Άσκηση 2: Μικροοργανισμοί Προκαρυωτικό/Ευκαρυωτικό κύτταρο Σύνοψη Σκοπός της άσκησης είναι η κατανόηση των διαφορών μεταξύ προκαρυωτικού και ευκαρυωτικού κυττάρου, η γνωριμία του φοιτητή με τους μικροοργανισμούς και η κατανόηση της θέσης τους στον κόσμο των έμβιων όντων. Στο εισαγωγικό μέρος περιγράφονται τα βασικά χαρακτηριστικά του προκαρυωτικού κυττάρου και αναλύονται οι ομοιότητες και οι διαφορές του με το ευκαρυωτικό. Ακολούθως, γίνεται αναφορά στην ταξινόμηση των οργανισμών σε επιμέρους βασίλεια και περιγραφή σημαντικών μικροοργανισμών, προκαρυωτικών (βακτηρίων και κυανοβακτηρίων) και ευκαρυωτικών (πρωτόζωα, φύκη, μύκητες). Το πρακτικό μέρος αφορά στην παρατήρηση αντιπροσωπευτικών προκαρυωτικών (κόκκοι, βάκιλοι, σπειρίλλια, κυανοφύκος Nostoc) και ευκαρυωτικών μικροοργανισμών (αμοιβάδα, Paramecium, Euglena, διάτομα, μυκηλιακοί μύκητες του γένους Penicillium και Aspergillus, κ.α.) σε μόνιμα και σε νωπά μικροσκοπικά παρασκευάσματα (π.χ. αιώρημα ξινισμένου γιαουρτιού, μουχλιασμένο ψωμί, στάσιμα νερά). Προαπαιτούμενη γνώση Από το βιβλίο των Campbell, N. A., & Reece, J. B. (2010), Βιολογία (τόμος Ι), Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, ISBN: 978-960-524-306-7, ο φοιτητής θα πρέπει να ανατρέξει στο Κεφάλαιο 1: Εισαγωγή: οι κανόνες που διέπουν το φαινόμενο της ζωής, και στο Κεφάλαιο 6: Περιήγηση στο κύτταρο. 1. Εισαγωγικό μέρος 1.1. Προκαρυωτικό Ευκαρυωτικό κύτταρο Η βασική μονάδα των ζώντων οργανισμών είναι το κύτταρο, που συνιστά τη μικρότερη μονάδα που είναι ικανή να ζει. Η σύστασή του είναι σε γενικές γραμμές η ίδια σε όλους τους οργανισμούς. Τα κύρια συστατικά όλων των κυττάρων είναι DNA, RNA, πρωτεΐνες, λίπη, πολυσακχαρίδια και φωσφολιπίδια. Ωστόσο, έρευνες που αφορούν στη λεπτομερή σύσταση και δομή των κυττάρων απεκάλυψαν ότι υπάρχουν σημαντικές διαφορές μεταξύ βακτηρίων και κυανοβακτηρίων από τη μια μεριά, και φυτών, ζώων και μυκήτων από την άλλη. Οι διαφορές αυτές είναι τόσο σημαντικές ώστε διαφοροποιούν τις δύο ομάδες σε δύο τύπους κυτταρικής αρχιτεκτονικής: τον προκαρυωτικό και τον ευκαρυωτικό. Οι προκαρυωτικοί οργανισμοί θεωρούνται ζωντανά λείψανα προγενέστερων εποχών της βιολογικής εξέλιξης, ενώ οι ευκαρυωτικοί είναι μεταγενέστεροι και η εμφάνισή τους αντιπροσωπεύει το μεγαλύτερο άλμα στην εξελικτική πορεία των όντων. Βασικό γνώρισμα του προκαρυωτικού κυττάρου είναι η έλλειψη πυρήνα (καρύου) περιβαλλόμενου από μεμβράνη καθώς και υποκυτταρικών οργανιδίων, όπως μιτοχονδρίων και χλωροπλαστών (Πίνακας 2.1). Το προκαρυωτικό κύτταρο χαρακτηρίζεται γενικά από την απλή του κατασκευή. Το γενετικό υλικό (DNA) έχει μορφή κλειστού μορίου και βρίσκεται μέσα στο κυτταρόπλασμα. Αυτό το «βακτηριακό χρωμόσωμα» περιέχει όλες τις απαραίτητες για την αναπαραγωγή του κυττάρου πληροφορίες. Επιπρόσθετα, μπορεί να υπάρχουν στο κύτταρο ένα ή περισσότερα μικρά κυκλικά μόρια DNA που ονομάζονται πλασμίδια. Τα πλασμίδια δεν είναι απαραίτητα για την αναπαραγωγή, μπορεί όμως να φέρουν πληροφορίες για κάποιες μεταβολικές λειτουργίες. Τα προκαρυωτικά ριβοσώματα είναι σχετικά μικρά (70S). Οι προκαρυωτικοί οργανισμοί δεν εμφανίζουν μεγάλες μορφολογικές διαφοροποιήσεις. Διαθέτουν όμως μια εντυπωσιακά μεγάλη βιοχημική ποικιλομορφία και προσαρμοστικότητα. Ενώ όλα τα φυτά και τα ζώα χρειάζονται οξυγόνο, υπάρχουν αρκετές ομάδες προκαρυωτικών οργανισμών που ζουν αναερόβια (απουσία οξυγόνου) και καλύπτουν τις ανάγκες τους σε ενέργεια για αύξηση μέσω ζυμωτικών αντιδράσεων ή με αναερόβια αναπνοή. Άλλες ομάδες έχουν την ικανότητα να χρησιμοποιούν τη φωτεινή ενέργεια και να συνθέτουν τα κυτταρικά τους υλικά είτε από οργανικές ενώσεις είτε από διοξείδιο του άνθρακα. Υπάρχουν, επίσης, ομάδες βακτηρίων που καλύπτουν τις ενεργειακές τους ανάγκες με την οξείδωση ή την αναγωγή ανόργανων ενώσεων ή στοιχείων, ενώ η ικανότητα δέσμευσης ατμοσφαιρικού (μοριακού) αζώτου είναι ευρύτατα διαδεδομένη μεταξύ των προκαρυωτικών οργανισμών. Το ευκαρυωτικό κύτταρο πάλι διαθέτει πυρήνα στον οποίο περικλείεται το μεγαλύτερο μέρος του γονιδιώματος διανεμημένο σε ένα σύνολο χρωμοσωμάτων (Πίνακας 2.1). Τα χρωμοσώματα αυτά αντιγράφονται και ισοκατανέμονται στα θυγατρικά κύτταρα μέσω ενός μηχανισμού που είναι γνωστός ως - 25 -
μίτωση. Το DNA των χρωμοσωμάτων συνδέεται με ιστόνες (βασικές πρωτεΐνες). Στο ευκαρυωτικό κύτταρο υπάρχουν επίσης οργανίδια, όπως μιτοχόνδρια και χλωροπλάστες (στα φυτά), τα οποία περιέχουν ένα μικρό ποσοστό του γονιδιώματος υπό μορφή κυκλικού DNA. Τα ριβοσώματα των ευκαρυωτικών κυττάρων είναι σχετικά μεγάλα (80S). Σε αντίθεση με το προκαρυωτικό, το ευκαρυωτικό κύτταρο εμφανίζει μεγάλες μορφολογικές διαφοροποιήσεις. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΟΡΓΑΝΙΔΙΑ ΠΡΟΚΑΡΥΩΤΙΚΟ ΚΥΤΤΑΡΟ (διάμετρος κυττάρου 1-10 μm) ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟ ΚΥΤΤΑΡΟ (διάμετρος κυττάρου 10-100 μm) Ανώτερα ΦΥΤΑ ΖΩΑ Κυτταρική μεμβράνη Ναι Ναι Ναι Κυτταρικό τοίχωμα Ναι (πεπτιδογλυκάνη) Ναι (κυτταρίνη) Όχι Πυρήνας Όχι Ναι Ναι Πυρηνική μεμβράνη Όχι Ναι Ναι Πυρηνίσκος Όχι Ναι Ναι Αριθμός χρωμοσωμάτων 1 > 1 > 1 Ιστόνες Όχι Ναι Ναι Μιτωτική διαίρεση Όχι Ναι Ναι Κυτταροσκελετός Όχι Ναι Ναι Μιτοχόνδρια Όχι Ναι Ναι Κεντρίδια Όχι Όχι Ναι Χλωροπλάστες Όχι Ναι Όχι Χυμοτόπια Όχι Ναι Όχι Ενδοπλασματικό Δίκτυο Όχι Ναι Ναι Συσκευή Golgi Όχι Ναι Ναι Ριβοσώματα Ναι (μικρά) Ναι Ναι Λυσοσώματα Όχι Ναι Ναι Υπεροξεισώματα Όχι Ναι Ναι Πίνακας 2.1 Βασικές διαφορές μεταξύ προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών κυττάρων. 1.2. Τα πέντε βασίλεια των οργανισμών Οι επιστήμονες υπολογίζουν πως τουλάχιστον 30 εκατομμύρια διαφορετικά είδη οργανισμών κατοικούν σήμερα στον πλανήτη Γη. Ο αριθμός αυτός ήταν κατά πολύ μεγαλύτερος στο παρελθόν, καθώς σήμερα πολλά είδη έχουν εξαφανιστεί. Στην προσπάθειά τους να ταξινομήσουν την τεράστια αυτή ποικιλία οργανισμών, οι Βιολόγοι χρησιμοποίησαν ταξινομικά σχήματα που αντικατοπτρίζουν την εξελικτική ιστορία των έμβιων όντων. Από την εποχή του Αριστοτέλη μέχρι σχετικά πρόσφατα τα έμβια όντα ταξινομούνταν σε δύο μεγάλα αθροίσματα (ή βασίλεια), αυτά των Φυτών και των Ζώων. Οι χαρακτήρες πάνω στους οποίους βασιζόταν ο διαχωρισμός των οργανισμών αφορούσαν τη μορφή της ενέργειας που χρησιμοποιούν για την κάλυψη των μεταβολικών τους αναγκών, τις αποθησαυριστικές τους ουσίες, την ικανότητα της κίνησης, την παρουσία ή απουσία κυτταρικών τοιχωμάτων και τον τύπο της αύξησής τους (Πίνακας 2.2). Ωστόσο, αν για τους ανώτερους οργανισμούς οι χαρακτήρες αυτοί είναι σαφείς και επαρκείς, δεν ισχύει το ίδιο και στην περίπτωση των μικροοργανισμών (βακτήρια, φύκη πρωτόζωα κ.λπ.), η ανακάλυψη και μελέτη των οποίων έγινε δυνατή μετά από την εφεύρεση του μικροσκοπίου. Βέβαια, μερικά φύκη μπορούν να χαρακτηριστούν φυτά ενώ πολλά πρωτόζωα μοιάζουν με ζώα. Δεν συμβαίνει όμως το ίδιο με τη μεγάλη πλειονότητα των άλλων μικροοργανισμών. Οι μύκητες, για παράδειγμα, μοιάζουν με αχλωρόφυλλα φυτά, τρέφονται όμως με έτοιμες οργανικές ουσίες όπως τα ζώα. Ορισμένα πάλι πρωτόζωα (μερικά μαστιγοφόρα), που όπως δηλώνει το όνομά τους θεωρούνται σαν οι τυπικοί εκπρόσωποι των ζώων στον κόσμο των μικροβίων, έχουν κυτταρικά τοιχώματα και χλωροφύλλη και φωτοσυνθέτουν όπως τα φυτά. Τα πράγματα γίνονται ακόμη πιο πολύπλοκα με τους ιούς, οι οποίοι δεν διαθέτουν κυτταρική οργάνωση και επομένως δεν μπορούν να χαρακτηριστούν «οργανισμοί». Τα ελεύθερα στη φύση τεμαχίδια ενός ιού είναι αδρανή δομικά στοιχεία, - 26 -
ανίκανα να αναπαραχθούν, τα οποία αποκτούν ιδιότητες ζωντανού συστήματος και μπορούν να πολλαπλασιαστούν μόνον εάν βρεθούν μέσα σε ζωντανά κύτταρα κατάλληλου ξενιστή. Χαρακτήρες ΦΥΤΑ ΖΩΑ Πηγή ενέργειας Χλωροφύλλη Αποθησαυριστικές ουσίες Αυτονομία κίνησης Κυτταρικά τοιχώματα Αύξηση* Φως Ναι Άμυλο Όχι Ναι Συνεχής στο μερίστωμα Έτοιμες οργανικές ουσίες Όχι Γλυκογόνο, Λίπος Ναι Όχι Πεπερασμένη * Η αύξηση στα ζώα συντελείται στην εμβρυακή φάση και οδηγεί στον σχηματισμό του ώριμου ατόμου, το τελικό μέγεθος του οποίου εξαρτάται από το είδος του ζώου. Αντίθετα, τα φυτά διατηρούν εμβρυικούς (μεριστοματικούς) ιστούς καθ όλη τη διάρκεια της ζωής τους. Πίνακας 2.2 Κύριοι χαρακτήρες διαφοροποίησης φυτών και ζώων. Οι δυσκολίες αυτές κατάταξης των μικροοργανισμών στο παραδοσιακό σχήμα των δύο βασιλείων, οδήγησαν τον Γερμανό Δαρβινιστή Ernst Haeckel (1834-1919) να προτείνει το 1866 ένα τρίτο βασίλειο, το βασίλειο Πρώτιστα, στο οποίο συμπεριλάμβανε τα πρωτόζωα, τα φύκη και τους μύκητες. Το σχήμα του Haeckel περιελάμβανε μόνο τους ευκαρυωτικούς μικροοργανισμούς. Για τον λόγο αυτό, ο Herbert F. Copeland (1938) αρχικά και ο Robert H. Whittaker (1959) αργότερα, πρότειναν να υποδιαιρεθούν τα Πρώτιστα σε δύο υποβασίλεια: τα προκαρυωτικά πρώτιστα ή Μονήρη, και τα Πρωτόκτιστα ή Πρώτιστα για τους ευκαρυωτικούς μικροοργανισμούς. Εικόνα 2.1 Τα πέντε βασίλεια των οργανισμών. - 27 -
Το ευρέως αποδεκτό σήμερα εξελικτικό σχήμα του Whittaker διαφοροποιεί τους οργανισμούς σε πέντε βασίλεια (Εικ. 2.1): Μονήρη (Monera), Πρώτιστα (Protista), Φυτά (Plantae), Ζώα (Animalia) και Μύκητες (Fungi), και διακρίνει τρία επίπεδα οργάνωσης. Το προκαρυωτικό (άθροισμα Μονήρη), το ευκαρυωτικό μονοκύτταρο (άθροισμα Πρώτιστα) και το ευκαρυωτικό πολυπύρηνο-πολυκύτταρο (αθροίσματα: Φυτά, Μύκητες και Ζώα). Στο κάθε επίπεδο διακρίνονται επίσης τρεις κύριες διαφοροποιήσεις ως προς τον τρόπο θρέψης: ο φωτοσυνθετικός, ο ωσμότροφος και ο πεπτικός. Οι τρεις διατροφικοί τύποι αναπτύσσονται κατά τρόπο συνεχή κατά μήκος των πολυάριθμων εξελικτικών γραμμών στα Πρώτιστα. Στο πολυπύρηνοπολυκύτταρο επίπεδο οι τρεις διατροφικοί τύποι καταλήγουν σε τρεις εντελώς διαφορετικές μορφές οργάνωσης οι οποίες χαρακτηρίζουν τα τρία παραδοσιακά ανώτερα αθροίσματα (βασίλεια), αυτά των Φυτών, των Μυκήτων και των Ζώων (Εικ. 2.1). Αν και το σύστημα των πέντε βασιλείων του Whittaker έχει αναγνωρισθεί και είναι σε χρήση, το σύστημα των «τριών βασιλείων» που ακολουθεί εκφράζει ίσως την πραγματική εικόνα των σχέσεων που υπάρχουν μεταξύ των μικροοργανισμών. Μετά την ανακάλυψη του κόσμου των Αρχαίων (Archaea) από τους Carl Woese και Ralf S. Wolfe το 1977, ακολούθησαν πολλές έρευνες που εδραίωσαν την άποψη ότι στον πλανήτη μας η ζωή αντιπροσωπεύεται από τρεις κύριες ομάδες όντων: τα Βακτήρια, τα Αρχαία και τα Ευκάρυα. Δείχθηκε, επίσης, ότι τα Αρχαία έχουν μεγαλύτερες ομοιότητες (ως προς μοριακούς μηχανισμούς που χρησιμοποιούν) με τα Ευκάρυα παρά με τα Βακτήρια. Το εξελικτικό δενδρόγραμμα που απεικονίζεται παρακάτω (Εικ. 2.2) δείχνει σχηματικά τη σύγχρονη άποψη ως προς τις ατραπούς που ακολούθησε η εξέλιξη και οδήγησε στη διαμόρφωση των σημερινών τριών βασιλείων. Εικόνα 2.2 Η εξελικτική πορεία διαφοροποίησης των όντων σε τρία βασίλεια. Αν και το παραπάνω σύστημα των τριών βασιλείων θεωρείται σήμερα ότι βρίσκεται πιο κοντά στην πραγματικότητα, το σύστημα των πέντε βασιλείων εξακολουθεί να χρησιμοποιείται διότι είναι πιο κατανοητό και ευχερές, και επειδή υπάρχουν ακόμα αρκετά προβλήματα στην ανάπτυξη και χρήση του νέου συστήματος. 1.3. Μικροοργανισμοί Με τον όρο μικροοργανισμοί εννοούμε γενικά όλους τους οργανισμούς που δεν διακρίνονται με γυμνό μάτι. Σ αυτούς περιλαμβάνονται όλοι οι προκαρυωτικοί, δηλαδή τα βακτήρια και τα κυανοβακτήρια, καθώς και αρκετοί από τους ευκαρυωτικούς: τα πρωτόζωα, τα φύκη και οι μύκητες. Επιπρόσθετα, στους μικροοργανισμούς συγκαταλέγονται και οι ιοί, οι οποίοι όμως, όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, είναι ακυτταρικές δομές που δεν μπορούν να χαρακτηριστούν ως οργανισμοί. 1.3.1. Προκαρυωτικοί μικροοργανισμοί 1.3.1α. Βακτήρια (Bacteria) Τα βακτήρια είναι πολύ απλής κατασκευής και οργάνωσης. Δεν έχουν μορφολογικά σχηματισμένο πυρήνα, ούτε χλωροπλάστες. Οι διαστάσεις του κυττάρου των περισσοτέρων βακτηρίων κυμαίνεται από 1-3 μm. Το κυτταρικό σχήμα στα περισσότερα βακτήρια είναι καθορισμένο και σταθερό, μπορεί όμως ως ένα βαθμό να επηρεασθεί από τις συνθήκες ανάπτυξης. Βακτήρια με σφαιρικό σχήμα χαρακτηρίζονται κόκκοι (cocci), ενώ - 28 -
αυτά που έχουν σχήμα κυλινδρικό-ραβδοειδές βάκιλοι (rods). Το κύτταρο ορισμένων βακτηρίων εμφανίζεται συνεστραμένο σπειροειδώς κατά μήκος του άξονά του και χαρακτηρίζεται ως σπειρίλλιο (spirillium) (Εικ. 2.3). Το σχήμα του κυττάρου επηρεάζει οπωσδήποτε τη σταθερότητα και τη συμπεριφορά του. Έτσι, το σφαιρικό σχήμα έχει τη μικρότερη αναλογία επιφάνειας προς όγκο και προσδίδει στους κόκκους αντοχή στην αποξήρανση. Τα ραβδοειδή πάλι βακτήρια, λόγω της μεγαλύτερης επιφάνειας που έχουν σε σχέση με τον όγκο τους, προσλαμβάνουν θρεπτικά υλικά από αραιά διαλύματα ταχύτερα απ ότι οι κόκκοι. Από το άλλο μέρος, τα σπειρίλλια διαθέτουν αυτόνομη κίνηση, μετακινούνται περιστρεφόμενα ελικοειδώς, όπως προχωρεί μια βίδα, και έτσι αντιμετωπίζουν μικρότερη αντίσταση μέσα στο νερό συγκριτικά με τους βακίλους. Εικόνα 2.3 Μορφολογία βακτηριακών κυττάρων. Κατά την κυτταρική διαίρεση τα σχηματιζόμενα θυγατρικά κύτταρα συχνά παραμένουν ενωμένα μεταξύ τους. Η διάταξη του κυτταρικού σχηματισμού που προκύπτει μετά από μερικές διαιρέσεις είναι χαρακτηριστική τόσο του είδους του βακτηρίου όσο και του τύπου της διαίρεσης που ακολουθεί το βακτήριο. Πολλά βακτήρια σχήματος κόκκου μερίζονται κατά μήκος ενός μόνο άξονα και δημιουργούν αλυσίδες (π.χ. τα βακτήρια του γένους Streptococcus). Το μήκος των αλυσίδων αυτών μπορεί να κυμαίνεται από 2-4 κύτταρα, μέχρι και πάνω από 20. Αν οι διαιρέσεις των κυττάρων είναι τυχαίες και σε άξονες διαφόρων κατευθύνσεων, τότε δημιουργούνται ακανόνιστοι σχηματισμοί που μοιάζουν με τσαμπιά σταφύλια (π.χ. τα βακτήρια του γένους Staphylococcus). Οι βάκιλοι μερίζονται πάντοτε κατά μήκος ενός μόνο άξονα και επομένως σχηματίζουν μόνο αλυσίδες. Τα σπειροειδούς σχήματος βακτήρια μερίζονται επίσης σε ένα επίπεδο, αλλά κατά κανόνα τα θυγατρικά κύτταρα αποχωρίζονται μεταξύ τους και δεν σχηματίζουν αλυσίδες. 1.3.1β. Κυανοβακτήρια ή κυανοφύκη (blue-green bacteria) Τα κυανοβακτήρια ή κυανοφύκη αποτελούν μια ιδιαίτερη κατηγορία φωτοσυνθετικών βακτηρίων (Εικ. 2.4). Περιέχουν χλωροφύλλη-α σε καλά οργανωμένες φωτοσυνθετικές μεμβρανικές δομές (θυλακοειδή) στο εσωτερικό του κυττάρου, γι αυτό και έχουν την ικανότητα να φωτοσυνθέτουν απελευθερώνοντας οξυγόνο. Κάτω από αναερόβιες συνθήκες επιτελούν ζύμωση, ενώ πολλά είδη είναι αζωτοδεσμευτικά. Αν και η φωτοσύνθεση είναι χαρακτηριστική λειτουργία των ευκαρυωτικών φυτικών κυττάρων, τα κυανοβακτήρια είναι τυπικοί προκαρυωτικοί οργανισμοί, στερούνται δηλαδή πυρήνα και άλλων υποκυτταρικών οργανιδίων. - 29 -
Εικόνα 2.4 Κυανοβακτήρια του γένους Nostoc. Πρόκειται για τυπικό εκπρόσωπο των κυανοφυκών που σχηματίζει νηματοειδείς αποικίες. Διακρίνετε τα διαφορετικά είδη κυττάρων. Τα κυανοβακτήρια ζουν ελεύθερα ως μεμονωμένα κύτταρα ή σχηματίζουν αποικίες. Ανάλογα με το είδος και τις περιβαλλοντικές συνθήκες τα κυανοβακτήρια σχηματίζουν νηματοειδείς αποικίες πάχους ενός κυττάρου ή σφαιρικές αποικίες. Σε πολλές νηματοειδείς αποικίες διακρίνονται τρία διαφορετικά είδη κυττάρων (Εικ. 2.4): τυπικά βλαστικά κύτταρα (η πλειοψηφία των κυττάρων), ακινητοσπόρια (ελλειψοειδή κύτταρα γεμάτα τροφή για περιόδους έλλειψης) και ετεροκύστεις (κυτταρικές δομές με παχιά τοιχώματα που σπάζουν όταν τα νήματα διαχωρίζονται κατά την αναπαραγωγή/πολλαπλασιασμό των κυττάρων). Όλα τα είδη των κυανοβακτηρίων που σχηματίζουν ετεροκύστεις είναι αζωτοδεσμευτικά, καθώς οι ετεροκύστεις περιέχουν το απαραίτητο για τη δέσμευση του αζώτου ένζυμο. Τα κυανοβακτήρια αναπαράγονται με διχοτόμηση (σχάση) των μητρικών κυττάρων σε δύο θυγατρικά κύτταρα, τα οποία αυξανόμενα λαμβάνουν το μέγεθος του μητρικού τους κυττάρου. 1.3.2. Ευκαρυωτικοί μικροοργανισμοί Στους ευκαρυωτικούς μικροοργανισμούς συγκαταλέγονται τα πρωτόζωα, τα φύκη και οι μύκητες. Στη συνέχεια ακολουθεί μια σύντομη περιγραφή ορισμένων αντιπροσωπευτικών ευκαρυωτικών μικροοργανισμών που θα παρατηρήσετε στην άσκηση αυτή. 1.3.2α. Η αμοιβάδα (Amoeba) Η αμοιβάδα (σαρκώδες πρωτόζωο) είναι ένας απλός μονοκύτταρος ευκαρυωτικός οργανισμός που ανήκει στο βασίλειο των Πρωτίστων. Ζει στα γλυκά νερά, έχει σχετικά μεγάλο μέγεθος (μόλις που διακρίνεται με γυμνό μάτι) και χαρακτηρίζεται από την έλλειψη σταθερής μορφής (Εικ. 2.5). Πράγματι, η έλλειψη κυτταρικού τοιχώματος ή άλλου περιβλήματος όχι μόνο δεν δίνει σταθερό σχήμα στον οργανισμό, αλλά του επιτρέπει να σχηματίζει παροδικές προεκβολές του κυτταροπλάσματος, τα ψευδοπόδια. Ο σχηματισμός των ψευδοποδίων προσδίνει στον οργανισμό μια ατελείωτη ποικιλία συνεχώς εναλλασσόμενων μορφών. Με τα ψευδοπόδια η αμοιβάδα μπορεί και κινείται. Ειδικότερα, το κυτταρόπλασμα στην αμοιβάδα αποτελείται από δύο μέρη: ένα εσωτερικό λεπτόρρευστο, το ενδόπλασμα, κι ένα επιφανειακό παχύρρευστο, το εξώπλασμα. Το ενδόπλασμα κυλάει προς το σημείο όπου εξαιτίας κάποιου περιβαλλοντικού ερεθίσματος (π.χ. φωτός, χημικής ουσίας ή κάποιας επαφής) αρχίζει ο σχηματισμός ενός ψευδοποδιού. Στην περιοχή αυτή, μέρος του ενδοπλάσματος μετατρέπεται σε εξώπλασμα για να καλύψει τα πλευρικά τοιχώματα του νεοσχηματιζόμενου ψευδοποδιού. Στην πίσω πλευρά της αμοιβάδας συμβαίνει ακριβώς το αντίθετο, δηλαδή εξώπλασμα μετατρέπεται σε ενδόπλασμα. Η αργή, οπωσδήποτε όμως χαρακτηριστική, αυτή κίνηση ονομάζεται αμοιβαδοειδής κίνηση (Εικ. 2.6) και παρατηρείται σε αρκετά πρωτόζωα, καθώς και σε λευκά κύτταρα του αίματος. Σε μοριακό επίπεδο, η διαδικασία αυτή φαίνεται να έχει βασικές ομοιότητες με τη σύσπαση των μυϊκών κυττάρων. - 30 -
Εικόνα 2.5 Μικροσκοπική (400Χ) και σχηματική απεικόνιση αμοιβάδας. Εικόνα 2.6 Διαδραστική απεικόνιση της αμοιβαδοειδούς κίνησης. Χάρη στα ψευδοπόδια η αμοιβάδα μπορεί ακόμη να συλλαμβάνει την τροφή της, που την αποτελούν συνήθως μικρότεροι οργανισμοί, π.χ. βακτήρια και μονοκύτταρα φύκη. Τα ψευδοπόδια περικυκλώνουν την τροφή για να την κλείσουν τελικά σε ένα πεπτικό κενοτόπιο (ενδοκυττάρωση). Η τροφή θα διασπαστεί στη συνέχεια σε απλούστερες ενώσεις που θα χρησιμοποιηθούν σε βιοσυνθετικές πορείες, ενώ τα αδιάσπαστα υπολείμματα θα αποβληθούν στο εξωτερικό περιβάλλον με τη διαδικασία της εξωκυττάρωσης. Η αμοιβάδα είναι υποχρεωμένη να διατηρεί ένα εσωτερικό περιβάλλον με πολύ μεγαλύτερη συγκέντρωση διαλυμένων ουσιών από ότι το εξωτερικό της περιβάλλον. Κάτι τέτοιο θα ήταν αδύνατον χωρίς την ύπαρξη ενός ομοιοστατικού μηχανισμού που θα απομάκρυνε το νερό, αφού νερό θα έμπαινε διαρκώς στο εσωτερικό του οργανισμού εξαιτίας του φαινομένου της ώσμωσης, ο οποίος θα φούσκωνε συνεχώς μέχρι που τελικώς θα έσπαζε. Ο ομοιοστατικός αυτός μηχανισμός είναι τα σφυγμώδη κενοτόπια που γεμίζουν σταδιακά με την περίσσεια νερού, για να την αδειάσουν κάποια στιγμή έξω από το κύτταρο. Το γέμισμα του σφυγμώδους κενοτόπιου με νερό απαιτεί ενέργεια, γι αυτό και η μεμβράνη των κενοτοπίων αυτών περιβάλλεται από πολυάριθμα μιτοχόνδρια (Εικ. 2.5). 1.3.2β. Το Paramecium Το βλεφαριδοφόρο αυτό πρωτόζωο περιβάλλεται από ελαστικό χιτινώδες περίβλημα που του προσδίδει σταθερό σχήμα (Εικ. 2.7). Η ύπαρξη του περιβλήματος αυτού επιβάλλει επιπλέον και διαφορετικό τρόπο κίνησης και πρόσληψης της τροφής από εκείνον της αμοιβάδας. Το Paramecium κινείται με τη βοήθεια βλεφαρίδων, μικρών δηλαδή κυτταροπλασματικών τριχιδίων που καλύπτουν ολόκληρη την εξωτερική του επιφάνεια. Η κίνησή του είναι περιστροφική. Οι βλεφαρίδες συνδέονται μεταξύ τους και στη βάση τους με ένα πολύπλοκο δίκτυο από ινίδια ώστε οι κινήσεις τους να είναι συντονισμένες. - 31 -
Εικόνα 2.7 Μικροσκοπική (400Χ) και σχηματική απεικόνιση του Paramecium. Το Paramecium παίρνει την τροφή του μέσα από ένα άνοιγμα του εξωτερικού περιβλήματος, το κυτταρόστομα. Σ αυτό βοηθούν οι βλεφαρίδες που βρίσκονται γύρω από το κυτταρόστομα και οι οποίες παλλόμενες δημιουργούν δίνη. Η τροφή οδηγείται στη συνέχεια στον κυτταροφάρυγγα, στο άκρο του οποίου σχηματίζονται πεπτικά κενοτόπια που την περικλείουν. Μετά την πέψη της τροφής, τα αδιάσπαστα υπολείμματα αποβάλλονται από ένα άλλο μικρό άνοιγμα, την κυτταροπηγή (Εικ. 2.7). Το Paramecium διαθέτει δύο πυρήνες, έναν μακροπυρήνα που ρυθμίζει γενικά τον μεταβολισμό του κυττάρου και έναν μικροπυρήνα που συμμετέχει στην αμφιγονική αναπαραγωγή. 1.3.2γ. Η Euglena Ο μονοκύτταρος αυτός ευκαρυωτικός μικροοργανισμός (Εικ. 2.8) αποτέλεσε σημείο αμφισβητήσεων ανάμεσα σε βοτανικούς και ζωολόγους και ζωντανή απόδειξη του πόσο εξασθενημένες παρουσιάζονται οι παραδοσιακές έννοιες «φυτό» και «ζώο» στο μικροσκοπικό τουλάχιστον επίπεδο. Πράγματι, είναι δύσκολο να πει κανείς με σιγουριά αν πρόκειται για φύκος ή για πρωτόζωο. Από τη μια διαθέτει χλωροπλάστες, φωτοσυνθέτει και αποθηκεύει έναν πολυσακχαρίτη που μοιάζει πολύ με το άμυλο των ανώτερων φυτών, το παράμυλο. Από την άλλη, δεν περιβάλλεται από κυτταρικό τοίχωμα ενώ διαθέτει μαστίγιο (όργανο κίνησης) με τη βοήθεια του οποίου κολυμπάει. Η ιστορία φαίνεται να περιπλέκεται περισσότερο καθώς έχει βρεθεί ότι κάτω από την επίδραση ορισμένων περιβαλλοντικών παραγόντων (π.χ. υψηλή θερμοκρασία, υπεριώδης ακτινοβολία) η Euglena χάνει τους χλωροπλάστες της και μετατρέπεται από αυτότροφο σε ετερότροφο οργανισμό, τρέφεται δηλαδή με έτοιμες οργανικές ουσίες που προσλαμβάνει από το περιβάλλον. Είναι πιθανό ότι από οργανισμούς σαν την Euglena μπορεί να προήλθαν τελικά οι φυτικοί και οι ζωικοί οργανισμοί. Η Euglena διαθέτει ένα φωτοευαίσθητο οργανίδιο, την οπτική κηλίδα, που βρίσκεται κοντά στο μαστίγιο έτσι ώστε να ρυθμίζεται η κίνηση του οργανισμού ανάλογα με την κατεύθυνση και την ένταση των φωτεινών ερεθισμάτων που δέχεται (Εικ. 2.8). Εικόνα 2.8 Μικροσκοπική (400Χ) και σχηματική απεικόνιση της Euglena. Παρατηρήστε το μαστίγιο με τη βοήθεια του οποίου κινείται ο οργανισμός αυτός. - 32 -
1.3.2δ. Τα Διάτομα (Diatomeae) Πρόκειται για μονοκύτταρα φύκη που ζουν μονήρη ή σχηματίζουν κοινόβια σε υγρά εδάφη με γλυκά ή αλμυρά νερά. Αποτελούν το κυριότερο μέρος το φυτοπλαγκτού. Το κυτταρικό τους τοίχωμα που αποτελείται κυρίως από πηκτίνη, περιέχει σε μεγάλη αναλογία διοξείδιο του πυριτίου (SiO 2 ). Από αυτό σχηματίζεται μια ισχυρή θήκη που αποτελείται από δύο μέρη που εφαρμόζουν το ένα μέσα στο άλλο (επιθήκη και υποθήκη) σαν ένα τρυβλίο Petri. Τα κελύφη τους φέρουν πολλές ποικιλόμορφες θηλές, γραμμές κ.α., εξαιρετικά διακοσμητικές που τα κάνουν εντυπωσιακά στη μικροσκοπική παρατήρηση (Εικ. 2.9). Από τα κελύφη τους σχηματίστηκε διαμέσου των γεωλογικών αιώνων η «γη των διατόμων» που χρησιμοποιείται σαν μονωτικό υλικό και σαν ηθμός. Εικόνα 2.9 Μορφές διατόμων (αριστερά) και σχηματική παράσταση θήκης διατόμου (δεξιά). 1.3.2ε. Οι ζύμες Οι ζύμες ή ζυμομύκητες (yeasts) ανήκουν σε μια ευρύτερη κατηγορία οργανισμών, τους μύκητες (fungi), που περιλαμβάνει οργανισμούς όπως οι μούχλες (molds) και τα μανιτάρια (mushrooms). Είναι μύκητες που δεν σχηματίζουν μυκήλιο. Οι ζύμες είναι μικροί μονοκύτταροι και μονοπύρηνοι ευκαρυωτικοί οργανισμοί που παρουσιάζουν, όπως άλλωστε και όλοι οι μύκητες, ανάμεικτα τα χαρακτηριστικά του φυτικού και ζωικού κυττάρου, όπως κυτταρικό τοίχωμα και χυμοτόπια από τη μια, έλλειψη φωτοσυνθετικών χρωστικών από την άλλη. Χαρακτηριστικός είναι ο τρόπος μονογονικής αναπαραγωγής τους με εκβλάστηση (Εικ. 2.10). Το κυτταρικό τοίχωμα, δηλαδή, μιας ζύμης λεπταίνει σε ένα σημείο του, όπου και αρχίζει ο σχηματισμός ενός εξογκώματος. Συγχρόνως, ο πυρήνας του κυττάρου διαιρείται μιτωτικά κι ο ένας από τους δύο θυγατρικούς πυρήνες περνάει στο νεοδημιουργούμενο κύτταρο. Όταν το τελευταίο μεγαλώσει αρκετά χωρίζεται από το πατρικό με τον σχηματισμό κυτταρικού τοιχώματος. Τα δύο κύτταρα μπορούν να αποχωριστούν ή και να παραμείνουν ενωμένα (Εικ. 2.11). - 33 -
Εικόνα 2.10 Διαδραστική αναπαράσταση των σταδίων εκβλάστησης ζυμομυκήτων του γένους Saccharomyces. Εικόνα 2.11 Μικροσκοπική παρατήρηση σταδίων εκβλάστησης ζυμομυκήτων του γένους Saccharomyces. Πολλοί από τους ετερότροφους αυτούς μικροοργανισμούς παρουσιάζουν ιδιαίτερο εμπορικό και οικονομικό ενδιαφέρουν (π.χ. Saccharomyces cerevisiae), καθώς φέρουν σε πέρας την αλκοολική ζύμωση, δηλαδή, τη βασική βιοχημική αντίδραση κατά την παραγωγή οινοπνεύματος (κρασί, μπύρα κ.λπ.). Κατά την αλκοολική ζύμωση παράγεται επίσης CO 2, εξαιτίας του οποίου παρατηρείται το «φούσκωμα» του ψωμιού. 2. Πρακτικό μέρος 2.1. Κατάλογος εφοδίων 2.1.1. Συσκευές φωτονικό μικροσκόπιο, επωαστικός κλίβανος (37 ο C), καμινέτο. 2.1.2. Υλικά μόνιμα παρασκευάσματα, αντικειμενοφόροι, καλυπτρίδες, - 34 -
σταγονόμετρα, διηθητικό χαρτί, βελόνες ανατομίας, μικροβιολογικοί κρίκοι, λαβίδες, αιώρημα γιαουρτιού, αιώρημα μαγιάς, καλλιέργειες μυκήτων σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα, μουχλιασμένο ψωμί και φρούτα, στάσιμο νερό. 2.1.3. Διαλύματα χρωστική κυανού του μεθυλενίου (Methylen Blue), (υδατικό διάλυμα 3%), χρωστική κρυσταλλικό ιώδες (Crystal violet), χρωστική σαφρανίνη. 2.2. Πειραματική διαδικασία 2.2.1. Παρατήρηση προκαρυωτικών οργανισμών 2.2.1α. Παρατήρηση Βακτηρίων σε μόνιμο παρασκεύασμα Σε μόνιμο παρασκεύασμα βακτηρίων (χρώση κατά Gram) θα παρατηρήσετε (1000Χ) τους τρεις βασικούς τύπους των βακτηρίων (βλέπε Εικ. 2.3): Τους κόκκους, που είναι πολύ μικροί, σφαιρικοί, μεμονωμένοι ή διπλοί (διπλόκοκκοι) ή σε αλυσίδες (στρεπτόκοκκοι) ή πολλοί μαζί ενωμένοι (σταφυλόκοκκοι). Τους βακίλους, που μοιάζουν με μικρά ραβδιά, κυλινδρικά, μεμονωμένα ή πολλά μαζί στη σειρά (στρεπτοβάκιλοι). Τα σπειρίλλια, που είναι πολύ μεγαλύτερα από τα άλλα βακτήρια και έχουν σπειροειδή μορφή. Απεικονίστε παρακάτω τους διάφορους τύπους βακτηριακών κυττάρων που παρατηρείτε. Κόκκοι Βάκιλοι Σπειρίλλια 2.2.1β. Χρώση και παρατήρηση Βακτηρίων σε νωπό υλικό Θα παρατηρήσετε βακτήρια σε αιώρημα ξινισμένου γιαουρτιού αφού προηγουμένως βάψετε το παρασκεύασμα που θα φτιάξετε. Σε μια καθαρή αντικειμενοφόρο πλάκα μεταφέρεται με ένα μικροβιολογικό κρίκο ή με την άκρη της βελόνας σας μια μικρή ποσότητα αραιωμένου γιαουρτιού, ώστε να σχηματιστεί μία λεπτή στοιβάδα. Αφήστε την αντικειμενοφόρο να στεγνώσει στον αέρα και μετά περάστε τη 3-4 φορές πάνω από τη φλόγα ενός καμινέτου. Μετά από την κατεργασία αυτή η πλάκα θα πρέπει να είναι ζεστή όχι όμως καυτή! Με τον τρόπο αυτό τα βακτήρια σκοτώνονται αλλά και στερεοποιούνται επάνω στην πλάκα. - 35 -
Ρίξτε 1-2 σταγόνες χρωστικής (π.χ. κυανού του μεθυλενίου, κρυσταλλικό ιώδες ή σαφρανίνη) επάνω στην πλάκα και αφήστε τη για 2-3 λεπτά, περίπου. Στη συνέχεια, ξεπλύνετε με νερό ώστε να μη βγαίνει άλλη χρωστική και στεγνώστε με διηθητικό χαρτί, χωρίς όμως να σκουπίσετε την πλάκα. Παρατηρήστε με μεγάλη μεγέθυνση (1000Χ), και χωρίς να χρησιμοποιήσετε καλυπτρίδα, τις διάφορες μορφές των βακτηρίων. 2.2.1γ. Παρατήρηση Κυανοβακτηρίων (κυανοφύκη) Σε μόνιμο παρασκεύασμα θα παρατηρήσετε (400Χ) τη δεύτερη σημαντική κατηγορία προκαρυωτικών οργανισμών, τα κυανοβακτήρια, και συγκεκριμένα το αζωτοδεσμευτικό κυανοφύκος Nostoc. Παρατηρήστε τις νηματοειδείς αποικίες που σχηματίζει το Nostoc (τα κύτταρα μοιάζουν με χάντρες σε κομπολόι) και διακρίνετε τις ετεροκύστεις (βλέπε Εικ. 2.4). Απεικονίστε 2-3 νήματα τοποθετώντας ενδείξεις και συγκρίνετε το μέγεθος των προκαρυωτικών κυττάρων με το μέγεθος των ευκαρυωτικών που θα παρατηρήσετε στη συνέχεια. Κυανοφύκος Nostoc 2.2.2. Παρατήρηση ευκαρυωτικών μικροοργανισμών 2.2.2α. Πρωτόζωα Σε μόνιμα παρασκευάσματα θα παρατηρήσετε δύο χαρακτηριστικά Πρωτόζωα: την Αμοιβάδα και το Paramecium. Παρατηρήστε κάθε οργανισμό προσεκτικά, χρησιμοποιώντας αντικειμενικό φακό 40Χ. Απεικονίστε με λεπτομέρεια τους δύο οργανισμούς και τοποθετήστε ενδείξεις. Amoeba proteus Paramecium - 36 -
2.2.2β. Φύκη Σε μόνιμα παρασκευάσματα θα παρατηρήσετε χαρακτηριστικά μονοκύτταρα Φύκη, όπως η Euglena και τα Διατόμα. Παρατηρήστε την Euglena και προσπαθήστε να εντοπίσετε το μαστίγιο που χρησιμοποιεί για την κίνησή της, τον πυρήνα και την οπτική κηλίδα. Από τη μεγάλη ποικιλία μορφών Διατόμων που θα δείτε, θα διαλέξετε να απεικονίσετε δύο χαρακτηριστικά Διάτομα από τις δύο μεγάλες ομάδες των Pennatae και των Centricae. Τα Pennatae είναι συνήθως επιμήκη, με το πολύ δύο άξονες συμμετρίας, ενώ τα Centricae είναι συνήθως σφαιρικά, τετράγωνα κ.α., με περισσότερους από δύο άξονες συμμετρίας. Euglena viridis Diatomeae 2.2.3. Παρατήρηση μυκήτων 2.2.3α. Ζυμομύκητες (Saccharomyces cerevisiae) Οι ζυμομύκητες (ζύμες) έχουν μορφή σφαιρική ή ελλειψοειδή και συχνά τους βλέπουμε με εκβλαστήσεις (βλέπε Εικ. 2.11). Θα τους παρατηρήσετε σε μαγιά που χρησιμοποιείται στην αρτοποιία, η οποία έχει προηγουμένως αραιωθεί με νερό και τοποθετηθεί σε κλίβανο θερμοκρασίας 37 ο C για 24 ώρες. Ετοιμάζετε μόνοι σας το παρασκεύασμα, παίρνοντας μια σταγόνα από το αιώρημα των σακχαρομυκήτων με την άκρη της βελόνας σας, ή αραιώνοντάς το μέσα σε μια σταγόνα αποσταγμένου νερού που έχετε βάλει επάνω σε μία καθαρή αντικειμενοφόρο πλάκα. Παρατηρήστε τις εκβλαστήσεις των κυττάρων και σχεδιάστε δυο-τρεις σακχαρομύκητες με εκβλαστήσεις. Saccharomyces - 37 -
2.2.3β. Μυκηλιακοί μύκητες Θα παρατηρήσετε μυκηλιακούς μύκητες (μύκητες που σχηματίζουν υφές) του γένους Penicillium (Εικ. 2.12) και Aspergillus (Εικ. 2.13). Εικόνα 2.12 Ο μυκηλιακός μύκητας του γένους Penicillium. Μικροσκοπική (100Χ) παρατήρηση του μύκητα (α) και λεπτομέρεια (400Χ) των κονιδιοφόρων με τα σπόρια (β). Παρατηρήστε τους κονιδιοφόρους σε σχήμα χρωστήρα. Εικόνα 2.13 Ο μυκηλιακός μύκητας του γένους Aspergillus. Μικροσκοπική (100Χ) παρατήρηση του μύκητα (α) και λεπτομέρειες (400Χ) των κονιδιοφόρων με τα σπόρια (β) και των υφών που σχηματίζει ο μύκητας (γ). Οι μύκητες αναπτύχθηκαν σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα μέσα σε τρυβλία Petri που θα βρείτε στον πάγκο σας. Ετοιμάζετε μόνοι σας τα παρασκευάσματα παίρνοντας με την άκρη της βελόνας σας μια μικρή ποσότητα μυκηλίων από τις αποικίες των μυκήτων, την οποία θα απλώσετε καλά σε μια σταγόνα νερού που έχετε βάλει επάνω σε μία καθαρή αντικειμενοφόρο πλάκα. Σκεπάστε με καλυπτρίδα και παρατηρήστε το παρασκεύασμα σε μεγέθυνση 10Χ και 40Χ. Παρατηρήστε τις υφές και τους κονιδιοφόρους με τα κονίδια (σπόρια). Απεικονίστε το παρασκεύασμα τοποθετώντας ενδείξεις. Μπορείτε να επαναλάβετε τη διαδικασία χρησιμοποιώντας υλικό από μουχλιασμένα τρόφιμα, όπως ψωμί ή φρούτα. - 38 -
Γένος Penicillium Γένος Aspergillus 2.2.4. Παρατήρηση μικροοργανισμών σε στάσιμα νερά Φτιάξτε ένα προσωρινό παρασκεύασμα χρησιμοποιώντας μία σταγόνα από στάσιμα νερά. Παρατηρήστε τους μικροοργανισμούς καθώς και την κίνησή τους. Σχεδιάστε και περιγράψτε μερικούς από αυτούς. - 39 -
2.3. Παρατηρήσεις.. Συνιστώμενη βιβλιογραφία 1. Campbell, N. A., & Reece, J. B. (2010). Βιολογία. Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο Κρήτης. ISBN: 978-960-524-305-0. 2. Mader, S. S., & Windelspecht Μ. (2013). Inquiry into Life (14 th /e), Εκδόσεις McGraw Hill, New York. ISBN-13: 978-0073525525. 3. Καμάρη, Γ., & Τηνιακού, Α. (1993). Εργαστηριακές ασκήσεις μορφολογίας φυτών. Τμήμα Βιολογίας, Εργαστήριο Βοτανικής, Πανεπιστήμιο Πατρών, Πάτρα. - 40 -