Επιβίωση των παθογόνων µικροοργανισµών Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus & Salmonella Enteritidis στα παραδοσιακά αλλαντικά ζυµώσεως Γουναδάκη 1 Α., Σωτηρόπουλος 1 Χ., ροσινός Ε.Χ, Μεταξόπουλος Ι., & Νυχάς 1 Γ-Ι.Ε. 1 Εργαστήριο Μικροβιολογίας & Βιοτεχνολογίας Τροφίµων, και Εργαστήριο Ποιοτικού Ελέγχου & Υγιεινής Τροφίµων και Ποτών, Τµήµα Επιστήµης & Τεχνολογίας Τροφίµων, Γεωπονικό Πανεπιστήµιο Αθηνών, Ιερά Οδός 75 Βοτανικός, 118 55 Αθήνα, Ε-mail: gjn@aua.gr Περίληψη Τα αλλαντικά αέρος είναι από τα πλέον διαδεδοµένα ζυµούµενα αλλαντικά στον χώρο της ελληνικής αλλαντοβιοµηχανίας. Στην παρούσα µελέτη τεµάχια αλλαντικού αέρος τύπου Θάσου ενοφθαλµίστηκαν µε στελέχη των παθογόνων µικροοργανισµών Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus και Salmonella Enterititis, συσκευάστηκαν σε πλαστικούς περιέκτες και συντηρήθηκαν σε θερµοκρασίες ο C και 5 ο C υπό αερόβιες συνθήκες για 5 ηµέρες, µε σκοπό τον προσδιορισµό της επίδρασης της θερµοκρασίας στην επιβίωσή τους στο προϊόν. Η απαρίθµηση των παθογόνων Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus και Salmonella Enterititis πραγµατοποιήθηκε µε εξάπλωση οµογενοποιηµένου δείγµατος πάνω στην επιφάνεια των θρεπτικών µέσων PALCAM, Baird-Parker και XLD, αντίστοιχα Οι πληθυσµοί των L. monocytogenes και S. αureus, µειώθηκαν σε µη-ανιχνεύσιµα επίπεδα (<100 cfu/g) κατά την διάρκεια του χρόνου συντήρησης των τεµαχισθέντων προϊόντων. Στην υψηλή θερµοκρασία συντήρησης (5 ο C) παρατηρήθηκε µεγαλύτερος ρυθµός καταστροφής των παθογόνων συγκριτικά µε την χαµηλότερη θερµοκρασία συντήρησης ( ο C). Ο πληθυσµός της S. Enterititis µειώθηκε κατά την συντήρηση σε θερµοκρασία 5 ο C, αλλά επιβίωσε κατά την συντήρηση σε θερµοκρασία ο C. Ο συνδυασµός της χαµηλής τιµής του ph (.-.), η παρουσία της ανταγωνιστικής χλωρίδας (γαλακτικά βακτήρια) και η διατήρηση των τεµαχισµένων αλλαντικών σε θερµοκρασία ψυγείου ( ο C) ή θερµοκρασία δωµατίου (5 ο C) επέδρασαν συνεργιστικά στον έλεγχο της αύξησης της L. monocytogenes και του S. αureus. Η επιβίωση της σαλµονέλλας σε συνθήκες ψύξης αξίζει να προσεχθεί ιδιαιτέρως. Λέξεις ευρετηρίασης: Ζυµούµενα αλλαντικά, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella Εnterititis. Survival of Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus and Salmonella Enterititis on fermented sausages Gounadaki 1 Α., Sotiropoulos 1 C., Drosinos Ε., Metaxopoulos J., & Nychas 1 G.J 1 Laboratoty of Food Microbiology and Biotechnology and Laboratory of Food Quality Control and Hygiene, Department of Food Science & Technology, Agricultural University of Athens, 75 Iera Odos St, Athens-Votanikos, GR-118 55, Email: gjn@aua.gr. ABSTRACT Among the dry fermented sausages produced in Greece, fermented sausages is probably the most important product for the Greek sausages manufacture. The objective of this study was to evaluate the survival of Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus and Salmonella Enterititis in sliced fermented sausages stored at different temperatures. Listeria monocytogenes, S. aureus or S.Enterititis was inoculated onto the surface of sliced fermented sausages. Inoculated slices were placed into sterile bags and left open to mimic air conditions. The packages were stored at or 5 o C for 5 days. All foodborne pathogens were reduced in fermented sausages during storage at both temperatures. The lower storage temperature ( o C) resulted in significantly slower decline of S.aureus, or L. monocytogenes, compared to storage at higher temperature (5 o C). On the other hand, Salmonella Enterititis was found to survive at o C over the period of storage among the three-foodborne pathogens. The low ph and the presence of lactic acid bacteria in fermented sausages may explain the death rate of foodborne pathogens during the storage at refrigeration or abuse temperatures. Keywords: Dry Fermented Sausage, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella Enterititis. 1
ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ζύµωση και ξήρανση, είναι πιθανόν οι αρχαιότερες µέθοδοι συντήρησης του κρέατος (Incze 1998). Η παρουσία παρεµποδιστικών παραγόντων όπως το χαµηλό ph, χαµηλή ενεργότητα νερού, προσθήκη οργανικών οξέων, αλάτων και η παρουσία φυσικών αντιµικροβιακών ουσιών καθιστά τα ζυµούµενα αλλαντικά ασφαλή προς κατανάλωση (Chikthimmah και Knabel 001). Παρόλα αυτά, η παρουσία παθογόνων µικροοργανισµών όπως Staphylococcus aureus, Salmonella Enterititis και Listeria monocytogenes έχουν αναφερθεί στην βιβλιογραφία (Arkoudelos και συν. 1997, Chikthimmah και Knabel 001). Η παραγόµενη ποσότητα των ζυµούµενων αλλαντικών εκτιµάται στους 10000 τόνους ετησίως, είναι από τα πλέον διαδεδοµένα προϊόντα στον χώρο της ελληνικής αλλαντοποιίας (Ανώνυµος 1995). Ενώ κατά το παρελθόν η παραγωγή αλλαντικών ζυµώσεως στηριζόταν στις αγροτικές οικογένειες και λάµβανε µέρος κυρίως κατά την περίοδο των Χριστουγέννων, σήµερα, ζυµούµενα αλλαντικά παράγονται από τα αλλαντοποιεία καθόλη τη διάρκεια του χρόνου (Papadima και συν. 1999). Ο βασικός τρόπος παρασκευής παραµένει κοινός σε αρκετές περιοχές της Ελλάδας, ενώ η χρήση διαφορετικών συστατικών κατά περιοχή, όπως µπαχαρικά, κρασί, ξύδι, ζάχαρη, τα διαφοροποιεί ελαφρώς. Το αλλαντικό τύπου Θάσου παρασκευάζεται µε βάση το χοιρινό κρέας και την χρήση διαφόρων µπαχαρικών. Η ενθήκευση του µείγµατος σε φυσικές θήκες (έντερο) µπορεί να αποβεί σηµαντική εστία µίανσης των προϊόντων µε παθογόνους µικροοργανισµούς. Η διάρκεια της ζύµωσης, είναι γνωστό ότι µπορεί να µειωθεί σηµαντικά µε την παρουσία ορισµένων βακτηρίων που είτε αποτελούν τα µέλη της µικροβιακής κοινότητας του κρέατος, είτε έχουν προστεθεί για να επιταχύνουν τη διαδιακασία µετατροπής της νωπής µάζας κρέατος σε βρώσιµη (Nychas και Arkoudelos 1990). Στη χώρα µας εργασίες που αφορούν την επιβίωση παθογόνων µικροοργανισµών σε ζυµούµενα αλλαντικά υπάρχουν σε περιορισµένη έκταση, σε αντίθεση µε τις σχετικά πλούσιες βιβλιογραφικές πηγές για αντίστοιχα προϊόντα του εξωτερικού. Η έλλειψη τέτοιων στοιχείων γίνεται εξαιρετικά σηµαντική, επειδή πρόσφατη καταγραφή της θερµοκρασίας των οικιακών συσκευών ψύξης, αλλά και των αντίστοιχων ψυγείων στις υπεραγορές κατέδειξε την µεγάλη διακύµανση της θερµοκρασίας τους (3-15 C). Άλλοι παράγοντες που επιτείνουν την ανάγκη της παρούσας µελέτης, δηλαδή της συµπεριφορας των παθογόνων µικροοργανισµών στα ζυµούµενα αλλαντικά, είναι η καταγραφή της υπάρχουσας κατάστασης όσον αφορά την λανθασµένη µεταχείριση των προϊόντων από τον τελικό καταναλωτή, η οποία οδηγεί σε διακύβευση της υγιεινής των προϊόντων. Στόχος της παρούσας εργασίας είναι η µελέτη της επιβίωσης των τριών παθογόνων µικροοργανισµών: Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus και Salmonella Enterititis, σε τεµάχια ζυµούµενου αλλαντικού τύπου Θάσου κατά την διάρκεια συντήρησης τους σε θερµοκρασίες ο C και 5 ο C υπό αερόβιες συνθήκες για 5 ηµέρες. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Αλλαντικά Τα αλλαντικά που χρησιµοποιήθηκαν ήταν τύπου Θάσου, τα οποία παρασκευάζονται από αλλαντοποιία στο Νοµό Αττικής. Τα αλλαντικά τεµαχίστηκαν στον χώρο της αλλαντοβιοµηχανίας και µεταφέρθηκαν στο Εργαστήριο αυθηµερόν. Ενοφθαλισµός, συσκευασία και συντήρηση δειγµάτων Οι παθογόνοι µικροοργανισµοί Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus και Salmonella Enterititis, που χρησιµοποιήθηκαν για τον ενοφθαλµισµό των
αλλαντικών ανήκουν στην συλλογή του Εργαστηρίου Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίµων του Γεωπονικού Πανεπιστηµίου Αθηνών. Οι µικροοργανισµοί ανακαλλιεργήθηκαν δύο φορές σε ζωµό Tryptone Soya, 100ml (Merck), ο οποίος επωάστηκε, χωρίς ανάδευση, σε θερµοκρασία 30 ο C για 18h. Η τελευταία ανακαλλιέργεια φυγοκεντρήθηκε στις 10.000 στροφές/λεπτό σε θερµοκρασία ο C για 10 λεπτά. Η υπερκείµενη φάση αποµακρύνθηκε και ακολούθησε πλύση του ιζήµατος των κυττάρων µε αποστειρωµένο αλατούχο διάλυµα (0,85%). Ακολούθησε ανάδευση του ιζήµατος και επανάληψη της φυγοκέντρησης. Η παραπάνω διαδικασία επαναλήφθηκε δύο φορές για την αποµάκρυνση υπολειµµάτων θρεπτικού υλικού από τα κύτταρα. Ακολούθησε επαναιώρηση των κυττάρων σε κατάλληλο όγκο αποστειρωµένου διαλύµατος φυσιολογικού ορού. Ο ενοφθαλµισµός των τεµαχίων µε τα παθογόνα βακτήρια έγινε µε την επιφανειακή επίστρωση 0,5 ml ενοφθαλµίσµατος στην κάθε πλευρά του τεµαχίου. Τα ενοφθαλµισµένα τεµάχια αλλαντικού (έξι έως οκτώ τεµάχια, βάρους γραµµ. το καθένα) µεταφέρθηκαν ασηπτικά και συσκευάστηκαν σε πλαστικό περιέκτη. Για τη µελέτη της συµπεριφοράς του κάθε µικροοργανισµού, παρασκευάστηκαν τριάντα µονάδες συσκευασίες από τις οποίες 15 τοποθετήθηκαν σε θερµοκρασία ο C και οι υπόλοιπες σε θερµοκρασία 5 ο C. Απαρίθµηση µικροβιακού πληθυσµού Από κάθε µονάδα συσκευασίας ζυγίζονταν ασηπτικά 5 γραµµ σε πλαστικό περιέκτη οµογενοποίησης και προσθέτονταν 5 ml πεπτονούχου υδατικού διαλύµατος και οµογενοποιούνταν για 1 λεπτό, σε θερµοκρασία περιβάλλοντος, σε οµογενοποιητή τ. Stomacher (lab Blender 00, Seward Medical, London). Ακολουθούσε παρασκευή διαδοχικών δεκαδικών αραιώσεων µε µεταφορά 1 ml δείγµατος προηγούµενης αραίωσης σε 9 ml διαλύµατος Ringer, οι οποίες χρησιµοποιήθηκαν για τον ενοφθαλµισµό των τριβλίων. Για την απαρίθµηση της L. monocytogenes ποσότητα 0,1 ml ενοφθαλµίζονταν µε την τεχνική της επιφανειακής εξάπλωσης στο επιλεκτικό υπόστρωµα PALCAM (Merck). Ακολουθούσε επώαση σε θερµοκρασία 30 ο C, για -8 h. Για τον προσδιορισµό του S. aureus, ποσότητα 0,1 ml ενοφθαλµίζονταν µε την τεχνική της επιφανειακής εξάπλωσης στο επιλεκτικό υπόστρωµα Βaird-Parker (Merck). Ακολουθούσε επώαση σε θερµοκρασία 37 ο C, για -8 h. Για τον προσδιορισµό της S. Εnterititis ποσότητα 0,1 ml ενοφθαλµίζονταν µε την τεχνική της επιφανειακής εξάπλωσης στο επιλεκτικό υπόστρωµα ξυλόζης, λακτόζης και δεοξυχολικού νατρίου (XLD, Merck). Ακολουθούσε επώαση σε θερµοκρασία 37 o C για h. Ύστερα από την ζύγιση της αναλυτικής µονάδας για την απαρίθµηση του µικροβιακού πληθυσµού ακολουθούσε η µέτρηση της τιµής του ph του προϊόντος κάθε µονάδας συσκευασίας µε πεχάµετρο (Russel, Model RL150). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Οι πληθυσµοί των παθογόνων L. monocytogenes και S. αureus µειώθηκαν σε µη-ανιχνεύσιµα επίπεδα (<100cfu/g) κατά την διάρκεια του χρόνου συντήρησης των τεµαχισµένων αλλαντικών σε θερµοκρασία o C και 5 o C. Η υψηλή θερµοκρασία συντήρησης (5 o C) έδειξε να επιταχύνει τον ρυθµό θανάτωσης των παθογόνων συγκριτικά µε την χαµηλότερη θερµοκρασία συντήρησης ( o C). Για την L. monocytogenes η τιµή D ήταν 8.18 ηµέρες σε θερµοκρασία o C και.55 ηµέρες σε θερµοκρασία 5 o C (σχήµα 1Α). Οµοίως για τον S. aureus, η τιµή D 3
ήταν.53 ηµέρες σε θερµοκρασία o C και.53 ηµέρες σε θερµοκρασία 5 o C (σχήµα 1Β). Ο πληθυσµός της S. Εnterititis µειώθηκε σε µη-ανιχνεύσιµα επίπεδο (<100 cfu/g) κατά την διάρκεια του χρόνου συντήρησης σε θερµοκρασία 5 o C, σε αντίθεση µε τα δείγµατα που συντηρήθηκαν σε θερµοκρασία o C στα οποία ο µικροοργανισµός παρουσίασε µείωση της τάξης των log και επιβίωσε σε ανιχνεύσιµα επίπεδα έως το πέρας της συντήρησης των δειγµάτων. Για την S. Εnterititis η τιµή D ήταν 7.0 ηµέρες σε θερµοκρασία o C και.55 ηµέρες σε θερµοκρασία 5 o C (σχήµα 1Γ). Το χαµηλό ph του προϊόντος είναι ένας από τους κυριότερους παρεµποδιστικούς παράγοντες που αντιµετωπίζουν οι παθογόνοι µικροοργανισµοί στα ζυµούµενα αλλαντικά. Ο Sameshima και συν. (1998) αναφέρουν ότι η διαδεδοµένη χρήση των γαλακτικών βακτηρίων ως εκκινητών στην παραγωγή ζυµούµενων αλλαντικών, εκτός από την δράση τους στη βελτίωση των οργανοληπτικών ιδιοτήτων, στοχεύει στην παρεµποδιστική τους δράση στoν έλεγχο των µικροοργανισµών. Χαµηλές τιµές ph (,-,) σηµειώθηκαν και στα υπό εξέταση αλλαντικά. Παρόµοια αποτελέσµατα έχουν αναφερθεί στο ενοφθαλισµένο µε παθογόνους µικροοργανισµούς ζυµούµενο αλλαντικό τ. Lebanon bologna, όπου παρατηρήθηκε µείωση της L. monocytogenes κατά την διάρκεια της συντήρησης και επιβίωση της Salmonella Τyphimurium στον ίδιο χρόνο συντήρησης (Chikthimmah και Knabel 001). Η θερµοκρασία συντήρησης είναι ένας από τους κύριους παρεµποδιστικούς παράγοντες που αντιµετωπίζουν οι παθογόνοι µικροοργανισµοί σε τρόφιµα µε χαµηλό ph. Ο Ellajosyula και συν. (1998) παρατήρησαν την ισχυρή παρεµποδιστική δράση του χαµηλού ph και των υψηλών θερµοκρασιών στην αύξηση των παθογόνων µικροοργανισµών. Η παρούσα µελέτη έδειξε την δραστική µείωση των παθογόνων µικροοργανισµών σε τεµάχια ζυµούµενου αλλαντικού κατά την συντήρηση του σε υψηλή θερµοκρασία. Επίσης, η εργασία καταδεικνύει την ανάγκη για συστηµατικούς µικροβιολογικούς ελέγχους καθόλη την διάρκεια της παραγωγής των ζυµούµενων αλλαντικών. Η χρήση ορθών κανόνων υγιεινής, η εφαρµογή του συστήµατος HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points) και νοµοθετικών ρυθµίσεων για τη διασφάλιση της υγιεινής των τροφίµων πρέπει να εφαρµόζονται κατά την παραγωγή, την µεταφορά, την διανοµή, την συντήρηση και την µεταχείριση κατά την πώληση και την κατανάλωση.
A 8 0 0 10 0 30 0 Πληθυσµός παθογόνων (log10 cfu/g προϊόντος) Γ B 8 0 8 0 10 0 30 0 0 0 10 0 30 0 ιάρκεια συντήρησης σε ηµέρες ΣΧΗΜΑ 1. Συµπεριφορά των µικροοργανισµών L. monocytogenes (Α), S. aureus (Β), και S. Εnterititis (Γ) σε τεµάχια αλλαντικού αέρος σε θερµοκρασίες διατήρησης ο C ( ) και 5 ο C( ). 5
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Anonymous (1995) The Greek meat Industry, COMETT-AGROSPEK, Agricultural Bank of Greece. Arkoudelos JS, Nychas GJE, Samaras F (1997) The occurrence of staphylococci on Greek fermented sausages, Fleischwirtscaft, 77:571-57. Chikthimmah N, Knabel SJ (001) Survival of Escherichia coli 0157:H7, Salmonella Typhimurium, and Listeria monocytogenes in and on Vacuum packaged Lebanon Bologna stored at 3, and 13 o C, J Food Prot, :958-93. Ellajosyula KR, Doores S, Mills EW, Wilson RA, Anantheswaran RC, Knabel SJ (1998) Destruction of Escherichia coli 0157:H7 and Salmonella Typhimuriumin Lebanon bologna by interaction of fermentation ph, heating temperature and time, J Food Prot, 1:15-157. Incze K (1998) Dry fermented sausages, Meat Sci, 9:S19-S177. Metaxopoulos J, Genigiorgis C, Fanelli MJ, Franti C, Cosma E (1981) Production of Italian dry salami, II: effect of starter culture and chemical acidulation on staphylococcal growth in salami under commercial manufacturing conditions, Appl Env Microbiol, :83-871. Metaxopoulos J, Samelis J, Papadelli M (001) Technological and microbiological evaluation of traditional processes as modified for the industrial manufacturing of dry fermented sausage in Greece, Ital J Food Sci,13:-3-18. Nychas GJE and Arkoudelos JS (1990) Microbiological and physicochemical changes of minced meat under carbon dioxide, nitrogen or air at 3 0 C, Int J Food Technol, 5:389-398. Papadima SN, Arvanitoyannis I, Bloukas JG, Fournitzis GC (1999) Chemometric model for describing Greek traditional sausages, Meat Sci, 51:71-77. Sameschima T, Magone C, Takeshita K, Arihara K, Itoh M, Kondo Y (1998) Effect of intestinal Lactobacillus starter cultures on the behaviour of Staphylococcus aureus in fermented sausage, Int J Food Microbiol, 1:1-7.