5 o Υποδοχείς που συνδέονται με G πρωτεΐνες Δομή κκαι ι αλλλληλλεεπι ιδράσεει ιςς μεε άλλλλα συσττήματτα.. Ταχχύττηττα κκαι ι εεξξεει ιδίκκεευση σττη μεετταγγωγγή σήματτοςς 1. Υποδοχείς που συνδέονται με G πρωτεΐνες GPCRs Δομή των GPCRs Σύνδεση GPCRs με G πρωτεΐνες και ενεργοποίηση του τελεστή Απευεσθητοποίηση και ανακύκλωση των GPCRs: Λήξη του μηνύματος Διμερισμός των GPCRs GPCRs γλυκοπρωτεϊνικών ορμονών GPCRs οι οποίοι ενεργοποιούνται από πρωτεάσες 2. Πρωτεΐνες G Δομή των πρωτεϊνών G Η μετάδοση του μηνύματος μέσω πρωτεϊνών G περιλαμβάνει πολύπλοκες διεργασίες Ο ρόλος των βγ υπομονάδων Ποικιλομορφία των α υπομονάδων των πρωτεϊνών G Τοξίνη του κοκίτη τοξίνη της χολέρας και η ADP ριβοσυλίωση των G πρωτεϊνών Εξειδίκευση των πρωτεϊνών G Ρυθμιστές των G πρωτεϊνών: Φωσδυσίνη και πρωτεΐνες RGS 3. Αδενυλοκυκλάση και camp Η δομή της αδενυλοκυκλάσης Οι διάφοροι τύποι της αδενυλοκυκλάσης Ο ρόλος της φορσκολίνης στη δράση της αδενυλοκυκλάσης Το camp ως δεύτερος διαβιβαστής Το camp έχει πολυάριθμα αποτελέσματα 4. Φωσφολιπάση C και IP 3 /διακυλογλυκερόλη Οι κατηγορίες φωσφολιπασών Τα πολυ φωσφολιπίδια της ινοσιτόλης (ΡΡΙ) της κυτταρικής μεμβράνης Διακυλογλυκερόλη Τριφωσφορική ινοσιτόλη (ΙΡ 3 ή Ins(1,4,5)P 3 ) Πρωτεϊνική κινάση C: δομή και ενεργοποίση από DAG και Ca 2+ Φωσφολιπίδια της ινοσιτόλης και η κινάση ΡΙ3 Κ Άλλα φωσφολιπίδια της μεμβράνης που συμμετέχουν στη σηματοδότητση Το Ca 2+ ως δεύτερος διαβιβαστής 5. Η έννοια της μικροπεριοχής (microdomain) 6. Cross talk Διασταυρούμενη επικοινωνία
170 Υποδοχείς που συνδέονται με G πρωτεΐνες 7. Οι GPCRs μπορούν να επικοινωνούν με μια ποικιλία μορίων εκτός από τις ετεροτριμερείς G πρωτεΐνες Η γέννηση της ιδέας του υποδοχεοσώματος receptosome Διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με GPCRs Διαλυτές GIPs που αλληλεπιδρούν με το C τελικό άκρο των GPCRs GIPs οι οποίες αλληλεπιδρούν με την i3 θηλιά των GPCRs GPCRs Κινάσες και ενδοκύττωση
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 171 1. Υποδοχείς που συνδέονται με G-πρωτεΐνες (G -protein-coupled receptors: GPCRs) Οι GPCRs ανήκουν σε μια υπεροικογένεια υποδοχέων που αποτελεί μια από τις μεγαλύτερες οικογένειες πρωτεϊνών στη φύση. Στον άνθρωπο, έχουν αναγνωριστεί 865 γονίδια που κωδικοποιούν για GPCRs, περίπου το 1% του ανθρώπινου γονιδιώματος. Από τους υποδοχείς αυτούς, οι 400 είναι λειτουργικοί αισθητήριοι υποδοχείς όσφρησης. Η ανακάλυψη της πληθώρας των οσφρητικών GPCRs οφείλεται στον Richard Axel (βραβείο Nobel 2004), ο οποίος απέδειξε ότι κάθε οσφρητικός νευρώνας εκφράζει ένα μόνο είδος οσφρητικού υποδοχέα. Οι 370 μη-οσφρητικοί GPCRs θεωρούνται λειτουργικοί (δηλαδή έχουν αναγνωριστεί οι προσδέτες και τα μεταγωγικά τους μονοπάτια), ενώ οι υπόλοιποι 90 χαρακτηρίζονται ως «ορφανοί», που σημαίνει ότι δεν έχει αναγνωριστεί ακόμη ο ενδογενής τους προσδέτης. Λόγω του σημαντικού ρόλου που παίζουν οι GPCRs στη λειτουργία του οργανισμού, το βραβείο Nobel Χημείας 2012, απονεμήθηκε στους Brian Kobilka και Robert Lefkowitz γα την έρευνά τους πάνω στους GPCRs. Brian Kobilka (1955 - ) Robert Lefkowitz (1943- ) Εικόνα 5.1 Οι Αμερικάνοι Brian Kobilka και Robert Lefkowitz τιμήθηκαν με το βραβείο Nobel Χημείας για τις ανακαλύψεις τους σχετικά με τον τρόπο δράσης των GPCRs. Το 1968, ο Lefkowitz χρησιμοποίησε για πρώτη φορά ραδιενεργό προσδέτη για να σημάνει τον β- αδρενεργικό υποδοχέα, ενώ στις αρχές του 1980 με τη βοήθεια του Kobilka απομόνωσε το γονίδιο που κωδικοποιεί τον υποδοχέα αυτό. Η ανάλυση του γονιδίου οδήγησε στην ανακάλυψη ότι οι β- αδρενεργικοί υποδοχείς ήταν όμοιοι με υποδοχείς που βρίσκονται στον αμφιβληστροειδή και δέχονται το φως. Τέλος το 2011, ο Kobilka πέτυχε να αποθανατίσει την εικόνα του β-αδρενεργικού υποδοχέα τη στιγμή που ενεργοποιείται από τον αγωνιστή. Αυτή η εικόνα θεωρήθηκε ως molecular masterpiece.
172 Υποδοχείς που συνδέονται με G πρωτεΐνες Φωτόνια, οσμές, νευροδιαβιβαστές, ορμόνες, χημειοκίνες, λιπίδια, νουκλεοτίδια, ιόντα ενεργοποιούν τους GPCRs και επάγουν μια πληθώρα φυσιολογικών λειτουργιών: Όραση: οι φωτοϋποδοχείς (η ροδοψίνη είναι ένας GPCR) μέσω μιας αντίδρασης φωτοϊσομερίωσης της 11-cis-ρετινάλης (προσδέτης) σε trans-ρετινάλη, μετατρέπουν την ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία σε κυτταρικό σήμα. Όσφρηση: υποδοχείς του οσφρητικού επιθηλίου αναγνωρίζουν οσμές και φερομόνες. Συμπεριφορά και ρύθμιση της διάθεσης: υποδοχείς στον εγκέφαλο των θηλαστικών δεσμεύουν τους νευροδιαβιβαστές, όπως η σεροτονίνη, η ακετυλοχολίνη, η ντοπαμίνη, το GABA. Διαβίβαση του Αυτόνομου Νευρικού Συστήματος: το Συμπαθητικό και το Παρασυμπαθητικό Νευρικό Σύστημα ρυθμίζονται από μονοπάτια των GPCRs, υπεύθυνα για τον έλεγχο πολλών αυτόματων λειτουργιών, όπως η πίεση του αίματος, ο καρδιακός ρυθμός, η σύσπαση των βρόγχων και διαδικασίες της πέψης. Ρύθμιση της δραστηριότητας του ανοσοποιητικού συστήματος και της φλεγμονής: οι υποδοχείς των χημειοκινών επάγουν τη χημειοταξία κυττάρων του ανοσοποιητικού κατά τη φλεγμονή, ενώ υποδοχείς της ισταμίνης επιβάλλουν στα κύτταρα στόχους την έναρξη της φλεγμονώδους αντίδρασης. Ρύθμιση της ομοιόστασης: υποδοχείς στον υποθάλαμο ρυθμίζουν πολλές λειτουργίες όπως πχ. ισοζύγιο του νερού. Όλες αυτές τις λειτουργίες, οι GPCRs τις κατευθύνουν μέσω μεταγωγικών μονοπατιών, που παρά την ποικιλομορφία τους βασίζονται σε ένα κοινό μοντέλο μεταγωγής σήματος: ο υποδοχέας ενεργοποιεί μια ετεροτριμερή G πρωτεΐνη (α, βγ υπομονάδες), η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί τελεστές (effectors) που παράγουν δεύτερους αγγελιοφόρους (camp, IΡ 3 ), ικανούς να προκαλέσουν διαφορετικές βιολογικές αποκρίσεις ενεργοποιώντας διαφορετικές πρωτεΐνες-στόχους. Επίσης, μέσω της διασταύρωσης διαφορετικών μονοπατιών, οι GPCRs ρυθμίζουν και σηματοδοτικά μονοπάτια άλλων τύπων υποδοχέων, συμμετέχοντας σε πιο πολύπλοκα και πολλές φορές μη προβλεπόμενα αποτελέσματα. ΥΠΕΡ-ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ GPCRS: ΚΟΙΝΑ ΔΟΜΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΚΑΙ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ Όλοι οι υποδοχείς που ανήκουν στην υπερ-οικογένεια των GPCRs μοιράζονται κάποια κοινά δομικά χαρακτηριστικά. Είναι γλυκοπρωτεΐνες 400 έως 600 αμινοξέων που διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη 7 φορές. Ενδομεμβρανικά σχηματίζονται 7 α-έλικες (η καθεμία αποτελείται από 20-25 αμινοξέα), οι οποίες καθώς αναδιπλώνονται σχηματίζουν 3 θηλιές-βρόχους (loops) εξωκυτταρικά και 3 θηλιές ενδοκυτταρικά. Το εξωκυτταρικό αμινοτελικό άκρο του υποδοχέα εμφανίζει θέσεις γλυκοσυλίωσης ενώ το ενδοκυτταρικό καρβοξυτελικό του άκρο είναι μια μακριά αλυσίδα που περιέχει κατάλοιπα Ser και Thr, τα οποία αποτελούν θέσεις φωσφορυλίωσης από κινάσες πρωτεϊνών (PKA, PKC και GRK), υπεύθυνες για την απενεργοποίηση του Εικόνα 5.2 Τρισδιάστατη δομή ενός G-Protein Coupled Receptor. Από Α. Morris and C. Malbon, Physiological Regulation of G- protein linked signaling, Physiological Rev. 1999, 79, 1373-1430. υποδοχέα. Η 3 η ενδοκυτταρική θηλιά, η οποία είναι και η μεγαλύτερη, παίζει πολύ σημαντικό ρόλο καθώς συμμετέχει στη σύνδεση του υποδοχέα με την πρωτεΐνη G και καθορίζει το
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 173 είδος της πρωτεΐνης G με την οποία θα συνδεθεί ο υποδοχέας. Η υπερ-οικογένεια των GPCRs υποδιαιρείται σε 3 οικογένειες, με βάση συγκεκριμένες χαρακτηριστικές δομικές διαφορές. Η οικογένεια Α ή οικογένεια της ροδοψίνης έχει δομή όμοια με τον υποδοχέα ροδοψίνη, δηλαδή χαρακτηρίζεται από πολλά καλά συντηρημένα αμινοξέα (στην Εικόνα 5.3 φαίνονται με κόκκινο), ένα δισουλφιδικό δεσμό που συνδέει την 1 η και 2 η εξωκυτταρική θηλιά, και μια παλμιτοϋλιωμένη κυστεΐνη στο καρβοξυτελικό άκρο. Η οικογένεια Α περιλαμβάνει τα περισσότερα μέλη: 701 GPCRs, από τους οποίους μόνο για 519 έχουν αναγνωριστεί ενδογενείς προσδέτες. Στην Οικογένεια Α ανήκουν οι GPCRs βιογενών αμινών (αδρεναλίνη, ντοπαμίνη, σεροτονίνη, Εικόνα 5.3 Οι GPCRs της οικογένειας Α χαρακτηρίζονται από πολλά καλά συντηρημένα αμινοξέα (φαίνονται με κόκκινο), ένα δισουλφιδικό δεσμό που συνδέει την 1 η και 2 η εξωκυτταρική θηλιά, και μια παλμιτοϋλιωμένη κυστεΐνη στο καρβοξυτελικό άκρο. ακετυλοχολίνη, ισταμίνη), οι GPCRs μικρών νευροπεπτιδίων (ΝΡΥ, PAF, εγκεφαλίνες), χημειοκινών, λιπιδίων (λευκοτριενίων, λυσοφωσφατιδικού οξέος, προστανοειδών), γλυκοπρωτεϊνικών ορμονών (LH, FSH, TSH), οι φωτοϋποδοχείς, οι γευστικοί υποδοχείς (για το πικρό) και οι οσφρητικοί GPCRs. Η οικογένεια Β ή οικογένεια της σεκρετίνης χαρακτηρίζεται από ένα σχετικά μεγάλο NH 2 -τελικό άκρο, το οποίο περιέχει πολλές κυστεΐνες, οι οποίες σχηματίζουν ένα δίκτυο δισουλφιδικών δεσμών. Η δομή τους είναι όμοια με αυτή της οικογένειας Α, με τη διαφορά ότι λείπει η θέση παλμιτοϋλίωσης στο καρβοξυτελικό άκρο, ο δεσμός θείου ανάμεσα στις κυστεΐνες των εξωκυτταρικών βρόχων και έχουν διαφορετικά συντηρημένα αμινοξέα ή μοτίβα. Η οικογένεια Β περιλαμβάνει 50 GPCRs, από τους οποίους μόνο για 29 έχουν αναγνωριστεί οι ενδογενείς τους προσδέτες. Ως προσδέτες των GPCRs Εικόνα 5.4 Οι GPCRs της οικογένειας Β χαρακτηρίζονται από από ένα σχετικά μεγάλο NH 2 -άκρο, το οποίο περιέχει πολλές καλά συντηρημένες κυστεΐνες (με κόκκινο), οι οποίες σχηματίζουν ένα δίκτυο δισουλφιδικών δεσμών. Λείπει η θέση παλμιτοϋλίωσης στο καρβοξυ-τελικό άκρο και ο δεσμός θείου ανάμεσα στις κυστεΐνες των εξωκυτταρικών βρόχων, χαρακτηριστικό της οικογένειας Α. της οικογένειας Β έχουν αναγνωριστεί μεγάλες πεπτιδικές ορμόνες, όπως η CRΗ (Corticotropin-releasing hormone), GHRH (Growth-hormone-releasing hormone), γλυκαγόνη, καλσιτονίνη, σεκρετίνη, VIP (Vasoactive intestinal peptide), PACAP (Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide), CGRP (Calcitonin gene related peptide) και παραθυρεοειδής ορμόνη (PTH). Οι προσδέτες των GPCRs της οικογένειας Β συνδέονται μεγάλο στο NH 2 -τελικό εξωκυτταρικό άκρο του υποδοχέα.
174 Υποδοχείς που συνδέονται με G πρωτεΐνες Η οικογένεια C χαρακτηρίζεται από ένα μεγάλο ΝΗ 2 -τελικό άκρο (που περιέχει τη θήκη σύνδεσης του προσδέτη, η οποία μοιάζει με το σαρκοφάγο φυτό εντομοπαγίδα της Αφροδίτης) και μια μεγάλη COOH-τελική ουρά. Το μόνο κοινό που έχουν με τη δομή των υποδοχέων της οικογένειας Α είναι ο δισουλφιδικός δεσμός που συνδέει την 1 η και 2 η εξωκυτταρική τους θηλιά. Ένα άλλο χαρακτηριστικό της οικογένειας C είναι ότι οι υποδοχείς εμφανίζονται σε διμερή μορφή. Η οικογένεια C περιλαμβάνει 22 GPCRs, από τους οποίους μόνο για 15 έχουν αναγνωριστεί οι ενδογενείς προσδέτες. Στους υποδοχείς της οικογένειας C ανήκουν οι μεταβοτροπικοί υποδοχείς του γλουταμινικού, οι αισθητήρες Ca 2+ και οι υποδοχείς του γ- αμινοβουτυρικού οξέος GABA B. Εικόνα 5.5 Οι GPCRs της οικογένειας C είναι διμερείς και χαρακτηρίζονται από ένα μεγάλο ΝΗ 2 -τελικό άκρο (που περιέχει τη θήκη σύνδεσης του προσδέτη) και από ένα μεγάλο COOH-τελικό άκρο. GPCRS ΤΗΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ A: ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΔΟΜΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΚΑΙ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ Όλοι οι υποδοχείς της οικογένειας Α δημιουργούν ένα δεσμό S-S ανάμεσα στον πρώτο και δεύτερο εξωκυτταρικό βρόχο, που παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της φυσιολογικής δομής της πρωτεΐνης, και επίσης μια θέση παλμιτοϋλίωσης σε κυστεΐνη του ενδοκυτταρικού COOH-άκρου. C C Εικόνα 5.6 A. Σχηματική αναπαράσταση του β-αδρενεργικού υποδοχέα, σε κάθετη όψη προς το επίπεδο της μεμβράνης. Διακρίνεται ο δεσμός θείου (S-S) ανάμεσα στις δύο κυστεΐνες του 1 ου και 2 ου εξωκυττάριου βρόχου. Επίσης διακρίνεται η σύνδεση του COOH άκρου στη μεμβράνη μέσω ενός παλμιτικού οξέος, το οποίο είναι συνδεδεμένο με μια κυστεΐνη. Από D. Strosberg and F. Pietri-Rouxel, Function and regulation of the beta 3-adrenoceptorTiPS, 1996, 17, 373-381.
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 175 Πίνακας 5.1 Ταξινόμηση των GPCRs της Οικογένειας Α Ροδοψίνης, με βάση τη θέση σύνδεσης του προσδέτη. ΟΟι ιικκοογγέέννεει αα ΑΑ ΟΟ ιικκοογγέέννεει ι ιιαα ττηηςς ρροοδδοοψψί ίίννηηςς ΛΛεει ιιττοουυρργγι ιικκοοί ίί:: 440000 οοσσφφρρηηττι ιικκοοί ίί,, 228844 μμηη οοσσφφρρηηττι ιικκοοί ίί μμεε ααννααγγννωωρρι ιισσμμέέννοουυςς εεννδδοογγεεννεεί ίίςς ππρροοσσδδέέττεεςς Υποοικογένεια Α Ομάδα 1 η Υποδοχείς ροδοψίνης Οσφρητικοί υποδοχείς / φερομονών Υποδοχείς βιογενών αμινών: ακετυλοχολίνης μουσκαρινικοί (Μ 1 -M 5 ), (νορ)αδρεναλίνης (α 1Α, α 1Β, α 1D, α 2A, α 2B, α 2C, β 1, β 2, β 3 ), ντοπαμίνης (D 1 D 5 ), σεροτονίνης ((5-ΗΤ 1Α, 5-ΗΤ 1Β, 5-ΗΤ 1D, 5-ΗΤ 1E, 5-ΗΤ 1F, 5- ΗΤ 2Α, 5-ΗΤ 2B, 5-ΗΤ 2C, 5-ΗΤ 4, 5-ΗΤ 5A, 5-ΗΤ 6, 5-ΗΤ 7 ), ισταμίνης (Η 1, Η 2, Η 3, Η 4 ) Υποδοχείς οπιοειδών: delta, kappa, mu και νοσισεπτίνης Υποοικογένεια λιπιδίων: υποδοχείς εικοσανοειδών (προσταγλανδινών: PGD 2, PGE 1, PGE 2, PGE 3, PGE 4, PGF F, PGI 2, και θρομβοξάνης A 2 ), λυσοφωσφατιδικού οξέος (LPAR1-6), λευκοτριενίων (LTB4R) ), σφιγγοσίνης, κανναβινοειδών (CNR) Υποδοχείς νουκλεοτιδίων: αδενοσίνης: (Α 1, Α 2a, A 2b, A 3 ), πουρινεργικοί υποδοχείς (P2YR1-14) Υποοικογένεια Α Ομάδα 2 η Υποδοχείς χημειοκινών CCR1-10, CXCR3-7, ιντερλευκίνη-8 ή CXCL8 (CXCR1, 2) Υποδοχείς fmlp (Fοrmyl Met-Leu-Phe peptide) Υποδοχείς πρωτεασών: θρομβίνης Υποδοχείς μικρών πεπτιδίων: υποδοχείς αγγειοτενσίνης, βασοπρεσίνης, βραδυκινίνης, γαλανίνης (GALR1-3), ενδοθηλίνης, GnRH (Gonadotropin releasing hormone), μελανοκορτίνης/acth (adrenocorticotrophin), νευροτενσίνης, νευροκινίνης, ΝΡΥ (neuropeptide Y), ορεξίνης, ωκυτοκίνης, PRP (prolactin releasing peptide), σωματοστατίνης (SSTR1-5), TRH (Thyroptropin-releasing hormone), χολεκυστοκινίνης (CCKAR) Υποοικογένεια Α Ομάδα 3 η Υποδοχείς μεγάλων γλυκοπρωτεϊνικών ορμονών: LH/hCG, FSH, TSH
176 Υποδοχείς που συνδέονται με G πρωτεΐνες Ανάλογα με το μέγεθος και το είδος του προσδέτη, διαφέρει η θέση σύνδεσής του (binding site) στον υποδοχέα, και οι υποδοχείς της οικογένειας Α κατατάσσονται σε 3 ομάδες: 1 η Ομάδα: Για τους προσδέτες μικρού ΜΒ (νευροδιαβιβαστές, οψίνες, οσφρητικά μόρια, νουκλεοτίδια, βιογενείς αμίνες, λιπιδικοί διαμεσολαβητές) η θέση σύνδεσης βρίσκεται στην τρίτη ενδομεμβρανική περιοχή. Στην περίπτωση που ο προσδέτης είναι αμίνη, βασικό ρόλο στη σύνδεσή του με τον υποδοχέα παίζει το Αsp113. Η καρβοξυλική ομάδα (COO - ) του ασπαρτικού οξέος χρησιμεύει σαν αντίθετο ιόν (counter-ion) στη σύνδεση της αμινομάδας (ΝΗ 2 + ) των μονοαμινών. Το ασπαρτικό οξύ, αν και παίζει κυρίαρχο ρόλο, δεν είναι το μόνο που απαιτείται για τη σύνδεση της αμίνης. Στους υποδοχείς των κατεχολαμινών, και ειδικότερα στον αδρενεργικό β 3, οι σερίνες Ser209 και Ser212 στην V περιοχή χρησιμεύουν στη δημιουργία δεσμού υδρογόνου (Η...ΟΗ) προσφέροντας το Η +, ενώ οι κατεχολαμίνες προσφέρουν το ΟΗ -. Τα υπεύθυνα λοιπόν αμινοξέα για τη σύνδεση δημιουργούν μια θήκη σύνδεσης (binding pocket). A. B. Εικόνα 5.7 Α. Σχηματική αναπαράσταση της θήκης σύνδεσης μορίου-υποδοχέα (binding pocket). Aπό C.D. Strader et al, Structural basis of beta-adrenergic receptor function, Faseb J., 1989, 3, 1825-32. Β. Αναπαράσταση του υποδοχέα ροδοψίνης, όπου διακρίνεται η θήκη σύνδεσης της ρετινάλης, Από Zubay G, Biochemistry 1998. Εικόνα 5.8 Μοντέλο για τη θήκη σύνδεσης του β 3 -αδρενοϋποδοχέα, σε κάτοψη. Διακρίνονται το Αsp117 της 3 ης ενδομεμβρανικής περιοχής, οι δύο σερίνες (Ser209 και Ser212) της 5 ης περιοχής και η Phe309 της 6 ης περιοχής. Το μόριο στο κέντρο είναι η ισοπρεναλίνη (αγωνιστής του υποδοχέα). e1-e4: είναι οι 4 εξωκυτταρικές περιοχές, και i1-i3: είναι οι 4 ενδοκυτταρικές περιοχές. Από D. Strosberg and F. Pietri-Rouxel, Function and regulation of the beta 3- adrenoceptor, TiPS, 1996, 373-381.
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 177 2 η Ομάδα: Για τους προσδέτες μικρά πεπτίδια, χημειοκίνες, καθώς και στους υποδοχείς πρωτεασών, η θέση σύνδεσης βρίσκεται στο ΝΗ 2 -τελικό άκρο και τους εξωκυττάριους βρόχους. Στη 2 η ομάδα ανήκουν και οι υποδοχείς πρωτεασών. Οι πρωτεάσες, για δεκαετίες, θεωρούνταν κυρίως αποικοδομητικά ένζυμα που παίζουν ποικίλους ρόλους στην πέψη ή σε θέσεις φλεγμονής καθαρίζοντας τα κυτταρικά απόβλητα. Στις αρχές της δεκαετίας του 70 ανακαλύφθηκε ότι οι σερινο-πρωτεάσες τρυψίνη και θρομβίνη ενεργοποιούν μια καινούρια ομάδα GPCRs, τους υποδοχείς που ενεργοποιούνται από πρωτεάσες (PARs: proteinasesactivated receptors). Αυτοί οι υποδοχείς ενεργοποιούνται από ένα μοναδικό μηχανισμό κατά τον οποίο πρωτεάσες υδρολύουν, σε μια εξειδικευμένη θέση κοπής, το εξωκυτταρικό ΝΗ 2 - τελικό άκρο του υποδοχέα. Λόγω της απομάκρυνσης ενός τμήματος του Ν-τελικού άκρου, εμφανίζεται ένα νέο Ν-τελικό άκρο, το οποίο δρα σαν ένας προσδέτης που συνδέεται ενδομοριακά στους εξωκυττάριους βρόχους και ενεργοποιεί τον υποδοχέα. Εικόνα 5.9 Α. Μοντέλο σύνδεσης των χημειοκινών στους εξωκυττάριους βρόχους και το ΝΗ 2 -άκρο του GPCR υποδοχέα τους. Από D. Rojo, K, Suetomi and J. Β Navarro. Structural biology of chemokine receptors. Biol Res. 1999, 32, 263-72. B. Μηχανισμός ενεργοποίησης των PARs. Οι πρωτεάσες, που εμφανίζονται σαν ένα ψαλίδι, κόβουν ένα τμήμα της εξωκυτταρικής ΝΗ 2 -τελικής περιοχής του υποδοχέα, εμφανίζοντας ένα νέο ΝΗ 2 -τελικό άκρο, το οποίο συνδέεται ενδομοριακά στο δεύτερο εξωκυτταρικό βρόχο και ενεργοποιεί τον υποδοχέα. Από Vergnolle N., et al, Proteinase-activated receptors: novel signals for peripheral nerves, Trends in Neurosci. 2003, 26, 496-500.
178 Υποδοχείς που συνδέονται με G πρωτεΐνες 3 η Ομάδα: Όταν οι προσδέτες είναι μεγάλες γλυκοπρωτεϊνικές ορμόνες, διμερείς πρωτεΐνες περίπου 30 kda που αποτελούνται από μια α-υπομονάδα, κοινή για όλες τις γλυκοπρωτεΐνες, και μια εξειδικευμένη β-υπομονάδα, όπως η θυλακιοτροπίνη (FSH: follicle stimulating hormone), ωχρινοτροπίνη (LH: lutropin), χοριονική γοναδοτροπίνη (hcg: human chorionic gonadotropin), οι υποδοχείς έχουν ένα μεγάλο (350-400 αα) αμινοτελικό εξωκυτταρικό άκρο, το οποίο είναι υπεύθυνο για την εξειδικευμένη πρόσδεση των ορμονών. Στο ΝΗ 2 -άκρο περιοχές πλούσιες σε λευκίνη, μοτίβα 20-25 αμινοξέων που αποτελούνται από ένα β-πτυχωτό φύλλο που συνδέεται μέσω βρόχου με μια α-έλικα, συμβάλλουν στην αναγνώριση των ορμονών. Στην ΝΗ 2 - περιοχή του υποδοχέα υπάρχουν 9 τέτοιες επαναλήψεις, οι οποίες παίζουν σημαντικό ρόλο στην αναγνώριση και στη σύνδεση της γλυκοπρωτεΐνης. Εικόνα 5.10 Χαρακτηριστική δομή του υποδοχέα των γλυκοπρωτεϊνικών ορμονών. Διακρίνεται το μεγάλο εξωκυτταρικό ΝΗ 2 άκρο (με τις πλούσιες σε Leu επαναλήψεις) που χαρακτηρίζει την 3 η ομάδα, οι 7 διαμεμβρανικές περιοχές και η ενδοκυτταρική περιοχή (με τους 3 βρόχους και το CΟΟΗ-άκρο. Από Kronenberg: Williams Textbook of Endocrinology, 11 th ed., Elsevier, 2008 Περιοχές πλούσιες σε λευκίνη (LRRs) συμβάλλουν στην αναγνώριση των ορμονών. Οι επαναλήψεις περιοχών πλούσιων σε λευκίνη, LRRs (leucine-rich repeats), είναι μοτίβα 20-25 αμινοξέων που αποτελούνται από ένα β-πτυχωτό φύλλο που συνδέεται μέσω βρόχου με μια α-έλικα. Στην ΝΗ 2 περιοχή του υποδοχέα υπάρχουν 9 τέτοιες επαναλήψεις, οι οποίες παίζουν σημαντικό ρόλο στην αναγνώριση και στη σύνδεση της γλυκοπρωτεΐνης. Με στοχευμένες αντικαταστάσεις αμινοξέων στα β-πτυχωτά φύλλα βρέθηκε ότι κατάλοιπα αμινοξέων, διαφορετικά της λευκίνης, δημιουργούν μία υδρόφοβη επιφάνεια διαθέσιμη για την αλληλεπίδραση με τη γλυκοπρωτεΐνη. Εικόνα 5.11 (a) Το ΝΗ 2 άκρο αποτελείται από μια περιοχή 9 επαναλήψεων λευκίνης (LRR), η οποία περιβάλλεται (πάνω και κάτω) από περιοχές πλούσιες σε κυστεΐνη. (b) Επαναλήψεις πλούσιες σε λευκίνη. (c) Τα κατάλοιπα που βρέθηκε να συμμετέχουν στη σύνδεση του προσδέτη είναι μηλευκίνες που βρίσκονται στα β-πτυχωτά φύλλα (x 1, x 2, x 3, x 4, x 5 ). Από Vassart G., et al, Trends in Biochemical Sciences, 2004, 29, 119-126
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 179 Ανταλλάσσοντας 8 αμινοξέα του TSH-R και 2 αμινοξέα του FSH-R με αντίστοιχα αμινοξέα του hcg-r, οδηγούμαστε σε μεταλλαγμένους υποδοχείς διπλής εξειδίκευσης, οι οποίοι παραδόξως κρατούν την ευαισθησία τους για τους φυσικούς τους προσδέτες και επιπλέον αυξάνουν την ευαισθησία τους για την hcg. Εικόνα 5.12 (i) Με στοχευμένη μετάλλαξη ανταλλάχθηκαν 8 αμινοξέα του TSH-R και (ii) 2 αμινοξέα του FSH-R με αντίστοιχα αμινοξέα του hcg-r, και προέκυψαν υποδοχείς διπλής εξειδίκευσης. Από Vassart G., Prado L., Costagliola S., A molecular dissection of the glycoprotein hormone receptors, Trends in Biochemical Sciences, 2004, 29, 119-126. Σύνδεση GPCRs με τις πρωτεΐνες G και ενεργοποίηση του τελεστή Ο υποδοχέας GPCR με τη βοήθεια της πρωτεΐνης G ενεργοποιεί τον τελεστή (effector), ο οποίος μπορεί να είναι ένα ένζυμο -αδενυλοκυκλάση, φωσφολιπάση C και Α 2, φωσφοδιεστεράση- ή ένα κανάλι ιόντων. Ο τελεστής στη συνέχεια συνθέτει το δεύτερο διαβιβαστή (second messanger) προκαλώντας μια σημαντική ενίσχυση του μηνύματος: παράγει 100.000 δεύτερους διαβιβαστές για κάθε μόριο νευροδιαβιβαστή. Οι δεύτεροι διαβιβαστές διαχέονται εν συνεχεία στο κυτταρόπλασμα και ενεργοποιούν άμεσα ή έμμεσα πρωτεϊνικές κινάσες (PKA, PKC) ικανές να φωσφορυλιώσουν πρωτεΐνες-στόχους. Στις περιπτώσεις που οι πρωτεΐνες αυτές είναι ένζυμα, προκαλείται μια δεύτερη ενίσχυση του αρχικού μηνύματος. Απευαισθητοποίηση και ανακύκλωση των GPCRs: Λήξη του μηνύματος Ένα φαινόμενο που συναντούμε στους GPCRs είναι το φαινόμενο της απευαισθητοποίησης. Απευαισθητοποίηση συμβαίνει όταν μετά από μακροχρόνια διέγερση του υποδοχέα από ορμόνες, νευροδιαβιβαστές ή αισθητήρια ερεθίσματα η μεταγωγή του μηνύματος εξασθενεί. Δηλαδή, παρά το παρατεταμένο εξωκυτταρικό ερέθισμα, το μήνυμα παύει να περνάει στο εσωτερικό του κυττάρου ή περνάει εξαιρετικά εξασθενημένο. Είναι ένας μηχανισμός, ο οποίος ρυθμίζει τη δραστηριότητα του υποδοχέα. Η απευαισθητοποίηση των GPCRs έχει μελετηθεί καλύτερα στο β 2 -αδρενεργικό υποδοχέα και στον φωτο-υποδοχέα της ροδοψίνης. Η αντίδραση-κλειδί στην απευαισθητοποίηση και των 2 αυτών υποδοχέων είναι η φωσφορυλίωσή τους, στην κυτταροπλασματική τους πλευρά, από ειδικές πρωτεϊνικές κινάσες. Δύο είδη πρωτεϊνικών κινασών εμπλέκονται στη φωσφορυλίωση και απευαισθητοποίηση των GPCRs: οι PKA (camp-dependent protein kinases) και οι GRK (Gprotein coupled receptor protein kinases). ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΑΠΟ ΚΙΝΑΣΕΣ ΡΚΑ: Η φωσφορυλίωση των υποδοχέων από τις κινάσες ΡΚΑ είναι ένας αρνητικός feed-back μηχανισμός μέσω του οποίου ο ενεργοποιημένος από την ορμόνη υποδοχέας οδηγεί μέσω της πρωτεΐνης G και της αδενυλοκυκλάσης/camp στην
180 Υποδοχείς που συνδέονται με G πρωτεΐνες ενεργοποίηση της ΡΚΑ. Η ενεργοποιημένη κινάση φωσφορυλιώνει τον υποδοχέα σε κατάλοιπα Ser/Thr της κυτταροπλασματικής του περιοχής. Εικόνα 5.13 Απευαισθητοποίηση των GPCRs μέσω camp-εξαρτώμενων κινασών. Ο ενεργοποιημένος υποδοχέας μεταφέρει το μήνυμα μέσω της Gα υπομονάδας στην αδενυλοκυκλάση. Η ενεργοποιημένη αδενυλοκυκλάση παράγει camp. Αυτό ενεργοποιεί την ΡΚΑ, η οποία μεταφέρει το μήνυμα φωσφορυλιώντας σε κατάλοιπα Ser/Thr σε συγκεκριμένες πρωτεΐνες-στόχους. Ένας από τους στόχους, μετά από παρατεταμένη διέγερση, είναι και ο ίδιος ο υποδοχέας, η φωσφορυλίωση του οποίου αναστέλλει τη δράση του. Από Biochemistry of Signal Transduction and Regulation, G. Krauss, 2008. ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΑΠΟ KINΑΣΕΣ GRK (G-PROTEIN-COUPLED RECEPTOR KINASES): Οι καλύτερα μελετημένες GRKs είναι η κινάση της ροδοψίνης και η κινάση του β-αδρενεργικού υποδοχέα (βαrk). Οι GRKs δεν ρυθμίζονται από το camp. Μεταφέρονται από το κυτταρόπλασμα προς την κυτταρική μεμβράνη (μέσω ενός μηχανισμού στον οποίο συμμετέχουν οι βγ υπομονάδες και η αρρεστίνη, και που θα αναλύσουμε σε επόμενο κεφάλαιο) και φωσφορυλιώνουν εξειδικευμένα τον υποδοχέα στην καρβοξυτελική περιοχή ή στην 3 η ενδοκυτταρική θηλιά του. ΕΣΩΤΕΡΙΚΕΥΣΗ (INTERNALIZATION) ΚΑΙ ΑΝΑΚΥΚΛΩΣΗ (RECYCLING) ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ: Ο φωσφορυλιωμένος υποδοχέας ενδοκυτταρώνεται με κυστίδια κλαθρίνης και μεταφέρεται στο κυτταρόπλασμα. Εκεί αποφωσφορυλιώνεται και επιστρέφει στην κυτταρική μεμβράνη.
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 181 Εσωτερίκευση (internalization) και ανακύκλωση (recycling) του υποδοχέα Ligand binding γ β α s αs GDP GTP E1 E2 GRK β γ P P A RGS Dimerization A Recycling Synthesis Signal P P Internalization Degradation ER Lysosome Endosome Εικόνα 5.14 Εσωτερίκευση και ανακύκλωση του υποδοχέα. Μετά την ενεργοποίηση του υποδοχέα (1) το σύμπλεγμα Gβγ απομακρύνεται (2) και ενεργοποιεί την κινάση βαrk, η οποία φωσφορυλιώνει τον υποδοχέα (3). Στον φωσφορυλιωμένο υποδοχέα συνδέεται η β-αρρεστίνη, η οποία επάγει την ενδοκύτωση του υποδοχέα μέσα σε κυστίδια (5). Στα κυστίδια, ο υποδοχέας αποφωσφορυλιώνεται και μεταφέρεται ξανά στη μεμβράνη. Ο υποδοχέας μετά την εσωτερίκευσή του είτε καταβολίζεται είτε αποφωσφορυλιώνεται και ανακυκλώνεται. ομή GPCRs γλουταμινικού και GABA Οικογένεια 3 Μέχρι πρόσφατα θεωρούσαν ότι οι GPCRs λειτουργούν ως μονομερή. Μελέτες όμως έδειξαν ότι ο διμερισμός ή ο ολιγομερισμός τους απαιτείται για τη μεταγωγή σήματος από πολλούς GPCRs. Οι GPCRs μπορούν να σχηματίζουν ομοολιγομερή ή ετεροολιγομερή. Χαρακτηριστικό παράδειγμα GPCR, οι οποίοι απαιτούν το διμερισμό τους για να δράσουν είναι οι υποδοχείς GABAB. Το διμερές που σχηματίζεται είναι ανάμεσα σε δύο ομόλογες υπομονάδες την GABAΒ1 και GABAΒ2. Το διμερές αυτό σχηματίζεται μέσω αλληλεπίδρασης των καρβοξυτελικών και αμινοτελικών τους άκρων καθώς και διαμεμβρανικών περιοχών τους. Αυτή η ενεργοποιημένη κατάσταση του διμερούς υποδοχέα επιτρέπει την αλληλεπίδρασή του με τη G-πρωτεΐνη και τελικά την ενεργοποίηση ενός τελεστή (Eικόνα 5.15). Άλλα παραδείγματα υποδοχέων που σχηματίζουν διμερή είναι οι οπιοειδείς υποδοχείς τύπου κ και δ, υποδοχείς αγγειοτανσίνης και βραδυκινίνης, ντοπαμίνης D1 και D2 και σωματοστατίνης SSTR5. Ο διμερισμός/ολιγομερισμός των GPCRs καθορίζει ένα νέο επίπεδο μοριακής αλληλεπίδρασης ανάμεσα στις διάφορες οικογένειες των GPCRs.
182 Υποδοχείς που συνδέονται με G πρωτεΐνες Εικόνα 5.15 Διμερισμός υποδοχέων GABA B. Το διμερές που σχηματίζεται είναι ανάμεσα σε δύο ομόλογες υπομονάδες την GABA Β R1 και GABA Β R2. Από Marshall F.H., Jones K.A., Kaupmann K., and Bettler B., GABA B receptors the first 7TM heterodimers, TiPS 1999, 20, 396-399.
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 183 2. Πρωτεΐνες G Οι πρωτεΐνες G αποτελούν το συνδετικό κρίκο ανάμεσα στη μεγάλη κατηγορία υποδοχέων G protein-coupled receptors και τον τελεστή. Είναι πρωτεΐνες που δεσμεύουν το GTP γι αυτό και ονομάζονται πρωτεΐνες που δεσμεύουν νουκλεοτίδια της γουανίνης (guanine nucleotide-binding proteins). ομή των πρωτεϊνών G Οι πρωτεΐνες G είναι ετερο-τριμερείς πρωτεΐνες που αποτελούνται από τις υπομονάδες α, β και γ. Οι α και β υπομονάδες είναι υδρόφιλες, ενώ η γ είναι ιδιαιτέρως υδρόφοβη και συνεπώς είναι αυτή που συγκρατεί την πρωτεΐνη Gαβγ στην κυτταρική μεμβράνη. (α) Τελεστής: AC PLC cgmp-pde 40-50kDa α γ β 5-11kDa 35kDa Πρωτεΐνη G (β) Εικόνα 5.16 (α) Ετεροτριμερής Gαβγ β-υπομονάδα πρωτεΐνη και ο τρόπος σύνδεσής της στην κυτταρική μεμβράνη. Η Gα υπομονάδα α-υπομονάδα συνδέεται με τη μεμβράνη, μέσω ενός μυριστοϊκού οξέος που βρίσκεται συνδεδεμένο σε μια γλυκίνη (Gly) του -ΝΗ 2 άκρου της α υπομονάδας, ενώ η Gγ γ-υπομονάδα υπομονάδα χρησιμοποιεί μια πρενυλ-ομάδα, η οποία βρίσκεται συνδεδεμένη σε μια κυστεΐνη (Cys) του COOH άκρου της. Επίσης διακρίνεται η σύνδεση του COOH άκρου του GPCR στη μεμβράνη, μέσω ενός παλμιτοϊκού οξέος που βρίσκεται συνδεδεμένο σε μια κυστεΐνη (Cys). (β)τρισδιάστατη δομή μιας ετεροτριμερούς πρωτεΐνης G. Με γκρι είναι η α-υπομονάδα, με μπλε η β- και με κίτρινο η γ-υπομονάδα. Η α-υπομονάδα είναι ένα πολυπεπτίδιο μοριακού βάρους 40-50 kda. Ο κύριος ρόλος της είναι η δέσμευση του GTP (γουανοσινο τριφωσφορικό οξύ) και η υδρόλυσή του σε GDP και Ρ i. Η α-υπομονάδα εκτελεί χρέη GTPάσης. H β-υπομονάδα είναι ένα πολυπεπτίδιο μοριακού βάρους 35-36 kda. Έχει μια δομή, η οποία αντίθετα με αυτή της α-υπομονάδας είναι πολύ καλά διατηρημένη από είδος σε είδος και από ιστό σε ιστό.
184 Υποδοχείς που συνδέονται με G πρωτεΐνες Η γ-υπομονάδα, η πιο πρόσφατα απομονωμένη, έχει μοριακό βάρος 5-11 kda και σχηματίζει ένα σύμπλοκο με τη β-υπομονάδα. Η μετάδοση του μηνύματος μέσω των πρωτεϊνών G περιλαμβάνει μια σειρά πολύπλοκων διεργασιών 1. Η ένωση του υποδοχέα (R) με την ορμόνη (Η) αλλάζει τη διαμόρφωση του, μετατρέποντάς την σε διαμόρφωση υψηλής συγγένειας. Ο υποδοχέας με τη νέα του διαμόρφωση συνδέεται με την πρωτεΐνη Gα(GDP)βγ, ενεργοποιώντας την απομάκρυνση του GDP και την ανταλλαγή του με το GΤΡ. Ένας ενεργοποιημένος υποδοχέας μπορεί να ενεργοποιήσει την ανταλλαγή πολλών μορίων GDP με GTP. 2. Το σύμπλοκο ορμόνη / υποδοχέας / (αgtpβγ) διαχωρίζεται σε RH/αGTP + βγ, και η υπομονάδα αgtp ενεργοποιεί τον τελεστή. 3. Η α-υπομονάδα εκτελεί χρέη GTPάσης υδρολύοντας το GTP σε GDP (που παραμένει δεσμευμένο στην α-υπομονάδα) και ανόργανο φώσφορο (P i ). Στη συνέχεια, το σύμπλοκο HR/αGDP/Ε διασπάται, ο τελεστής παραμένει ενωμένος με την α-υπομονάδα, αλλά ανενεργός, και η ορμόνη διαχωρίζεται από τον υποδοχέα, ο οποίος ξαναβρίσκει την παλιά του διαμόρφωση (διαμόρφωση χαμηλής συγγένειας). 4. Οι τρεις υπομονάδες της πρωτεΐνης G ενώνονται μεταξύ τους (αgdp + βγ = GDPαβγ). Εικόνα 5.17 Ο ρόλος της πρωτεΐνης G στη μετάδοση του μηνύματος της ορμόνης (Η), από τον υποδοχέα (R) στον τελεστή-effector (E). Ο υποδοχέας και ο τελεστής παρουσιάζονται σαν γλυκοσυλιωμένα διαμεμβρανικά μόρια. Ο υποδοχέας εμφανίζεται σε δύο διαμορφώσεις, μια υψηλής συγγένειας (με δεσμευμένη την ορμόνη) και μια χαμηλής συγγένειας (χωρίς ορμόνη). Από L. Birnbaumer et al, Kidney Inter., 1987, 32, S14-S37 Ο ρόλος του ενεργοποιημένου από την ορμόνη υποδοχέα είναι να ενεργοποιεί την ανταλλαγή του GDP ώστε η Gα να δεσμεύσει το GTP. Το σύμπλοκο ορμόνης-υποδοχέα αλληλεπιδρά με την Gα, και ανοίγει τη θέση δέσμευσης του νουκλεοτιδίου ώστε το GDP να αποδεσμευτεί και να συνδεθεί το GTP. Η Gα-υπομονάδα αποτελείται από τρία πολυπεπτιδικά τμήματα-κλειδιά: το διακόπτη Ι, διακόπτη ΙΙ και διακόπτη ΙΙΙ, τα οποία αλληλεπιδρούν είτε
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 185 άμεσα είτε έμμεσα με τη γ-φωσφορική ομάδα του GTP αλλάζοντας τη διαμόρφωσή τους. Οι δομικές αυτές αλλαγές μειώνουν τη συγγένεια της Gα προς το διμερές Gβγ. Ο διαχωρισμός της ετεροτριμερούς πρωτεΐνης G σε Gα και Gβγ, μεταδίδει το μήνυμα στον τελεστή. Α. Β. Ο ρόλος των βγ-υπομονάδων Εικόνα 5.18 (Α) Η απομάκρυνση του GDP και η σύνδεση του GTP στις τρεις περιοχές-διακόπτες (switch I, II, III) αλλάζει τη διαμόρφωση της Gα με αποτέλεσμα τον αποχωρισμό των Gβγ. Από Berg et al, ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ, 2001, σελ.448. (Β) Σχηματική αναπαράσταση του μηχανισμού-διακόπτη της Gα -υπομονάδας, στην ανοιχτή-ενεργή του διαμόρφωση (με συνδεδεμένο το GTP) και στην κλειστή του διαμόρφωση (με συνδεδεμένο το GDP). Από Lodish et al, Molecular Cell Biology, 2004. Είναι φανερό ότι η α-υπομονάδα της πρωτεΐνης G έχει τον κυρίαρχο ρόλο στην ενεργοποίηση του τελεστή. Τα τελευταία όμως 2-3 χρόνια, έρευνες πάνω στις βγυπομονάδες, των οποίων η σημασία είχε παραμεληθεί, έδειξαν ότι το σύμλποκο των
186 Υποδοχείς που συνδέονται με G πρωτεΐνες υπομονάδων βγ μπορεί και αυτό να ενεργοποιήσει ορισμένους τελεστές, τη φωσφολιπάση PLC-β, την αδενυλοκυκλάση AC-II, και ειδικά κανάλια Κ + και Ca 2+. Ένα άλλο σημαντικό ρόλο που παίζει το σύμπλεγμα Gβγ είναι ότι ενεργοποιεί κινάσες των συνδεδεμένων με G-πρωτεΐνες υποδοχέων (GRKs: G-protein coupled receptor kinases), οι οποίες φωσφορυλιώνουν τον υποδοχέα, ρυθμίζοντας τη δράση του. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η κινάση των β-αδρενεργικών υποδοχέων (βark), η οποία αφού ενεργοποιηθεί από το σύμπλεγμα των βγ-υπομονάδων φωσφορυλιώνει και απενεργοποιεί τον β-αδρενεργικό υποδοχέα. Ποικιλομορφία των α-υπομονάδων των πρωτεϊνών G Οι α-υπομονάδες κατατάσσονται σε 4 μεγάλες κατηγορίες: 1/ Η ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ G S (G STIMULATORY). Περιλαμβάνει τις πρωτεΐνες Gα s που συναντώνται σε όλους τους ιστούς, και Gα οlf που βρίσκονται μόνο σε νευρικούς ιστούς και ιδιαίτερα στους νευρώνες του οσφρητικού επιθηλίου (olfactory epithelium). Οι πρωτεΐνες G s ενεργοποιούν την αδενυλοκυκλάση, και συνεπώς αυξάνουν την ενδοκυτταρική συγκέντρωση του cαμρ. Χαρακτηριστικό τους γνώρισμα είναι ότι είναι στόχος μιας τοξικής ουσίας που προέρχεται από το βακτήριο Vibrio cholerae, της τοξίνης της χολέρας (CTX: cholera toxine), η οποία δρα στην Gas και εμποδίζει την υδρόλυση του GTP σε GDP+P i εμποδίζοντας τη διάσπαση του συμπλόκου RH/αsGTP/Αδενυλοκυκλάση. Σαν αποτέλεσμα παρατείνεται η δραστηριότητα της αδενυλοκυκλάσης. 2/ Η ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ G i (G INHIBITORY). Ορισμένα μέλη της κατηγορίας αυτής (Gα i 1, Gα i 2, Gα i 3) αναστέλλουν τη δράση της αδενυλοκυκλάσης, ορισμένα (Gα ο ) ενεργοποιούν τη φωσφολιπάση C, άλλα (Gα i 1, Gα i 2, Gα i 3, Gα ο ) ρυθμίζουν τη λειτουργία καναλιών ιόντων και τέλος η Gα t (transducin) ενεργοποιεί τη φωσφοδιεστεράση του cgmp. Οι πρωτεΐνες αυτές έχουν το χαρακτηριστικό γνώρισμα ότι είναι στόχος μιας τοξίνης που παράγεται από το βακτήριο Bortedella pertussis, της τοξίνης του κοκκύτη (PTX: pertussis toxine), η οποία εμποδίζει τη σύνδεση της πρωτεΐνης Gαi με τον υποδοχέα, εμποδίζοντας τη μετάδοση του μηνύματος. 3/ ΟΙ ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ G 12 ΚΑΙ G q έχουν ανακαλυφθεί τελευταία. Δεν αποτελούν στόχο για τη PTX (PTX-resistants). Οι Gα q ενεργοποιούν μια φωσφολιπάση C-β, ενώ ο ρόλος των πρωτεϊνών Gα 12 δεν είναι ακόμη γνωστός. Τοξίνη του κοκίτη τοξίνη της χολέρας και η ADP-ριβοσυλίωση των G-πρωτεϊνών Και οι δυο τοξίνες, τόσο της χολέρας όσο και του κοκίτη είναι ένζυμα που τροποποιούν τις α-υπομονάδες των G πρωτεϊνών καταλύοντας την ομοιοπολική σύνδεση της ομάδας της ADP-ριβόζης του NAD +. Ας δούμε όμως με λεπτομέρειες πώς δρουν. ΤΟΞΙΝΗ ΤΗΣ ΧΟΛΕΡΑΣ (CTX). Η τοξίνη της χολέρας είναι μια πρωτεΐνη 87 kda με σύνθεση υπομονάδων ΑΒ 5, όπου οι Β υπομονάδες (103 κατάλοιπα η καθεμιά) δημιουργούν ένα πεντάγωνο δαχτυλίδι, στο οποίο συνδέεται η Α υπομονάδα (240 κατάλοιπα). Πριν από την έκκριση της τοξίνης της χολέρας, η Α υπομονάδα έχει κοπεί από μια βακτηριακή πρωτεάση, σε δυο κομμάτια το Α1 (του Ν-τελικού άκρου, 195 κατάλοιπα) και το Α2 (του C- τελικού άκρου, 45 κατάλοιπα), τα οποία όμως παραμένουν συνδεδεμένα με ένα δισουλφιδικό δεσμό.
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 187 Τοξίνη της χολέρας: εξαμερές ΑΒ 5 Α 1 Β1 Β 2 Α 2 Β 5 Β 3 Β 4 Β 1 Β 5 Εικόνα 5.19 Η δομή της τοξίνης της χολέρας. (α) Αναπαράσταση όλων των υπομονάδων Α(Α1+Α2)Β 5. (β) Η δομή μόνο του πενταμερούς Β 5, με τη μορφή πεντάγωνου δαχτυλιδιού. Από Voet and Voet, BIOCHEMISTRY, 2004. Η CTX συνδέεται στην επιφάνεια του κυττάρου σε γαγγλιοσίδια της μεμβράνης. Στη συνέχεια, η λιπόφιλη Α υπομονάδα (όχι οι Β) εισέρχεται με ενδοκύτωση στο εσωτερικό του κυττάρου. Στο κυτταρόπλασμα η Α1 διαχωρίζεται από την Α2 υπομονάδα, και είναι πλέον ικανή να καταλύσει την μη αντιστρεπτή μεταφορά της ADP-ριβόζης από το NAD + σε μια εξειδικευμένη Arg (Arg201) της Gas υπομονάδας. Η Arg201 βρίσκεται κοντά στην γ- φωσφορική ομάδα του συνδεδεμένου GTP, και η ριβοσυλίωσή της παρεμποδίζει τη δράση GTPάσης, με αποτέλεσμα να εμποδίζεται η υδρόλυση του GTP, και συνεπώς η Gas υπομονάδα να είναι συνεχώς ενεργοποιημένη. Θεωρείται δε ότι η διάρροια που προκαλεί οφείλεται στην αυξημένη παραγωγή camp λόγω της υπερενεργοποίησης της αδενυλικής κυκλάσης από την Gas υπομονάδα. ΤΟΞΙΝΗ ΤΟΥ ΚΟΚΙΤΗ (ΡTX). Η τοξίνη του κοκίτη έχει την ίδια δομή και τον ίδιο μηχανισμό δράσης με την τοξίνη της χολέρας, με τη μόνη διαφορά ότι μεταφέρει την ADPριβόζη σε μια Cys της Gai που βρίσκεται τέσσερις θέσεις πριν το C-τελικό άκρο. Η ριβοσυλίωση σε αυτήν τη θέση παρεμποδίζει τη σύνδεση υποδοχέα Gi πρωτεΐνης καθηλώνοντας τη Gi στην GDP-κατάσταση. Με αυτόν τον τρόπο εμποδίζεται η αρνητική δράση της Gai πρωτεΐνης.
188 Υποδοχείς που συνδέονται με G πρωτεΐνες (α) Vibrio cholerae γαγγλιοσίδιο (β) Εικόνα 5.20(α) Μετά τη σύνδεση της CTX στα γαγγλιοσίδια της μεμβράνης, η Α υπομονάδα της εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα, κόβεται στα δυο (Α1 και Α2) και η Α1 καταλύει τη ριβοσυλίωση της Gas υπομονάδας. (β) Η αντίδραση της ADP-ριβοσυλίωσης από την Α1 υπομονάδα. Η ADP-ριβόζη από το NAD + μεταφέρεται στην Arg201 της Gas, γεγονός που οδηγεί στην αναστολή της δράσης της GTPασης. Από Voet and Voet, BIOCHEMISTRY, 2004.