απόσταση μεταξύ των ατόμων. Βασίζεται στην παρεμβολή μονόχρωμων ακτινών Χ σε ένα κρυσταλλικό δείγμα. Οι ακτίνες X συμπεριφέρονται σαν δημιουργοί της απεικόνισης της κρυσταλλικής δομής, όταν αυτές περιθλώνται σε έναν κρύσταλλο. Έτσι αν ακτίνες Χ πέσουν σε ένα επίπεδο ατόμων με γωνία πρόσπτωσης θ, οι ακτίνες θα διαπεράσουν τα στρώματα των ατόμων και θα δώσουν την απεικόνιση τους. Η αλληλεπίδραση των ακτινών με το δείγμα παράγει την περίθλαση ακτινών Χ όταν οι συνθήκες ικανοποιούν το Νόμο του Bragg (nλ=2d sinθ), όπου λ το μήκος κύματος της ακτινοβολίας, θ η γωνία και d η απόσταση. Αυτή η περίθλαση των ακτινών Χ ανιχνεύεται και στη συνέχεια επεξεργάζεται. Είναι προφανές ότι ένας τύπος κρυστάλλου μπορεί να οριστεί ως προς τα μήκη των πλευρών της μοναδιαίας κυψελίδας του και τις γωνιές μεταξύ των όψεων. Δεδομένου ότι κάθε υλικό αποτελείται από μια μοναδική διάταξη και αριθμό ατόμων, κάθε υλικό θα δώσει ένα μοναδικό πρότυπο περίθλασης. Με τη σάρωση του δείγματος εντός ενός εύρους 2θ γωνιών, όλες οι πιθανές κατευθύνσεις περίθλασης του πλέγματος επιτυγχάνονται, λόγω του τυχαίου προσανατολισμού του υλικού. Μετατροπή των κορυφών περίθλασης σε αποστάσεις d επιτρέπει την αναγνώριση του υλικού, καθώς όπως προαναφέρθηκε κάθε υλικό έχει ένα σύνολο μοναδικών αποστάσεων d. Τυπικά, αυτό επιτυγχάνεται με σύγκριση των αποστάσεων d με βιβλιογραφικά πρότυπα περίθλασης. [42] 5.5 Μέθοδος Ηλεκτροστατικού Ψεκασμού για Δημιουργία Νανοσωματιδίων (Electrospraying System) Το Electrospinning είναι μια απλή τεχνική για την παραγωγή nonwoven μικρο- ή νανο-ινώδων δομών, και βασίζεται στην εφαρμογή υψηλής τάσης σε ένα πολυμερικό διάλυμα, προκειμένου να δημιουργήσει ένα ηλεκτρικά φορτισμένο πίδακα (jet) που συλλέγεται τυχαία σε ένα γειωμένο στόχο. Η τεχνολογία του Electrospinning είναι μια απλή και ευέλικτη μέθοδος παρασκευής εξαιρετικά λεπτών ινών από πολυμερή διαλύματα ή τήγματα. Οι παραγόμενες ίνες έχουν συνήθως διάμετρο από μερικά nm έως μερικά μm, και ως επί το πλείστον εκατοντάδες nm. Οι electrospun πολυμερικές νανοΐνες έχουν πολλές εξαιρετικές ιδιότητες, συμπεριλαμβανομένων των μικρών διαμέτρων, τη μεγάλη ειδική επιφάνεια, ένα υψηλό βαθμό δομικής τελειότητας (high 64

degree of structural perfection) και τις προκύπτουσες ανώτερες μηχανικές ιδιότητες. Επιπροσθέτως, οι nonwoven πολυμερείς δομές προσφέρουν μια μοναδική ικανότητα να ελέγχουν τα μεγέθη των πόρων μεταξύ των ινών. Πολλές μελέτες έχουν αποδείξει την ικανότητα των νανοϊνόδων υλικών να καθοδηγήσουν την αρχική προσκόλληση των κυττάρων και στην εξάπλωσή τους πάνω στο υλικό, καθώς και την περαιτέρω ενεργοποίησή τους έτσι ώστε να εκκρίνουν τα κατάλληλα ECM μόρια που στοχεύουν στο δέρμα, τα αιμοφόρα αγγεία, τους χόνδρους, τους μύες, τα λιπώδη, τα νεύρα και τα οστά. Τα Electrospun νανοϊνώδη ικριώματα μιμούνται την αρχιτεκτονική και τις βιολογικές λειτουργίες του ECM, και θεωρούνται πολύ ελπιδοφόρα υποστρώματα για τη μηχανική ιστών. Στη παρούσα εργασία, για την παρασκευή των νανοσωματιδίων αργύρου, χρησιμοποιήθηκε το σύστημα Ηλεκτροψεκασμού Εναπόθεσης (esprayer ES-2000S Fuence Co., Ltd) (Εικόνα 5.5) που διαθέτει το εργαστήριο LTFN. [43] Εικόνα 5.5: Σύστημα Ηλεκτροψεκασμού του Εργαστηρίου LTFN 5.6 Σύστημα Ηλεκτροστατικής Ινοποίησης για Δημιουργία Ινών (Electrospinning System) Η διαδικασία χρησιμοποίησης ηλεκτροστατικών δυνάμεων για τον σχηματισμό συνθετικών ινών είναι γνωστή για πάνω από 100 χρόνια. Αυτή η διαδικασία, γνωστή ως ηλεκτροστατική Ινοποίηση (Electrospinning), χρησιμοποιεί μια πηγή υψηλής τάσης για την έγχυση φορτίου συγκεκριμένης πολικότητας στο πολυμερικό διάλυμα ή τήγμα, το οποίο στη συνέχεια επιταχύνεται ως προς ένα συλλέκτη αντίθετης πολικότητας. Καθώς η ηλεκτροστατική έλξη μεταξύ του αντίθετα φορτισμένου 65

υγρού και του συλλέκτη και οι ηλεκτροστατικές απώσεις μεταξύ των όμοιων φορτίων στο υγρό γίνονται ισχυρότερες από το πρόσθιο άκρο του διαλύματος, αλλάζει από ένα στρογγυλεμένο μηνίσκο σε ένα κώνο (Taylor cone). Ένας πίδακας ινών τελικά εκτοξεύεται από τον κώνο Taylor καθώς η δύναμη του ηλεκτρικού πεδίου υπερβαίνει τις επιφανειακές τάσεις του υγρού (Εικόνες 5.6 και 5.7). [44] Εικόνα 5.6: Η κατανομή του φορτίου στην ίνα και καθώς η ίνα στεγνώνει κατά τη διάρκεια της πτώσης [44] Εικόνα 5.7: Κώνος Taylor [44] Ο πίδακας των ινών ταξιδεύει μέσω της ατμόσφαιρας επιτρέποντας τον διαλύτη να εξατμιστεί με αποτέλεσμα την εναπόθεση των στερεών πολυμερικών ινών πάνω στον συλλέκτη. Οι ίνες που παράγονται χρησιμοποιώντας αυτή τη διαδικασία τυπικά έχουν διαμέτρους τάξης μεγέθους από μερικά μικρά μέχρι κάποιες δεκάδες νανόμετρων. Η ικανότητα να παράγονται υλικά με ευκολία σε μεγέθη της κλίμακας των βιολογικών υλικών έχει δημιουργήσει ένα νέο ενδιαφέρον για την τεχνική 66

Electrospinning, ειδικά για εφαρμογές ιστικής αναγέννησης (tissue engineering) και στοχευμένης μεταφοράς φαρμάκου (drug delivery). Μια τυπική εγκατάσταση Electrospinning αποτελείται από ένα τριχοειδή σωλήνα μέσω του οποίου το υγρό ωθείται για να υποστεί ηλεκτροστατική ινοποίηση, μια υψηλή πηγή τάσης με θετική ή αρνητική πολικότητα, η οποία εγχέει φορτίο στο υγρό και ένα γειωμένο συλλέκτη (Εικόνα 5.8). Μία αντλία σύριγγας, οι βαρυτικές δυνάμεις, ή πεπιεσμένο αέριο χρησιμοποιείται συνήθως για να αναγκάσει το υγρό μέσω μιας μικρής διαμέτρου του τριχοειδούς να σχηματιστεί μια σταγόνα στην άκρη. Ένα ηλεκτρόδιο από την πηγή υψηλής τάσεως στη συνέχεια εμβαπτίζεται μέσα στο υγρό ή μπορεί να συνδέεται απευθείας με το τριχοειδή σωλήνα εάν χρησιμοποιείται μια μεταλλική βελόνα. Η πηγή τάσης τίθεται σε λειτουργία και η φόρτιση εγχέεται εντός του διαλύματος του πολυμερούς. Με την αύξηση της δύναμης του ηλεκτρικού πεδίου προκαλούνται απωστικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των όμοιων φορτίων στο υγρό και ελκτικές δυνάμεις μεταξύ των ετερόσημα φορτισμένων υγρού και συλλέκτη έτσι ώστε να αρχίσουν να ασκούνται δυνάμεις εφελκυσμού στο υγρό, επιμηκύνοντας την κρεμάμενη σταγόνα του υγρού στο άκρο του τριχοειδούς. Καθώς η δύναμη του ηλεκτρικού πεδίου αυξάνεται περεταίρω από ένα σημείο θα επιτευχθεί ισορροπία μεταξύ των ηλεκτροστατικών δυνάμεων και της επιφανειακής τάσης του υγρού οδηγώντας στην ανάπτυξη του κώνου του Taylor. Εάν η εφαρμοζόμενη τάση αυξάνεται πέραν αυτό το σημείο ένας πίδακας ινών αποβάλλεται από την κορυφή του κώνου για να επιταχυνθεί προς το γειωμένο συλλέκτη (Εικόνα 5.8). [45] Εικόνα 5.8: Αριστερά, μια τυπική διάταξη συσκευής Electrospinning και δεξιά: Electrospraying [45] 67

Παρά την σχετική ευκολία της τεχνικής Electrospinning υπάρχει ένας σημαντικός αριθμός παραμέτρων που μπορούν να επηρεάσουν τη δομή και τον σχηματισμό των ινών. Ομαδοποιώντας τις παραμέτρους με βάση των σχετικών επιπτώσεων της Electrospinning διαδικασίας, αυτές οι παράμετροι είναι η εφαρμοζόμενη τάση, ο ρυθμός ροής του πολυμερούς (ταχύτητα), και η απόσταση τριχοειδούς-συλλέκτη. Επιπλέον, και οι τρεις παράμετροι μπορούν να επηρεάσουν το σχηματισμό beads στις παραγόμενες ίνες. 5.7 Μέθοδος Διαπερατότητας και Επιφανειακά Πλασμόνια (Transmittance Method and Surface Plasmon) για την περίπτωση υμενίων Αργύρου Τις τελευταίες δεκαετίες έχει γίνει μια πολύ μεγάλη έκρηξη ανάπτυξης στην έρευνα των φυσικών και χημικών χαρακτηριστικών των μεταλλικών επιφανειών. Με την έλευση των σύγχρονων φασματοσκοπικών μεθόδων αρκετές πτυχές των μεταλλικών επιφανειών και των αλληλεπιδράσεών τους με άλλες ουσίες ή μίγματα καθώς και σωματίδια με τα οποία έρχονται σε επαφή, μπορούν να εξετασθούν και να επεξηγηθούν. Ένα γεγονός προσρόφησης που παρατηρείται στη φύση και βρέθηκε να είναι υψίστης τεχνικής σημασίας είναι η κατασκευή συσκευών κενού, ο σχηματισμός εξαιρετικά λεπτών μεταλλικών στρωμάτων (χρυσός, άργυρος) για πλασμονικές εφαρμογές κ.α. Για αυτό το λόγο, η επιστήμη της διεπιφάνειας είναι διεπιστημονική από τη φύση της και έτσι, ένα σημαντικό ενδιάμεσο εργαλείο μεταξύ βασικής και εφαρμοσμένης έρευνας. Μια από τις μεθόδους μελέτης της επιφάνειας ενός υλικού, είναι η διαπερατότητα. [46] Πολλές ουσίες απορροφούν υπεριώδες (UV) ή ορατό (Vis) φώς. Μια δέσμη μονοχρωματικής ακτινοβολίας με ισχύ Ρο κατευθύνεται διαμέσου ενός δείγματος. Η απορρόφηση λαμβάνει χώρα και η δέσμη που αφήνει το δείγμα κατά τη διέλευσή της έχει πλέον ισχύ Ρ. Το ποσοστό της ακτινοβολίας που απορροφήθηκε μπορεί να μετρηθεί με διάφορους τρόπους. Ο ένας από αυτούς είναι μέσω της διαπερατότητας Τ, η οποία ορίζεται ως το κλάσμα της ισχύος Ρ μετά τη διέλευση, προς την ισχύ Ρο, πριν τη διέλευση και συχνά πολλαπλασιάζεται με το 100 για να μας δώσει την ανάλογη ποσοστιαία σύσταση, δηλαδή Τ = (Ρ / Ρο) x 100. Ένας άλλος τρόπος μέτρησης, είναι μέσω της απορρόφησης Α, η οποία ορίζεται ως ο δεκαδικός 68

λογάριθμος της διαπερατότητας, δηλαδή Α = log 10 P / Poή Α = 2 log 10 %T. Η σχέση μεταξύ απορρόφησης και διαπερατότητας φαίνεται στο παρακάτω διάγραμμα (Εικόνα 5.9): [47] Εικόνα 5.9: Σχέση μεταξύ διαπερατότητας και απορρόφησης [47] Το επιφανειακό πλασμόνιο, ως συλλογικό ηλεκτρόνιο με ταλαντωτική συμπεριφορά, έχει μελετηθεί εκτενώς από τότε που προέβλεψε την ύπαρξή του ο Ritchie [49].Το πιο κοινό πλασμονικό υλικό, ο άργυρος λόγω των ευρέων οπτικών και ηλεκτρικών του εφαρμογών, έχει λάβει μεγάλη προσοχή, αν και δεν έχουν ακόμη αποσαφηνιστεί ιδιαίτερα τα υπέρλεπτα υμένια αργύρου. Για παράδειγμα, η εξάρτηση του πάχους των υπέρλεπτων υμενίων το οποίο είχε προβλεφθεί το 1957 εμφανίζει ελλείψεις όσον αφορά άμεσες οπτικές πειραματικές αποδείξεις από τότε. Οι οπτικές και διηλεκτρικές ιδιότητες των υπέρλεπτων υμενίων αργύρου παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές από τα στερεά υλικά. Ένας τρόπος να αναλύσουμε το επιφανειακό πλασμόνιο είναι μέσω της συνάρτησης απώλειας ενέργειας η οποία μπορεί να εξαχθεί απευθείας από τις οπτικές σταθερές, τον δείκτη διάθλασης nκαι τον συντελεστή απόσβεσης k. Έχουν πραγματοποιηθεί οπτικές μετρήσεις ή μετρήσεις φασματοσκοπίας απώλειας ενέργειας ηλεκτρονίου είτε σε συμπαγή άργυρο, είτε σε κρυσταλλικό άργυρο. Όμως, οι εφαρμογές που χρησιμοποιούν τα επιφανειακά πλασμόνια χρησιμοποιούν υμένια με νανοσωματίδια αργύρου, ή αλλιώς, υπέρλεπτα υμένια που αποτελούνται από νανοσωματίδια. [48] Η εικόνα 5.10 παρουσιάζει τα διαγράμματα απώλειας ενέργειας για το στερεό άργυρο καθώς και απώλειας ενέργειας για την επιφάνεια υμενίων αργύρου που προέρχονται από τις παρούσες οπτικές σταθερές, ως συναρτήσει της ενέργειας φωτονίου στην περιοχή του υπεριώδους. Τα διαγράμματα αυτά δείχνουν την διέγερση πλασμονίου στερεού υλικού και επιφάνειας, αντίστοιχα. Οι θέσεις των 69

κορυφών για τις δύο περιπτώσεις πλασμονίου για ένα παχύ υμένιο, είναι 327 nm (3.79 ev) και 338 nm (3. 67 ev). Εικόνα 5.10: Διάγραμμα απώλειας ενέργειας στερεού υλικού (a) και διάγραμμα απώλειας ενέργειας επιφάνειας (b) στην περιοχή του υπεριώδους για υμένια αργύρου με διαφορετικά πάχη. [48] Στην Eικόνα 5.11 φαίνεται η εξάρτηση του πάχους των θέσεων των κορυφών της εξίσωσης απώλειας ενέργειας στερεού και επιφάνειας. BELF και SELF. Είναι προφανές πώς και οι δύο μεταβάλλονται σε υψηλότερη περιοχή ενέργειας καθώς αυξάνεται το πάχος. Η συχνότητα του πλασμονίου του στερεού μπορεί να εκφραστεί με όρους της πυκνότητας του ελεύθερου ηλεκτρονίου (ρ), του φορτίου του ηλεκτρονίου (e) και της αποτελεσματικής μάζας (m*) : ω ρ = 4πρe 2 / m*. Με την αύξηση του πάχους του υμενίου η πυκνότητα ελεύθερου ηλεκτρονίου αυξάνεται και φθάνει την τιμή του στερεού αργύρου, η οποία έρχεται σε συμφωνία με την 70

παρατηρούμενη αυξανόμενη μεταλλική συμπεριφορά παράλληλα με το πάχος καθώς εξάγεται από τις οπτικές σταθερές. [48] Εικόνα 5.11: Οι κόκκινες και μπλε διακεκομμένες γραμμές αντιπροσωπεύουν την διεπιφάνεια μετάλλου αερίου, και μετάλλου υποστρώματος αντίστοιχα. Το κόκκινο βέλος σημειώνει τη θέση του επιφανειακού πλασμονίου του αργύρου από τη βάση δεδομένων Palik, ενώ το μαύρο αντιστοιχεί στο πλασμόνιο όγκου (στερεού). [48] Συνοπτικά, με τη μέθοδο της ελλειψομετρίας σε συνδυασμό με τη μέθοδο διαπερατότητας μπορούν να μελετηθούν το αποτελεσματικό πάχος και οι αποτελεσματικές οπτικές σταθερές των λεπτών υμενίων αργύρου που εναποτίθενται σε υποστρώματα γυαλιού. Η εξίσωση απώλειας ενέργειας επιφάνειας καθώς και η εξίσωση απώλειας ενέργειας στερεού των νανο λεπτών υμενίων αργύρου με διαφορετικό πάχος, έχουν δείξει προφανή διαφορά με τα δεδομένα του Palik για μεμονωμένο κρυσταλλικό άργυρο. 5.8 Μελέτες Κυτταροτοξικότητας 5.8.1 Κυτταρική σειρά L929 Στη συγκεκριμένη διπλωματική εργασία χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά L929 ώστε να μελετηθεί η κυτταροσυμβατότητα των νανοϊνδών ικριωμάτων της πολυκαπρολακτόνης PCL όταν είναι εμπλουτισμένα με νανοσωματίδια αργύρου, καθώς και η κυτταροσυμβατότητα των ίδιων των νανοσωματιδίων αργύρου. Το κεφάλαιο αυτό αποτελεί σημαντικό κομμάτι της μελέτης των ικριωμάτων, καθώς οι 71

επιφανειακές ιδιότητες των νανοσύνθετων ικριωμάτων αποτελούν βασικό παράγοντα για την επιτυχία της μηχανικής των ιστών, για μελλοντική αξιοποίησή τους σε εφαρμογές της Ιστικής Μηχανικής και Αναγενητικής Ιατρικής. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν ινοβλάστες ποντικιού (κυτταρική σειρά L929). Τα συγκεκριμένα κύτταρα ανήκουν στην κατηγορία των αθανατοποιημένων κυτταρικών σειρά (immortalized cell lines), η οποία λόγω μετάλλαξης έχουν απαλλαχθεί από τη φυσιολογική κυτταρική γήρανση και αντ αυτού μπορούν να υποβληθούν σε αδιάκοπη κυτταρική διαίρεση. Υπάρχει η δυνατότητα ανακαλλιέργειας αυτών των κυττάρων για μεγάλες χρονικές περιόδους με τα απαραίτητα μέτρα αποστείρωσης και καθαρισμού ώστε να αποτρέπεται κάθε κίνδυνος πιθανής μόλυνσης λόγω ευαισθησίας των κυττάρων αυτών. Η ανακαλλιέργεια αυτή μπορεί να πραγματοποιηθεί in vitro στο εργαστήριο LTFN. Οι μεταλλάξεις που απαιτούνται για την αθανασία μπορούν να συμβούν είτε φυσικά, είτε μπορεί να προκληθούν τεχνητά, για πειραματικούς σκοπούς, προς χρήση τους σε τομείς της Βιοτεχνολογίας και Βιοχημείας. Τα κύτταρα L929 είναι ινοβλάστες ποντικιού και λαμβάνονται από τον υποδόριο λιπώδη ιστό. Η λειτουργία των ινοβλαστών συνιστάται στη σύνθεση και έκκριση της άμορφης θεμέλιας ουσίας και, όπως φαίνεται και από το όνομά τους, υπονοεί των ινών του συνδετικού ιστού, περιλαμβανομένου και του κολλαγόνου, των ελαστικών και δικτυωτών ινών της εξωκυττάριας ουσίας. Οι ινοβλάστες είναι ωοειδή ή αστεροειδή κύτταρα με μακριές, λεπτές αποφυάδες, οι οποίες φέρουν διακλαδώσεις. Στην παρούσα πειραματική διαδικασία, η ανακαλιλιέργεια των κυττάρων έγινε σε θάλαμο επώασης (Galaxy 1705) που βρίσκεται στις εγκαταστάσεις του εργαστηρίου LTFNενσωματωμένο με έναν απαγωγό ο οποίος προορίζεται για τη διαδικασία αποστείρωσης των δειγμάτων πριν την έναρξη των πειραμάτων. 5.8.2 Βιοχημική Μέθοδος Εκτίμησης Κυτταροτοξικότητας ΜΤΤ Η μέθοδος MTT χρησιμοποιείται για τον καθορισμό της ζωτικότητας και του αριθμού των κυττάρων σε κυτταρικές καλλιέργειες όπου έχει προστεθεί κάποιος παράγοντας που μπορεί να επηρεάσει τη βιωσιμότητα. Η αρχή της μεθόδου 72

στηρίζεται στη μετατροπή του υδατοδιαλυτού MTT (3 (4-5- Dimethylthiazol 2 yl) 2,5 diphenyl tetrazolium bromide) σε αδιάλυτο άλας φορμαζανίου. Στη συνέχεια, το άλας διαλυτοποιείται και η συγκέντρωσή του καθορίζεται από την οπτική πυκνότητα σε δύο διαφορετικά μήκη κύματος, στα 570 nmκαι στα 630 (reference). Η συγκεκριμένη τεχνική χρησιμοποιήθηκε για μέτρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων και να μελετηθεί ο πολλαπλασιασμός τους. Είναι μια ευρέως διαδεδομένη και αξιόπιστη μέθοδο για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και επομένως τον έλεγχο της κυτταροτοξικότητας ενός υλικού είναι η αναγωγή των αλάτων του τετραζολίου, μεταβολικά ενεργών κυττάρων, όπου με τη βοήθεια του μιτοχονδριακού ενζύμου της ηλεκτρικής αφυδρογονάσης (succinic dehydrogenase), έχει ως αποτέλεσμα να παράγονται ως προϊόν ιώδεις κρύσταλλοι. Αυτή η μέθοδος υπερτερεί στο γεγονός ότι μπορεί να γίνει έμμεσος υπολογισμός των ζωντανών κυττάρων χωρίς την ανάγκη για ακριβή αριθμητική μέτρηση. Πιο συγκεκριμένα, οι κρύσταλλοι αυτοί μπορούν να διαλυτοποιηθούν με τη βοήθεια κατάλληλων οργανικών διαλυτών (π.χ. ισοπροπανόλη, DMSO dimethyl sulfoxide) και να προσδιοριστεί στη συνέχεια φωτομετρικά (οπτική απορρόφηση) η έκταση της αντίδρασης: όσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των ζωντανών κυττάρων τόσο πιο έντονος είναι ο σχηματισμός των κρυστάλλων τετραζολίου και τόσο μεγαλύτερη οπτική απορρόφηση καταγράφεται σε μήκος κύματος (570 630 nm). Επομένως, η τεχνική ανάλυσης MTTαντανακλά άμεσα τη μιτοχονδριακή δραστηριότητα και κατά επέκταση τη ζωτικότητα (viability) και τον ρυθμό αύξησης (growth rate) ενός κυτταρικού πληθυσμού. Η ΜΤΤ είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται περισσότερο λόγω: α) χαμηλού κόστους, β) ακριβείας), γ) ταχύτητας και δ) ποικιλίας των υπό μελέτη κυττάρων. 5.8.3 Χρώση Methylene Blue Η χρήση χρωστικών ουσιών είναι μια βοηθητική τεχνική που χρησιμοποιείται σε μελέτες για την επισήμανση δομών σε βιολογικούς ιστούς με τη βοήθεια διαφόρων μικροσκοπίων για την ενίσχυση της εικόνας του εν προκειμένω δείγματος. Η 73

μέθοδος αυτή έχει εφαρμογές στην μικροβιολογία και γενικώς στις ιατρικές επιστήμες. Οι χρώσεις για παράδειγμα, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να καθοριστεί και να εξεταστεί ένας ιστός, ένας κυτταρικός πληθυσμός (π.χ. ταξινόμηση των διαφόρων κυττάρων του αίματος) ή οργανίδια μεμονομένων κυττάρων. Το κυανό του μεθυλενίου (Methylene Blue) είναι μια αρωματική ετεροκυκλική χημική ένωση με μοριακό τύπο C 16 H 18 N 3 SCl, όπου σε θερμοκρασία δωματίου είναι μια στερεή, άοσμη, σκούρα μπλε σκόνη και παράγει ένα μπλε διάλυμα όταν διαλύεται στο νερό. Το κυανό του μεθυλενίου δεν μπορεί να διεισδύσει σε ζωντανά κύτταρα και να τα αφήσει χωρίς χρώση, σε αντίθεση με τα νεκρά κύτταρα, που δεν είναι σε θέση να κρατήσουν τη χρώση κατά τη διείσδυση από την κυτταρική μεμβράνη, αποτελώντας έτσι τον καταλυτικό παράγοντα αυτής της χρώσης στον καθορισμό της βιωσιμότητας και κυτταροσυμβατότητας ενός δείγματος. 5.9 Πρωτόκολλα Ανακαλλιέργειας κυττάρων, MTT assay και Methylene Blue 5.9.1 Πρωτόκολλο Ανακαλλιέργειας Κυτταρικής Σειράς L929 Πριν την έναρξη της υποκαλλιέργειας, ο χώρος όπου τοποθετούνται όλα τα αντικείμενα που επρόκειτο να χρησιμοποιηθούν, καθαρίζεται με αιθανόλη 70%. Στη συνέχεια, τοποθετούνται όλα τα αναλώσιμα για 20-30 λεπτά κάτω από ακτινοβολία UV, σε θάλαμο νηματικής ροής με UV (PV-30/70, Telstar TechnologiesS.L.), ώστε να απολυμανθούν. Αυτή η διαδικασία είναι απαραίτητη για την αποφυγή πιθανής μόλυνσης των αποστειρωμένων διαλυμάτων που χρησιμοποιούνται. Ο θάλαμος επώασης (incubator) των κυττάρων που χρησιμοποιήθηκε για την σωστή ανάπτυξή τους, είναι ο (Galaxy 170S, New Brunswick) σε συνθήκες 37 C και 5% CO 2. Για την φυγοκέντριση και τη λήψη του κυτταρικού ιζήματος χρησιμοποιήθηκε η φυγόκεντρος Universal 320, Hettich. Όλα αυτά τα μηχανήματα βρίσκονται στις εγκαταστάσεις του εργαστηρίου LTFN. Τα κύτταρα L929 καλλιεργούνται είτε σε φλάσκες (flasks) με βιδωτό πώμα χωρητικότητας 50 ml (25 cm 2 ), είτε σε τρυβλία Petri (Petri dishes) διαμέτρου 90 mm με αεριζόμενο καπάκι από πολυ(στυρένιο). Αυτό εξαρτάται από την ποσότητα 74

των κυττάρων που απαιτείται για το κάθε πείραμα. Η φλάσκα όταν καλυφθεί πλήρως με κύτταρα έχει περίπου 1.500.000-2.000.000 αριθμό κυττάρων, ενώ αντίστοιχα το τρυβλίο περίπου 2.500.000-3.000.000 κύτταρα. Τα αναλώσιμα υλικά που χρησιμοποιούνται για την κυτταρική υποκαλλιέργεια είναι τα εξής: Θρεπτικό κυτταρικό διάλυμα DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 5% FBS (Fetal Bovine Serum) 1% P/S (μίγμα αντιβιοτικών πενικιλλίνης/στρεπτομυκίνης) Τρυψίνη (trypsin) 0,25% PBS (Phosphate buffered saline) Φυγόκεντροι σωλήνες των 15ml ή 50ml Tips για πιπέτα των 200μl και 1000μl Σωλήνες μιας χρήσης για τροφικό διάλυμα των 10 ml Πρώτα απ όλα η υποκαλλιέργεια γίνεται όταν τα κύτταρα αγγίξουν περίπου το 80% κάλυψης της περιοχής ανάπτυξής τους. Τα βήματα που ακολουθούνται για την πειραματική διαδικασία της κυτταρικής υποκαλλιέργειας είναι τα παρακάτω: 1. Αφαίρεση του περιεχομένου της φλάσκας / τριβλίου (τροφικό διάλυμα και κύτταρα που δεν είναι προσκολλημένα στην επιφάνεια της φλάσκας / τριβλίου). 2. Προσθήκη PBS (φυσιολογικό ορό) για την κάλυψη του πάτου της φλάσκας/τριβλίου. Το περιεχόμενο ανακινείται προσεκτικά έτσι ώστε να μην ξεκολλήσουν τα κύτταρα. 3. Προσθήκη διαλύματος τρυψίνης (αραιωμένη σε διάλυμα PBS) και τοποθέτηση της φλάσκας / τριβλίου στο θάλαμο επώασης για 4 min περίπου. Η τρυψίνη βοηθάει στην αποκόλληση των κυττάρων. (ο έλεγχος αποκόλλησης των κυττάρων γίνεται στο οπτικό μικροσκόπιο). 4. Προσθήκη θρεπτικού υλικού στη φλάσκα / τρυβλίο, ποσότητας ίσης με αυτή της τρυψίνης, έτσι ώστε να εξουδετερωθεί η τρυψίνη και τα κύτταρα να μην νεκρωθούν. Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε είναι είτε το DMEM (5% FBS, 1%A/B). 75

5. Τοποθέτηση του ολικού διαλύματος (τρυψίνης-κυτταρικού διαλύματος) σε φυγόκεντρο σωλήνα και φυγοκέντριση στη συνέχεια του διαλύματος ώστε να μαζευτεί το ίζημα των κυττάρων στον πάτο του φυγόκεντρου σωλήνα και να δημιουργηθεί ένα cell pellet από κύτταρα. 6. Αφαίρεση του υπερκείμενου διαλύματος και προσθήκη θρεπτικού υλικού 7. Διάσπαση του ιζήματος με αναρρόφηση του θρεπτικού υλικού με την πιπέτα. 8. Προσθήκη νέου θρεπτικού υλικού στις καινούριες φλάσκες / τρυβλία. 9. Προσθήκη της ποσότητας του κυτταρικού διαλύματος που προήλθε από την κυτταροκαλλιέργεια. Η ποσότητα του κυτταρικού διαλύματος που προστίθεται σε κάθε νέα φλάσκα / τρυβλίο, εξαρτάται από τον επόμενο πειραματικό προγραμματισμό. 5.9.2 Πρωτόκολλο βιοχημικής μεθόδου εκτίμησης κυτταροτοξικότητας MTT 1. Τα δείγματα με μόνο τα νανοσωματίδια αργύρου, καθώς και εκείνα με ενσωματωμένα τα νανοσωματίδια στο εσωτερικό των ινών της πολυκαπρολακτόνης αφού αποστειρωθούν στον απαγωγό, τοποθετούνται σε τρυβλία 5 θέσεων (5 well plates) 2. Τα κύτταρα συλλέγονται από τις κυτταρικές καλλιέργειες και διαπιστώνεται ο αριθμός τους με μέτρηση σε πλάκα NeuBauer. Τοποθετούνται περίπου 20.000 50.000 κύτταρα ανά θέση. 3. Τα κύτταρα παραμένουν σε επαφή με τα δείγματα για 48 και 72 ώρες 4. Μετά το πέρας των ωρών, γίνεται πλύση των κυττάρων με PBS. 5. Εάν έχει μέσα θρεπτικό υλικό, το αφαιρώ με πλύση με PBS. 6. Η σκόνη του ΜΤΤ διαλύεται σε PBS σε συγκέντρωση 5 mg / mlκαι προστίθεται στις θέσεις των δειγμάτων. Η αντίδραση σχηματισμού αλάτων λαμβάνει χώρα σε 5 6 ώρες. 7. Σε κάθε well plate βάζουμε 1 ml, άρα με υπολογισμούς βάζουμε σε κάθε well plate 0,025 grμττ. 76

8. Μετά την πάροδο 5 6 ωρών γίνεται αφαίρεση του διαλύματος ΜΤΤ και προστίθεται ισοπροπανόλη ώστε να διαλυτοποιηθούν τα άλατα φορμαζανίου και να δώσουν ένα μωβ χρώμα στο διάλυμα. 9. Το χρωματισμένο διάλυμα μεταφέρεται σε τρυβλία 5 θέσεων (5 well plate) εις τριπλούν. 10. Η οπτική πυκνότητα μετρείται στα 570 nmκαι στα 630 nmμε το σύστημα Biotek plate reader. Το ποσοστό ζωτικότητας των κυττάρων προκύπτει από τη σύγκριση των τιμών απορρόφησης στα 570 nmτων κυττάρων ελέγχου που δεν ήρθαν σε επαφή με τις επιφάνειες με τις τιμές των απορροφήσεων στα 570 nmτων κυττάρων που αναπτύχθηκαν στις επιφάνειες των δειγμάτων. 5.9.3 Πρωτόκολλο χρωματισμού κυττάρων με Methylene Blue 1. Τοποθετούμε προσεκτικά τα δείγματα σε νέα πηγαδάκια, στα οποία ήδη υπάρχει PBSδιάλυμα. Τα αφήνουμε για 2 3 λεπτά. 2. Αφαιρούμε το PBS διάλυμα και προσθέτουμε μεθανόλη για 15 λεπτά (Στάδιο σταθεροποίησης Fixation Stage) 3. Αφαιρούμε την μεθανόλη και προσθέτουμε λίγο Methylene Blue (σε συγκέντρωση 0.4%). Το Methylene Blue διάλυμα σε συγκέντρωση 0.4% είναι το 0.4 gr Methylene Blue σκόνη σε 100 ml απεσταγμένο νερό. 4. Αφήνουμε τα δείγματα μέσα στο διάλυμα για 30 λεπτά. 5. Ξεπλένουμε τα δείγματα με άφθονο νερό προσεκτικά και τα αφήνουμε να στεγνώσουν σε καθαρό μέρος. Για το Οπτικό Μικροσκόπιο: Δύο διαφορετικές μεγεθύνσεις επιλέγονται, x200 και x50 για να πάρουμε εικόνες των κυττάρων στα πηγαδάκια. 77

Κεφάλαιο 6 o : Πρωτόκολλα Διαδικασιών 6.1 Μέθοδος Σύνθεσης Νανοσωματιδίων Αργύρου 6.1.1 Υλικά Τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν στην περίπτωση παρασκευής των νανοσωματιδίων αργύρου, είναι: AgNO 3 : Silver Nitrate 99,8 100,5 % / M.W: 169, 87 g / mol / D: 4.35 g / cm 3 PVP: Polyvinylpyrrolidone / average mol wt 10.000 NaBH 4 : Sodium Borohydride / M.W: 37.83 g.mol NaOH: Sodium Hydroxide / M.W: 39.9971 g / mol / D: 2.13 g /cm 3 Deionized Water 6.1.2 Περιγραφή πειραματικής διαδικασίας Η πειραματική διαδικασία για την παρασκευή των νανοσωματιδίων αργύρου ακολουθεί τη μέθοδο του S. Agnihotri [67], ελαφρά τροποποιημένη. Αρχικά, πλένονται και καθαρίζονται όλα τα σκεύη που θα χρησιμοποιηθούν, με αιθανόλη, ακετόνη και ισοπροπανόλη. Μετρούνται 25 ml αποσταγμένου (deionized) νερού με τη βοήθεια ογκομετρικού κυλίνδρου και προστίθενται 0.025 gr πολυβινυλοπυρρολιδόνης (PVP), δηλαδή σε συγκέντρωση 0.1% καθώς και 0.00189 gr βοροϋδρίδιο νατρίου (NaBH 4 )έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση καθενός από τα δύο αυτά συστατικά να γίνει 2 mm. Η PVP χρησιμοποιείται ως σταθεροποιητικός παράγοντας και το NaBH 4 ως αναγωγικό μέσο. Το παραπάνω διάλυμα θερμαίνεται στους 60 ο C για 30 min με ταυτόχρονη ανάδευση με magnetic stirrer. Παράλληλα, ζυγίζονται 0.0849 gr AgNO 3 και διαλύονται σε 10 ml αποσταγμένου νερού και ακολουθείται ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου για 20 min. Με τη βοήθεια πιπέτας των 1000 μl λαμβάνεται ποσότητα από το υδατικό διάλυμα του νιτρικού αργύρου ίση με 1 ml(0.05 M) και προστίθεται αργά και σταθερά, με τη μορφή σταγόνων στο αρχικό διάλυμα της PVP. Η τελική συγκέντρωση των ιόντων Ag + είναι κι αυτή στα 2 mm. Παρατηρείται πως με την σταδιακή προσθήκη του νιτρικού αργύρου, το διάλυμα από διαυγές λευκό μετατρέπεται σε κίτρινο του χρυσού, σηματοδοτώντας με αυτό τον τρόπο τον σχηματισμό των νανοσωματιδίων αργύρου, 78

όπως φαίνεται και από την παρακάτω Εικόνα (Εικόνα 6.1). Το διάλυμα των νανοσωματιδίων αργύρου είναι κίτρινο, λόγω της απορρόφησης του όπως είναι γνωστό, στα 390 nm περίπου, στο φάσμα του Υπεριώδους Ορατού, όπως προκύπτει και από τη βιβλιογραφία [ 68]. Εικόνα 6.1: Διάλυμα PVP & NaBH 4 πριν και μετά την προσθήκη του AgNO 3 Συνεχίζεται η ανάδευση του παραπάνω διαλύματος και σταδιακά ανεβάζεται η θερμοκρασία από 60 ο C σε 90 ο C όπου και παρατηρείται ο σχηματισμός υδρατμών στα τοιχώματα του ποτηριού ζέσεως. Σε αυτό το σημείο μετράται το ph του διαλύματος με τη βοήθεια πεχαμετρικού χάρτου στα 6.4. Ζυγίζονται 0.1 gr NaOH και διαλύονται σε 25 ml deionized H 2 O και το διάλυμα αναδεύεται σε θερμοκρασία δωματίου για 10 περίπου min και έπειτα με τη βοήθεια πιπέτας προστίθεται με τη μορφή σταγόνων κατάλληλη ποσότητα στο διάλυμα των νανοσωματιδίων αργύρου, έτσι ώστε το τελικό ph το οποίο μετράται πάλι με τη βοήθεια πεχαμετρικού χάρτου, να φτάσει το 8.7 (περίπου 12 σταγόνες). Κατά την προσθήκη του NaOH το διάλυμα των νανοσωματιδίων μετατρέπεται από κίτρινο σε σκούρο καφέ. Κατόπιν, συνεχίζεται η ανάδευση για 40 επιπλέον min, στους 90 ο C. Τότε, απομακρύνεται από την εστία ανάδευσης και θέρμανσης και αφήνεται σε ηρεμία ώστε να έρθει σε θερμοκρασία δωματίου. Όταν το διάλυμα των νανοσωματιδίων έλθει σε θερμοκρασία δωματίου, ακολουθεί η φυγοκέντρηση, ώστε να επιτευχθεί η μέθοδος της νανοκαταβύθισης. Συγκεκριμένα, το διάλυμα διοχετεύεται σε πλαστικό falkon των 50 ml και τοποθετείται στη συσκευή φυγοκέντρησης του εργαστηρίου, η οποία φαίνεται στην παρακάτω Εικόνα 79

(Εικόνα 6.2). Πραγματοποιείται η διαδικασία της φυγοκέντρησης στις 5000 rpm για μία ώρα. Εικόνα 6.2: Συσκευή φυγοκέντρησης του εργαστηρίου LTFN Μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας φυγοκέντρησης, παρατηρείται πως στο falkon που λαμβάνεται, τα νανοσωματίδια σχηματίζουν ίζημα σκούρου καφέ χρώματος στον πυθμένα του, ενώ από πάνω βρίσκεται το υπερκείμενο υγρό. Το falkon στη συνέχεια αφήνεται σε ηρεμία για ένα βράδυ και την επόμενη ημέρα το υπερκείμενο υγρό αυτό απομακρύνεται και το ίζημα υφίσταται 3 φορές πλύση με αποσταγμένο νερό, δηλαδή γίνεται η επαναδιασπορά των νανοσωματιδίων σε ύδωρ και το υδατικό πλέον διάλυμα τοποθετείται πρώτα σε Vortex Mixer και ύστερα σε λουτρό υπερήχων για 15 περίπου λεπτά, για πλήρη ομογενοποίηση και κυρίως για αποφυγή δημιουργίας συσσωματωμάτων (clusters) των νανοσωματιδίων. Η μέση συγκέντρωση των νανοσωματιδίων είναι 2 mm. Τέλος, το διάλυμα σφραγίζεται με parafilmκαι φυλάσσεται σε σκοτεινό και δροσερό περιβάλλον για μελλοντική χρήση. 6.2 Μέθοδος Χιτοζάνης 6.2.1 Υλικά Τα υλικά που χρησιμοποιούνται στη διαδικασία επικάλυψης των νανοσωματιδίων αργύρου με χιτοζάνη είναι τα εξής: Low Molecular Weight Chitosan75 85% deacetylated Ethanol 95.0 % Acetic Acid 99.5% 80

Deionized Water Χρησιμοποιείται η χιτοζάνη χαμηλού μοριακού βάρους. Η χιτοζάνη είναι ένας γραμμικός φυσικός πολυσακχαρίτης που βασίζεται σε μέρη γλυκοσαμινών και προέρχεται από τη Ν αποακετυλενοποίηση της χιτίνης. Η χιτίνη είναι το δεύτερο πιο άφθονο φυσικό πολυμερές στον κόσμο μετά την κυτταρίνη. Η χιτοζάνη είναι συμπολυμερές της γλυκοσαμίνης και της Ν ακετυλ γλυκοσαμίνης. Έχει αμινομάδες και υδροξυλομάδες ως μέρη της κύριας αλυσίδας της και σταθερά διάσπασης pka κοντά στο 6.5. Επομένως είναι ελαφρά όξινη σε διαλύματα, επειδή ορισμένες από τις αμίνες πρωτονιώνονται. Χρησιμοποιείται ευρέως σε βιολογικές εφαρμογές, λόγω των εξαιρετικών χαρακτηριστικών της. Είναι ένα φυσικό πολυμερές με πολυκατιονική φύση, βιοσυμβατό και βιοδιασπώμενο, έχει αντιμικροβιακές ιδιότητες και μπορεί να λειτουργήσει και ως μέσο για τη σύνδεση πεπτιδίων. Λόγω των ιδιοτήτων αυτών, χρησιμοποιείται ευρέως σε βιοϊατρικές εφαρμογές, όπως μεταφορά φαρμάκων και πρωτεϊνών. 6.2.2 Περιγραφή πειραματικής διαδικασίας Αρχικά, πλένονται και καθαρίζονται όλα τα σκεύη που θα χρησιμοποιηθούν στην παρούσα διαδικασία. Έπειτα, συντίθενται διάλυμα οξικού οξέος 1.0% σε αποσταγμένο νερό έτσι ώστε η αναλογία οξικού οξέος προς νερό να είναι 1 : 10 και ζυγίζεται σε ζυγό ακριβείας η κατάλληλη ποσότητα χιτοζάνης. Στην παρούσα διπλωματική εργασία συντέθηκαν τρία διαφορετικά υδατικά διαλύματα χιτοζάνης με ποσότητες αυτής 0,1 gr, 0,01 gr και 0,001 gr. Σε κάθε περίπτωση, το παραπάνω διάλυμα της χιτοζάνης τοποθετείται για ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες προς πλήρη διάλυση της χιτοζάνης και ομογενοποίηση του διαλύματος. Στη συνέχεια λαμβάνεται ορισμένη ποσότητα από το διάλυμα της χιτοζάνης και ενώνεται με τη μορφή σταγόνων με τη βοήθεια πιπέτας με ορισμένη ποσότητα από το διάλυμα των νανοσωματιδίων αργύρου που παρασκευάστηκε με τη διαδικασία που περιγράψαμε προηγουμένως. Το προκύπτον διάλυμα νανοσωματιδίων χιτοζάνης τοποθετείται σε γυάλινο μπουκαλάκι και ρυθμίζεται η ανάδευση σε χαμηλή ταχύτητα με magnetic stirrer στους 60 ο C για μία ώρα, και κατόπιν συνεχίζεται η ανάδευση για άλλη μια ώρα σε θερμοκρασία δωματίου ώστε να 81

επιτευχθεί η πλήρη ομοιογένεια του διαλύματος. Κατά τη διάρκεια της ανάδευσης το μπουκαλάκι του διαλύματος κλείνεται με parafilm. Μετά το πέρας της παραπάνω διαδικασίας, ακολουθείται η φυγοκέντρηση για καταβύθιση του διαλύματος. Τοποθετείται το διάλυμα της χιτοζάνης με τα νανοσωματίδια σε πλαστικό falkon των 20 ml και εισάγεται στη συσκευή φυγοκέντρησης του εργαστηρίου. Πραγματοποιείται η φυγοκέντρηση για 1 ώρα, στις 5000 rpm για παραλαβή του ιζήματος στον πυθμένα του falkon. Αφήνεται το falkon σε ηρεμία για ένα ολόκληρο βράδυ για κατακάθιση και των μικρότερων νανοσωματιδίων λόγω βαρύτητας και την επόμενη ημέρα απομακρύνεται το υπερκείμενο υγρό και ακολουθείται πλύση του ιζήματος 3 φορές με αποσταγμένο νερό, τοποθετείται σε Vortex Mixer αρχικά και έπειτα σε λουτρό υπερήχων για 15 λεπτά για πλήρη διάλυση του ιζήματος στο νερό και αποφυγή συσσωμάτωσης. Τέλος, φυλάσσεται σε σκοτεινό και δροσερό περιβάλλον για μελλοντική χρήση. 6.3 Μέθοδος παρασκευής διαλύματος PCL 6.3.1 Υλικά Για την μέθοδο παρασκευής του διαλύματος πολυκαπρολακτόνης, χρησιμοποιήθηκαν τα εξής υλικά: PCL: ε polycaprolactone / M.W: 45.000 g/mol Chloroform 99 % Methanol anhydrous, 99.8% Λόγω της δομής της η πολυκαπρολακτόνη κρυσταλλώνεται εύκολα είναι σκληρή και εύκαμπτη. Διαθέτει εξαιρετική ικανότητα να σχηματίζει μίγματα με μία ποικιλία πολυμερών καθώς και είναι ιδιαίτερα διαλυτή σε οργανικούς διαλύτες. Η θερμοκρασία τήξης της κυμαίνεται από 50 έως 61 ο C. Η θερμοκρασία υαλώδους μετάπτωσης (Tg) είναι αρκετά χαμηλή στους -60 o C. Έτσι, η πολυκαπρολακτόνη είναι ελαστική και παρουσιάζει υψηλή διαπερατότητα σε χαμηλά μοριακά βάρη στη θερμοκρασία σώματος. Ο ρυθμός βιοαποικοδόμισης της είναι αρκετά αργός. Επιπλέον, οι μηχανικές ιδιότητες του πολυμερούς αυτού μπορούν να ρυθμιστούν και να σχεδιαστούν ανάλογα με τα επιθυμητά χαρακτηριστικά. Όλα αυτά, σε συνδυασμό με την αποδεδειγμένη βιοσυμβατότητα, κάνουν την πολυκαπρολακτόνη ένα πολλά υποσχόμενο 82

υποψήφιο συνθετικό πολυμερές για την επιδιόρθωση και αναγέννηση ιστών και εφαρμογή στα ορθοπεδικά εμφυτεύματα. 6.3.2 Περιγραφή πειραματικής διαδικασίας Αρχικά, πλένονται και στεγνώνονται όλα τα σκεύη που θα αξιοποιηθούν στην παρούσα διαδικασία. Ζυγίζονται 2.5 gr PCL στον ζυγό ακριβείας και διαλύονται σε μίγμα μεθανόλης και χλωροφορμίου σε αναλογία 3:1. Το προκύπτον διάλυμα έπειτα κλείνεται με parafilm σε γυάλινο δοχείο για αποφυγή εξάτμισης και τοποθετείται αρχικά στο Vortex Mixer και εν συνεχεία για ανάδευση για 24 ώρες με magnetic stirrer σε θερμοκρασία δωματίου προκειμένου επιτευχθεί πλήρης ομοιογένεια στα συστατικά του. Είναι άχρωμο διαυγές με υψηλό βαθμό ιξώδους όπως παρατηρείται οπτικά επειδή είναι παχύρρευστο. Φυλάσσεται σε δροσερό περιβάλλον για μελλοντική χρήση. Λίγο πριν την χρήση του στην διάταξη Electrospinning System, γίνεται ανάδευση σε Vortex Mixer για 15 περίπου λεπτά στην υψηλή ταχύτητα (24 rpm). 6.3.3 Μέθοδος Ηλεκτροστατικού Ψεκασμού Ινών με PCL Όπως έχει περιγραφεί και στο 5 ο κεφάλαιο, η μέθοδος του Ηλεκτροστατικού Ψεκασμού (Electrospinning System) είναι μια ευρέως διαδεδομένη τεχνική για την παρασκευή νανοϊνώδων δομών και κατά επέκταση παραγωγή εξαιρετικά λεπτών ινών από πολυμερικά διαλύματα ή τήγματα. Για την παρασκευή των πολυμερικών ικριωμάτων της πολυκαπρολακτόνης (PCL) χρησιμοποιήθηκε το σύστημα Ηλεκτροψεκασμού Εναπόθεσης (esprayer ES-2000S Fuence Co., Ltd) που διαθέτει το εργαστήριο LTFN. Το σύστημα περιλαμβάνει έναν ηλεκτρονικό υπολογιστή με τον οποίο γίνεται έλεγχος των παραμέτρων (Τάση, Ρυθμός ροής, θερμοκρασία συλλέκτη πιάτου, διάρκεια πειράματος, επιλογή είδους σύριγγας, επιλογή μοτίβου κίνησης συλλέκτη) καθώς και το θάλαμο παρασκευής ινών / υμενίων. Μέσα στο θάλαμο βρίσκεται ο συλλέκτης-πιάτο, ο οποίος καλύπτεται με αλουμινόχαρτο (λόγω αγωγιμότητας) και του οποίου η απόσταση από τη βελόνα μπορεί να μεταβληθεί χειροκίνητα. Επίσης στο θάλαμο υπάρχει και η κατάλληλη υποδοχή για τη σύριγγα. Σε όλα τα πειράματα χρησιμοποιήθηκε γυάλινη σύριγγα στην οποία τοποθετήθηκε 83

ποσότητα διαλύματος ίση με 2mL και η έγχυση έγινε μέσω βελόνας διαμέτρου 0,52 mm (needle 21). Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σε θερμοκρασία δωματίου (T~20 C). Επιλέχθηκε ως μοτίβο κίνησης του συλλέκτη, το Bio spirral. Η απόσταση μεταξύ βελόνας και συλλέκτη ήταν στα 5 cm, ενώ η διάρκεια της διαδικασίας δημιουργίας ινών ήταν 20 λεπτά, ενώ για μελέτη με AFMη διάρκεια του πειράματος ήταν μικρότερη, στα 5 λεπτά, διότι στα 20 λεπτά το δίκτυο των ινών που δημιουργείται είναι αρκετά πυκνό και τραχύ και καθίσταται αδύνατο για μελέτη. Χρησιμοποιήθηκε ως πολυμερικό διάλυμα το διάλυμα της πολυκαπρολακτόνης 25% σε μίγμα διαλυτών χλωροφόρμιο μεθανόλη σε αναλογία 3:1. Ως υποστρώματα χρησιμοποιήθηκαν αλουμινόχαρτο και γυαλάκι. Τα υποστρώματα γυαλιού χρησιμοποιήθηκαν για μελέτη με AFM, XRD, Οπτικό Μικροσκόπιο και ContactAngle, ενώ τα υποστρώματα γυαλιού για μελέτη με SEM. Κεφάλαιο 7 ο : Μελέτη Φυσικών και Μορφολογικών χαρακτηριστικών νανοσωματιδίων και ικριωμάτων - Αποτελέσματα 7.1 Σύνθεση νανοσωματιδίων αργύρου 7.1.1 Μικροσκοπία Ατομικών Δυνάμεων (AFM) Το διάλυμα των νανοσωματιδίων αργύρου συντέθηκε όπως περιγράφηκε στο 6 ο κεφάλαιο στα πρωτόκολλα διαδικασιών. Λαμβάνεται ένα ml από το διάλυμα με τη βοήθεια πιπέτας και απλώνεται σε γυαλάκι και τοποθετείται για 1 2 λεπτά στην εστία θέρμανσης για εξάτμιση του διαλύτη. Η παραμονή στην εστία δεν θα πρέπει να ξεπερνά τα 2 λεπτά, διότι υπάρχει κίνδυνος δημιουργίας συσσωματωμάτων των νανοσωματιδίων. Αφού ετοιμαστεί το γυαλάκι, τοποθετείται στη διάταξη Μικροσκοπίας Ατομικών Δυνάμεων (AFM) για μελέτη των μορφολογικών χαρακτηριστικών τους. Παρακάτω φαίνονται οι εικόνες τοπογραφίας που λήφθηκαν στις οποίες έγινε επεξεργασία στη συνέχεια με το πρόγραμμα NOVA. 84

Εικόνα 7.1: Εικόνες τοπογραφίας των νανοσωματιδίων αργύρου. Scan size 30 x 30 Όπως προκύπτει από τις παραπάνω εικόνες και με τη βοήθεια του προγράμματος NOVA, το μέσο μέγεθος των νανοσωματιδίων αργύρου κυμαίνεται στα 80 περίπου nm. Η επιφανειακή τραχύτητα (Peak to Peak) είναι 169,785 nm, η μέση τραχύτητα (Average Roughness) στα 23, 1921 nm ενώ η μέση τετραγωνική τιμή της τραχύτητας (Root Mean Square) είναι 28, 1547 nm. Λόγω της μικρής τραχύτητας, τα υμένια είναι λεία χωρίς ανωμαλίες και τραχιές επιφάνειες. Επίσης, παρατηρείται από τις εικόνες πως τα νανοσωματίδια είναι σφαιρικά και ομοιόμορφα, ενώ υπάρχουν και λίγες περιπτώσεις ύπαρξης συσσωματωμάτων. Επιπλέον, τα νανοσωματίδια διακρίνονται από μεγάλη ικανότητα σταθερότητας, διότι το διάλυμά τους παρατηρήθηκε πως μπορεί να παραμείνει για μεγάλο χρονικό διάστημα αποθηκευμένο σε σκοτεινό και δροσερό περιβάλλον χωρίς να αλλάξει χρώμα. 7.1.2 Περίθλαση ακτινών Χ (XRD) Κατόπιν, πραγματοποιούνται μετρήσεις περίθλασης ακτινών Χ, με τις οποίες επιβεβαιώνεται η κρυσταλλική φύση των νανοσωματιδίων αργύρου. Όπως φαίνεται από την παρακάτω εικόνα (Εικόνα 7.2), γίνεται ταυτοποίηση του αργύρου με δύο κορυφές. Συγκεκριμένα, παρατηρείται μια έντονη κορυφή στα (111), η οποία υποδεικνύει την μεταλλική φύση του αργύρου και την παρουσία του στα υμένια των δειγμάτων, εξαιτίας του υψηλού βαθμού κρυσταλλικότητας του, ενώ παρατηρείται και μια μικρότερη κορυφή στα (200). Τα νανοσωματίδια αργύρου έχουν 85

ενδροκεντρωμένη κυβική (fcc) δομή στο κρυσταλλικό σύστημα. Τα αποτελέσματα συμφωνούν με τη βιβλιογραφία [69], [70]. Εικόνα 7.2: Περίθλαση ακτινών Χ για τα υμένια νανοσωματιδίων αργύρου. Φαίνονται οι δύο κορυφές στα (111) και στα (200) που ταυτοποιούν την παρουσία του αργύρου στα υμένια. 7.1.3 Μετρήσεις Διαπερατότητας Είναι πλέον γνωστό και επιβεβαιωμένο πως ο άργυρος είναι το μεταλλικό στοιχείο με τις πιο διαδεδομένες εφαρμογές του εξαιτίας των εξαιρετικών οπτικών του ιδιοτήτων. Ως το πιο κοινό πλασμονικό υλικό, ο άργυρος λόγω των ευρέων οπτικών και ηλεκτρικών του εφαρμογών, έχει λάβει μεγάλη προσοχή, αν και δεν έχουν ακόμη αποσαφηνιστεί ιδιαίτερα τα υπέρλεπτα υμένια αργύρου. Η παρουσία των 4d ηλεκτρονίων καθώς ο περιορισμός των κβάντων στη νανοκλίμακα αλλάζει σημαντικά την οπτική απόκριση των νανοσωματιδίων αργύρου σε σύγκριση με το συμπαγές υλικό. Στην παρούσα εργασία γίνεται μελέτη των υμενίων στα οποία έχουν εναποτεθεί νανοσωματίδια αργύρου. Συγκεκριμένα, αφού γίνει η εναπόθεση των νανοσωματιδίων σε γυαλάκια, πραγματοποιούνται μετρήσεις διαπερατότητας στη περιοχή του ορατού φάσματος 290 έως 550 nm ή αλλιώς 1.5 έως 4.5 ev στο φάσμα του Υπεριώδους - Ορατού για την επιβεβαίωση της παρουσίας του αργύρου στα υμένια. Χρησιμοποιήθηκε ως υμένιο αναφοράς καθαρό γυαλάκι, του οποίου η 86

μέτρηση διαπερατότητας (η οποία καλείται διαπερατότητα αναφοράς), αφαιρείται από τη μέτρηση του δείγματος. Οι αντίστοιχες εικόνες (Εικόνα 7.3 και 7.4 ) για τη διαπερατότητα συναρτήσει τόσο του μήκους κύματος όσο και της ενέργειας φωτονίου, φαίνονται παρακάτω: Εικόνα 7.3: Διάγραμμα διαπερατότητας νανοσωματιδίων αργύρου συναρτήσει του μήκους κύματος σε nm. 87

Εικόνα 7.4: Διάγραμμα διαπερατότητας νανοσωματιδίων αργύρου συναρτήσει της ενέργειας φωτονίων σε ev. Από τις παραπάνω εικόνες παρατηρείται έντονη κορυφή και στα δύο διαγράμματα η οποία αφορά την πλασμονική εκπομπή του αργύρου, στα 320 nm. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν μαζί με τα παραπάνω την παρουσία του αργύρου στα υμένια. Η έντονη κορυφή στα 320 nm είναι χαρακτηριστικό του αργύρου και της μεταλλικής του φύσης όπως προβλέπεται και από τη βιβλιογραφία [46], [48]. 7.2 Σύνθεση νανοσωματιδίων με τη μέθοδο της χιτοζάνης 7.2.1 Μικροσκοπία Ατομικών Δυνάμεων (AFM) Όπως αναφέρθηκε και στο 6 ο κεφάλαιο στα πρωτόκολλα διαδικασιών σχετικά με τη σύνθεση νανοσωματιδίων αργύρου με επικάλυψη με χιτοζάνη, πραγματοποιήθηκαν συνθέσεις με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις χιτοζάνης. Συγκεκριμένα, οι συγκεντρώσεις της χιτοζάνης που επιλέχθηκαν ήταν 0.1%, 0.01% και 0.001% με σκοπό την επιλογή της βέλτιστης συγκέντρωσης της χιτοζάνης για την επικάλυψη των νανοσωματιδίων και κατά επέκταση τη δημιουργία ακόμη πιο σταθερών σωματιδίων καθώς η χιτοζάνη είναι γνωστή τόσο για την ικανότητά της ως σταθεροποιητικός παράγοντας όσο και τη συμβολή της για αποφυγή συσσωμάτωσης των νανοσωματιδίων. Επιπλέον, η χιτοζάνη ως φυσικό πολυμερές χρησιμοποιείται 88

ευρέως στα ορθοπεδικά εμφυτεύματα και στην Αναγεννητική Ιατρική λόγω της βιοσυμβατότητάς της και της ικανότητας ελεγχόμενης απελευθέρωσης του φορτίου της σε ιατρικές συσκευές. [71], [72] Παρακάτω λοιπόν, παρατίθενται οι εικόνες που λήφθηκαν με Ατομική Μικροσκοπία Δυνάμεων (AFM) των νανοσωματιδίων αργύρου με επικάλυψη με χιτοζάνη. Αξίζει να σημειωθεί πως το ζ- δυναμικό των νανοσωματιδίων αργύρου όπως συντέθηκαν με τη μέθοδο Agnihotri [67] βρίσκεται πως είναι αρνητικό, και συγκεκριμένα κυμαίνεται μεταξύ -26.8 και -53.1 mv. Η χιτοζάνη όπως προαναφέρθηκε, είναι φυσικό, γραμμικό πολυμερές με ζ δυναμικό θετικό, και μάλιστα στην τιμή του 10.1 mv όπως ευρίσκεται και από τη βιβλιογραφία για χιτοζάνη χαμηλού μοριακού βάρους [73]. Όπως είναι λοιπόν αναμενόμενο, η πρόσδεση της χιτοζάνης χαμηλού μοριακού βάρους με θετικό δυναμικό, επιτυγχάνεται με την ένωση με ομοιοπολικό δεσμό, με τα νανοσωματίδια αργύρου τα οποία έχουν αρνητικό δυναμικό, και έτσι με αυτό τον τρόπο γίνεται η επικάλυψη της χιτοζάνης γύρω από τα νανοσωματίδια, καθιστώντας τα νανοσωματίδια περισσότερο σταθερά, με ελεγχόμενη απελευθέρωση του φορτίου τους, του αργύρου στην προκειμένη περίπτωση, ενώ παράλληλα παρατηρείται αύξηση του μεγέθους των σωματιδίων. Παρακάτω παρατίθενται οι εικόνες τοπογραφίας που λήφθηκαν με AFM για τις τρεις διαφορετικές περιπτώσεις συγκεντρώσεων της χιτοζάνης που χρησιμοποιήθηκαν Α) 0.1% Chitosan Εικόνα 7.5: Εικόνες τοπογραφίας για νανοσωματίδια αργύρου με επικάλυψη με χιτοζάνη 0.1 %.Scan size 30 x 30 89

Β) 0.01% Chitosan Εικόνα 7.6: Εικόνες τοπογραφίας των νανοσωματιδίων με επικάλυψη με χιτοζάνη 0.01%. Scan size 30 x 30 C) 0.001% Chitosan Εικόνα 7.7: Εικόνες τοπογραφίας των νανοσωματιδίων με επικάλυψη με χιτοζάνη 0.001%. Scan size 30 x 30 Από τις παραπάνω εικόνες παρατηρείται αρχικά στην Εικόνα 7.5 πως για την επικάλυψη των νανοσωματιδίων με 0.1% χιτοζάνη, δεν υπάρχει ουσιαστικά σχηματισμός νανοσωματιδίων, διότι η συγκέντρωση αυτή της χιτοζάνης είναι αρκετά μεγάλη, που ουσιαστικά σχηματίζεται ένα υμένιο, όπως φαίνεται και από την εικόνα της τρισδιάστατης δομής στα δεξιά. Μπορούμε δηλαδή με άλλα λόγια να πούμε πως η συγκέντρωση αυτή της χιτοζάνης ουσιαστικά «ισοπεδώνει» και καταστρέφει το σχηματισμό των νανοσωματιδίων, μετατρέποντας τα σε ένα άμορφο, τραχύ και παχύ υμένιο. Στην Εικόνα 7.6 παρατηρείται πως με επικάλυψη με 0.01% χιτοζάνη, υπάρχει καλύτερη μορφολογία και σχηματισμός των νανοσωματιδίων. Τα νανοσωματίδια 90

είναι ομοιόμορφα με καλή ομοιογένεια και καλώς διεσπαρμένα, με λίγες ενδείξεις συσσωματωμάτων. Στην τρισδιάστατη εικόνα φαίνονται οι κορυφές των νανοσωματιδίων. Στην Εικόνα 7.7 παρατηρείται και πάλι ο σχηματισμός νανοσωματιδίων αργύρου επικαλυμμένων με χιτοζάνη 0.001%. με καλή ομοιομορφία και ομοιογένεια, αν και στην προκειμένη περίπτωση παρατηρούνται περισσότερα συσσωματώματα. Εξάγεται το συμπέρασμα πως η χιτοζάνη όπως είναι άλλωστε γνωστό, αξιοποιείται ως παράγοντας καλής διασποράς των νανοσωματιδίων, καθιστώντας πιο σταθερά και αποτρέπει το σχηματισμό συσσωματωμάτων. Η χρήση όμως περίσσειας ποσότητας χιτοζάνης καταστρέφει τα νανοσωματίδια καταλήγοντας σε άμορφο υμένιο ενώ η χρήση πολύ μικρής ποσότητας από την άλλη πλευρά, δε συμβάλλει στην καλύτερη δημιουργία και μορφολογία των νανοσωματιδίων. Συνεπώς, η βέλτιστη συγκέντρωση ανάμεσα σε αυτές οι 3 είναι η ενδιάμεση, δηλαδή η 0.01% χιτοζάνη. Παρακάτω στις Εικόνες 7.8 και 7.9 φαίνεται το διάγραμμα κατανομής των νανοσωματιδίων αργύρου με επικάλυψη με 0.01% και 0.001% χιτοζάνη συναρτήσει της διαμέτρου τους, όπως προκύπτει από το πρόγραμμα ImageJ software. Το μέσο μέγεθος των νανοσωματιδίων προκύπτει στα 160 nm και 120 nm, που είναι σχεδόν το διπλάσιο από τα νανοσωματίδια αργύρου χωρίς επικάλυψη. Αυτή η αύξηση του μεγέθους σηματοδοτεί την πρόσδεση της χιτοζάνης γύρω από τα νανοσωματίδια και το σχηματισμό ενός πολυμερικού κελύφους γύρω από αυτά. 91

Εικόνα 7.8: Κατανομή του αριθμού των νανοσωματιδίων αργύρου με βάση τη διάμετρό τους με επικάλυψη με χιτοζάνη 0.01% όπως εξάγεται από το πρόγραμμα ImageJ software. Εικόνα 7.9: Κατανομή του αριθμού των νανοσωματιδίων αργύρου με βάση τη διάμετρό τους με επικάλυψη με χιτοζάνη 0.001% όπως εξάγεται από το πρόγραμμα ImageJ software. Στις επόμενες εικόνες (Εικόνες 7.10 και 7.11) παρατίθενται τα διαγράμματα των συγκεντρώσεων % της χιτοζάνης συναρτήσει τόσο της μέσης τιμής τετραγωνικής τραχύτητας (Root Mean Square), όσο και της επιφανειακής τραχύτητας (Peak to Peak) 92

60 Root Mean Square vs Chitosan Concentration Root Mean Square (Sa) 40 20 0 0,001 0,01 0,1 Chitosan Concentration (%) Εικόνα 7.10: Διάγραμμα μέσης τιμής τετραγωνικής τραχύτητας συναρτήσει των τριών διαφορετικών συγκεντρώσεων % της χιτοζάνης Peak - to Peak vs Chitosan Concentration 300 250 Peak to Peak (Sy) 200 150 100 50 0 0,1 0,01 0,001 Chitosan Concentration (%) Εικόνα 7.10: Διάγραμμα επιφανειακής τραχύτητας συναρτήσει των τριών διαφορετικών συγκεντρώσεων % της χιτοζάνης Από τα δύο παραπάνω διαγράμματα διαπιστώνεται πως όσο η συγκέντρωση της χιτοζάνης αυξάνεται, η μέση τετραγωνική τιμή της τραχύτητας μειώνεται, δηλώνοντας μικρότερη τραχύτητα. Το ίδιο ισχύει και για την επιφανειακή τραχύτητα. Όμως οι τιμές είναι χαμηλές για όλα τα δείγματα, υποδεικνύοντας επίπεδη και ομαλή τοπογραφία. Πιθανόν, αν είχαμε ακόμη μεγαλύτερες συγκεντρώσεις χιτοζάνης, η τραχύτητα να ήταν κοντά στο μηδέν, δηλαδή τα υμένια 93

να ήταν τελείως λεία, λόγω του στρώματος της χιτοζάνης που θα δημιουργούνταν, όπως φαίνεται και από την τρισδιάστατη εικόνα της 0.1% χιτοζάνης (Εικόνα 7.5) όπου σχηματίζεται ουσιαστικά λείο υμένιο. 7.2.2 Μετρήσεις Διαπερατότητας Όπως και στην περίπτωση των νανοσωματιδίων αργύρου, έτσι και στην περίπτωση της επικάλυψης τους με τις τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις 0.1%, 0.01% και 0.001%. Συγκεκριμένα, τα νανοσωματίδια αργύρου εναποτίθενται σε υποστρώματα γυαλιού καθώς και εκείνα που είναι επικαλυμμένα με τις τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις χιτοζάνης. Οι μετρήσεις διαπερατότητας διεξάχθηκαν στην περιοχή του υπεριώδους ορατού στα 290 έως 550 nmγια την αξιολόγηση των πλασμονικών επιδράσεων της χιτοζάνης όταν προσδένεται στα νανοσωματίδια, δεδομένου ότι το περιβάλλον μέσο θα πρέπει να επηρεάζει τη διασπορά και την απόσβεση των επιφανειακών πλασμονίων στα νανοσωματίδια αργύρου. [74], [75]. Σε κάθε περίπτωση, η συνεισφορά του υποστρώματος γυαλιού ορίζεται ως αναφορά και αφαιρείται από τις τελικές τιμές της διαπερατότητας. Η Εικόνα 7.11 δείχνει το κανονικοποιημένο φάσμα διαπερατότητας των διαφορετικών δειγμάτων των νανοσωματιδίων αργύρου διότι το πάχος των υμενίων ποικίλλει σε κάθε περίπτωση εξαιτίας της διαφορετικής κάθε φορά συγκέντρωσης επικάλυψης της χιτοζάνης. Συγκεκριμένα, το δείγμα με τη 0.1% συγκέντρωση χιτοζάνης δεν παρουσιάζει πλασμονική επίδραση. Για την αξιολόγηση των χαρακτηριστικών των κορυφών της διαπερατότητας, έγινε επεξεργασία των κορυφών με συναρτήσεις Gaussian. Στις περιπτώσεις των επικαλυμμένων νανοσωματιδίων, τα αποτελέσματα παρουσιάζουν αύξηση του πλήρους εύρους στο μισό του μεγίστου (Full Width at Half Maximum) από 26.5 nm στα 29.7 nm και στα 35.5 nm στις περιπτώσεις των 0.001% και 0.01% συγκέντρωσης της χιτοζάνης αντίστοιχα. Αυτό γίνεται πλήρως κατανοητό δεδομένου ότι το FWHM της κορυφής του επιφανειακού πλασμονίου συνδέεται με την απόσβεση του επιφανειακού πλασμονίου και επηρεάζεται ισχυρά από τα μεταλλικά νανοσωματίδια που περιβάλλουν το διηλεκτρικό μέσο. Παρόλα αυτά, η θέση της κορυφής παραμένει αμετάβλητη στα 322 περίπου nm δεδομένου ότι ο μηχανισμός που καθορίζει τη διασπορά, είναι το μέγεθος του πυρήνα του Ag το οποίο στις παραπάνω περιπτώσεις είναι σταθερό. 94

Εικόνα 7.11: Κανονικοποιημένο φάσμα διαπερατότητας των νανοσωματιδίων αργύρου 7.2.3 Μετρήσεις ph καθώς και της επικάλυψης με χιτοζάνη Για την επιβεβαίωση της επικάλυψης των νανοσωματιδίων αργύρου με χιτοζάνη, πραγματοποιηθήκαν επιπλέον μετρήσεις που αφορούν το phτων διαλυμάτων. Συγκεκριμένα, μετράται το phτου διαλύματος των νανοσωματιδίων αργύρου, με τη βοήθεια πεχαμετρικού χάρτου πριν και μετά την επικάλυψη με τη χιτοζάνη και προκύπτει το παρακάτω διάγραμμα των τιμών ph συναρτήσει των διαφορετικών συγκεντρώσεων της χιτοζάνης καθώς και των νανοσωματιδίων αργύρου χωρίς επικάλυψη. 95

ph vs Chitosan Concentration (%) 5 4 ph 3 2 1 0 0,001 0,01 0,1 Chitosan Concentration (%) Εικόνα 7.12: Διάγραμμα ph συναρτήσει της συγκέντρωσης χιτοζάνης για τις τρεις διαφορετικές περιπτώσεις 0.1%, 0.01% και 0.001% Παρατηρείται ότι όλες οι τιμές είναι κάτω του 7, δηλαδή όξινες, αφού η χιτοζάνη διαλύεται σε διάλυμα οξικού οξέος σε νερό, ενώ για τα νανοσωματίδια Ag είναι πάνω από 7 υποδηλώνοντας βασική συμπεριφορά. Επιβεβαιώνεται με αυτό τον τρόπο η επικάλυψη της χιτοζάνης στα νανοσωματίδια Ag. 7.2.4 Μετρήσεις XRD Με τη μέθοδο της περίθλασης ακτινών Χ επιλέγονται για μέτρηση τα νανοσωματίδια αργύρου που έχουν επικαλυφθεί με τη βέλτιστη συγκέντρωση της χιτοζάνης. Στο παρακάτω διάγραμμα (Εικόνα 7.13) φαίνεται η καμπύλη για τα νανοσωματίδια με 0.01% χιτοζάνης, ενώ έχει παρατεθεί και η καμπύλη με τα νανοσωματίδια αργύρου χωρίς επικάλυψη για σύγκριση. 96

Εικόνα 7.13: Διάγραμμα XRD νανοσωματιδίων Ag και επικάλυψης με 0.01% χιτοζάνη Από το παραπάνω διάγραμμα φαίνεται καθαρά πως η δομή των νανοσωματιδίων αργύρου όταν προσδένονται με τη χιτοζάνη μετατρέπεται από κρυσταλλική σε άμορφη, καθώς δε παρατηρείται σχηματισμός κορυφών που να υποδηλώνουν κρυσταλλικότητα. Αυτό είναι αναμενόμενο, δεδομένου πως η χιτοζάνη ως πολυμερές έχει άμορφη δομή. Συνεπώς, επιβεβαιώνεται για άλλη μια φορά η παγίδευση των νανοσωματιδίων αργύρου στο εσωτερικό της χιτοζάνης. Τα δεδομένα συμφωνούν με τη βιβλιογραφία. [76] 7.3 Δημιουργία 3D Ικριωμάτων PCL 7.3.1 Ατομική Μικροσκοπία Δυνάμεων Μετά την πραγματοποίηση της διαδικασίας του Electrospinning System για την δημιουργία και εναπόθεση ινών PCL 25% σε μίγμα χλωροφορμίου μεθανόλης σε αναλογία 3:1 πάνω σε υπόστρωμα γυαλιού και σε αλουμινόχαρτο, μελετώνται τα υποστρώματα γυαλιού με την Ατομική Μικροσκοπία Δυνάμεων. Αξίζει να σημειωθεί πως για τη μελέτη με AFM η διάρκεια του Ηλεκτροψεκασμού περιορίζεται στα 5 λεπτά, καθώς στα 20 λεπτά δημιουργείται ένα πολύ πυκνό δίκτυο ινών με αποτελέσματα μεγάλη τραχύτητα και πάχος του υμενίου, και ως εκ τούτου, αδυναμία μελέτης του. Παρακάτω φαίνονται οι εικόνες AFM που λήφθηκαν. 97

Εικόνα 7.14: Εικόνες AFM με ίνες PCL 25% σε χλωροφόρμιο : μεθανόλη 3:1 Από τις παραπάνω εικόνες τοπογραφίας παρατηρείται πως υπάρχει καλή μορφολογία ινών, με το σχηματισμό δικτύου, ενώ απουσιάζει η ύπαρξη beads. Η επιφανειακή τραχύτητα (Peak to Peak) είναι 2210,52 nm, η μέση τραχύτητα (Average Roughness) στα 221,343 nm ενώ η μέση τετραγωνική τιμή της τραχύτητας (Root Mean Square) είναι 304,575 nm 7.3.2 Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης Για την περαιτέρω εκτίμηση της μορφολογίας των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε η ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (JSM-6390LV, Jeol) (Εικόνα 7.15) στα 20 kvαφού προηγήθηκε απανθράκωση των δειγμάτων ((Jeol Jee-4X Vacuum Evaporator). Οι εικόνες που ελήφθησαν για κάθε δείγμα έγιναν σε διάφορες μεγεθύνσεις (x500, x1000, x3000, x5000, x7000, x8000) ανάλογα με τις διαστάσεις της απεικονιζόμενης δομής. Εικόνα 7.15: Σύστημα Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Σάρωσης (SEM), του τμήματος Φυσικής, με το οποίο μελετήθηκε η μορφολογία των δειγμάτων. 98

Κυρίως, μελετήθηκαν τα δείγματα με ικριώματα για να εξαχθούν συμπεράσματα σχετικά με τη διευθέτηση των ινών, την κατανομή των διαμέτρων των ινών, την παρουσία στρογγυλών δομών στην πορεία των ινών (beads) και τις διαστάσεις τους. Για την παρατήρηση των ινών PCL με Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης, πραγματοποιούνται οι ανάλογες διαδικασίες για τοποθέτηση του υποστρώματος αλουμινόχαρτου αυτή τη φορά, και γίνεται η παρακολούθηση. Οι εικόνες φαίνονται παρακάτω: Εικόνα 7.16: Εικόνες SEM με ίνες PCL 25% σε χλωροφόρμιο μεθανόλη 3:1. Πάνω: μεγέθυνση x4000. Κάτω: μεγέθυνση x2000 99

Ο μέσος όρος των διαμέτρων των ινών καθώς και των beads υπολογίστηκε μετρώντας τη διάμετρο 10 ινών και 10 beads από κάθε εικόνα με το ImageJ software. Προκύπτει λοιπόν πως η μέση διάμετρος των ινών κυμαίνεται στα 1.59 ± 0.34 μm. 7.3.3 Οπτικό Μικροσκόπιο Επίσης, πέρα από τις παραπάνω μετρήσεις, πραγματοποιείται και παρατήρηση με Οπτική Μικροσκοπία, όπως φαίνεται και από τις παρακάτω εικόνες: Εικόνα 7.17: Εικόνες Οπτικού Μικροσκοπίου με ίνες PCL 25% σε χλωροφόρμιο : μεθανόλη 3:1. Πάνω: κλίμακα 200 μm. Κάτω: κλίμακα 50 μm 100

Οι παραπάνω εικόνες επιβεβαιώνουν τον σχηματισμό και την καλή μορφολογία και σχηματισμό ινών με αποτέλεσμα το σχηματισμό δικτύου, ενώ διατηρείται η ομαλότητα της επιφάνειας του ικριώματος, ενώ υπάρχουν λίγαbeads. 7.4 Σύνθεση 3D Ικριωμάτων PCL ενσωματωμένων με Νανοσωματίδια Αργύρου Τεχνικές Εναπόθεσης Στη παρούσα παράγραφο, γίνεται προσπάθεια ενσωμάτωσης των νανοσωματιδίων αργύρου που συντέθηκαν όπως περιγράφηκε στο 6ο κεφάλαιο, με τα ικριώματα PCL. Έχει αποδειχθεί όπως προαναφέρθηκε και στο θεωρητικό μέρος της παρούσας εργασίας, πως ο άργυρος όπως και η νανοδομή του, είναι τοξικός και αναπτύσσει αξιόλογη βακτηριοκτόνα δράση έναντι μικροοργανισμών. Με άλλα λόγια, έχει αποδειχθεί ότι η χρήση νανοδομημένων υλικών αργύρου ενισχύει την ανασταλτική ικανότητα πιθανόν επειδή τα νανοδομημένα υλικά έχουν μεγάλη επιφάνεια επαφής. Ωστόσο, η χρήση τους περιορίζεται από τις δυσκολίες που σχετίζονται με το χειρισμό και την επεξεργασία τους. Στην πραγματικότητα, συναθροίζονται (aggregated) εύκολα, λόγω της υψηλής επιφανειακής τους ελεύθερης ενέργειας, και μπορούν να οξειδωθούν ή να μολυνθούν στον αέρα. Η συσσωμάτωση των nanosized μετάλλων στις βιοδιασπώμενες πολυμερικές μήτρες είναι μια αξιόλογη λύση στο πρόβλημα της σταθεροποίησης, και επιτρέπει μια ελεγχόμενη αντιβακτηριδιακή δράση. Επιπλέον, οι χαμηλές συγκεντρώσεις των Ag NPs είναι σε θέση να επάγουν μορφολογικές αλλαγές στην επιφάνεια του πολυμερικού ικριώματος και να επηρεάσουν την επιφανειακή διαβρεξημότητα του νανοσύνθετου, αλλά και την τραχύτητα. Επίσης, όλες αυτές οι πτυχές επηρεάζουν τη διαδικασία της βακτηριακής προσκόλλησης στην επιφάνεια του νανοσύνθετου. Αφού λοιπόν δημιουργήθηκαν τα τρισδιάστατα πολυμερικά ικριώματα PCL25%, και συντέθηκε το διάλυμα των νανοσωματιδίων αργύρου, γίνεται προσπάθεια ενσωμάτωσης των νανοσωματιδίων αργύρου στα παραπάνω ικριώματα. Αυτή η προσπάθεια γίνεται με τρεις διαφορετικές μεθόδους εναπόθεσης. Η πρώτη μέθοδος είναι η Drop Casting Method, η δεύτερη αφορά το Electrospinning System, και η τρίτη το Electrosprayingμε διπλή σύριγγα (Dual Syringe Electrospraying System). Οι τρεις αυτές μέθοδοι θα εξεταστούν λεπτομερώς παρακάτω. 101

7.4.1 Drop Casting Method Η μέθοδος Drop Casting (Εικόνα 7.18) είναι μια μέθοδος εναπόθεσης, εύκολη σχετικά στη διαδικασία χωρίς οικονομικό κόστος, καθώς δεν απαιτείται ιδιαίτερος εξοπλισμός και μπορεί να πραγματοποιηθεί σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Το πάχος του υμενίου που δημιουργείται πάνω στο υπόστρωμα εξαρτάται από τον όγκο της διασποράς που χρησιμοποιείται, καθώς και από τη συγκέντρωση των σωματιδίων. Και τα δύο είναι μεταβλητές παράμετροι αυτής της μεθόδου. Υπάρχουν επίσης και άλλες μεταβλητές που επηρεάζουν τη δομή του υμενίου όπως για παράδειγμα το πόσο αποτελεσματικά διαβρέχει ο διαλύτης το υπόστρωμα, ο ρυθμός εξάτμισης του διαλύτη, οι τριχοειδείς δυνάμεις που σχετίζονται με τη ξήρανση, κλπ. Γενικότερα, είναι επιθυμητή η χρήση διαλυτών που έχουν χαρακτηριστικά μεγάλης πτητικότητας, διαβρέχουν το υπόστρωμα, δεν είναι ευαίσθητοι σε αστάθειες των λεπτών υμενίων (de wetting). Το νερό τείνει να είναι φτωχός διαλύτης για τη μέθοδο Drop Casting, εξαιτίας της χαμηλής πίεσης ατμών και της μεγάλης επιφανειακής του τάσης. Σε ορισμένες περιπτώσεις, οι αλκοόλες μπορούν να αντικαταστήσουν το νερό, ενώ οργανικοί διαλύτες (όπως το εξάνιο, τολουένιο ή αλογονωμένοι διαλύτες) αποτελούν συχνά καλές επιλογές για νανοσωματίδια με υδρόφοβους προσδέτες κάλυψης (hydrophobic capping ligands). Ένα μειονέκτημα της μεθόδου αυτής είναι ακόμη και κάτω από ιδανικές συνθήκες, οι διαφορές στους ρυθμούς εξάτμισης συναρτήσει του υποστρώματος ή των διακυμάνσεων της συγκέντρωσης μπορεί να οδηγήσουν σε διαφοροποιήσεις στο πάχος του υμενίου ή την εσωτερική δομή. Ωστόσο, η μέθοδος αυτή εξυπηρετεί μια γρήγορη και προσιτή τεχνική για τη παραγωγή λεπτών υμενίων σε σχετικά μικρά υποστρώματα, όπως εκείνα του γυαλιού. Άλλα μειονεκτήματα είναι ο περιορισμός που συναντάται σε κάλυψη μεγάλης επιφάνειας, δυσκολία ελέγχου του πάχους του υμενίου, και χαμηλή ομοιομορφία. Τα μειονεκτήματα όμως αυτά μπορούν να ξεπεραστούν με τη χρήση συνδυασμού διαλυτών καθώς και με θέρμανση σε εστία για γρήγορη εξάτμιση του διαλύτη και βελτίωση της μορφολογίας του διαλύτη. [77] 102

Εικόνα 7.18: Σχηματική αναπαράσταση της μεθόδου Drop Casting [78] Στην παρούσα πειραματική διαδικασία, χρησιμοποιείται το διάλυμα των νανοσωματιδίων αργύρου για επικάλυψη των ικριωμάτων που έχουν δημιουργηθεί με ίνες PCL. Όπως έχει αναφερθεί και στην προηγούμενη παράγραφο, αποφεύγεται η χρήση νερού ως διαλύτη λόγω μεγάλης επιφανειακής τάσης καθώς και χαμηλής πίεσης ατμών. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί πως η αιθανόλη είναι καλή επιλογή διαλύτη για τη μέθοδο Drop Casting, καθώς έχει χαρακτηριστικά υψηλής πτητικότητας και χαμηλής τοξικότητας, ενώ τα νανοσωματίδια αργύρου διαλύονται εξίσου καλά και σε αυτήν. Συνεπώς, το διάλυμα των νανοσωματιδίων αργύρου συντίθενται σύμφωνα με την πειραματική διαδικασία που έχει περιγραφεί έως και το στάδιο της φυγοκέντρησης, με τη δημιουργία ιζήματος στον πυθμένα του falkon και απομάκρυνση του υπερκείμενου υγρού. Η επαναδιασπορά των νανοσωματιδίων κατόπιν, γίνεται με διάλυση σε αιθανόλη. Συγκεκριμένα, προστίθεται μικρή ποσότητα αιθανόλης στο falkonκαι το νέο διάλυμα τοποθετείται στο Vortex Mixer και κατόπιν στο λουτρό υπερήχων για πλήρη ομοιογένεια των συστατικών του και ομοιομορφία. Στη συνέχεια η πραγματοποίηση της μεθόδου Drop Casting γίνεται όπως στην Εικόνα 7.19. Αρχικά, τοποθετούνται τα ικριώματα με τις ίνες PCLσε υάλινο δισκίο. Με πιπέτα των 1000 μl λαμβάνεται ποσότητα νανοσωματιδίων αργύρου ίση με 50 μlκαι εναποτίθενται προσεκτικά και αργά πάνω στο ικρίωμα ενώ με λαβίδα μετακινείται το ικρίωμα, ώστε να επιτευχθεί όσο είναι δυνατόν καλύτερη κάλυψη των ινών και καλύτερη ομοιομορφία. Η όλη διαδικασία πραγματοποιείται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος ( 25 o C). Κατόπιν, το δισκίο με τα ενσωματωμένα με νανοσωματίδια αργύρου ικριώματα τοποθετείται σε θερμό περιβάλλον ( 30 o C) για 20 περίπου λεπτά, έως ότου εξατμιστεί η αιθανόλη. Αξίζει να σημειωθεί πως η παραπάνω 103

διαδικασία είχε αρχικά πραγματοποιηθεί με διαλύτη νερό και υπήρχε αδυναμία εξάτμισής του ακόμη και όταν τα ικριώματα τοποθετήθηκαν στον απαγωγό (37 o C). Ως εκ τούτου επιλέχτηκε η αιθανόλη, ενώ το διάλυμα των νανοσωματιδίων ήταν πιο πυκνό, δηλαδή διασπορά σε μικρότερο όγκο αιθανόλης, από ότι σε όγκο νερού. Εικόνα 7.19: Σχηματική αναπαράσταση της πειραματικής διαδικασίας με τη μέθοδο Drop 7.4.1.1 Οπτικό Μικροσκόπιο Casting [79] Τα ικριώματα PCL μετά την ενσωμάτωση των νανοσωματιδίων αργύρου, παρατηρούνται στο Οπτικό Μικροσκόπιο. Οι εικόνες φαίνονται παρακάτω: Εικόνα 7.20: Εικόνες ινών PCL με νανοσωματίδια αργύρου με Οπτικό Μικροσκόπιο. Αριστερά: κλίμακα 200μm. Δεξιά: κλίμακα 50 μm 104

Από τις παραπάνω εικόνες φαίνονται καθαρά οι ίνες PCL χωρίς να υπάρχει αλλοίωση του δικτύου τους. Συμπεραίνεται πως η εναπόθεση των νανοσωματιδίων αργύρου με τη μέθοδο Drop Casting δεν επηρεάζει τη μορφολογία των ινών του ικριώματος. Τα νανοσωματίδια εύλογα δε φαίνονται στις παραπάνω εικόνες καθώς με την Οπτική Μικροσκοπία γίνεται ανάλυση σε μικροκλίμακα και όχι σε νανοκλίμακα. Για αυτό το λόγο εφαρμόζεται παρακάτω εξέταση με Ατομική Μικροσκοπία Δυνάμεων (AFM) ώστε να διαπιστωθεί η ύπαρξη των νανοσωματιδίων πάνω και μέσα στις ίνες PCL. 7.4.1.2 Ατομική Μικροσκοπία Δυνάμεων Πέρα από την παρακολούθηση με Οπτική Μικροσκοπία, γίνεται και παρακολούθηση με Ατομική Μικροσκοπία Δυνάμεων, για διαπίστωση της ύπαρξης νανοσωματιδίων αργύρου, καθώς και της ενσωμάτωσής τους στην επιφάνεια αλλά και στο εσωτερικό των ινών PCL. Οι εικόνες τοπογραφίας με τις οποίες έγινε επεξεργασία με το πρόγραμμα NOVA, παρουσιάζονται παρακάτω: Εικόνα 7.21: Εικόνες AFM ικριωμάτων PCL ενσωματωμένων με Ag NPs με τη μέθοδο Drop Casting. Scan size 15x15 Σύμφωνα με το πρόγραμμα NOVA, εξάγονται τα παρακάτω στοιχεία από την ανάλυση της σκληρότητας του ικριώματος: Η επιφανειακή τραχύτητα (Peak to Peak) είναι 2010,52 nm, η μέση τραχύτητα (Average Roughness) στα 231,343 nm ενώ η μέση τετραγωνική τιμή της τραχύτητας (Root Mean Square) είναι 313,575 nm, ενώ το μέσο μέγεθος των νανοσωματιδίων κυμαίνεται στα 30 35 nm. Από τις παραπάνω τιμές τραχύτητας και από τις εικόνες τοπογραφίας παρατηρείται μεγάλη 105

τραχύτητα και ανωμαλία του υμενίου, γεγονός που είναι αναμενόμενο, λόγω της εναπόθεσης πυκνού διαλύματος νανοσωματιδίων στην επιφάνεια του ικριώματος. Πραγματοποιούνται επίσης μετρήσεις σε μεγαλύτερη ανάλυση για καλύτερη παρατήρηση των νανοσωματιδίων. Για αυτό το λόγο, απομονώνεται εικόνα μιας ίνας και γίνεται ανάλυση της. παρακάτω φαίνονται οι εικόνες: Εικόνα 7.22: Εικόνες AFM ικριωμάτων PCL ενσωματωμένων με Ag NPs με τη μέθοδο Drop Casting. Scan size 30x30 Από τις παραπάνω εικόνες τοπογραφίας φαίνονται τα νανοσωματίδια πάνω στην ίνα. Για διαπίστωση εάν βρίσκονται και στην επιφάνεια αλλά και στο εσωτερικό της ίνας, δηλαδή εάν έχουν διεισδύσει τα νανοσωματίδια στην εσωτερική δομή του ικριώματος, πραγματοποιείται ανάλυση ιστογράμματος στον άξονα χ και στον άξονα y με τη βοήθεια του προγράμματος NOVA. Εικόνα 7.23: Ιστόγραμμα στον άξονα χ (αριστερά) και στον άξονα y (δεξιά). Από την παρατήρηση των παραπάνω εικόνων εξάγεται το συμπέρασμα πως πολύ πιθανόν τα νανοσωματίδια να παρουσιάζουν ικανότητα διείσδυσης εντός του 106

εσωτερικού των ινών, χωρίς νε επηρεάζουν το μέγεθος και τη μορφολογία των ινών. Επίσης, λόγω του μικρού μεγέθους τους, τα νανοσωματίδια δεν επηρεάζουν σημαντικά τη διάμετρο των ινών. Η διάμετρος κυμαίνεται περίπου στα 2.10 ± 0.11μm, λίγο παραπάνω δηλαδή από ότι οι ίνες χωρίς τα νανοσωματίδια των οποίων η διάμετρος κυμαίνεται στα 1.59 ± 0.34 μm. 7.4.2 Electrospinning System Η δεύτερη μέθοδος για την οποία έγινε εκτεταμένα λόγος στο 5 ο κεφάλαιο, είναι με την τεχνική Electrospinning. Αυτή η τεχνική η οποία χρησιμοποιήθηκε ήδη για τον σχηματισμό και εναπόθεση ινών PCL σε υποστρώματα γυαλιού και αλουμινόχαρτου, δοκιμάστηκε επίσης για τον σχηματισμό των νανοσωματιδίων αργύρου καθώς και για την εναπόθεσή τους πάνω στα ικριώματα PCL. Συγκεκριμένα, συντίθενται το διάλυμα των νανοσωματιδίων, επαναλαμβάνοντας τα ίδια βήματα διαδικασίας όπως και στις προηγούμενες περιπτώσεις, παραλείποντας όμως στην προκειμένη περίπτωση το στάδιο της φυγοκέντρησης. Δηλαδή το πολυμερικό διάλυμα των νανοσωματιδίων χωρίς να υποστεί νανοκαταβύθιση, εισάγεται στο σύστημα του Electrospinning. Συγκεκριμένα, εισάγονται 4 ml πολυμερικού διαλύματος των νανοσωματιδίων αργύρου στη γυάλινη σύριγγα και η έγχυση έγινε με βελόνα διαμέτρου 0.52 mm(needle 21). Το πείραμα διεξήχθη σε θερμοκρασία δωματίου (20 ο C). Στο θάλαμο υπάρχει και κατάλληλη υποδοχή για τη σύριγγα. Οι παράμετροι που χρησιμοποιήθηκαν στην προκειμένη περίπτωση είναι τάση V = 15 kvκαι ταχύτητα S = 10 μl / min. Το μοτίβο (pattern) που επιλέχτηκε ήταν dense lines και η διάρκεια που έλαβε χώρα ήταν 1 ώρα και 20 λεπτά. Η απόσταση του συλλέκτη από τη βελόνα η οποία μεταβάλλεται και χειροκίνητα ρυθμίστηκε στα 200 nm. Ως υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε αλουμινόχαρτο (aluminum foil) και φυσικά, τα ικριώματα με τις ίνες PCL (γυαλάκια). 7.4.2.1 Ατομική Μικροσκοπία Δυνάμεων (AFM) Παρακάτω φαίνονται οι εικόνες τοπογραφίας (Εικόνα 7.24) που λήφθηκαν με την βοήθεια του συστήματος της Ατομικής Μικροσκοπίας Δυνάμεων (AFM) στις οποίες έχει γίνει ανάλυση με τη βοήθεια του προγράμματος NOVA, με τις ίνες PCLστις 107

οποίες έχει γίνει εναπόθεση του πολυμερικού διαλύματος Ag NPsμε τη βοήθεια του Electrospinning System. Εικόνα 7.24: Εικόνες τοπογραφίας ικριωμάτων PCLμε εναπόθεση των νανοσωματιδίων Ag. Scan size 15 x15 Από ανάλυση των παραπάνω εικόνων, προκύπτει πως οι ίνες PCL έχουν επιφανειακή τραχύτητα (Peak to Peak) στα 840,03 nm, η μέση τραχύτητα (Average Roughness) στα 98, 631 nm ενώ η μέση τετραγωνική τιμή της τραχύτητας (Root Mean Square) είναι 130, 043 nm, ενώ το μέσο μέγεθος των νανοσωματιδίων κυμαίνεται στα 20 32 nm. Η διάμετρος των ινών δεν επηρεάζεται από την εναπόθεση των νανοσωματιδίων, διατηρείται δηλαδή σταθερή στα 2000 μm. Σε σύγκριση με τη προηγούμενη μέθοδο (τεχνική Drop Casting), σε αυτή τη μέθοδο το μέγεθος των νανοσωματιδίων μειώνεται, λόγω ψεκασμού μέσω σύριγγας ορισμένης διαμέτρου, και πιθανόν λόγω της ύπαρξης της πολυμερικής ουσίας PVP. Οι ίνες δεν επηρεάζονται σε καμία από τις δύο περιπτώσεις από την εναπόθεση των νανοσωματιδίων, διατηρώντας σταθερή τη διάμετρό τους, στα 2000 μm. Το μέγεθος δηλαδή των νανοσωματιδίων είναι πολύ μικρό για να επηρεάσει τη διάμετρο των ινών. Επίσης, τα ικριώματα με τη μέθοδο του Electrospinning Systemεμφανίζονται λιγότερο τραχιά από ότι με τη μέθοδο του Drop Casting, από τη σύγκριση των τιμών της επιφανειακής τραχύτητας, 98, 631 nm και 231, 343 nm αντίστοιχα. Αυτό πιθανόν να οφείλεται στο ότι με τη πρώτη μέθοδο εγχέεται μέσω πιπέτας αρκετά μεγαλύτερη ποσότητα διαλύματος νανοσωματιδίων (1 ml) ενώ με τη σύριγγα εγχέεται μικρή ποσότητα διαλύματος κάθε φορά. Επιπλέον, με τη μέθοδο τουdrop 108

Casting, τα νανοσωματίδια πέφτουν μαζί με το διαλύτη στον οποίο έχουν επαναδιασπειρθεί, και εναποτίθενται μαζί με τον διαλύτη τους στην επιφάνεια των ικριωμάτων. Αντίθετα, με την τεχνική του Electrospinning System, τα νανοσωματίδια έως ότου φτάσουν στον αγώγιμο συλλέκτη, εξατμίζεται ο διαλύτης στον οποίο έχει γίνει η επαναδιασπορά. 7.4.2.2 Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης Παρακάτω (Εικόνα 7.25) παρατίθενται οι εικόνες των ινών PCL 25% ενσωματωμένων με τα νανοσωματίδια Ag τα οποία έχουν εναποτεθεί με τη βοήθεια του Electrospinning Systemόπως περιγράφηκε παραπάνω. 109

Εικόνα 7.25: Εικόνες SEMτων ινών PCL φορτωμένων με νανοσωματίδια Αργύρου με τη μέθοδο Electrospinning System. Πάνω: μεγέθυνση x2000. Κάτω: μεγέθυνση x 10.000. 7.4.3 Dual Syringe Electrospraying System Σε αυτή την παράγραφο γίνεται λόγος για το σύστημα ηλεκτροψεκασμού με τη χρήση διπλής σύριγγας, του λεγόμενου Dual Syringe Electrospraying System. Σε αυτή την περίπτωση γίνεται εφαρμογή δύο συρίγγων. Στη μία τοποθετείται το διάλυμα του PCL 25% σε μίγμα χλωροφορμίου: μεθανόλης 3:1, και στην άλλη το πολυμερικό διάλυμα των νανοσωματιδίων αργύρου, δηλαδή το διάλυμα που παρασκευάστηκε σύμφωνα με την περιγραφή του πρωτοκόλλου στο 6 ο κεφάλαιο, παραλείποντας όπως και στην περίπτωση του Electrospinning System, το τελικό στάδιο της φυγοκέντρησης. Και στις δύο σύριγγες έγινε έγχυση με βελόνα διαμέτρου 0.52 mm (needle 21) και εισάχθηκαν ποσότητες των 2 mlη καθεμία. Οι συνθήκες που επιλέχτηκαν είναι τάση V = 25 kvκαι ρυθμός ροής S = 5 μl / min. Το μοτίβο που επιλέχτηκε είναι bio spirral small και η διάρκεια της διαδικασίας ήταν 1 ώρα. Η απόσταση μεταξύ σύριγγας και αγώγιμου συλλέκτη ορίστηκε στα 200 nm. Με αυτή τη διαδικασία επιτυγχάνεται η ταυτόχρονη δημιουργία ινών PCLκαι νανοσωματιδίων αργύρου. Έτσι, δημιουργείται δίκτυο πολυμερικών ινών όπου τα νανοσωματίδια αργύρου δεν εναποτίθενται μόνο στην επιφάνεια, όπως έγινε με τις δύο προηγούμενες τεχνικές, αλλά εμπλέκονται και στο εσωτερικό των ινών, αφού γίνεται ταυτόχρονη εναπόθεση και των δύο στο υπόστρωμα. Ως υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκαν γυαλάκια και αλουμινόχαρτο. Στη συνέχεια τα δημιουργούμενα 110

ικριώματα δηλαδή γυαλάκια με ίνες PCL και νανοσωματίδια, εξετάζονται με Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης καθώς και με Περίθλαση Ακτινών Χ (XRD) και Γωνία Επαφής (Contact Angle). Αξίζει να σημειωθεί πως λόγω της αρκετά μεγάλης τραχύτητας και πάχους του ικριώματος, ήταν αδύνατη η εξέταση με Ατομική Μικροσκοπία Δυνάμεων (AFM). 7.4.3.1 Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM) Παρακάτω (Εικόνα 7.26) παρατίθενται οι εικόνες που λήφθηκαν με Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης. Εικόνα7.26: Εικόνες SEM των ικριωμάτων με ίνες PCL και Ag NPs με τη μέθοδο Dual Syringe Electrospraying System. Αριστερά: μεγέθυνση x500. Δεξιά: μεγέθυνση x5000 Από τις εικόνες παρατηρείται πως με τη χρήση του συστήματος Electrospraying System διπλής σύριγγας όπου στη μία τοποθετείται το διάλυμα των νανοσωματιδίων Ag, και στην άλλη το διάλυμα του PCL 25% σε μίγμα χλωροφόρμιο : μεθανόλη σε αναλογία 3:1, σχηματίζεται καλά διαμορφωμένο και οργανωμένο δίκτυο ινών με ενσωματωμένα τα νανοσωματίδια, τόσο εντός των ινών όσο και ενδιάμεσα, καθώς και στην επιφάνεια τους. Αποδεικνύεται και με την τεχνική αυτή, πως η εναπόθεση και ενσωμάτωση των νανοσωματιδίων αργύρου στις ίνες PCL δεν επηρεάζει τη μορφολογία τους, καθώς η διάμετρος των ινών παραμένει σταθερή στα 2000 μm. Το μέγεθος των νανοσωματιδίων, όπως εξάχθηκε με μετρήσεις στο λογισμικό ImageJ, κυμαίνεται στα 100 με 120 nm, δηλαδή σχεδόν όσο και με την δημιουργία με την τεχνική της νανοκαταβύθισης που περιγράφηκε στη πειραματική διαδικασία στο 5 ο κεφάλαιο. 111

Πλήθος ινών Παρακάτω φαίνονται οι εικόνες που λήφθηκαν με τη βοήθεια του λογισμικού ImageJ εξετάζοντας τις παραπάνω εικόνες SEM. Συγκεκριμένα, μετρήθηκε η διάμετρος 23 ινών και σχηματίστηκε το παρακάτω διάγραμμα (Εικόνα 7.27). 4 3 2 1 0 2000 2600 2900 3400 3500 3700 3800 4000 4200 4600 4900 5300 5400 5800 Διάμετρος ινών (nm) Εικόνα 7.27: Διάγραμμα πλήθους ινών συναρτήσει της διαμέτρου τους που λήφθηκε με τη βοήθεια του λογισμικού ImageJ. Βάση του παραπάνω διαγράμματος, παρατηρείται πως ο μέσος όρος των ινών του πολυμερούς της πολυκαπρολακτόνης οι οποίες είναι εμποτισμένες με νανοσωματίδια αργύρου, κυμαίνεται από 3700 nm έως 4900 nm. Η διάμετρος των ινών της πολυκαπρολακτόνης χωρίς τα νανοσωματίδια αργύρου κυμαίνεται όπως έχει αναφερθεί, στα 2100 nm. Όπως είναι αναμενόμενο, με τη φόρτωση των νανοσωματιδίων αργύρου, τα οποία λόγω του μικρού τους μεγέθους εισχωρούν στο εσωτερικό των ινών, η διάμετρος των ινών αυξάνει, κάτι που επαληθεύεται από τα παραπάνω δεδομένα. Αν και στις δύο προηγούμενες περιπτώσεις (Drop Casting και Electrospinning System) είχε εξαχθεί το συμπέρασμα πως τα νανοσωματίδια λόγω του μικρού τους μεγέθους δεν επηρεάζουν τη μορφολογία και τη διάμετρο των ινών, σε αυτή τη περίπτωση επειδή ίσως δημιουργούνται ταυτόχρονα οι ίνες και τα νανοσωματίδια, η διάμετρος των νανοσωματιδίων αυξάνεται, καθώς εναποτίθενται περισσότερα νανοσωματίδια σε περισσότερες ίνες και η εναπόθεση αυτή γίνεται τόσο στο εσωτερικό των ινών όσο και στην επιφάνεια. 112

7.5 Γωνία Επαφής (Contact Angle) Για τη γωνία επαφής έχει γίνει αναλυτικά λόγος στο 5ο κεφάλαιο όπου περιγράφονται οι τεχνικές και μέθοδοι χαρακτηρισμού. Στην παρούσα παράγραφο γίνεται λόγος για τις μετρήσεις που πραγματοποιήθηκαν με την συγκεκριμένη τεχνική για έξι δείγματα, δηλαδή για νανοσωματίδια αργύρου, για νανοσωματίδια αργύρου με επικάλυψη με χιτοζάνη, για νανοσωματίδια αργύρου με εναπόθεση πάνω σε πολυμερική μήτρα PCL με τη μέθοδο Drop Casting, με τη μέθοδο Electrospinning System και τέλος με τη μέθοδο Dual Syringe Electrospraying System. Οι μετρήσεις έγιναν με το σύστημα CAM 200 contact angle / surface energy analyzer (KSV Instr. Ltd) (Εικόνα 7.28). Τα στιγμιότυπα διαβροχής των δειγμάτων καταγράφηκαν από τη κάμερα του συστήματος και έπειτα αναλύθηκαν με το λογισμικό της κατασκευαστικής εταιρίας. Εικόνα 7.28: Το σύστημα Contact Angle με το οποίο έγινε μελέτη της διαβροχής των δειγμάτων, του εργαστηρίου LTFN Σαν παράμετροι του υλικού τέθηκαν για το PCL με μοριακό βάρος MW = 45. 000 και πυκνότητα d = 1. 1450 g / cm 3 και για το AgNO 3 με μοριακό βάρος MW = 169.87 και πυκνότηταd = 4.35 g / cm 3. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν με απιονισμένο νερό. Συγκεκριμένα, κάθε δείγμα τοποθετήθηκε στην κατάλληλη βάση του συστήματος, πάνω στο οποίο εναποτέθηκε αργά και προσεκτικά μια σταγόνα απιονισμένου νερού 5 μl. Εικόνες από τη σταγόνα λήφθηκαν αυτόματα από το 113

σύστημα και με τη βοήθεια λογισμικού που παρέχεται από τον κατασκευαστή, λάβαμε τις γωνίες διαβροχής. Συνολικά, πραγματοποιήθηκαν 2 μετρήσεις (n = 2) από 2 διαφορετικά σημεία του δείγματος και λήφθηκε ο μέσος όρος. Κατά αυτόν τον τρόπο εξάχθηκαν συμπεράσματα σχετικά με την υδροφιλικότητα ή υδροφοβικότητα των δειγμάτων μας. Πίνακας 7.1: Contact Angle (Degrees) για PCL 25%in chloroform: methanol (3:1), MW = 45000, substrate: glass, V = 30 kv, Speed = 10 μl / min, Bio_spirral PCL 25% Electrospinning System Substrate: glass Mean contact Angle: 131.2 ± 0.2 volume: 2,15 Εικόνα 7.29: Γωνία Επαφής για ικρίωμα πολυκαπρολακτόνης PCL25% in chloroform : methanol 3:1 Πίνακας 7.2:Contact Angle (Degrees) για εναπόθεση Ag NPs σε ικριώματα PCL 25% με την τεχνική Drop Casting. PCL 25% + Ag NPs Drop Casting Substrate: glass Mean contact Angle: 138.8± 0.8 volume: 2,77 114

Εικόνα 7.30: Γωνία Επαφής με εναπόθεση Ag NPs σε ικρίωμα PCL 25% με την τεχνική Drop Casting Πίνακας 7.3:Contact Angle (Degrees) για εναπόθεση Ag NPs με επικάλυψη χιτοζάνης 0.01% σε ικριώματα PCL 25% με την τεχνική Drop Casting PCL 25% + Substrate: glass Ag NPs @ Chitosan Drop Casting Mean contact Angle: 107.7± 3.2 volume: 2.06 Εικόνα 7.31: Γωνία Επαφής με εναπόθεση Ag@ Chitosan NPs σε ικρίωμα PCL 25% με την τεχνική Drop Casting 115

Πίνακας 7.4: Contact Angle (Degrees) για εναπόθεση Ag σε ικριώματα PCL 25% με την τεχνική Electrospinning System, V = 15 kv, Speed = 10 μl / min. PCL 25% + Ag NPs Electrospinning System Substrate: glass Mean contact Angle: 96.3± 0.0 volume: 2.14 Εικόνα 7.32: Γωνία Επαφής ικριώματος PCL με εναπόθεση Ag NPs με τη μέθοδο Electrospinning System Πίνακας 7.5: Contact Angle (Degrees) για εναπόθεση Ag NPs σε ικριώματα PCL 25% με την τεχνική Dual Syringe Electrospraying System, V = 15 kv, Speed = 5 μl / min, dense lines PCL 25% Substrate: glass Dual Syringe Electrospraying System Mean contact Angle: 147.4± 0.6 volume: 2.09 116

Εικόνα 7.33: Γωνία επαφής με ταυτόχρονη εναπόθεση Ag NPsκαι ινών PCL 25% με την τεχνική Dual System Electrospraying System Συγκεντρώνοντας τα παραπάνω δεδομένα, δημιουργείται το παρακάτω γράφημα όπου αποτυπώνεται η γωνία επαφής συναρτήσει των δειγμάτων (Εικόνα 7.28) 117

Γωνία Επαφής για όλα τα διαλύματα 160 140 120 100 80 60 40 20 0 PCL 25% in chloroform : methanol 3:1 Drop Casting εναπόθεση των Ag NPs σε γυαλάκι με PCL 25% Drop Casting εναπόθεση των Ag NPs @ Chitosan σε γυαλάκι με PCL 25% Electrospinning των Ag NPs σε γυαλάκι PCL 25% Electrospinning dual syringe Ag NPs + PCL 25% με συνθήκες 15:5 Εικόνα 7.28: Γωνία Επαφής συναρτήσει των δειγμάτων που παρασκευάστηκαν με τις τρεις μεθόδους, Drop Casting, Electrospinning System και Dual Syringe Electrospraying System. Όπως φαίνεται και από τα παραπάνω, Όλα τα ικριώματα συμπεριλαμβανομένου και της πολυκαπρολακτόνης και εκείνων που είναι ενσωματωμένα με νανοσωματίδια αργύρου, εμφανίζουν υδροφοβικότητα. Ειδικότερα, με την ενσωμάτωση των νανοσωματιδίων αργύρου με τη μέθοδο Drop Casting, αλλάζει η υδροφοβικότητα του ικριώματος σε σύγκριση με εκείνο που έχει μόνο πολυκαπρολακτόνη και μάλιστα αυξάνεται. Με την ενσωμάτωση νανοσωματιδίων αργύρου με επικάλυψη με χιτοζάνη με Drop Casting μειώνεται ελαφρώς η υδροφοβικότητα, λόγω μείωσης της επιφανειακής τραχύτητας λόγω επικάλυψης με χιτοζάνη. Τη μικρότερη υδροφοβικότητα την παρουσιάζει το ικρίωμα της πολυκαπρολακτόνης όπου εναποτεθεί τα νανοσωματίδια αργύρου με τη μέθοδο Electrospinning System. Αυτό πιθανώς οφείλεται στο γεγονός πως τα νανοσωματίδια με τη μέθοδο αυτή «στρώνονται» καλύτερα και ομοιόμορφα επάνω στα ικριώματα, δημιουργώντας λείο υμένιο. 118

Αντιθέτως, με την τεχνική Dual Syringe Electrospraying System, η υδροφοβικότητα αυξάνεται αρκετά, γεγονός που είναι αναμενόμενο, καθώς η διαδικασία της εναπόθεσης με διπλή σύριγγα διήρκεσε μια ώρα και λίγα λεπτά, δημιουργώντας παχύ και τραχύ υμένιο, ώστε να είναι αδύνατη ακόμη και η εξέτασή του με Ατομική Μικροσκοπία Δυνάμεων. Τα παραπάνω συμπεράσματα συμφωνούν και με τη βιβλιογραφία [80] με την έννοια ότι τα νανοσωματίδια αργύρου καθώς και εκείνα που είναι επικαλυμμένα με χιτοζάνη, επηρεάζουν την υδροφοβικότητα των ικριωμάτων της πολυκαπρολακτόνης εξαιτίας του γεγονότος ότι τροποποιούν την επιφανειακή τους τραχύτητα και συγκεκριμένα την επιφανειακή τους διαβρεξιμότητα και σκληρότητα. Το γεγονός αυτό επαληθεύεται και από τις τιμές της επιφανειακής τραχύτητας (Peak to Peak Roughness) για τα παραπάνω δείγματα, όπως αναγράφηκαν και παραπάνω, σε καθεμία από τις τρεις μεθόδους. Συγκεκριμένα, για το διάλυμα PCL, η επιφανειακή τραχύτητα ευρίσκεται στα 2398.58 nm και η γωνία επαφής όπως αναφέρθηκε, στις 131.2 ο. Για την τεχνική της εναπόθεσης των νανοσωματιδίων αργύρου πάνω στα ικριώματα PCL με την τεχνική του Electrospinning System η επιφανειακή τραχύτητα προκύπτει στα 840.03 nm και η γωνία επαφής στις 96.3 ο Για την τεχνική Drop Casting, η τραχύτητα προκύπτει στα 2010.52 nm και η γωνία επαφής στις 128.7 ο. Παρατηρείται λοιπόν, πως η επιφανειακή τραχύτητα επηρεάζει σε μεγάλο βαθμό την γωνία επαφής καθώς καθορίζει την τραχύτητα του δείγματος. Κεφάλαιο 8 ο : Αντιμικροβιακές Μελέτες 8.1Γενικά για Staphylococcus aureus και Escherichia coli Από τα προϊστορικά ακόμη χρόνια, τα ιόντα αργύρου είναι γνωστά για την αποτελεσματικότητά τους έναντι ενός ευρέος φάσματος μικροοργανισμών. Σήμερα, τα ιόντα αργύρου χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο της βακτηριακής ανάπτυξης σε πολλές ιατρικές εφαρμογές, όπως σε οδοντικές εργασίες, καθετήρες και στη θεραπεία εγκαυμάτων. Τα ιόντα αργύρου βρίσκουν επίσης απήχηση και σε πολλούς μη ιατρικούς σκοπούς, όπως σε ηλεκτρικές εφαρμογές και στην προστασία του περιβάλλοντος. Η ικανότητα βραδείας αποδέσμευσης των ιόντων αργύρου από τα 119

νανοσωματίδια αξιοποιείται και σε οικιακές εργασίες όπως πλυντήρια πιάτων και ρούχων, ψυγεία και σε χώρους προσωπικής υγιεινής. Είναι πλέον σαφές πως είμαστε εκτεθειμένοι σε μια ποικιλία άγνωστων ακόμη εφαρμογών των ιόντων αργύρου σε προϊόντα που προορίζονται να λειτουργούν αντιμικροβιακά μυοκτόνα. Ο Staphylococcus aureus ή αλλιώς χρυσίζων σταφυλόκοκκος είναι αναερόβιο Gramθετικό βακτήριο, στρογγυλού σχήματος, το οποίο είναι μέλος της οικογένειας Firmicutes και αποτελεί το συχνότερο αίτιο των σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων. Βρίσκεται συχνά στο δέρμα, και στη μύτη, ενώ περίπου 20% του πληθυσμού είναι χρόνιοι φορείς του βακτηρίου. Αν και δεν είναι πάντα παθογόνος, μπορεί να προκαλέσει από ελαφρές δερματικές λοιμώξεις (δερματίτιδα, θυλακίτιδα κ.α.) έως επικίνδυνες για τη ζωή λοιμώξεις όπως πνευμονία, μηνιγγίτιδα, οστεομυελίτιδα, ενδοκαρδίτιδα, βακτηριαιμία και σήψη. Αποτελεί ακόμα σήμερα μία από τις 5 συχνότερες αιτίες νοσοκομειακών λοιμώξεων, που συνήθως προκαλεί επιμολύνσεις χειρουργικών τομών. Τα παθογόνα στελέχη συχνά προάγουν λοιμώξεις με την παραγωγή λοιμογόνων παραγόντων, όπως τοξίνες με ισχυρές πρωτεΐνες, και η έκφραση πρωτεϊνών επιφανειακών κυττάρων οι οποίες δεσμεύουν και απενεργοποιούν αντιβιοτικά. Η εμφάνιση στελεχών S. Aureus ανθεκτικών στα αντιβιοτικά είναι ένα μείζον παγκόσμιο πρόβλημα σήμερα. [81] Εικόνα 8.1: Αριστερά: Staphylococcus aureus σε μικροσκοπία SEM. Δεξιά: Αποικίες σταφυλόκοκκου σε τρυβλίο με αιματούχο άγαρ [82] 120

Η Escherichia coli είναι ένα αρνητικό Gram, ραβδοειδούς σχήματος κολοβακτηρίδιο. Συνήθως βρίσκεται στο έντερο ενδόθερμων ζώων. Τα στελέχη της συνήθως αποτελούν μέρος της φυσικής χλωρίδας του έντερου όντας αβλαβή και μπορούν να ωφελήσουν τους ξενιστές τους παράγοντας βιταμίνη Κ2 και εμποδίζοντας την εγκατάσταση άλλων παθογόνων βακτηρίων μέσα στο έντερο. Απαντώνται συχνά στα κόπρανα ζώων και ανθρώπων. Τα περισσότερα στελέχη είναι αβλαβή, αλλά το O157:H7 παράγει πολύ την ισχυρή τοξίνη verotoxin (VT) που μοιάζει με τη Shiga και καταστρέφει το έντερο. Αυτή η τοξίνη είναι εφάμιλλη των παραγώγων του Shigella dysenteriae και προκαλεί αιμορραγική κολίτιδα στο ξενιστή. Επίσης, όταν βρεθεί σε διπλανά όργανα όπως την ουροδόχο κύστη μπορεί να προκαλέσει ουρολοίμωξη. Το βακτήριο δεν αντέχει σε υψηλές θερμοκρασίες και πεθαίνει όταν ζεσταίνεται στους 70 C για αρκετό χρονικό διάστημα, ενώ μπορεί να επιβιώσει στο ψυγείο για αρκετές μέρες υπό κάποιες συνθήκες. [83] Εικόνα 8.2: Μικρογραφίες της E. coli [84] 8.2 Προετοιμασία δειγμάτων Για την πραγματοποίηση των αντιμικροβιακών τεστ και την αξιολόγηση της μικροβιακής ευαισθησίας των νανοσωματιδίων αργύρου καθώς και των αντίστοιχων με επικάλυψη με τη βέλτιστη συγκέντρωση της χιτοζάνης (0.01 %). Οι παθογόνοι μικροοργανισμοί που επιλέχτηκαν ήταν τα Gram positive bacteria και τα Gram negative bacteria. Συγκεκριμένα, για τα Gram positive bacteria επιλέχτηκε ο Staphylococcus aureus και για τα Gram negative bacteria, η Escherichia coli τα οποία περιγράφηκαν παραπάνω. 121

Αρχικά ετοιμάστηκαν δύο διαλύματα νανοσωματιδίων αργύρου με τη μέση συγκέντρωση νανοσωματιδίων στα 2 mm, καθώς και τα αντίστοιχα με την επικάλυψη με χιτοζάνη 0.01%. Κόπηκαν συνολικά 4 κύκλοι από διηθητικό χαρτί διαμέτρου 1 cm, δύο για το διάλυμα των νανοσωματιδίων αργύρου και δύο για το διάλυμα της χιτοζάνης. Κατόπιν, οι κύκλοι εμβαπτίστηκαν στα διαλύματα και παρέμειναν για 1 ώρα περίπου, ώστε να απορροφηθούν τα διαλύματα από το διηθητικό χαρτί. Αντιστοίχως, πραγματοποιήθηκε η διαδικασία του Electrospinning System για δημιουργία και εναπόθεση ινών PCL 25% in chloroform : methanol 3 :1 και κόπηκαν αντίστοιχοι κύκλοι από το αλουμινόχαρτο το οποίο χρησιμοποιήθηκε στη διαδικασία του Electrospinning κατά την εναπόθεση αυτή. Στη συνέχεια, με την τεχνική Drop Casting εναποτέθηκαν τα νανοσωματίδια πάνω στους κύκλους του αλουμινόχαρτου που φέρουν τις ίνες PCL. Το ίδιο έγινε και για τα νανοσωματίδια με επικάλυψη με χιτοζάνη. Τέλος, έγινε αποστείρωση των δειγμάτων με ακτίνες UVγια δέκα λεπτά. Ως θρεπτικά υλικά χρησιμοποιήθηκαν το Mac Cokney για τα Gram negative βακτήρια (E. Coli) και το αιματούχο άγαρ για τα Gram positive βακτήρια (S. Aureus). Χρησιμοποιήθηκαν 8 τρυβλία συνολικά, 2 για τα διηθητικά χαρτιά με τα νανοσωματίδια αργύρου (1 για Gram positive και 1 για Gram negative), 2 για τα επικαλυμμένα με χιτοζάνη, 2 για τα ινώδη ικριώματα της πολυκαπρολακτόνης φορτισμένα με νανοσωματίδια αργύρου και τέλος 2 για τα ινώδη ικριώματα φορτισμένα με νανοσωματίδια αργύρου με επικάλυψη με χιτοζάνη. Έγινε εμβολιασμός των μικροοργανισμών στα τρυβλία, με τον καθένα στον θρεπτικό υλικό που του αναλογεί, με τη βοήθεια μικροβιακού κρίκου, ο οποίος αποστειρώνεται σε φλόγα κάθε φορά που γίνεται επίστρωση. Κατόπιν, γίνεται προσεκτικά τοποθέτηση των διηθητικών χαρτιών με επίσης αποστειρωμένη λαβίδα πάνω στα τρυβλία στα οποία έγινε επίστρωση των μικροοργανισμών. Τέλος, τα τρυβλία εισάγονται στον κλίβανο στους 37 ο Cγια επώαση για 24 ώρες και την επόμενη μέρα παρατηρούνται τα αποτελέσματα. Δυστυχώς, τα αλουμινόχαρτα με τις ίνες της πολυκαπρολακτόνης έλιωσαν στον κλίβανο οπότε δεν ήταν δυνατή η παρατήρησή τους. Οπότε παρατηρήθηκαν μόνο τα τρυβλία με τα νανοσωματίδια αργύρου και χιτοζάνης όπως φαίνεται παρακάτω (Εικόνα 8.3). 122

Εικόνα 8.3: Πάνω: Τρυβλία με νανοσωματίδια αργύρου με θρεπτικό υλικό Mac Cokney και μικροοργανισμό E. Coli (αριστερά) και θρεπτικό υλικό αιματούχο άγαρ και μικροοργανισμό S. Aureus (δεξιά). Κάτω: Αντίστοιχα για νανοσωματίδια επικαλυμμένα με χιτοζάνη. Παρατηρείται πολύ μικρή έως ελάχιστη αναστολή της καλλιέργειας των μικροοργανισμών γύρω από τα διηθητικά χαρτιά, με εμφανέστερο αποτέλεσμα σε εκείνο των νανοσωματιδίων αργύρου σε E. coli. Η μικρή ανασταλτική τους δράση πιθανώς οφείλεται στο ότι έχουν στεγνώσει τα νανοσωματίδια και αποστειρωθεί, ώστε να έχουν χάσει τη μεγαλύτερη ικανότητα της αντιμικροβιακής τους δράσης. Για αυτό το λόγο δοκιμάζεται η μέθοδος της θολερότητας, χρησιμοποιώντας υγρό θρεπτικό υλικό TSB (Trisodium Soy Broth) και LB (Luria Broth). Το LB μάλιστα αξιοποιείται και σε στερεή και σε υγρή μορφή, χρησιμοποιώντας στερεά σκόνη άγαρ, η οποία πήζει στους 30 ο C και λιώνει στους 80 ο C. Συγκεκριμένα, πραγματοποιείται η μέθοδος στερεού θρεπτικού υλικού με ταυτόχρονη ενσωμάτωση 123

των νανοσωματιδίων, καθώς η μέθοδος χρήσης υγρού θρεπτικού υλικού και μέτρησης απορρόφησης συναρτήσει του χρόνου. Καθεμία από αυτές περιγράφεται αναλυτικά και ξεχωριστά παρακάτω. 8.2.1 Μέθοδος στερεού θρεπτικού υλικού με ταυτόχρονη ενσωμάτωση νανοσωματιδίων και εμβολιασμός του μικροοργανισμού Σε αυτή τη μέθοδο, παρασκευάστηκε στερεό θρεπτικό υλικό LB, το οποίο ήταν εξαρχής σε υγρή μορφή. Συγκεκριμένα, παρασκευάστηκε αρχικά το διάλυμα των νανοσωματιδίων αργύρου σε μέση και υψηλή συγκέντρωση, καθώς και τα αντίστοιχα διαλύματα της χιτοζάνης σε μέση και υψηλή συγκέντρωση, και μετά την ολοκλήρωση του σταδίου της φυγοκέντρησης τα falkonτοποθετήθηκαν σε θερμό και ξηρό περιβάλλον για εξάτμιση του διαλύτη και συλλογή των νανοσωματιδίων σε ξηρή μορφή. Κατόπιν, η σκόνη των νανοσωματιδίων ζυγίστηκε και ενσωματώθηκε η κατάλληλη ποσότητα στο υγρό θρεπτικό υλικό LB μαζί με την απαραίτητη ποσότητα άγαρ προς στερεοποίηση. Στη συνέχεια, το τελικό θρεπτικό υλικό μοιράστηκε ισόποσα σε τρυβλία και έγινε φύλαξη στο ψυγείο. Την επόμενη μέρα έγινε εμβολιασμός των μικροοργανισμών Staphylococcus aureus και της Escherichia coli, με τη βοήθεια βαμβακοφόρων στυλεών. Συγκεκριμένα, με τη βοήθεια του στυλού παίρνεται μικρή ποσότητα μικροοργανισμού από το τρυβλίο στο οποίο έχει αναπτυχθεί και «στρώνεται» στο τρυβλίο στο οποίο έχει χυτευθεί το στερεό πλέον θρεπτικό υλικό LB με ενσωματωμένα τα νανοσωματίδια αργύρου. Η διαδικασία γίνεται για κάθε τρυβλίο χωριστά. Συλλογικά, διαθέτουμε δύο τρυβλία μέσης συγκέντρωσης νανοσωματιδίων αργύρου (2 mm), στερεό θρεπτικό υλικό, E. Coli στο ένα και S. Aureus στο άλλο, δύο τρυβλία υψηλής συγκέντρωσης νανοσωματιδίων αργύρου (5 mm) με E. Coli στο ένα και Staphylococcusστο άλλο. Το ίδιο γίνεται και με τα τρυβλία για τα νανοσωματίδια χιτοζάνης, μέσης και υψηλής συγκέντρωσης. Με την ολοκλήρωση του εμβολιασμού των μικροοργανισμών, τα τρυβλία εισάγονται στον κλίβανο για 24ωρη παραμονή στους 37 ο C. Την επόμενη μέρα φαίνονται τα αποτελέσματα τα οποία παρουσιάζονται στην Εικόνα 8.4 124

125

Εικόνα 8.4: Φωτογραφίες των τρυβλίων με στερεό θρεπτικό υλικό LB με ενσωματωμένα τα νανοσωματίδια αργύρου και εκείνων με επικάλυψη με χιτοζάνη, μετά από επώαση σε κλίβανο στους 37 ο C για 24 ώρες. Από την οπτική παρατήρηση των παραπάνω τρυβλίων, βλέπουμε πως ουσιαστική αλλαγή με επιβράδυνση και αναστολή της καλλιέργειας των μικροοργανισμών παρατηρείται στις 4 τελευταίες φωτογραφίες (Εικόνα 8.4) όπου γίνεται ενσωμάτωση των νανοσωματιδίων αργύρου με επικάλυψη με χιτοζάνη, και στους δύο μικροοργανισμούς. Αυτό πιθανώς να οφείλεται στην αργή αλλά σταδιακή απελευθέρωση του φορτίου αργύρου, δηλαδή του αντιμικροβιακού παράγοντα τον οποίο εσωκλείουν στο εσωτερικό τους τα νανοσωματίδια με επικάλυψη με χιτοζάνη. Με άλλα λόγια, η χιτοζάνη λειτουργεί ως φορέας της σταδιακής αποδέσμευσης του αργύρου και στόχευση στον παθογόνο μικροοργανισμό. Όμως, επειδή τα παραπάνω αποτελέσματα εξυπηρετούν κατά προσέγγιση και τα αποτελέσματα περιέχουν μεγάλο ποσοστό αβεβαιότητας, πραγματοποιήθηκε και η μέθοδος της οπτικής πυκνότητας, χρησιμοποιώντας υγρό θρεπτικό υλικό LB και TSB και μετρώντας την απορρόφηση των δειγμάτων συναρτήσει του χρόνου, για ένα διάστημα 24 ωρών. Η μέθοδος αυτή η οποία κρίθηκε και η πιο αποτελεσματική για την ανάδειξη των αντιμικροβιακών ιδιοτήτων των νανοσωματιδίων τόσο του αργύρου όσο και της επικάλυψης με χιτοζάνη, περιγράφεται αναλυτικά αμέσως παρακάτω. 126

8.2.2 Μέθοδος υγρού θρεπτικού υλικού LB και TSB και μέτρηση απορρόφησης συναρτήσει του χρόνου Σε αυτή τη μέθοδο αξιοποιείται η υγρή μορφή των θρεπτικών υλικών Trisodium broth και Luria broth και γίνεται ενστάλαξη ορισμένης ποσότητας διαλύματος νανοσωματιδίων αργύρου και χιτοζάνης. Χρησιμοποιούνται συνολικά 8 μπουκαλάκια με LB και 8 μπουκαλάκια με TSB, και άλλα 4, που αποτελούν τα διαλύματα control(μπουκαλάκια μόνο με LB και μικροοργανισμό, και TSB με μικροοργανισμό). Συγκεκριμένα, τοποθετείται σε κάθε ένα από τα 9 μπουκαλάκια, 5 ml LB. Έπειτα με τη βοήθεια πιπέτας γίνεται ενστάλαξη ορισμένης ποσότητας νανοσωματιδίων αργύρου σε 4 από τα μπουκαλάκια αυτά, και ενστάλαξη ορισμένης ποσότητας διαλύματος χιτοζάνης στα άλλα 4 μπουκαλάκια. και ακολουθείται ανάδευση στο Vortex Mixer έως ότου επιτευχθεί ομοιομορφία και ομοιογένεια του διαλύματος. Ήδη από τα πρώτα κιόλας λεπτά της ανάδευσης παρατηρείται θόλωση των διαλυμάτων. Κατόπιν, με τη βοήθεια μικροβιακού κρίκου, γίνεται εμβολιασμός των μικροοργανισμών μέσα στο διάλυμα με το θρεπτικό υλικό και τα νανοσωματίδια, ενώ ταυτόχρονα γίνεται ανάδευση στο Vortex Mixer έως ότου όλη η ποσότητα του μικροοργανισμού που βρίσκεται στον κρίκο να διοχετευθεί στο διάλυμα. Γίνεται αντιληπτό οπτικά ότι ο μικροοργανισμός διαλύθηκε στο διάλυμα όταν ο μικροβιακός κρίκος βγαίνει καθαρός. Κατόπιν, πραγματοποιείται επανάληψη της ανάδευσης στο Vortex Mixer για άλλη μια φορά για κάθε διάλυμα ξεχωριστά, ώστε να πραγματοποιηθεί πλήρης ομοιογένεια στα συστατικά τους. Η ίδια διαδικασία πραγματοποιήθηκε και για το υγρό θρεπτικό υλικό TSB, χρησιμοποιώντας τα υπόλοιπα 8 μπουκαλάκια. Τα υπόλοιπα τέσσερα μπουκαλάκια προορίζονται για σημεία αναφοράς, δηλαδή δύο μπουκαλάκια με LBκαι μικροοργανισμούς (Gram positive στο ένα και Gram negative στο άλλο) και στα άλλα δύο με TSB ομοίως. Κατόπιν, με πιπέτα των 200 μlλαμβάνεται ποσότητα ίση με 100 μlκαι τοποθετείται σε πηγαδάκι εις τριπλούν, σε well plate 96 θέσεων και μετράται η απορρόφηση σε μια, δύο, τρεις και τέσσερις ώρες καθώς και σε διάστημα 24 ωρών και κατασκευάζονται τα αντίστοιχα διαγράμματα απορρόφησης συναρτήσει του χρόνου. 127

Absorption vs time for LB in E.coli 1 0,8 LB (-) Abs (600 nm) 0,6 0,4 0,2 0 0 hr 1hr 2hr 3hr 4hr 24hr Ag NPs high (-) Ag @ Chitosan NPs middle (-) Ag NPs middle (- ) t (hr) Εικόνα 8.5: Διάγραμμα απορρόφησης συναρτήσει χρόνου σε σταθερό μήκος κύματος 600 nm με θρεπτικό υλικό LB (Luria Bertani) και εμβολιασμός μικροοργανισμού E. coli. Absorption vs time for LB in S. aureus 1,2 1 LB (+) 0,8 Ag NPs high (+) Abs 600 nm 0,6 0,4 0,2 Ag @ Chitosan middle (+) Ag @ Chitosan NPs high (+) Ag NPs middle (+) 0 0 hr 1hr 2hr 3hr 4hr 24hr t (hr) Εικόνα 8.6: Διάγραμμα απορρόφησης συναρτήσει χρόνου σε σταθερό μήκος κύματος 600 nm με θρεπτικό υλικό LB (Luria Bertani) και εμβολιασμός μικροοργανισμού S.aureus 128

Absorption vs time for TSB in E.coli 1,2 Abs 1 0,8 0,6 0,4 0,2 TSB (-) Ag NPs middle (-) Ag @ Chitosan high (-) Ag @ Chitosan middle (-) Ag NPs high (-) 0 0 hr 1hr 2hr 3hr 4hr 24hr t (hr) Εικόνα 8.7: Διάγραμμα απορρόφησης συναρτήσει χρόνου με θρεπτικό υλικό TSB σε σταθερό μήκος κύματος 600 nm και εμβολιασμός μικροοργανισμού E. coli. Absorption vs time for TSB in S. aureus Abs 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 hr 1hr 2hr 3hr 4hr 24hr t (hr) TSB (+) Ag NPs middle (+) Ag @ Chitosan middle (+) Ag @ Chitosan NPs high (+) Ag NPs high (+) Εικόνα 8.8: Διάγραμμα απορρόφησης συναρτήσει χρόνου σε σταθερό μήκος κύματος 600 nmμε θρεπτικό υλικό TSB (Trisodium Broth) και εμβολιασμός μικροοργανισμού S.aureus Μελετήθηκαν οι παραπάνω καμπύλες αναστολής της βακτηριακής καλλιέργειας και αξιολογήθηκαν οι αντιβακτηριδιακές ιδιότητες των νανοσωματιδίων αργύρου με μέση και υψηλή συγκέντρωση, όσο και των επικαλυμμένων με χιτοζάνη, επίσης σε μέση και υψηλή συγκέντρωση και εξάχθηκαν τα παρακάτω αποτελέσματα: 129

Τα νανοσωματίδια αργύρου καθώς και εκείνα που είναι επικαλυμμένα με χιτοζάνη παρουσιάζουν μεγαλύτερη απόδοση όταν βρίσκονται στο θρεπτικό υλικό LB (Luria Bertani) από ότι στο TSB (Trisodium Broth). Με άλλα λόγια, τα νανοσωματίδια ανταποκρίνονται καλύτερα στην αναστολή της ανάπτυξης των μικροοργανισμών όταν βρίσκονται σε LB παρά σε TSB. Προφανώς, όσο υψηλότερη είναι η συγκέντρωση των νανοσωματιδίων αργύρου τόσο υψηλότερος ο ρυθμός επιβράδυνσης της βακτηριακής καλλιέργειας. Το γεγονός αυτό επιβεβαιώνεται και στις δύο περιπτώσεις θρεπτικού υλικού καθώς και μικροοργανισμών. Τα νανοσωματίδια με επικάλυψη με χιτοζάνη συμπεριφέρονται κι εκείνα αναλόγως. Το αντιμικροβιακό φορτίο των νανοσωματιδίων, τόσο των μονών όσο και των επικαλυμμένων παρουσιάζει μεγαλύτερη αναστολή της καλλιέργειας έναντι στην E. coli από ότι στον S. aureus. Ως δείγμα αναφοράς (sample control) χρησιμοποιήθηκε υγρό θρεπτικό υλικό LB και TSB τα οποία αποτελούν και τα negative control, για σύγκριση. Δεν υπάρχει προφανής αναστολή της βακτηριακής ανάπτυξης και στα δύο θρεπτικά υλικά, απουσία νανοσωματιδίων αργύρου και χιτοζάνης, και μάλιστα παρατηρείται πολλαπλασιασμός των βακτηρίων με την πάροδο του χρόνου. Επίσης, τα νανοσωματίδια τα οποία είναι επικαλυμμένα με την μέση και υψηλή συγκέντρωση χιτοζάνης εμφανίζουν πιο αργή αλλά σταθερή απελευθέρωση του αντιμικροβιακού φορτίου που εσωκλείουν στο εσωτερικό τους. Από αυτό εξάγεται το γενικότερο συμπέρασμα που είναι και το πλεονέκτημα της επικάλυψης των νανοσωματιδίων αργύρου με χιτοζάνη, ότι η χιτοζάνη καθιστά πιο σταθερά τα νανοσωματίδια αργύρου και συμβάλλει στην σταδιακή αλλά σταθερή απελευθέρωση των ιόντων αργύρου, για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα, δηλαδή παρατείνεται η αντιμικροβιακή δραστηριότητα. 9. Μελέτες Κυτταροσυμβατότητας (Cytocompatibility studies) Οι επιφανειακές ιδιότητες των νανοσύνθετων ικριωμάτων αποτελούν βασικό παράγοντα για την επιτυχία της μηχανικής των ιστών, όσον αφορά την προσκόλληση 130

των κυττάρων. Είναι γνωστό πως τόσο οι χημικές όσο και οι τοπογραφικές ιδιότητες της επιφάνειας των υλικών μπορούν να συμβάλλουν σημαντικά στη διαμόρφωση της κυτταρικής συμπεριφοράς μέσω ελέγχου του κυτταρικού σχήματος, της λειτουργικότητας και της κινητικότητας. Μάλιστα, ο σχεδιασμός της νανοτοπογραφίας της επιφάνειας των βιοϋλικών για αναπτύξεις της μηχανικής των ιστών έχει αναδειχθεί ότι ενισχύει τη διαφοροποίηση των κυττάρων στο προγραμματισμένο μονοπάτι των κυτταρικών γραμμών τους, με αποτέλεσμα τη ενίσχυση της καταλληλότητας των υλικών αυτών για ενσωμάτωση και αξιοποίησή τους στον ανθρώπινο οργανισμό, προωθώντας με αυτό τον τρόπο τα οφέλη της Ιστικής Μηχανικής και της Αναγεννητικής Ιατρικής. Στο προηγούμενο κεφάλαιο αναδείχθηκαν οι αντιμικροβιακές ιδιότητες τόσο των νανοσωματιδίων αργύρου όσο και με το κέλυφος της χιτοζάνης. Στο παρόν κεφάλαιο γίνεται προσπάθεια ανάδειξης καταλληλότητας για κυτταρική ανάπτυξη, τόσο των νανοσωματιδίων αργύρου, όσο και των ικριωμάτων της πολυκαπρολακτόνης που είναι φορτωμένα με τα νανοσωματίδια αργύρου, με τη μέθοδο Drop Casting, η οποία όπως προαναφέρθηκε, επιλέχθηκε ως η βέλτιστη για τον εμπλουτισμό της πολυμερικής μήτρας με τα νανοσωματίδια. Με άλλα λόγια, εξετάζεται η κυτταροσυμβατότητα ή κυτταροτοξικότητα των νανοσωματιδίων μόνα τους, όσο και όταν ενσωματωθούν στα νανοϊνώδη ικριώματα. Αρχικά, γίνεται ανακαλλιέργεια κυττάρων και συγκεκριμένα ινοβλαστών ποντικιού της κυτταρικής σειράς L929 σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται στο 5 ο κεφάλαιο. Κατόπιν, γίνεται εξέταση της κυτταροσυμβατότητας των δειγμάτων με τις δύο μεθόδους που επίσης έγινε περιγραφή των αντίστοιχων πρωτοκόλλων στο 5 ο κεφάλαιο, της βιοχημικής μεθόδου για εκτίμηση της κυτταροτοξικότητας MTT assay (ποσοτική εκτίμηση), καθώς και της χρώσης με το Κυανό του Μεθυλενίου (Methylene Blue). Κάθε μια από τις δύο αυτές μεθόδους εξετάζεται ξεχωριστά παρακάτω. 9.1 Βιοχημική Μέθοδος Εκτίμησης Κυτταροτοξικότητας MTT assay Το πρωτόκολλο περιγραφής της διαδικασίας αυτής της μεθόδου περιγράφηκε αναλυτικά στο 5ο κεφάλαιο. Σε αυτή τη παράγραφο παρατίθενται τα αποτελέσματα που εξάχθηκαν από τη μελέτη της κυτταροτοξικότητας για τα νανοσωματίδια 131

cells' viability cells' viability αργύρου μόνα τους πάνω σε υπόστρωμα γυαλιού, καθώς και για τα νανοϊνώδη ικριώματα πολυκαπρολακτόνης με ενσωματωμένα τα νανοσωματίδια αργύρου με τη μέθοδο Drop Casting για χρονικό διάστημα 48 και 72 ωρών. Τα αποτελέσματα φαίνονται στα παρακάτω διαγράμματα: MTT assay - Ag NPs 700 600 500 400 300 200 100 0 48 hr 72 hr Time Point (hr) Ag NPs only cells Εικόνα 8.9: Ποσοτικός Προσδιορισμός κυτταρικής ανάπτυξης και πολλαπλασιασμού μέσω της βιοχημικής μεθόδου MTT για τα νανοσωματίδια αργύρου MTT assay - PCL Matrices loaded with Ag NPs 400 350 300 250 200 150 100 50 0 48 hr 72 hr Time Point (hr) Ag NPs into PCL matrices only cells Εικόνα 8.10: Ποσοτικός Προσδιορισμός κυτταρικής ανάπτυξης και πολλαπλασιασμού μέσω της βιοχημικής μεθόδου MTT για τις μήτρες PCL οι οποίες είναι φορτωμένες με τα νανοσωματίδια αργύρου 132

cells' viability MTT assay - Ag NPs & PCL matrices loaded with Ag NPs 700 600 500 400 300 200 100 0 48 hr 72 hr Time Point (hr) Ag NPs Ag NPs into PCL matrices only cells Εικόνα 8.11: Ποσοτικός Προσδιορισμός κυτταρικής ανάπτυξης και πολλαπλασιασμού μέσω της βιοχημικής μεθόδου MTT και για τα νανοσωματίδια αργύρου και για τις μήτρες PCL οι οποίες είναι φορτωμένες με τα νανοσωματίδια αργύρου Με την ανάλυση των αποτελεσμάτων και την επεξεργασία των μετρήσεων παρατηρήθηκε πως για την περίπτωση των νανοσωματιδίων αργύρου σε σχέση με το control δείγμα που περιείχε μόνο κύτταρα, τα κύτταρα που ήταν επάνω στα νανοσωματίδια αργύρου προσκολλήθηκαν άριστα και αναπτύχθηκαν με ταχείς ρυθμούς όπως φαίνεται και από το διάγραμμα της Εικόνας 8.7. Μάλιστα, σε διάστημα 48 ωρών (2 η μέρα), εκτοξεύεται ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων σηματοδοτώντας την υψηλή κυτταροσυμβατότητα των νανοσωματιδίων αργύρου. Και στις 48 και στις 72 ώρες οι τιμές ξεπερνούν κατά πολύ τις αντίστοιχες του control. Για την περίπτωση των ικριωμάτων της πολυκαπρολακτόνης φορτωμένων με τα νανοσωματίδια αργύρου, παρατηρείται πως οι ποσοτικές τιμές ξεπερνούν κατά πολύ την δεύτερη μέρα (48 ώρες) τις αντίστοιχες τιμές του control, γεγονός που συμβαίνει και τη 3 η μέρα (72 ώρες), αν και κάπως μειωμένες. Το γεγονός αυτό πιθανόν να οφείλεται στο ότι τα νανοσωματίδια αργύρου όταν ενσωματώνονται στα πολυμερικά ικριώματα της πολυκαπρολακτόνης μειώνουν την κυτταροσυμβατότητα αυτών των ικριωμάτων, πιθανών λόγω της τραχύτερης επιφάνειας που δημιουργείται και που αποτελεί ανασταλτικό παράγοντα για την προσκόλληση και ανάπτυξη των κυττάρων και έτσι το ποσοστό τους στις τιμές ΜΤΤ μειώθηκε αλλά όχι όμως πιο κάτω από τις τιμές του control. Σύμφωνα με αυτά τα αποτελέσματα, τα ικριώματα της 133

πολυμερικής μήτρας με φορτωμένα τα νανοσωματίδια αργύρου καθίστανται κυτταροσυμβατά και βιώσιμα. 9.2 Χρώση Methylene Blue Το πρωτόκολλο περιγραφής της διαδικασίας αυτής της μεθόδου περιγράφηκε αναλυτικά στο 5ο κεφάλαιο. Η διαδικασία αυτή αποτελεί μέθοδο ποσοτικής μελέτης, Το Κυανό του Μεθυλενίου (Methylene Blue) λειτουργεί σαν δείκτης για την ποσοτικοποίηση και καθορισμό των ζωντανών κυττάρων, καθώς διεισδύει μόνο στα ζωντανά κύτταρα βάφοντας τον πυρήνα τους μπλε, γεγονός που τα καθιστά ορατά και διαχωρίσιμα στο οπτικό μικροσκόπιο, με αποτέλεσμα να είναι εύκολος ο διαχωρισμός τους από τα νεκρά κύτταρα τα οποία δεν βάφονται μπλε. Έτσι, είναι εφικτή η ποσοτικοποίηση της βιωσιμότητάς τους. Σε αυτή την παράγραφο παρατίθενται τα αποτελέσματα που εξάχθηκαν από τη χρώση μόνο των ικριωμάτων της πολυκαπρολακτόνης με ενσωματωμένα τα νανοσωματίδια αργύρου. Ο λόγος που δεν εφαρμόστηκε αυτή η μέθοδος και στα νανοσωματίδια αργύρου είναι πως δεν υπάρχει δυνατότητα να παρατηρηθούν τα κύτταρα τα οποία θα βάφονταν μπλε με αυτή τη χρώση, καθώς θα διασκορπίζονταν ανάμεσα στα νανοσωματίδια. Συνεπώς, παρατίθενται εικόνες από το Οπτικό Μικροσκόπιο με τα αποτελέσματα της χρώσης με το κυανό του μεθυλενίου, σε διάστημα 24 και 48 ωρών μόνο για τα ικριώματα της πολυκαπρολακτόνης στα οποία έχει γίνει ενσωμάτωση των νανοσωματιδίων αργύρου με τη μέθοδο Drop Casting. Επίσης, λαμβάνονται με τη βοήθεια του Οπτικού Μικροσκοπίου πάλι, εικόνες από το δείγμα αναφοράς (control) όπου υπάρχουν μόνο κύτταρα, για σύγκριση, καθώς και εικόνες με μόνο τα κύτταρα που λήφθηκαν από τα ικριώματα, μετά την πάροδο των 24 και 48 ωρών, ώστε να διαπιστωθεί ο πολλαπλασιασμός τους συναρτήσει του χρόνου, με αναφορά πάντα στο control. 134

Εικόνα 8.12: Εικόνες Οπτικού Μικροσκοπίου με το δείγμα αναφοράς (Control). Αριστερά: Κλίμακα x40. Δεξιά: Κλίμακα x100 Εικόνα 8.13: Εικόνες Οπτικού Μικροσκοπίου των ικριωμάτων της πολυκαπρολακτόνης με ενσωματωμένα τα νανοσωματίδια αργύρου, με τη μέθοδο Drop Casting, μετά την πάροδο διαστήματος 24 ωρών. 135

Εικόνα 8.14: Εικόνες Οπτικού Μικροσκοπίου των ικριωμάτων της πολυκαπρολακτόνης με ενσωματωμένα τα νανοσωματίδια αργύρου, με τη μέθοδο Drop Casting, μετά από την πάροδο διαστήματος 48 ωρών. 136

Εικόνα 8.15: Εικόνες Οπτικού Μικροσκοπίου με το υγρό με τα κύτταρα στο οποίο ήταν τοποθετημένο το ικρίωμα της πολυκαπρολακτόνης με τα νανοσωματίδια αργύρου, μετά την πάροδο 24 ωρών. Εικόνα 8.16: Εικόνες Οπτικού Μικροσκοπίου με το υγρό με τα κύτταρα στο οποίο ήταν τοποθετημένο το ικρίωμα της πολυκαπρολακτόνης με τα νανοσωματίδια αργύρου, μετά την πάροδο 48 ωρών. Από τις παραπάνω εικόνες των δειγμάτων της πολυμερικής μήτρας, των δειγμάτων αναφοράς (control) καθώς και των δειγμάτων του υγρού που λήφθηκαν από τα ικριώματα, συμπεραίνεται πως σε διάστημα 24 ωρών υπάρχει καλή προσκόλληση των κυττάρων στην επιφάνεια των ικριωμάτων καθώς και πολλαπλασιασμός τους, ενώ σε διάστημα 48 ωρών εξακολουθεί να υπάρχει άριστη προσκόλληση των κυττάρων και συνεχής πολλαπλασιασμός τους στην επιφάνεια των ικριωμάτων. 137