ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή: Γεώργιος Βογιατζής Χρήστος Κοντογιάννης Μαλβίνα Όρκουλα - ΠΑΤΡΑ 2008 -

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Αργύριος Νοχός ΑΜ:194 Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή Γεώργιος Βογιατζής Χρήστος Κοντογιάννης Μαλβίνα Όρκουλα - ΠΑΤΡΑ 2008 -

Ευχαριστίες Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στα πλαίσια του μεταπτυχιακού προγράμματος του τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών υπό την επίβλεψη του αναπληρωτή καθηγητή του ιδίου τμήματος, Χρήστου Κοντογιάννη, κατά την διάρκεια των ετών 2006-2008. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κύριο Κοντογιάννη για την καθοριστική βοήθειά του καθώς και τον ρ. Γεώργιο Βογιατζή, κύριο ερευνητή του ερευνητικού ινστιτούτου ΙΤΕ/ΕΙΧΗΜΥΘ για την πολύτιμη καθοδήγησή του στην διεξαγωγή του πειραματικού μέρους αλλά και της συγγραφής της παρούσας εργασίας. Επιπλέον πρέπει να ευχαριστήσω τους συναδέλφους ρ. Σοφία Οικονομοπούλου, ρ. Amaia Soto, Αναστάσιο Μανίκα, Νικόλαο Χουρδάκη, Γεωργία Τσούκλερη, Ιωάννη Καραμπά, Νικόλαο Ζωητό, Έφη Βόγλη, και ρ. Βασίλη ρακόπουλο για την βοήθεια που προσέφερε ο καθένας στην ερευνητική μου δραστηριότητα. Τέλος οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στους γονείς μου Βάγια και Νίκο για την ανεκτίμητη υποστήριξή τους κατά την διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών. Αργύριος Νοχός

Περίληψη Η παρούσα εργασία μελετά την ανάπτυξη ενός ευέλικτου συστήματος αντιμικροβιακής προστασίας για εφαρμογή σε είδη ρουχισμού και υφάσματα οικιακής χρήσης. Πιο συγκεκριμένα αναπτύχθηκαν διασυνδεδεμένα πολυμερικά νανοσφαιρίδια πολυστυρολίου-διβινυλοβενζολίου στα οποία ενσωματώθηκε Triclosan, μία ευρέος φάσματος εμπορική αντιμικροβιακή ουσία. Σημειώνεται ότι στο πλαίσιο ανάσχεσης των ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων η ανάπτυξη αντιμικροβιακών νοσοκομειακών στολών, σεντονιών και άλλων σχετικών κλωστοϋφαντουργικών προϊόντων αποτελούν τις τελευταίες δεκαετίες αντικείμενο έντονου επιστημονικού ενδιαφέροντος. Το μέγεθος των νανοσωματιδίων βρέθηκε μετά από εξέταση με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM) και δυναμική σκέδαση φωτός (DLS) να κυμαίνεται μεταξύ 35-350 nm ανάλογα την σύσταση. H θερμική συμπεριφορά τους μελετήθηκε μέσω διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης (DSC) και διαπιστώθηκε σημείο τήξεως στους ~425 ο C. Χρησιμοποιώντας την φασματοσκοπία UV- Vis προσδιορίστηκε ο πραγματικός εγκλωβισμός του αντιμικροβιακού στο σύστημα κατά μέσο όρο σε ποσοστό ~72% του ονομαστικού και παρακολουθήθηκε ο ρυθμός αποδέσμευσης του σε διαλύματα αιθανόλης-νερού. Επιπλέον, τα σφαιρίδια που όπως διαπιστώθηκε παρουσιάζουν χαρακτηριστικά ελεγχόμενης αποδέσμευσης ενσωματώθηκαν σε μήτρες πολυπροπυλενίου οι οποίες υπό την μορφή φιλμ εφελκύστηκαν μονοαξονικά. Τέλος κάνοντας χρήση της δονητικής φασματοσκοπίας Raman εκτιμήθηκε ο μοριακός προσανατολισμός που επιβλήθηκε στα εφελκυσμένα φιλμ και συσχετίσθηκε με την παρατηρούμενη μείωση που επιτεύχθηκε στην κινητική αποδέσμευσης της εγκλωβισμένης δραστικής ουσίας. Το πρώτο κεφάλαιο της παρούσας εργασίας ασχολείται με το πρόβλημα της μικροβιακής επιμόλυνσης υφασμάτων, τις διάφορες λύσεις που έχουν προταθεί κατά καιρούς και τέλος αναλύει τον στόχο της παρούσας εργασίας. Στο δεύτερο κεφάλαιο επεξηγείται η έννοια της ελεγχόμενης αποδέσμευσης και περιγράφονται οι διάφορες κατηγορίες συστημάτων ελεγχόμενης χορήγησης μαζί με χαρακτηριστικά παραδείγματα. Τα νανοσωματίδια, η σύστασή, οι μοναδικές ιδιότητες, οι εφαρμογές και οι διάφοροι τρόποι σύνθεσης και χαρακτηρισμού τους συζητούνται στο τρίτο κεφάλαιο. Το τέταρτο κεφάλαιο αναφέρει πληροφορίες για τα υλικά και επεξηγεί τις τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν στην σύνθεση, την επεξεργασία και τον χαρακτηρισμό των νανοσωματιδίων και των μιγμάτων τους. Τέλος στο πέμπτο κεφάλαιο παρουσιάζονται τα αποτελέσματα των πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν και ακολουθεί ο σχολιασμός τους.

Abstract The present thesis studies the development of a versatile system of antimicrobial protection for use in clothing and household products. In particular Triclosan incorporated crosslinked polystyrenedinylbenzene nanobeads were developed; triclosan is a widely used antimicrobial agent. It is noted that the health hazards arising during nosocomial treatment due to infections caused by microbial pathogens and the means to protect oneself against such threats have become the subject of many research activities during the last few decades. The size of the nanoparticles after examination with scanning electron microcopy (SEM) and dynamic light scattering (DLS) was found to vary between 35-350 nm depending on the system formulation. Their thermal behavior was studied with differential scanning calorimetry (DSC) and their melting point was measured at ~425 o C. Using UV-Vis spectroscopy the real encapsulation efficiency of the antimicrobial in the system was determined at ~72% and its release kinetics were studied in a water-ethanol solution. The nanobeads possess controlled release properties; they were furthermore incorporated into polypropylene matrixes which were uniaxially drawn in film form. Finally utilizing polarized Raman spectra, the draw induced molecular orientation of the films was correlated to the relevant variation of the related antimicrobial release kinetics. The first chapter of the present thesis reviews the textile microbial infections and the various solutions that have been proposed showing up the specific research goal targeted. In the second chapter the meaning of controlled release is explained and the basic system categories involved are presented along with characteristic examples. The nanoparticles, their composition, special attributes, applications, synthesis and characterization techniques are the subject of the third chapter. The fourth chapter reports information about the materials and the methods used in the synthesis, postprocessing and characterization of the nanoparticles and their blends. Finally the last chapter presents the experimental results and relevant comments.

Περιεχόμενα Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή 1 1.1 Ανάγκη για αντιμικροβιακά υφάσματα 1 1.2 Προαπαιτήσεις για την ανάπτυξη αντιμικροβιακών υφασμάτων 3 1.3 Σύγχρονες μέθοδοι παραγωγής αντιμικροβιακών υφασμάτων 4 1.4 Αντιμικροβιακές ουσίες με χρήση σε υφάσματα 5 1.5 Σκοπός 7 Κεφάλαιο 2 Θεωρία ελεγχόμενης αποδέσμευσης 11 2.1 Εισαγωγή 11 2.1.1 Εφαρμογή της ελεγχόμενης αποδέσμευσης στην φαρμακευτική επιστήμη 12 2.2 Κατηγορίες συστημάτων ελεγχόμενης αποδέσμευσης 15 2.2.1 Συστήματα προκαθορισμένου ρυθμού αποδέσμευσης 16 2.2.2 Συστήματα ενεργοποιούμενης αποδέσμευσης 18 2.2.3 Συστήματα στα οποία η αποδέσμευση ελέγχεται από μηχανισμό ανάδρασης 19 2.2.3.α Συστήματα αποδέσμευσης ρυθμιζόμενα μέσω βιοδιάσπασης 20 2.2.3.β Βιοαποκρινόμενα συστήματα αποδέσμευσης 21 2.2.3.γ Αυτό-ρυθμιζόμενα συστήματα αποδέσμευσης 22 2.2.4 Συστήματα στόχευσης 23 2.3 Επίδραση του μοριακού προσανατολισμού στον ρυθμό αποδέσμευσης δραστικών 25 ουσιών από ένα πολυμερικό πλέγμα Κεφάλαιο 3 Νανοσωματίδια 27 3.1 Εισαγωγή 27 3.1.1 Η ευέλικτη δομή των νανοσωματιδίων 29 3.1.2 Χρησιμοποιούμενα υλικά 30 3.1.3 Άλλες εφαρμογές 31 3.2 Τεχνικές παρασκευής νανοσωματιδίων 32 3.2.1 Γαλακτωματοποίηση με εξάτμιση του διαλύτη 33 3.2.2 Παραγωγή νανοσωματιδίων από φυσικά μακρομόρια 35 3.2.3 Πολυμερισμός γαλακτώματος 37 3.2.3.1 Κατηγοριοποίηση γαλακτωμάτων με βάση το μέγεθος 38 3.2.3.2 Σταθερότητα γαλακτωμάτων 39 3.2.3.3 Γαλακτοματοποιητές 41 3.2.3.4 Συν-σταθεροποιητές 42 3.2.4 Έλεγχος χαρακτηριστικών των νανοσωματιδίων 43 3.2.5 Επιλογή και σχεδιασμός της μεθόδου παρασκευής 44 3.3 Χαρακτηρισμός νανοσωματιδίων 44 3.3.1 Μέτρηση του Ζ-δυναμικού 45 3.3.2 Μέτρηση του μεγέθους 48 Κεφάλαιο 4 Υλικά και μέθοδοι 51 4.1 Χρησιμοποιούμενα υλικά 51 4.1.1 Triclosan 51 4.1.2 Πολυστυρόλιο 52 4.1.3 Πολυπροπυλένιο 54 4.1.4 Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 56 4.1.5 Εξαδεκάνιο (Hexadecane) 57

4.2 Τεχνικές παρασκευής και κατεργασίας δειγμάτων 57 4.2.1 Πειραματική πορεία 57 4.2.2 Αντίδραση πολυμερισμού γαλακτώματος 59 4.2.3 Λυοφιλοποίηση 60 4.2.4 Άλεση Μύλος σφαιριδίων 63 4.2.5 Ανάμειξη πολυμερούς-νανοσφαιριδίων 63 4.2.6 Μορφοποίηση σε Φιλμ 64 4.2.7 Εφελκυσμός 65 4.3 Τεχνικές χαρακτηρισμού 66 4.3.1 Προσδιορισμός του Triclosan με φασματοσκοπία απορρόφησης UV-Vis 66 4.3.2 Διερεύνηση του ποσοστού εγκλωβισμού της δραστικής ουσίας 67 4.3.3 Μελέτη της Αποδέσμευσης 68 4.3.3.α Φασματομετρία Μοριακής Απορρόφησης στο Υπεριώδες/Ορατό (UV/Vis) 70 4.3.4 Μορφολογική μελέτη 74 4.3.4.α Ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM) 74 4.3.4.β Δυναμική σκέδαση φωτός (DLS) 75 4.3.5 Διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης (DSC) 76 4.3.6 Τεχνικές εξέτασης αντιμικροβιακής δράσης 78 4.3.7 Φασματοσκοπία Raman 79 4.3.7.α Εισαγωγή στη φασματοσκοπία Raman 79 4.3.7.β Ανίχνευση μοριακού προσανατολισμού 84 μέσω της φασματοσκοπίας Raman 4.3.7.γ Πειραματικές διάτάξεις 86 Κεφάλαιο 5 Αποτελέσματα και συζήτηση 89 5.1 Σύσταση και χαρακτηριστικά των συστημάτων που μελετήθηκαν 89 5.2 Ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM) 91 5.3 Δυναμική σκέδαση φωτός (DLS) 94 5.4 Διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης (DSC) 96 5.5 Φασματοσκοπία Raman 100 5.5.1 Χαρακτηρισμός των νανοσφαιριδίων με Triclosan 100 5.5.2 Μελέτη του μοριακού προσανατολισμού των φιλμ PP-νανοσωματιδίων 101 5.6 Ποσοστό εγκλωβισμού 103 5.7 Μελέτες αποδέσμευσης 104 5.8 Εξέταση αντιμικροβιακής δράσης 109 5.9 Σχόλια και συζήτηση 112 5.10 Συμπεράσματα 114 Βιβλιογραφία 117

1 Κεφάλαιο 1 - Εισαγωγή Είτε πρόκειται για προστατευτικές στολές είτε για αθλητικά είδη ένδυσης, η καταναλωτική ζήτηση των υφασμάτων με αντιμικροβιακές ιδιότητες αυξάνει ραγδαία. Στο κεφάλαιο αυτό αναλύονται οι σύγχρονες μέθοδοι παρασκευής βιοκτόνων (ή και βιοστατικών) υφασμάτων και παρουσιάζεται ο σκοπός της παρούσας εργασίας. 1.1 Ανάγκη για αντιμικροβιακά υφάσματα Τις τελευταίες δεκαετίες παρατηρείται ένα ολοένα και αυξανόμενο ενδιαφέρον για τους κινδύνους κατά της υγείας που ανακύπτουν κατά την νοσοκομειακή περίθαλψη εξαιτίας μικροβιακών μολύνσεων. Έχει αναφερθεί μάλιστα ανησυχητική αύξηση των νοσοκομειακών μολύνσεων, ειδικά αυτών που προκαλούνται από ανθεκτικά στα αντιβιοτικά βακτηρίδια. Εκτιμάται πως τέτοιου είδους μολύνσεις προσβάλουν το 5% των ασθενών που νοσηλεύονται παγκοσμίως. Συνέπεια των παραπάνω μελετών είναι η συνεχής αναζήτηση τρόπων προστασίας ενάντια σε τέτοιες μικροβιακές απειλές με μια από τις δημοφιλέστερες λύσεις να είναι η ανάπτυξη αντιμικροβιακών υφασμάτων για χρήση σε προστατευτικά είδη ρουχισμού, ιατρικές γάζες, νοσοκομειακά σεντόνια και αρκετά άλλα καταναλωτικά είδη [1]. Είναι γνωστό πως τα υφάσματα αποτελούν ένα υπόστρωμα κατάλληλο για ανάπτυξη μικροοργανισμών, όπως βακτήρια και μύκητες. Τέτοιου είδους μικροοργανισμοί συναντιούνται σχεδόν παντού στο περιβάλλον και πολλαπλασιάζονται ραγδαία όταν συναντήσουν τις κατάλληλες συνθήκες όπως υγρασία, θρεπτικά συστατικά και σχετικά υψηλή θερμοκρασία. Οι περισσότερες

Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή 2 συνθετικές ίνες, εξαιτίας της υψηλής υδροφοβικότητάς τους, παρουσιάζουν κάποια ανθεκτικότητα στις επιθέσεις μικροοργανισμών. Αντίθετα οι πρωτεΐνες και τα οι υδατάνθρακες που συνήθως περιέχονται στις φυσικές ίνες (πχ. βαμβάκι) μπορούν να δράσουν ως θρεπτικό υλικό και πηγή ενέργειας δημιουργώντας έτσι πρόσφορο έδαφος για ανάπτυξη μικροβίων. Τον ίδιο ακριβώς ρόλο μπορούν να παίξουν το χώμα, η σκόνη, ο ιδρώτας που συσσωρεύονται στις ίνες καθώς και ορισμένα υλικά επίστρωσης σε αυτές. Εικόνα 1.1 - Τα προϊόντα που προσφέρουν αντιμικροβιακή προστασία είναι πλέον μέρος της καθημερινότητάς μας και περιλαμβάνουν αθλητικά είδη, είδη οικιακής χρήσης όπως σεντόνια, προστατευτικές στολές για επαγγελματίες όπως γιατροί και ερευνητές, συσκευασίες τροφίμων και φαρμάκων καθώς και ειδικές βαφές διαφόρων χρήσεων [2,3,4,5]. Η ανάπτυξη των μικροοργανισμών στα υφάσματα προκαλεί μια σειρά από ανεπιθύμητες επιπτώσεις όχι μόνο στο ίδιο το ύφασμα αλλά και στον χρήστη. Οι επιπτώσεις αυτές περιλαμβάνουν την ανάπτυξη δυσοσμίας, λεκέδων, τον αποχρωματισμό του υφάσματος, την υποβάθμιση της μηχανικής αντοχής του υλικού καθώς και αυξημένη πιθανότητα επιμόλυνσης του χρήστη τους. Για όλους τους παραπάνω λόγους απαιτείται η προστασία των υφασμάτων από την εμφάνιση μικροοργανισμών κατά την χρήση και αποθήκευσή τους.

3 Κεφάλαιο 1 - Εισαγωγή Λόγω της μεγάλης καταναλωτικής ζήτησης τα αντιμικροβιακά προϊόντα ήδη καλύπτουν ένα σημαντικό μερίδιο της παγκόσμιας αγοράς ρουχισμού. Εκτιμάται πως η παραγωγή αντιμικροβιακών υφασμάτων άγγιζε τους 30.000 τόνους στην Δυτική Ευρώπη και τους 100.000 παγκοσμίως το έτος 2000. Επιπλέον η παραγωγή τους αυξανόταν περισσότερο από 15% ετησίως από το έτος 2000 μέχρι το 2005 στην Δυτική Ευρώπη, τοποθετώντας την στους ταχύτερα αναπτυσσόμενους τομείς της αγοράς υφασμάτων. Υπολογίζεται πως το 85% των αντιμικροβιακών υφασμάτων που παράγονται είναι αθλητικά είδη, κάλτσες και εσώρουχα ενώ το υπόλοιπο 15% συμπληρώνεται από υφάσματα εξωτερικής χρήσης (πχ. τεντόπανα), φίλτρα αέρα, επενδύσεις αυτοκινήτων και υφάσματα ιατρικών εφαρμογών. Η ζήτηση αυτή έχει με την σειρά της συγκεντρώσει μεγάλο επιστημονικό ενδιαφέρον καθώς τα τελευταία χρόνια έχει προκύψει ένας μεγάλος αριθμός δημοσιεύσεων και πατεντών πάνω στο αντικείμενο των αντιμικροβιακών υφασμάτων [6]. 1.2 Προαπαιτήσεις για την ανάπτυξη αντιμικροβιακών υφασμάτων Προκειμένου να επιτευχθεί το μέγιστο όφελος, το ιδανικό αντιμικροβιακό ύφασμα πρέπει να πληροί ορισμένες βασικές προϋποθέσεις. Καταρχήν θα πρέπει να είναι αποτελεσματικό σε ένα ευρύ φάσμα βακτηρίων και μυκήτων ενώ ταυτόχρονα θα πρέπει να είναι πλήρως ασφαλές για τους καταναλωτές (να μην προκαλεί αλλεργία, τοξικότητα ή άλλου είδους ενόχληση). Πριν την διάθεσή τους προς κατανάλωση τα προϊόντα που έχουν δεχθεί αντιμικροβιακή προστασία πρέπει να ικανοποιούν κάποια διεθνή πρότυπα συμβατότητας (κυτοτοξικότητας, ερεθισμού και ευαισθητοποίησης). Επιπλέον η αντιμικροβιακή ουσία που θα ενσωματωθεί στα υφάσματα θα πρέπει να είναι ανθεκτική στο πλύσιμο, το στεγνό καθάρισμα και το σιδέρωμα. Αυτή είναι και η μεγαλύτερη πρόκληση, καθώς ένα τέτοιο ύφασμα θα πρέπει να διατηρήσει την βιοκτόνο/βιοστατική ιδιότητά του μετά από τα συχνά πλυσίματα στα οποία θα υποβληθεί κατά την διάρκεια της ζωής του. Μία ακόμη σημαντική προϋπόθεση για τα παραπάνω προϊόντα είναι πώς η αντιμικροβιακή τους επεξεργασία δεν πρέπει να υποβαθμίζει την ποιότητα (πχ. φυσική αντοχή) αλλά ούτε και την εμφάνιση του τελικού υφάσματος. Επιπροσθέτως, η διαδικασία προσθήκης του βιοκτόνου/βιοστατικού θα πρέπει να είναι συμβατή με τις συνήθεις χημικές

Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή 4 επεξεργασίες των υφασμάτων όπως η βαφή και η αδιαβροχοποίηση, να είναι οικονομικά συμφέρουσα και να μην παράγει επικίνδυνα απόβλητα για τον παρασκευαστή ή το περιβάλλον. Ένας ακόμη παράγοντας που πρέπει να ληφθεί υπόψη όσον αφορά στο αντιμικροβιακό πρόσθετο στο ύφασμα είναι πως δεν πρέπει να εξαλείφει την φυσική χλωρίδα των μη παθογόνων βακτηρίων που κατοικούν στην επιφάνεια του δέρματος. Ο μεγάλος αυτός αριθμός βακτηρίων είναι σημαντικός για την υγεία του δέρματος καθώς χαμηλώνουν το επιφανειακό ph παράγοντας ένα δυσμενές περιβάλλον για την ανάπτυξη παθογόνων μικροοργανισμών. Οι μέχρι στιγμής έρευνες δείχνουν πως τα υφάσματα που φέρουν βιοκτόνες/βιοστατικές ουσίες απλώς μειώνουν την πυκνότητα της χλωρίδας του δέρματος χωρίς να την εξαλείφουν τελείως. Τέλος, αρκετά από τα αντιμικροβιακά που χρησιμοποιούνται σήμερα ως πρόσθετα σε υφάσματα έχουν αναφερθεί ως ύποπτα για αύξηση της ανθεκτικότητας των μικροοργανισμών σε παρόμοιες ουσίες ή ακόμη και ευρέως χρησιμοποιούμενα αντιβιοτικά. Είναι ένα ζήτημα που αξίζει να μελετηθεί διεξοδικά στο μέλλον καθώς προκειμένου να είναι αποτελεσματικές οι βιοκτόνες/βιοστατικές ουσίες προστίθενται στα υφάσματα σε μεγάλες περιεκτικότητες [6]. Συμπερασματικά, για κάθε νέο αντιμικροβιακά δραστικό ύφασμα που αναπτύσσεται και για κάθε ξεχωριστή εφαρμογή που αυτό προορίζεται πρέπει να καταγράφονται τα προτερήματα του και να βρίσκεται μια ισορροπία ανάμεσα στην αποτελεσματικότητα και τους πιθανούς κινδύνους που εγκυμονεί η χρήση του [7]. 1.3 Σύγχρονες μέθοδοι παραγωγής αντιμικροβιακών υφασμάτων Μια μεγάλη ποικιλία μεθόδων που εξαρτώνται από το δραστικό συστατικό και τον τύπο της ίνας έχουν αναπτυχθεί και συνεχίζουν να αναπτύσσονται τα τελευταία χρόνια με σκοπό να προσδώσουν αντιμικροβιακές ιδιότητες σε υφάσματα. Για τις συνθετικές ίνες η βιοκτόνος/βιοστατική ουσία μπορεί να ενσωματωθεί στις πολυμερικές ίνες πριν την παραγωγή τους μέσω εξώθησης (extrusion). Αυτού του είδους η επεξεργασία προσφέρει την βέλτιστη αντοχή στον χρόνο καθώς το δραστικό συστατικό βρίσκεται παγιδευμένο μέσα στην δομή της ίνας και αποδεσμεύεται αργά κατά την διάρκεια χρήσης του υφάσματος. Η παραπάνω μέθοδος παρασκευής έχει

5 Κεφάλαιο 1 - Εισαγωγή υιοθετηθεί από αρκετές εταιρίες και σύγχρονα εμπορικά παραδείγματά της αποτελούν οι πολυεστερικές ίνες Bioactive της Trevira που φέρουν άργυρο και οι ίνες κυτταρίνης (cellulose acetate) με ενσωματωμένο Triclosan της Novaceta με την εμπορική ονομασία Silfresh. Εναλλακτικά της ενσωμάτωσης χρησιμοποιείται η συμβατική μέθοδος της επικάλυψης (finishing) για προσθήκη αντιμικροβιακής δράσης σε συνθετικές αλλά και φυσικές ίνες, η οποία έχει εφαρμοστεί για βιοκτόνα όπως το Triclosan και το PHMB. Επικάλυψη μέσω ψεκασμού ή παραγωγής αφρού (foam finishing) έχει επιτευχθεί επίσης για το βασισμένο στο πυρίτιο αντιμικροβιακό quarternary AEM 5700. Αρκετές ακόμη τεχνικές έχουν αναφερθεί όπως η χρήση κολλοειδών διαλυμάτων νανομετρικής κλίμακας, μικροκαψιδίων με δεξαμενή αντιμικροβιακού ή ακόμη και εγκλωβισμό του δραστικού συστατικού σε κυκλικά μόρια όπως οι κυκλοδεξτρίνες. Τα παραπάνω μπορούν να ενσωματωθούν ή να χρησιμοποιηθούν ως επικάλυψη στο τελικό ύφασμα. Σε άλλες περιπτώσεις έχει επιτευχθεί η χημική τροποποίηση του δραστικού συστατικού προκειμένου να σχηματίζει ισχυρούς δεσμούς με την ίνα, αλλά και ο σχηματισμός δεσμών διασταύρωσης με την ίνα χρησιμοποιώντας έναν παράγοντα δικτύωσης (crosslinker). Τέλος μία πολλά υποσχόμενη μέθοδος είναι η τεχνική sol-gel, που επιτρέπει την παρασκευή υλικών με μεγάλη ποικιλία ιδιοτήτων (από κεραμικές ίνες μέχρι αεροπηκτώματα (aerogels)) και τελευταία διερευνάται εκτενώς για εφαρμογές επικάλυψης [6]. 1.4 Αντιμικροβιακές ουσίες με χρήση σε υφάσματα Αρκετά γνωστές αντιμικροβιακές ουσίες χρησιμοποιούνται σήμερα από την βιομηχανία υφασμάτων. Οι περισσότερες από αυτές έχουν δοκιμαστεί ως προς την αξιοπιστία τους για αρκετά χρόνια σε ένα μεγάλο πλήθος διαφορετικών εφαρμογών, από συντηρητικά τροφίμων και απολυμαντικά σαπούνια μέχρι και επιθέματα τραυμάτων. Τα κυριότερα αντιμικροβιακά που έχουν αναφερθεί να χρησιμοποιούνται ως σήμερα σε υφάσματα περιλαμβάνουν τον άργυρο, το triclosan, τα quartenary ammonium salts, το polyhexamethylene biguanide, τα regenerable N-halamine compounds, τα peroxyacids και φυσικές βαφές χιτοζάνης (λεπτομέρειες των εφαρμογών τους αναφέρονται στον πινακα 1.1). Όλες οι παραπάνω ουσίες χαρακτηρίζονται πλήρως ικανές για την καταπολέμηση μικροοργανισμών πάνω από

Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή 6 μία (καθορισμένη για κάθε αντιμικροβιακό) τιμή συγκέντρωσης που αναφέρεται ως ελάχιστη συγκέντρωση παρεμπόδισης (Minimum Inhibitory Concentration, MIC). Ωστόσο η διασπορά μιας βιοκτόνου ουσίας μέσα στις ίνες των υφασμάτων μειώνει σημαντικά τη δραστικότητά της και περιορίζει τη διαθεσιμότητά της. Αυτή η μείωση, σε συνδυασμό με την ενδεχόμενη απώλεια του βιοκτόνου από το ύφασμα μετά από κάποιους κύκλους πλύσεων επιβάλλουν την χρήση μεγάλων συγκεντρώσεων της δραστικής ουσίας στα παραγόμενα αντιμικροβιακά υφάσματα [6]. ΠΙΝΑΚΑΣ 1.1 Κάποια από τα εμπορικά αντιμικροβιακά που εφαρμόζονται ή διερευνούνται για εφαρμογή σε υφάσματα. Τα F και Ι στην στήλη 'τρόπος εφαρμογής' υποδεικνύουν εάν το αντιμικροβιακό αντίστοιχα χρησιμοποιήθηκε ως επικάλυψη (F, finishing) ή ενσωματώθηκε απευθείας στην ίνα (I, incorporated) [6]. Αντιμικροβιακή Oυσία Τύπος Ίνας Τρόπος Εφαρμογής Εμπορικά προιόντα; Άργυρος πολυεστέρας F/I Ναι nylon I Ναι μαλλί F Ναι Regenerated Cellulose F Ναι? QACs βαμβάκι F Ναι (π.χ. ΑΕΜ 5700) πολυεστέρας F Ναι nylon F Ναι μαλλί F Όχι PHMB βαμβάκι F Ναι πολυεστέρας F Ναι nylon F Ναι Triclosan πολυεστέρας F/I Ναι nylon F/I Ναι πολυπροπυλένιο I Ναι cellulose acetate I Ναι ακρυλικές ίνες I Ναι Chitosan βαμβάκι F Όχι πολυεστέρας F Όχι μαλλί F Όχι N-halamine βαμβάκι F Όχι πολυεστέρας F Όχι nylon F Όχι μαλλί F Όχι Peroxyacids βαμβάκι F Όχι πολυεστέρας F Όχι

7 Κεφάλαιο 1 - Εισαγωγή Η επιβίωση και ανάπτυξη ενός μικροοργανισμού βασίζεται στην ακεραιότητα του κυττάρου του και την ομαλή λειτουργία όλων των οργανιδίων του. Μια αντιμικροβιακή ουσία είτε παρεμποδίζει την ανάπτυξη τέτοιων μικροοργανισμών και ονομάζεται βακτηριοστατικό είτε τους εξοντώνει οπότε ονομάζεται βακτηριοκτόνο. Οι περισσότερες από τις δραστικές ουσίες που χρησιμοποιούνται στα εμπορικά αντιμικροβιακά υφάσματα υπάγονται στην κατηγορία των βακτηριοκτόνων (πχ. triclosan, άργυρος). Ο συνήθης τρόπος δράσης τους περιλαμβάνει την λύση της κυτταροπλασματικής μεμβράνης ή την μεταβολή της διαπερατότητάς της, το ξετύλιγμα σημαντικών για το κύτταρο πρωτεϊνών και ενζύμων ή την παρεμπόδιση της σύνθεσης λιπιδίων. Καθένας από τους παραπάνω τρόπους θα οδηγήσει τελικά στον θάνατο των μικροοργανισμών [6]. 1.5 Σκοπός Στόχος της παρούσας εργασίας είναι η ανάπτυξη ενός ευέλικτου συστήματος μεταφοράς μικροβιοκτόνων ουσιών που θα επιτρέπει την απευθείας ενσωμάτωσή τους σε συνθετικές ίνες/νήματα ή/και την επίστρωσή τους σε υφάσματα προσδίδοντας αντιμικροβιακή προστασία. Στην ουσία μιλάμε για την προσπάθεια ανάπτυξης νέου κλωστοϋφαντουργικού προϊόντος. Σε προηγούμενη εργασία του εργαστηρίου είχε επιτευχθεί μέσω πολυμερισμού αιωρήματος η σύνθεση πολυμερικών αντιμικροβιακών μικροσφαιριδίων (διαμέτρου περίπου 200-300 μικρομέτρων) με ιδιότητες ελεγχόμενης αποδέσμευσης [8, 57, 70]. Η παρούσα εργασία αποσκοπεί στην ενσωμάτωση διασυνδεδεμένων αντιμικροβιακών σφαιριδίων σε συνθετικές ίνες/νήματα. Το μέγεθος όμως των μικροσφαιριδίων που είχαν προηγουμένως αναπτυχθεί δεν επιτρέπει την ενσωμάτωσή τους σε συνθετικές ίνες νημάτων με συνήθη διάμετρο τα 16-18 μm. Σε μια προσπάθεια λοιπόν μείωσης των πολυμερικών σφαιριδίων κατά 2 με 3 τάξεις μεγέθους, διατηρώντας όμως όλες τις άλλες ιδιότητές τους, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική πολυμερισμού γαλακτώματος. Πιο συγκεκριμένα περιγράφεται η επιτυχημένη σύνθεση διασυνδεδεμένων νανοσωματιδίων πολυστυρολίου στα οποία έχει εγκλωβιστεί Triclosan, ένας από τους δημοφιλέστερους σήμερα ευρέος φάσματος αντιμικροβιακός παράγοντας. Η πολύ χαμηλή υδατοδιαλυτότητα του

Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή 8 Triclosan μεγιστοποιεί την παραμονή του στην οργανική φάση του γαλακτώματος επομένως και στα παραγόμενα σφαιρίδια, ενώ η ρύθμιση της ποσότητας του παράγοντα δικτύωσης (divinyl benzene) επιτρέπει τον έλεγχο της πυκνότητας των δεσμών διασταύρωσης και έμμεσα της ταχύτητας αποδέσμευσης της εγκλωβισμένης δραστικής ουσίας. Επιπλέον τα παραχθέντα αντιμικροβιακά νανοσωματίδια ενσωματώθηκαν σε πολυπροπυλένιο με ανάμειξη σε κατάσταση τήγματος, ενώ η μορφοποίηση του μίγματος σε φιλμ επέτρεψε τον μονοαξονικό εφελκυσμό τους. Ο μοριακός προσανατολισμός που επιτυγχάνεται στην πολυμερική μήτρα κατά τον εφελκυσμό συνιστά μια επιπλέον παράμετρο για τον έλεγχο του ρυθμού αποδέσμευσης του δραστικού συστατικού [9]. Στα αντιμικροβιακά νανοσφαιρίδια χρησιμοποιήθηκε η τεχνική δυναμικής σκέδασης φωτός για τον έλεγχο της κατανομής των μεγεθών τους, ενώ τα μίγματά τους με το πολυπροπυλένιο χαρακτηρίστηκαν ως προς την μορφολογία τους μέσω ηλεκτρονικής μικροσκοπίας και ως προς την σύστασή τους μέσω φασματοσκοπίας Raman και διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης. Τέλος χρησιμοποιήθηκε η φασματοσκοπία UV-Vis για την παρακολούθηση της κινητικής αποδέσμευσης του Triclosan από ελευθέρα νανοσφαιρίδια αλλά και εγκλωβισμένα σε εφελκυσμένα και ισοτροπικά φιλμ.

9 Κεφάλαιο 1 - Εισαγωγή Εικόνα 1.2 - Σχηματική αναπαράσταση του πολυμερικού αντιμικροβιακού συστήματος που προτείνεται για ενσωμάτωση σε ίνες υφασμάτων. Διακρίνεται (αριστερά) μια εργαστηριακή ποδιά στην οποία έχει εφαρμοστεί αντιμικροβιακή προστασία, ενώ μέσω διαδοχικών μεγεθύνσεων παρουσιάζεται η δομή των ινών (στο κέντρο) με ενσωματωμένα τα πολυμερικά νανοσωματίδια που φέρουν την βιοκτόνο ουσία (δεξιά).

Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή 10

11 Κεφάλαιο 2 Θεωρία Ελεγχόμενης Αποδέσμευσης Μια δραστική ουσία (είτε πρόκειται για φάρμακο είτε για αντιμικροβιακό) προκειμένου να επιφέρει το θεραπευτικό ή άλλου είδους προστατευτικό αποτέλεσμά της πρέπει με κάποιο τρόπο να βρεθεί στο σωστό μέρος, σε συγκεκριμένη δοσολογία και να παραμείνει εκεί για το απαιτούμενο χρονικό διάστημα. Εδώ ξεκινά η επιστήμη της ελεγχόμενης αποδέσμευσης ενεργών συστατικών την οποία θα μελετήσουμε στο συγκεκριμένο κεφάλαιο. 2.1 Εισαγωγή Η τεχνολογία της ελεγχόμενης αποδέσμευσης (controlled release) αποτελεί δημιούργημα σύμπραξης διαφόρων σύγχρονων επιστημών όπως η φαρμακευτική, η χημεία πολυμερών και η νανοτεχνολογία. Βασική της ιδέα είναι ο συνδυασμός (είτε πρόκειται για εγκλωβισμό είτε για σύνδεση) μιας δραστικής ουσίας με κατάλληλο πολυμερικό (συνήθως) φορέα και αποδέσμευσή της από τον τελευταίο με προκαθορισμένο ρυθμό (συνεχώς, κυκλικά ή μετά από απόκριση σε εξωτερικά ερεθίσματα) ώστε να μεγιστοποιείται η δράση της, τόσο σε ένταση όσο και σε διάρκεια χρόνου. Το σύστημα αποδέσμευσης όσον αφορά την σύστασή του μπορεί να αποτελείται από βιοδιασπώμενα, μη-βιοδιασπώμενα, διαλητοποιήσημα, βιοσυμβατά ή ανόργανα υλικά ενώ η μορφή του ποικίλλει από μίκρο- και νάνο-σφαιρίδια, μέχρι ογκώδη εμφυτεύματα ή μεμβράνες. Σε όλες τις περιπτώσεις εμπλέκεται κάποιο φαινόμενο διάχυσης της δραστικής ουσίας από το πλέγμα που την εμπεριέχει. Ο μηχανισμός αυτός της αποδέσμευσης μπορεί να ελέγχεται από διάχυση οφειλόμενη στην βάθμωση συγκέντρωσης, μέσω διόγκωσης του πολυμερικού δικτύου ή μέσω

Κεφάλαιο 2 Θεωρία Ελεγχόμενης Αποδέσμευσης 12 αποικοδόμησης (πχ. υδρόλυση ή ενζυματική διάσπαση των δεσμών του υλικού) στην περίπτωση των βιοαποικοδομήσιμων πολυμερικών υλικών [10]. Τα τελευταία χρόνια η τεχνολογία ελεγχόμενης αποδέσμευσης έχει εφαρμοστεί ευρέως σε διάφορους τομείς όπως η φαρμακευτική, η κοσμητική, η βιομηχανία ενώ συναντάται επίσης σε αρκετά καταναλωτικά προϊόντα όπως είδη υγιεινής, συσκευασίες τροφίμων και είδη οικιακής χρήσης [11]. 2.1.1 Εφαρμογή της ελεγχόμενης αποδέσμευσης στην φαρμακευτική επιστήμη Για πολλές δεκαετίες η θεραπευτική αγωγή μιας οξείας ή χρόνιας ασθένειας βασιζόταν κυρίως στην συχνή λήψη φαρμάκων από τους ασθενείς σε διάφορες φαρμακομορφές όπως, ταμπλέτες, κάψουλες, χάπια, κρέμες, σιρόπια, υπόθετα και ενέσεις. Ακόμη και σήμερα τα συμβατικά αυτά συστήματα μεταφοράς φαρμάκων φαίνεται να κυριαρχούν στην αγορά. Παρόλα αυτά, για να επιτευχθεί αλλά και να διατηρηθεί η συγκέντρωση του φαρμάκου στον οργανισμό μέσα στα απαραίτητα θεραπευτικά επίπεδα, είναι συχνά απαραίτητη η λήψη των παραπάνω φαρμάκων πολλές φορές την ημέρα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα μια ανεπιθύμητη αυξομείωση στα επίπεδα του φαρμάκου στο αίμα [12]. Ένας ακόμη σημαντικός λόγος που οι φαρμακοβιομηχανίες ερευνούν συνεχώς νέες μορφές φαρμάκων, είναι η διαχείριση του κύκλου ζωής των προϊόντων τους. Μια εταιρία παρασκευής φαρμάκων διαρκώς ψάχνει τρόπους να εμποδίσει τα πιο επιτυχημένα της φάρμακα να φτάσουν στο τέλος του χρόνου ζωής της πατέντας τους, και να χτυπηθούν από τον αναπόφευκτο ανταγωνισμό. Αυτό μπορεί να αποφευχθεί αν αξιοποιώντας τις τελευταίες τεχνολογικές εξελίξεις το φάρμακο επανακυκλοφορήσει σε νέα πιο εύχρηστη και ίσως ελκυστικότερη μορφή φέροντας καινούρια ενδιαφέροντα χαρακτηριστικά [13]. Η σύγχρονη τεχνολογία επιτρέπει τον έλεγχο του ρυθμού απελευθέρωσης του φαρμάκου, παρατείνοντας την διάρκεια της θεραπευτικής του δράσης (κάτι που συνεπάγεται μικρότερο αριθμό δόσεων) ή και στοχεύοντας στην μεταφορά του σε έναν συγκεκριμένο ιστό. Ο έντονος ανταγωνισμός στο εμπόριο φαρμάκων λοιπόν, εξυπηρετεί έμμεσα το συμφέρον του καταναλωτή, αφού οι εταιρίες προκειμένου να αποκτήσουν το συγκριτικό πλεονέκτημα υπέρ του ανταγωνισμού, προσφέρουν προϊόντα ανώτερα σε ποιότητα και αποτελεσματικότητα.

13 Κεφάλαιο 2 Θεωρία Ελεγχόμενης Αποδέσμευσης Το ενδιαφέρον πλέον έχει μετατοπιστεί σε πιο πολύπλοκες φόρμουλες χορήγησης φαρμάκων, για μακρομόρια όπως οι πρωτεΐνες που είναι δύσκολο να χορηγηθούν μέσω κατάποσης και συνήθως χορηγούνται μέσω μιας επώδυνης ένεσης. Προσπάθεια γίνεται λοιπόν να αντικατασταθούν οι ενέσιμες χορηγήσεις των μακρομορίων με άλλες εναλλακτικές μεθόδους [13], αλλά και να βελτιωθεί η ποιότητα πολλών φαρμάκων με το να γίνουν πιο ασφαλή, φιλικότερα προς τον καταναλωτή και να μειωθούν οι απαιτούμενες ημερήσιες δόσεις. Για την υλοποίηση όλων των παραπάνω, οι εταιρίες έχουν στρέψει τις έρευνες τους σε νέες πολλά υποσχόμενες τεχνολογίες όπως είναι η ελεγχόμενη χορήγηση φαρμάκων (controlled drug delivery). Δύο όροι που χρησιμοποιούνται για να περιγράψουν τις νέες τεχνικές μεταφοράς φαρμάκων είναι η παρατεταμένη απoδέσμευση (sustained release) και η ελεγχόμενη αποδέσμευση (controlled release). Ο πρώτος όρος αναφέρεται σε φαρμακοσκευάσματα τα οποία έχουν την ιδιότητα να επιβραδύνουν την απελευθέρωση της δραστικής ουσίας και την είσοδό της στην κυκλοφορία έτσι ώστε να ενισχύεται η θεραπευτική τους δράση. Ο όρος ελεγχόμενη αποδέσμευση υποδηλώνει συστήματα μεταφοράς με προβλέψιμο και φυσικά επαναλήψιμο ρυθμό αποδέσμευσης του φαρμάκου [12]. Στο επόμενο σχήμα διακρίνεται η διαφορά της συμβατικής μεθόδου χορήγησης φαρμάκων (α) με την ελεγχόμενη χορήγηση (b). Όπως προαναφέρθηκε, κατά την λήψη μιας δραστικής ουσίας για να εκδηλωθεί η φαρμακολογική της ενέργεια, θα πρέπει η συγκέντρωσή της στο αίμα να υπερβεί την ελάχιστη θεραπευτική συγκέντρωση [14]. Επίσης, για να αποφευχθούν συμπτώματα τοξικότητας δεν πρέπει να ξεπεραστεί κάποια ανώτατη τιμή που ονομάζεται μέγιστη επιτρεπτή συγκέντρωση.

Κεφάλαιο 2 Θεωρία Ελεγχόμενης Αποδέσμευσης 14 Εικόνα 2.1- Γραφικές παραστάσεις της συγκέντρωσης του φαρμάκου στο αίμα σε συνάρτηση με τον χρόνο για τις περιπτώσεις: (a) συμβατικής μεθόδου χορήγησης φαρμάκων, (b) Ελεγχόμενης χορήγησης φαρμάκων [10]. Η μέθοδος ελεγχόμενης αποδέσμευσης κατά την εφαρμογή της στην φαρμακευτική παρουσιάζει αρκετά σημαντικά πλεονεκτήματα αλλά και κάποια μη παραβλέψιμα μειονεκτήματα. Τα πλεονεκτήματά της είναι: Σταθεροποίηση της συγκέντρωσης της δραστικής ουσίας πάνω από τα θεραπευτικά επίπεδα για όσο χρόνο διαρκεί η θεραπεία και μικρότερες διακυμάνσεις της συγκέντρωσης. Ελάττωση των παρενεργειών. Ελάττωση της ποσότητας του φαρμάκου που απαιτείται για τη θεραπεία. Ελάττωση της συχνότητας χορήγησης των δόσεων. Αποτελεσματική χορήγηση βιοδραστικών ουσιών με μικρή βιολογική ημιπερίοδο ζωής. Ενώ αντίστοιχα τα μειονεκτήματα της είναι: Υψηλό κόστος παρασκευής Πιθανή τοξικότητα λόγω των υλικών που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή τους ή των προϊόντων διάσπασης αυτών. Κίνδυνος υπέρβασης των τοξικών επιπέδων του φαρμάκου από την μη αναμενόμενη απελευθέρωση του εγκλεισμένου φαρμάκου.