ΟΙΝΟΛΟΓΙΑ-ΟΙΝΟΠΝΕΥΜΑΤΩ Η

ηµοκρίτειο Πανεπιστήµιο Θράκης Τµήµα Αγροτικής Ανάπτυξης Κατεύθυνση Επιστήµης & Τεχνολογίας Τροφίµων ιδάσκων: Πλέσσας Σταύρος Επίκουρος Καθηγητής Τµήµα Αγροτικής Ανάπτυξης, ΠΘ ΟΙΝΟΛΟΓΙΑ-ΟΙΝΟΠΝΕΥΜΑΤΩ Η ΠΟΤΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ Ορεστιάδα 2013

ΑΣΚΗΣΗ 1 ΟΙΝΟΛΟΓΙΑ: ΚΑΘΑΡΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΣΑΚΧΑΡΟΜΥΚΗΤΩΝ α. Στερεή καλλιέργεια σακχαροµυκητών Σε ογκοµετρική φιάλη των 1000mL παρασκευάζεται διάλυµα που περιέχει 0.1% KH2PO 4, 0.1% (NH4)2SO4, 0.5% MgSO4, 2% γλυκόζη και 0.4% yeast extract. Από το διάλυµα αυτό παραλαµβάνονται 100mL σε κωνική φιάλη των 250mL και διαλύονται µε θέρµανση 2g άγαρ. Στη συνέχεια τα διαυγή διαλύµατα (µε άγαρ και χωρίς άγαρ) αποστειρώνονται σε αυτόκλειστο για 15min. Αµέσως µετά την αποστείρωση το υγρό µε το άγαρ προστίθεται σε 4 τριβλία έτσι ώστε το κάθε τριβλίο να περιέχει τον ίδιο όγκο θρεπτικού. Τα τριβλία µένουν σκεπασµένα µέχρις ότου η θερµοκρασία του περιεχοµένου γίνει µικρότερη των 30 o C οπότε και λαµβάνεται το θρεπτικό σε στερεά µορφή. Στη συνέχεια σε αποστειρωµένο και καθαρό δοκιµαστικό σωλήνα διασπείρουµε µικρή ποσότητα ζύµης αρτοποιίας σε 5mL υγρού θρεπτικού που παρασκευάζεται µε την παρακάτω µέθοδο. Μετά µε ένα κρίκο αποστειρωµένο σε φλόγα λύχνου εµβολιάζεται η στερεή καλλιέργεια κοντά σε φλόγα λύχνου. Το τριβλίο τοποθετείται στον θερµοθάλαµο στους 30 o C και παρακολουθείται κάθε µέρα η ανάπτυξη της καλλιέργειας. Όταν η καλλιέργεια πάρει την επιθυµητή µορφή τότε παραδίδεται στον υπεύθυνο της άσκησης. β. Υγρή καλλιέργεια σακχαροµυκητών Σε δοκιµαστικό σωλήνα αποστειρωµένο προσθέτουµε 5mL υγρό θρεπτικό (χωρίς άγαρ) που παρασκευάστηκε και αποστειρώθηκε κατά την προηγούµενη περίοδο. Από αναπτυγµένη στερεή καλλιέργεια σακχαροµυκητών λαµβάνεται µε έναν αποστειρωµένο σε λύχνο κρίκο ποσότητα και διασπείρεται µε τη βοήθεια Vortex. Το παρασκεύασµα φυλάσσεται στο θερµοθάλαµο (30 o C) για 15-20 ώρες. Μετά µεταγγίζεται σε 50mL αποστειρωµένου υγρού θρεπτικού και αφήνεται η καλλιέργεια να αναπτυχθεί για 15-20 ώρες. Στο τέλος λαµβάνεται η οπτική πυκνότητα µε το φασµατοφωτόµετρο και το παρασκεύασµα παραδίδεται στον υπεύθυνο της άσκησης. γ. Προσδιορισµός περιεκτικότητας κυττάρων σε ζυµούµενο γλεύκος (κατασκευή πρότυπης καµπύλης) Σε ογκοµετρική φιάλη των 250mL παρασκευάζεται αιώρηµα ζύµης µε τη βοήθεια Vortex. Για τον σκοπό αυτό ζυγίζονται 0.5g ζύµης αρτοποιίας και χρησιµοποιείται υγρό θρεπτικό µε την ίδια σύσταση που περιγράφτηκε στην προηγούµενη µέθοδο χωρίς άγαρ και αποστείρωση. Από το αιώρηµα αυτό παρασκευάζονται µε αραίωση 10 διαλύµατα µε διαφορετική περιεκτικότητα σε κύτταρα και λαµβάνεται για το κάθε αιώρηµα στα 700nm οπτική πυκνότητα µε το φασµατοφωτόµετρο. Έτσι κατασκευάζουµε σε ηµιλογαριθµικό χαρτί την καµπύλη της οπτικής πυκνότητας σε συνάρτηση µε την πυκνότητα σε κύτταρα. 2

ΑΣΚΗΣΗ 2 ΟΙΝΟΛΟΓΙΑ: ΙΟΡΘΩΣΗ ΓΛΕΥΚΟΥΣ α. Μέτρηση πυκνότητας γλεύκους (αρχικού ή ζυµούµενου) σε o Be Σε ογκοµετρικό κύλινδρο των 250mL µεταφέρεται το προς µέτρηση γλεύκος. Σε αυτό βυθίζουµε το αραιόµετρο (µποµόµετρο) ενώ ταυτόχρονα µετράµε τη θερµοκρασία του διαλύµατος µε θερµόµετρο. Έστω ότι η ένδειξη του αραιοµέτρου είναι 11.7 και η θερµοκρασία 21 o C. Η αναγωγή της πυκνότητας στους 15 o C γίνεται ως εξής: ιαφορά θερµοκρασίας 21-15 = 6 Τελικό o Be: 11.7 + (6x0.045) = 11.97 Αν η θερµοκρασία είναι 9 o C τότε έχουµε: ιαφορά θερµοκρασίας 15 9 = 6 β. Προσδιορισµός οξύτητας γλεύκους Τελικό o Be: 11.7 - (6x0.045) = 11.43 10mL γλεύκους µετρηµένα µε σιφώνιο µεταφέρονται σε κωνική φιάλη αραιώνονται µε απιονισµένο νερό και ογκοµετρούνται µε Ν/10 διάλυµα NaOH και δείκτη φαινολοφθαλεΐνης. Αν το γλεύκος ζυµώνεται τότε θερµαίνουµε τα 10mL του γλεύκους επί 15min στους 80 o C για να εκλυθεί το CO2 και µετά ογκοµετρούµε το διάλυµα όπως αναφέρθηκε πιο πάνω. Στην περίπτωση που θέλουµε να εκφράσουµε την οξύτητα σε g/l τρυγικού οξέος τότε τα ml του διαλύµατος Ν/10 NaOH που καταναλώθηκαν πολλαπλασιάζονται µε 0.75 ενώ όταν θέλουµε να εκφραστούν σε θειικό οξύ τότε πολλαπλασιάζονται µε 0.49. γ. Αλκοολική ζύµωση γλεύκους χωρίς την προσθήκη ζύµης Σε µια πλαστική λεκάνη συνθλίβουµε 1Kg σταφύλια. Από το γλεύκος που προκύπτει παίρνουµε δείγµα για την µέτρηση της πυκνότητας σε o Be και της τελικής οξύτητας. Στη συνέχεια το γλεύκος διορθώνεται σε τιµή o Be 11.5-12 και τελική οξύτητα 6-8g/L τρυγικού οξέος. Σε µία κωνική φιάλη του 1l µεταφέρουµε 500mL του διορθωµένου γλεύκους και τοποθετούµε στο θερµοθάλαµο σε θερµοκρασία 25-27 o C. Μετά µετράµε την πυκνότητα του γλεύκους και τη θερµοκρασία του κάθε µέρα. Αυτό γίνεται µέχρι η πυκνότητα γίνει 0 o Be και σταµατήσει η έκλυση φυσαλίδων CO2. Καταγράφουµε τα αποτελέσµατα των µετρήσεων σε πίνακα. Αλκοολική ζύµωση γλεύκους µε προσθήκη ζύµης Σε µια κωνική φιάλη 500mL µεταφέρουµε 200mL γλεύκους πυκνότητας 11.5-12 o Be. Σε αυτό διασπείρουµε 2-4g πιεστής ζύµης. Τοποθετούµε τη φιάλη στο θερµοθάλαµο στους 25-30 o C και µετράµε την πυκνότητα στο τέλος της εργαστηριακής περιόδου και την επόµενη ανά 2 ώρες έως 0 o Be. Παράλληλα µε τη µέτρηση της οπτικής πυκνότητας κάνουµε και προσδιορισµό της περιεχόµενης στο ζυµούµενο γλεύκος ζύµης σύµφωνα µε τη µέθοδο που δίνεται στις σηµειώσεις αυτές. 3

o Α/Α Ηµεροµηνία Ώρα Χρόνος Be Οπτική Βιοµάζα Παραγωγικότητα ζύµωσης (h) πυκνότητα (g/l) (g/l/d) 1 2 3 4 5 Αν η οπτική πυκνότητα είναι µεγαλύτερη του 1 τότε το γλεύκος αραιώνεται προκειµένου να µετρηθεί. Η αραίωση γίνεται σε αναλογία 1:10 και σε αυτό µετράται η οπτική πυκνότητα. δ. Παρασκευή µιστελιού Σε ογκοµετρικό κύλινδρο των 500mL µεταφέρουµε 300mL γλεύκος χωρίς στέµφυλα. Ακολουθεί η προσθήκη πόσιµου οινοπνεύµατος έτσι ώστε να έχουµε 20 αλκοολικούς βαθµούς. Το προϊόν τοποθετείται σε ψυγείο στους -1 µέχρι -4 o C µέχρι να διαυγάσει. Μετά από αυτό το υπερκείµενο κρασί διαχωρίζεται από την οινολάσπη µε µετάγγιση, υφίσταται κολλάρισµα µε λευκό αυγού όπως περιγράφεται σε ανάλογη µέθοδο. Αφήνεται το ίζηµα προς καθίζηση και στη συνέχεια το διαυγές προϊόν αποµακρύνεται από το ίζηµα µε µετάγγιση ή διήθηση. Το προϊόν φυλάσσεται σε µπουκάλι ανάλογου µεγέθους αφήνεται επί δύο εβδοµάδες σε θερµοκρασία δωµατίου και παραδίδεται στον υπεύθυνο της άσκησης προς έλεγχο. ε. Αλκοολική ζύµωση για παραγωγή λευκού ξηρού κρασιού Σε µια καθαρή πλαστική λεκάνη γίνεται σύνθλιψη 2Kg λευκών σταφυλιών (ροδίτης). Το γλεύκος (αφού αποµακρυνθούν τα στέµφυλα µε διήθηση µε σουρωτήρι), διορθώνεται ως προς πυκνότητα o Be (11.5-12) και ως προς την οξύτητα (6-8g/L τρυγικού οξέος). Ακολούθως µεταφέρεται σε καθαρό και απολυµασµένο µε οινόπνευµα ειδικό δοχείο µε στρόφιγγα. Ακολουθεί µικροσκοπική εξέταση των σακχαροµυκήτων και επώαση σε θερµοκρασία 25 o C, αφού γίνει απολύµανση του πάνω µέρους του δοχείου µε οινόπνευµα και κάλυψή του µε αλουµινόχαρτο. Στη συνέχεια η ζύµωση παρακολουθείται τουλάχιστον κάθε 48ωρο (µέτρηση o Be) σε ότι αφορά το ρυθµό της, µακροσκοπικά παρακολουθώντας την έκλυση του CO2 αλλά και µικροσκοπικά µε παρακολούθηση των κυττάρων των σακχαροµυκήτων. Έτσι καταγράφεται η µεγάλη διαφορά στον αριθµό των κυττάρων πριν και µετά τη ζύµωση, η καθαρότητα στην καλλιέργεια που βελτιώνεται συνεχώς σε ότι αφορά τα στελέχη, την ύπαρξη βακτηρίων, η ζωτικότητα των κυττάρων αλλά και του συνόλου της καλλιέργειας. Μεγάλος σχετικά αριθµός κυττάρων σε κάθε οπτικό πεδίο είναι ενθαρρυντικό στοιχείο για την καλή προαγωγή της ζύµωσης. Η παρουσία σχετικά µεγάλων ελλειψοειδών κυττάρων στην καλλιέργεια είναι επίσης ενθαρρυντικός παράγοντας. 4

Η παρουσία S. αpiculatus στην καλλιέργεια σε µεγάλα ποσά δεν µας ενθαρρύνει για την πορεία της ζύµωσης. Η επικράτηση κυκλικών κυττάρων Candida προωθεί τη ζύµωση αλλά όχι σε µεγάλους αλκοολικούς βαθµούς. Μικρά ελλειψοειδή κύτταρα φαίνεται ότι ανήκουν σε στελέχη ανθεκτικά στην αιθανόλη και δίνουν πολύ καλή παραγωγικότητα σε αιθανόλη κατά τη ζύµωση. Κύτταρα λαµπερά χωρίς σκοτεινές περιοχές στην επιφάνεια µας πληροφορούν ότι πρόκειται για υγιή καλλιέργεια, ενώ κύτταρα που παρουσιάζονται σκούρα σε πολλά σηµεία, δείχνουν ότι είναι γερασµένα ή νεκρά. Τα βακτήρια παρουσιάζονται µε γραµµικά κύτταρα ή σαν ένα είδος αλυσίδας. Από τα στοιχεία που δίνονται πιο πάνω αλλά και από το ρυθµό της ζύµωσης που ο φοιτητής καταγράφει, βγάζει τελικά το συµπέρασµα για τη σωστή ή µη πορεία της ζύµωσης, αφού πρώτα (κι αν το κρίνει σκόπιµο) συζητήσει τα στοιχεία αυτά µε τον υπεύθυνο της άσκησης. Η εµφάνιση λευκού υµένα στην επιφάνεια οφείλεται στην ανάπτυξη του Mycoderma vini και δεν είναι επιθυµητό να υπάρχει. Αυτό συµβαίνει συνήθως όταν δεν έχουµε ταχεία ζύµωση. Όταν παρατηρείται θα πρέπει να ενηµερώνεται ο επιβλέπων της άσκησης. Στην περίπτωση που η ζύµωση διακοπεί για οποιοδήποτε λόγο ή έχουµε µικρή ταχύτητα θα πρέπει να προστίθεται η καλλιέργεια στο γλεύκος που έχουµε ετοιµάσει από την προηγούµενη άσκηση I. Η ποσότητα των κυττάρων που θα προστίθεται θα πρέπει να δίνει µια τελική συγκέντρωση κυττάρων 2-5g/L. Για να το πετύχουµε αυτό προβαίνουµε στη µέτρηση µε το φασµατοφωτόµετρο της οπτικής πυκνότητας της καλλιέργειας του γλεύκους της άσκησης I και από την πρότυπη καµπύλη που κατασκευάσαµε υπολογίζουµε την συγκέντρωση κυττάρων σε g/l ενώ από το αποτέλεσµα αυτό, την ποσότητα κυττάρων που έχουµε στο σύνολο του όγκου της καλλιέργειας αυτής. Στη συνέχεια υπολογίζουµε τον όγκο της καλλιέργειας που πρέπει να προσθέσουµε στο δύσκολα ζυµούµενο γλεύκος έτσι ώστε η τελική σε αυτό συγκέντρωση κυττάρων να βρίσκεται στην περιοχή 2-5g/L. Κάθε φορά που ελέγχουµε τη ζύµωση µετράµε και τη θερµοκρασία του γλεύκους. Θερµοκρασία µεγαλύτερη των 28ºC θα πρέπει να µας ενεργοποιεί για τη µείωσή της. Αυτό γίνεται µετά από ψύξη µε νερό στα εξωτερικά τοιχώµατα του δοχείου. Η µείωση της θερµοκρασίας θα πρέπει να γίνεται µέχρι τους 25ºC. Απότοµες µεταβολές της θερµοκρασίας προς τα επάνω και προς τα κάτω απαγορεύονται. Αυτές δεν θα πρέπει να υπερβαίνουν τους 3ºC. Θερµοκρασία ζυµούµενου γλεύκους µεγαλύτερη των 30ºC είναι επικίνδυνη και µπορεί να σταµατήσει τη ζύµωση. Αυτό γίνεται οπωσδήποτε όταν η θερµοκρασία περάσει τους 32ºC. Όταν η διακοπή της ζύµωσης προέρχεται από την άνοδο της θερµοκρασίας πέρα από τους 32ºC η µείωσή της δεν συνεπάγεται οπωσδήποτε και την επιτάχυνση της ζύµωσης. Σε αυτές τις περιπτώσεις καλό είναι να ψύχεται το γλεύκος στους 25ºC και να ζυµώνεται στη συνέχεια µε προσθήκη καλλιεργηµένης ζύµης. Όταν η θερµοκρασία του γλεύκους πέσει κάτω από τους 20ºC (και αυτό συµβαίνει µετά από πρώιµο κρύο καιρό) η ζύµωση µπορεί να σταµατήσει. Στην περίπτωση αυτή η άνοδος της θερµοκρασίας στους 25ºC (όχι όµως απότοµα) µπορεί να επαναφέρει τη ζύµωση σε καλούς ρυθµούς. Σχετικά υψηλές θερµοκρασίες ευνοούν την ανάπτυξη βακτηρίων ενώ οι χαµηλές όχι. Κατά τη διάρκεια της ζύµωσης αποφεύγουµε την ανατάραξη της υποστάθµης. 5

Επίσης το ζυµούµενο γλεύκος προστατεύεται από έντοµα (κουνούπια, σκνίπες) που µεταφέρουν µικροοργανισµούς και είναι επικίνδυνα για τη δηµιουργία της ασθένειας της οξίνισης. Το τέλος της ζύµωσης διαπιστώνεται από τη µη έκλυση φυσσαλίδων και πιστοποιείται οριστικά από τη µέτρηση του Be που για πλήρη ζύµωση είναι µηδέν (µε τη διόρθωση της θερµοκρασίας). Όταν διαπιστωθεί το τέλος της ζύµωσης το κρασί αποµακρύνεται από την υποστάθµη µε µετάγγιση εφόσον είναι δυνατό αυτό ή µε διήθηση του υπερκείµενου. Ακολουθεί θείωση µε προσθήκη Κ2S2Ο2 (πυροθειώδους καλίου) έτσι ώστε η τελική ποσότητα SO2 που µεταφέρεται στο κρασί να είναι 130 mg/l (για τους υπολογισµούς βλέπε σχετική αντίδραση στο βιβλίο). Ακολουθεί ψύξη στις συνθήκες και τη διάρκεια που έχει αναφερθεί για το µιστέλι, µετάγγιση κολλάρισµα και στη συνέχεια µετάγγιση ή διήθηση. Το προϊόν αφήνεται για µια εβδοµάδα σε κλειστό γυάλινο µπουκάλι που φροντίζει να φέρνει ο φοιτητής και στη συνέχεια παραδίδεται στον επιβλέποντα όπου από κοινού µε τον φοιτητή εξετάζεται το χρώµα (πρέπει να είναι λευκό), η διαύγεια, η οσµή και στη συνέχεια η γεύση του. Αν το κρασί δεν εκπληρώνει τις προδιαγραφές για το χρώµα, τη διαύγεια, τον οργανοληπτικό χαρακτήρα ή δεν έχει ζυµωθεί πλήρως, η άσκηση για παρασκευή κρασιού επαναλαµβάνεται. στ. Αλκοολική ζύµωση για ερυθρό γλυκό κρασί Σε µια καθαρή πλαστική λεκάνη γίνεται σύνθλιψη 2kg κόκκινων σταφυλιών. Το γλεύκος µεταφέρεται µαζί µε τα στέµφυλα σε καθαρό και απολυµασµένο µε οινόπνευµα ειδικό δοχείο µε στρόφιγγα και διορθώνεται ως προς την περιεκτικότητα σε σάκχαρο έτσι ώστε η πυκνότητα σε βαθµούς ºBe να είναι 12.0. Ακολουθεί µικροσκοπική εξέταση των σακχαροµυκήτων και επώαση σε θερµοκρασία 25ºC, αφού γίνει απολύµανση του επάνω µέρους του δοχείου µε οινόπνευµα και κάλυψή του µε αλουµινόχαρτο. Η παρακολούθηση της ζύµωσης γίνεται µε τον τρόπο και την µεθοδολογία που περιγράφεται παραπάνω στη µέθοδο για την παρασκευή του ξηρού λευκού κρασιού. Μετά από 3 ηµέρες ελέγχουµε τη ζύµωση µε τη µέτρηση του ºBe. Όταν διαπιστωθεί ότι το ºBe του ζυµούµενου γλεύκους έχει µειωθεί στο 6 τότε διακόπτουµε τη ζύµωση µε προσθήκη οινοπνεύµατος. Το οινόπνευµα που θα προστεθεί θα είναι τόσο ώστε το κρασί που θα προκύψει να έχει τελικά 17 αλκοολικούς βαθµούς. Το κρασί αφήνεται επί ένα 24ωρο σε θερµοκρασία δωµατίου και αποµακρύνεται από την υποστάθµη µε µετάγγιση εφόσον είναι δυνατό ή µε διήθηση του υπερκείµενου. Επειδή το κρασί έχει 17 αλκοολικούς βαθµούς είναι αδύνατο να αναπτυχθούν βακτήρια και να εµφανίσει αλλοίωση. Συνεπώς οι παραπέρα κατεργασίες θα στοχεύουν στην διαύγαση και τη σταθεροποίηση της διαύγειας και όχι στη συντήρησή του. Ακολουθεί ψύξη στις συνθήκες και τη διάρκεια που αναφέρονται για το µιστέλι, κολλάρισµα και στη συνέχεια µετάγγιση ή διήθηση. Το προϊόν αφήνεται για µια εβδοµάδα σε κλειστό γυάλινο µπουκάλι που φροντίζει να φέρνει οι φοιτητής και στη συνέχεια παραδίδεται στον επιβλέποντα όπου από κοινού µε τον φοιτητή εξετάζεται το χρώµα (πρέπει να είναι κόκκινο), η διαύγεια, η οσµή και στη συνέχεια η γεύση του. 6

Αν το κρασί δεν εκπληρώνει τις προδιαγραφές για το χρώµα, τη διαύγεια, τον οργανοληπτικό χαρακτήρα ή δεν έχει ζυµωθεί πλήρως, η άσκηση για παρασκευή κρασιού επαναλαµβάνεται και πραγµατοποιείται σε ωράριο εκτός του προγραµµατισµένου. Στην περίπτωση που το κρασί είναι αποδεκτό τότε ο φοιτητής εξετάζεται προφορικά σε όλες τις ασκήσεις της οινολογίας που έχει κάνει. Εάν κριθεί ότι δεν είναι επαρκώς µελετηµένος τότε επανεξετάζεται µια εβδοµάδα αργότερα. Απαραίτητο για να δώσει εξετάσεις το µάθηµα είναι η επιτυχής εξέτασή του στις ασκήσεις της οινολογίας. ΣΗΜΕΙΩΣΗ Η κάθε οµάδα φοιτητών θα πρέπει να έχει µαζί της τα σταφύλια που χρειάζονται για τη διεξαγωγή της άσκησης. Θα πρέπει να υπάρχει τέτοια συνεννόηση ώστε οι φοιτητές να προµηθεύονται τα λευκά και τα κόκκινα σταφύλια πριν έρθουν στο εργαστήριο. Αυτό θα γίνεται στην άσκηση ΙΙ ενώ στην άσκηση ΙV οι φοιτητές της οµάδας θα πρέπει να έχουν µαζί τους 1 αυγό και 1 κρασί λευκό. 7

ΑΣΚΗΣΗ 3 ΟΙΝΟΛΟΓΙΑ: ΑΝΑΛΥΣΗ ΟΙΝΟΥ α. Προσδιορισµός αλκοολικού βαθµού µε απόσταξη Εισαγωγή Ο προσδιορισµός του αλκοολικού βαθµού µε απόσταξη δίνει ασφαλή αποτελέσµατα και πρέπει να εκτελείται για ακριβείς προσδιορισµούς. Βασίζεται: 1. στην απόσταξη όλου του ποσού της αλκοόλης που περιέχεται σε ορισµένο όγκο γλεύκους που ζυµώνεται ή κρασιού, 2. στη συµπλήρωση του αποστάγµατος µε νερό µέχρι του αρχικού όγκου, 3. στον καθορισµό του ειδικού βάρους του υγρού αυτού, όπου µε τη βοήθεια πινάκων βρίσκεται το αντίστοιχο ποσό της αλκοόλης. Συνήθως χρησιµοποιούνται ειδικά αραιόµετρα που παρέχουν απευθείας την κατ όγκο περιεκτικότητα σε αλκοόλη, τα αλκοολόµετρα (οινοπνευµατόµετρα) Gay-Lussac. Τα πτητικά οξέα που περιέχονται στο κρασί ή στο ζυµούµενο γλεύκος (κυρίως το τρυγικό οξύ), συναποστάζουν κατά την παραπάνω µέθοδο, οπότε επιφέρουν αύξηση στο ειδικό βάρος του αποστάγµατος µε αποτέλεσµα να εµφανίζεται µικρότερο το ποσό της περιεχόµενης αλκοόλης. Εάν το ποσό των πτητικών οξέων είναι µικρό το λάθος είναι ασήµαντο, αν όµως είναι υψηλό συνήθως πάνω από 1.2g/L σε τρυγικό οξύ, πρέπει το υγρό πριν την απόσταξη να εξουδετερώνεται µε µια βάση, υπολογίζοντας το ποσό που απαιτείται µε προσδιορισµό της οξύτητας του κρασιού. Εάν το υπόλειµµα της απόσταξης χρησιµοποιηθεί για τον έµµεσο προσδιορισµό του στερεού υπολείµµατος του κρασιού, τότε δεν γίνεται εξουδετέρωση των οξέων. Αλλά µετρούµε την οξύτητα του αποστάγµατος και γίνεται διόρθωση στο µετρούµενο ειδικό βάρος του αποστάγµατος. Πειραµατικό µέρος Για τον προσδιορισµό του αλκοολικού βαθµού υποβάλλονται σε απόσταξη 200mL γλεύκους ή κρασιού µετρηµένα σε ογκοµετρική φιάλη στη θερµοκρασία των 15 C και µεταφέρονται στην σφαιρική φιάλη που χρησιµοποιείται σαν βραστήρας της αποστακτικής συσκευής. Γίνεται έκπλυση της ογκοµετρικής φιάλης τρεις φορές µε λίγα κάθε φορά ml νερού, και τα υγρά έκπλυσης µεταφέρονται και αυτά στον βραστήρα. Κατά την έναρξη της απόσταξης πολλά κρασιά κυρίως νέα, αφρίζουν πολύ, έτσι ώστε να υπάρχει κίνδυνος να υπερχειλίσει το υγρό και να µεταφερθεί µέσω του ψυκτήρα στον υποδοχέα. Το άφρισµα οφείλεται σε πρωτεϊνικές ύλες και γι αυτό καλό είναι να προστίθεται στη φιάλη της αποστακτικής συσκευής µικρή ποσότητα ταννίνης, µε την οποία δεσµεύονται οι πρωτεϊνικές ύλες. Αντί για ταννίνη µπορεί να προστεθεί λίγη ελαφρόπετρα ή αντιαφριστικό. Εάν όµως το υπόλειµµα της απόσταξης χρησιµοποιηθεί για τον προσδιορισµό του στερεού υπολείµµατος του κρασιού µε έµµεση µέθοδο, τότε δεν πρέπει να προστεθεί η ταννίνη. Σε αυτή την περίπτωση ο αφρισµός αποφεύγεται εάν η θέρµανση γίνει µε πολύ µεγάλη προσοχή ιδίως κατά την αρχή της απόσταξης. Το υγρό υποβάλλεται σε αργή απόσταξη µε µικρή 8

θέρµανση, καλή ψύξη του ψυκτήρα, ο οποίος θα πρέπει να είναι κατά προτίµηση κατακόρυφος και οφιοειδής. Σαν υποδοχέας για το απόσταγµα χρησιµοποιείται η ίδια ογκοµετρική φιάλη µε την οποία µετριέται το προς απόσταξη υγρό. Η απόσταξη συνεχίζεται µέχρι να µεταφερθεί όλη η αλκοόλη στο απόσταγµα, πράγµα που συµβαίνει όταν αποσταχθούν τα 2/3 τουλάχιστον του αρχικού υγρού. Τότε διακόπτεται η απόσταξη, συµπληρώνεται η ογκοµετρική φιάλη που περιέχει το απόσταγµα µε απεσταγµένο νερό µέχρι την χαραγή σε θερµοκρασία 15 C ανακινείται καλά για να γίνει οµοιογενές και προσδιορίζεται η περιεκτικότητά του σε αλκοόλη µε το αλκοολόµετρο. Η ανάγνωση του αλκοολοµέτρου γίνεται στην κάτω γραµµή του µηνίσκου. Ταυτόχρονα µετριέται µε θερµόµετρο και η θερµοκρασία του υγρού. Η αναγωγή των αλκοολικών βαθµών στην θερµοκρασία των 15 C γίνεται µε τη χρήση πινάκων. β. Προσδιορισµός οξύτητας Εισαγωγή Τα οργανικά οξέα που περιέχονται στο γλεύκος ή στο κρασί κατά ένα ποσοστό είναι ελεύθερα και ένα άλλο υπό τη µορφή όξινων ή ουδέτερων αλάτων. Με την συνηθισµένη ογκοµέτρηση βρίσκεται η λεγόµενη ολική ή ογκοµετρούµενη οξύτητα η οποία οφείλεται στα ελεύθερα οξέα και στα όξινα άλατα, τόσο σε εκείνα που βρίσκονται ως ιόντα εν διαστάσει όσο και στα αδιάστατα. Από τα οξέα του γλεύκους ή του κρασιού το d-τρυγικό οξύ, που πρέρχεται από την οξειδωτική διάσπαση της d-γλυκόζης, συναντάται ελεύθερο, ενωµένο, κυρίως όµως σαν όξινο άλας του καλίου και σε µικρή ποσότητα σαν άλας του ασβεστίου. Υπάρχει επίσης το µηλικό οξύ και άλλα οργανικά οξέα σε µικρότερες συγκεντρώσεις. Πειραµατικό µέρος 1. Ογκοµετρούµενη ή ολική οξύτητα Σε κωνική φιάλη 200mL φέρονται µε σιφώνι 10mL κρασιού. Για την αποµάκρυνση του CO2 προτείνεται θέρµανση του κρασιού στους 80 C σε ατµόλουτρο ή µε προσοχή πάνω από πλέγµα µέχρι να αρχίσει ο βρασµός, ο οποίος δεν πρέπει να παραταθεί για να µην αποµακρυνθούν τα πτητικά οξέα. Μετά την ψύξη αραιώνονται τα 10mL µε λίγο νερό αν πρόκειται για λευκό κρασί και µε περισσότερο αν πρόκειται για ερυθρό. Προστίθενται 2-3 σταγόνες αλκοολικού διαλύµατος φαινολαφθαλεΐνης 1% και ογκοµετρούνται µε Ν/10 NaOH. Σε κρασιά µε βαθιά χρώση η ογκοµέτρηση γίνεται σταγονοµετρικά χρησιµοποιώντας σαν δείκτη ευαίσθητο χαρτί ηλιοτροπίου. Η ογκοµετρούµενη οξύτητα σε g/l βρίσκεται µε πολλαπλασιασµό των ml της βάσεως που καταναλώθηκαν επί 0.75 για την αναγωγή σε τρυγικό οξύ ή επί 0.49 για την αναγωγή σε θειϊκό οξύ. 2. Πτητική οξύτητα Κανονικά στα κρασιά υπάρχει µια µικρή ποσότητα πτητικών οξέων κυρίως οξικού (κάτω του 1 0 /00) που σχηµατίζονται κατά την ζύµωση. Σε ελαττωµατικά ή ασθενή όµως κρασιά το ποσό τους είναι αυξηµένο. Τα πτητικά οξέα προσδιορίζονται µε απόσταξη µεθ υδρατµών και ογκοµέτρηση του αποστάγµατος. 9

Με ειδική συσκευή (θα σας δείξει την λειτουργία της ο επιβλέπων της άσκησης) διοχετεύεται υδρατµός σε 50mL κρασιού και µέσω του ψυκτήρα συλλέγονται σε κωνική φιάλη των 250mL, περίπου 150mL αποστάγµατος. Προστίθεται 2-3 σταγόνες φαινολοφθαλεΐνης και γίνεται ογκοµέτρηση µε διάλυµα NaOH, N/10. Αν α είναι τα ml τα διαλύµατος NaOH N/10 που καταναλώθηκαν, σε 1L κρασιού περιέχονται 0.12α g πτητικών οξέων εκφρασµένα σε οξικό οξύ. γ. Θειώδες οξύ Εισαγωγή Το θειώδες οξύ βρίσκεται στα κρασιά ένα µέρος ελεύθερο και ένα µέρος ενωµένο. Σαν ελεύθερο χαρακτηρίζεται το Η2SO3 ή SO2 και το θειώδες που βρίσκεται µε τη µορφή όξινων θειωδών αλάτων µε κατιόντα του κρασιού. Σαν ενωµένο θειώδες οξύ χαρακτηρίζεται αυτό που υπάρχει σε ενώσεις προσθήκης του µε καρβονυλικές ενώσεις, όπως ακεταλδεΰδη, σάκχαρα, χρωστικές κ.α. Οι ενώσεις προσθήκης είναι κι αυτές µε τη µορφή ουδέτερων αλάτων αφού είναι ενωµένες µε κατιόντα του κρασιού. Μεταξύ του ελεύθερου και του ενωµένου θειώδους οξέος του κρασιού υπάρχει πάντοτε κατάσταση ισορροπίας που εξαρτάται από πολλούς παράγοντες π.χ. θερµοκρασία, οξύτητα κ.α. Η αύξηση της θερµοκρασίας αυξάνει την διάσπαση των ενώσεων του θειώδους οξέος µε τις καρβονυλικές ενώσεις. Γι αυτό κατά τον προσδιορισµό του ελεύθερου θειώδους οξέος βρίσκεται ποσό µεγαλύτερο όταν η θερµοκρασία του προς ανάλυση δείγµατος είναι υψηλή. Αντίθετα περιορίζεται σε αξιοσηµείωτο βαθµό η διάσπαση αυτή του ενωµένου θειώδους οξέος παρουσία οξέων. Πειραµατικό µέρος 1. Προσδιορισµός του ελεύθερου θειώδους οξέος σε κρασί Ο προσδιορισµός βασίζεται στην οξείδωση του θειώδους οξέος µε ιώδιο SO2 + 2H2O + I2 H2 SO4 + 2ΗΙ Σε κωνική φιάλη των 250mL φέρονται 50mL κρασιού µε σιφώνι του οποίου το άκρο παραµένει χαµηλά στον πυθµένα της φιάλης έτσι ώστε το κρασί να µην αναταραχθεί στον αέρα και χαθεί SO2. Προστίθενται 5mL αραιού θειϊκού οξέος (25% κ.ο.) και µικρή ποσότητα διαλύµατος αµύλου. Στο µίγµα προστίθεται µε προχοΐδα και όσο το δυνατόν ταχύτερα και µε συνεχή ανάδευση Ν/50 διάλυµα ιωδίου. Η προσθήκη του διαλύµατος ιωδίου διακόπτεται από τη στιγµή που το κυανό χρώµα του σχηµατιζόµενου ιωδιαµύλου διατηρείται για λίγο και µετά την ανατάραξη της φιάλης. Το κυανό χρώµα δεν παραµένει για πολύ διότι κι άλλα συστατικά του κρασιού όπως π.χ. η ταννίνη, οξειδώνονται από το ιώδιο. Ο αριθµός των ml ιωδίου που καταναλώθηκαν πολλαπλασιασµένος επί 12.8 παρέχει την περιεκτικότητα του ελεύθερου θειώδους οξέος σε mg/l κρασιού. 2. Προσδιορισµός του ολικού θειώδους οξέος 10

Σε κωνική φιάλη 200mL φέρονται 25mL διαλύµατος ΚΟΗ και 50mL κρασιού µε σιφώνι του οποίου το άκρο βρίσκεται εµβαπτισµένο στο αλκαλικό διάλυµα. Το χρησιµοποιούµενο κανονικό διάλυµα ΚΟΗ πρέπει να δοκιµαστεί ώστε να µην περιέχει ύλες που οξειδώνουν το SO2. Η δοκιµή γίνεται µε προσδιορισµό της περιεκτικότητας ενός υδατικού διαλύµατος θειώδους οξέος αφ ενός µεν χωρίς την προσθήκη του διαλύµατος της βάσης αφ ετέρου δε µετά την προσθήκη 25mL από το διάλυµα αυτό. Αφήνεται να επιδράσει το διάλυµα το ΚΟΗ για 15min. Το ενωµένο θειώδες οξύ αποσπάται από τις καρβονυλικές ενώσεις µε την επίδραση του ΚΟΗ και σχηµατίζει ΚΗSO3. Στη συνέχεια προστίθενται 10mL αραιού διαλύµατος Η2SO4 (25% κ.ο.) για διάσπαση του σχηµατιζόµενου ΚΗSO 3, µικρή ποσότητα διαλύµατος αµύλου και ογκοµετρείται µε Ν/50 διαλύµατος ιωδίου όπως παραπάνω. Το ενωµένο SO2 υπολογίζεται από τη διαφορά. 11

ΑΣΚΗΣΗ 4 ΟΙΝΟΛΟΓΙΑ: ΚΑΤΕΡΓΑΣΙΕΣ ΓΙΑ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΛΕΥΚΟΥ ΞΗΡΟΥ ΚΑΙ ΕΡΥΘΡΟΥ ΓΛΥΚΟΥ ΚΡΑΣΙΟΥ α. Παρακολούθηση της ζύµωσης ανά 48ωρο: 1. Μακροσκοπικά 2. Με µικροσκοπική παρατήρηση σακχαροµυκητών Από το ζυµούµενο γλεύκος παίρνουµε µια σταγόνα και την τοποθετούµε σε µια αντικειµενοφόρο πλάκα. Η σταγόνα καλύπτεται στη συνέχεια µε καλυπτρίδα και παρατηρούνται στο µικροσκόπιο τα υγιή κύτταρα σακχαροµυκητών, τα νεκρά και τυχόν µολύνσεις (µε τη βοήθεια του επιβλέποντος). Για ασφαλέστερη παρατήρηση των µολύνσεων κάνουµε το παρακάτω παρασκεύασµα. Σε µια αντικειµενοφόρο πλάκα προστίθεται µια σταγόνα του προς εξέταση ζυµούµενου γλεύκους. Στη συνέχεια φέρεται η καλυπτρίδα σε λύχνο περνώντας την πάνω από φλόγα για µικρά σχετικά χρονικά διαστήµατα. Αυτό γίνεται µέχρι να εξατµιστεί το νερό και το στερεό υπόλειµµα να αρχίζει να εµφανίζει ένα ανοιχτό καστανό χρώµα. Στη συνέχεια προσθέτουµε διάλυµα κυανούν του µεθυλενίου 1:1.000.000 και µετά 2-3 λεπτά ξεπλένουµε µε νερό. Τοποθετούµε πάνω στο παρασκεύασµα µια καλυπτρίδα και παρατηρούµε στο µικροσκόπιο. Τυχόν µόλυνση από βακτήρια φαίνεται σαν µπλε ευθείες λεπτές γραµµές. Το παρασκεύασµα παραδίδεται στον υπεύθυνο της άσκησης. 3. Εφόσον χρειάζεται ενίσχυση της ζύµης γίνεται προσθήκη καλλιέργειας β. ιακοπή της ζύµωσης µε προσθήκη οινοπνεύµατος για παρασκευή ερυθρού γλυκού κρασιού (όπως περιγράφεται στην άσκηση 2). γ. Κατεργασία για παρασκευή µιστελιού (όπως περιγράφεται στην άσκηση 2). δ. ιαπίστωση του τέλους της ζύµωσης Το τέλος της ζύµωσης διαπιστώνεται από τη µη έκλυση φυσαλίδων και πιστοποιείται οριστικά από τη µέτρηση του Be που για πλήρη ζύµωση είναι µηδέν, µε τη διόρθωση της θερµοκρασίας. ε. Μετάγγιση Όταν διαπιστωθεί το τέλος της ζύµωσης το κρασί αποµακρύνεται από την υποστάθµη µε µετάγγιση εφόσον είναι δυνατό αυτό ή µε διήθηση του υπερκείµενου. στ. Θείωση Ακολουθεί θείωση µε προσθήκη K2S2O5 (πυροθειώδους καλίου) έτσι ώστε η τελική ποσότητα SO2 που µεταφέρεται στο κρασί να είναι 130mg/L (για τους υπολογισµούς βλέπε σχετική αντίδραση στο βιβλίο). 12

ζ. Ψύξη του κρασιού - ιήθηση Ακολουθεί ψύξη στις συνθήκες και τη διάρκεια που έχει αναφερθεί για το µιστέλι, µετάγγιση ή διήθηση. η. Κολλάρισµα Το κολλάρισµα γίνεται στη συνέχεια ως εξής: Αποχωρίζουµε το λευκό ενός αυγού το οποίο και χτυπάµε σε ένα πιάτο µε τη βοήθεια ενός πιρουνιού αφού προηγουµένως προσθέσουµε 1g NaCl. Αυτό προστίθεται σε 1L κρασί λευκό που ο φοιτητής είναι υποχρεωµένος να φέρει µαζί µε το αυγό. Ακολουθεί ανάδευση και προσθήκη 10mL από το παρασκεύασµα στο προς διαύγαση κρασί στην περίπτωση που αυτό είναι λευκό. Αν είναι ροζέ τότε προστίθενται 20mL. Στη συνέχεια αφήνεται µέχρι πλήρη καθίζηση του ιζήµατος και το κρασί µεταγγίζεται ή διηθείται. Η µετάγγιση γίνεται µε µεγάλη προσοχή έτσι ώστε να µη παρασύρεται λάσπη από τον πυθµένα. θ. οκιµασία γεύσης αρώµατος Το προϊόν αφήνεται για µια εβδοµάδα σε κλειστό γυάλινο µπουκάλι που φροντίζει να φέρνει ο φοιτητής και στη συνέχεια παραδίδεται στον επιβλέποντα όπου από κοινού µε τον φοιτητή εξετάζεται το χρώµα (πρέπει να είναι λευκό), η διαύγεια, η οσµή και στη συνέχεια η γεύση του. 13