Γεωπονικό Πανεπιστήµιο Αθηνών Εργαστήριο Ποιοτικού Ελέγχου & Υγιεινής Τροφίµων & Ποτών ΜΕΛΕΤΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΑΠΟΛΥΜΑΝΤΙΚΩΝ ΣΤΗΝ ΑΠΟΜΑΚΡΥΝΣΗ ΒΙΟΫΜΕΝΙΩΝ LISTERIA MONOCYTOGENES ΠΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΖΟΝΤΑΙ ΣΕ ΕΠΙΦΑΝΕΙΕΣ ΑΝΟΞΕΙ ΩΤΟΥ ΧΑΛΥΒΑ ΥΠΟ ΙΑΦΟΡΕΤΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΗΣ ΠΡΑΚΤΙΚΗΣ Μακρυπούλια, Α., Σάτµαρη, Β., ροσινός, Ε.Χ. και Σκανδάµης, Π.Ν.
L. monocytogenes Farber and Peterkin,, 1991 Επιβίωση & Ανάπτυξη (Τ ψύξης, χαµηλό ph, υψηλές C NaCl) Μηχανισµοί επιβίωσης (quorum sensing, βιοϋµένια, αντοχή στα αντιµικροβιακά) Τρόφιµα (Έτοιµα προς κατανάλωση τρόφιµα, γαλακτοκοµικά προϊόντα, λαχανικά, ψάρια) Υψηλά % θνησιµότητας στις ευαίσθητες οµάδες
Βιοϋµένια Wong, 1998; Meyer, 2003; Hall-Stoodley et al. 2004 Τι; Πως; Που; οµηµένες, εξειδικευµένες οµάδες προσκολληµένων µ/ο µέσα σε καλούπι σύνθετης εξωπολυµερούς ουσίας EPS EPS: προστασία στους µ/ο είτε παρεµποδίζοντας την πρόσβαση των χηµικών ενώσεων είτε µειώνοντας τη συγκέντρωσή τους Οµάδες κυττάρων σχηµατίζονται, ωριµάζουν και αποκολλούνται για να διαδοθούν σε νέες επιφάνειες Monoculture & mixed culture biofilms Πλήθος επιφανειών βιοµηχανικός εξοπλισµός
Βιοϋµένια Γιατί; Εξασφάλιση σε προστατευτικό βαθµό, οµοιόστασης και σταθερότητας σε µεταβαλλόµενο περιβάλλον Εύκολη στρατηγική µικροβιακής επιβίωσης Hood and Zottola,, 1997 L. monocytogenes: επιβίωση επί µακρότερο χρονικό διάστηµα σε mixed cultures (Norwood and Gilmor, 2001; Gandhi & Chikindas,, 2007)
Σχηµατισµός
Απολύµανση Frank and Koffi,, 1990; Ronner and Wong, 1993; Sommers and Wong, 2004 L. monocytogenes biofilms σε ανοξείδωτο χάλυβα, πρίν (Α) και µετά (Β) από απολύµανση µε υπεροξεικό οξύ. (Pan et al., 2006) Μέθοδοι απολύµανσης: Φυσικές: θερµότητα (νερό, ατµός, αέρας), ακτινοβολία Χηµικές: Ενώσεις χλωρίου, ιωδίου, τεταρτοταγείς ενώσεις του αµµωνίου, Αµφολυτικά απολυµαντικά, Υπεροξείδια, Όζον Παράγοντες που επηρεάζουν τη δράση απολυµαντικών: ιάρκεια έκθεσης, Θερµοκρασία, Συγκέντρωση, Σκληρότητα νερού, Καθαρισµός
Στόχοι µελέτης Επίδραση της θερµικής επεξεργασίας στη µείωση βιοϋµενικού πληθυσµού Επίδραση του χρόνου απολύµανσης στη µείωση βιοϋµενικού πληθυσµού Επίδραση της προσαρµογής σε όξινη καταπόνηση στο σχηµατισµό και την ανθεκτικότητα των βιοϋµενίων ιερεύνηση σε πραγµατικές συνθήκες
Υλικά και µέθοδοι Εµβόλιο: L. monocytogenes ScottA Υπόστωµα: Tryptic Soy Broth + 0,6% Yeast Extract (TSB-YE) χωρίς Γλυκόζη µε 1% Γλυκόζη Α w : NaCl Θερµική επεξεργασία: Νερό (60 ο C) Απολυµαντικά: Εµπορική χλωρίνη (200 ppm Cl - ) QUAT (1 και 1,5 %) PAA (2 και 2,5%) Coupons: Ανοξείδωτος χάλυβας (20x50 50x2 mm, 30x8x1 mm) Neutralizer: Dey- Engley Μέτρηση: Tryptic Soy Agar + 0,6% Yeast Extract (TSA-YE)
Πειραµατικός σχεδιασµός Επίδραση aw Επίδραση ph-όξινης προσαρµογής Θερµική επεξεργασία-απολύµανση Απολύµανση Θεσσαλονίκη, Θεσσαλονίκη, 2ο 2ο
Σχηµατισµός Βιοϋµενίου Βιοϋµενικός πληθυσµός στους 5 ο C(µαύρες ράβδοι) και τους 20 ο C (άσπρες ράβδοι) στις 3 a w Πλανκτωνικός πληθυσµός στους 5 ο C και τις ενεργότητες 0,99 (µαύρες ράβδοι), 0,97 (άσπρες ράβδοι) και 0,96 (γκρίζες ράβδοι)
Θερµική επεξεργασία Σχηµατισµός: 5 ο C, 19d Θ. Ε.: 20 ο C, 20 min Σχηµατισµός: 20 ο C, 12d Θ. Ε.: 20 ο C, 20 min
Απολύµανση Σχηµατισµός: 5 ο C, 19d Α.: 1, 2, 3 min, PAA Σχηµατισµός: 20 ο C, 19d A.: 1, 2, 3 min, PAA
In vitro µελέτη Ανθεκτικότητα Βιοϋµενίων Πληθυσµός αιωρούµενων κυττάρων (planktonic) προ απολύµανσης και επιβίωση βιοϋµενικών κυττάρων, κατόπιν επώασης σε TSB µε ph 7.0 για 12 µέρες στους 4 C και πλύση µε νερό ή απολύµανση µε διαφορετικά απολυµαντικά για 6 λεπτά
In vitro µελέτη Ανθεκτικότητα Βιοϋµενίων Πληθυσµός αιωρούµενων κυττάρων (planktonic) προ απολύµανσης και επιβίωση βιοϋµενικών κυττάρων, κατόπιν επώασης σε TSB µε ph 5.0 για 12 µέρες στους 4 C και πλύση µε νερό ή απολύµανση µε διαφορετικά απολυµαντικά για 6 λεπτά
Συµπεράσµατα Η χρήση ζεστού νερού (60 C) έχει µικρή έως και καθόλου αποτελεσµατικότητα, στη θανάτωση των προσκολληµένων κυττάρων. Η διάρκεια της απολύµανσης παίζει καθοριστικό ρόλο στην αποτελεσµατικότητα ενός απολυµαντικού (σε συνδυασµό µε άλλους παράγοντες Τ, a w ). Συγκεκριµένα, βρέθηκε πως ο χρόνος των 6 min είναι επαρκής για την αποµάκρυνση του συνόλου του βιουµενικού πληθυσµού από το κουπόνι, συµπέρασµα κοινό για όλες τις a w και Τ.
Συµπεράσµατα Όσο πιο ευνοϊκές είναι οι συνθήκες στη δηµιουργία βιουµενίου, τόσο πιο δύσκολη είναι η αποµάκρυνσή του. Αποτελεσµατικότητα απολύµανσης: : PAA, QUAT >> Cl - >>> Η 2 Ο (60 o C) Με την τακτική απολύµανση, αποφεύγεται η δηµιουργία ανθεκτικών βιοϋµενίων, ιδιαίτερα σε έλαφρώς όξινα περιβάλλοντα (π.χ. βιοµηχανία παρασκευής τυροκοµικών προϊόντων).
Επίδραση υποστρώµατος Πραγµατικές συνθήκες? Επιφάνειες σε επαφή µε γάλα παραδοσιακή κρέµα
Προσοµοιώσεις (Sommers and Wong, 2004; Gram et al. 2007) Food soiled surface Planktonic Detached Biofilms L. monocytogenes Natural flora Planktonic Biofilms
Προσκόλληση Λιστέρια-ΟΜΧ log CFU/ml or cm 2 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Ringer- Listeria Ringer- TVC Attachment 5 C Attachment 20 C Milk- Listeria Milk-TVC Crème- Listeria Crème- TVC Yoghurt- Listeria lo g C F U /m l o r c m 2 Yoghurt- TVC Plaktonics 10Biofilms 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Milk-High Inoc- Listeria Milk-High Inoc-TVC Milk-Low Inoc- Listeria Milk-Low Inoc-TVC Crème-Low Inoc- Listeria Crème-Low Inoc-TVC Plaktonics Biofilms
10 9 8 7 Αποκόλληση βιοϋµενίων LM και επιµόλυνση προϊόντων Yoghurt, 5 o C -> > Milk, 20 o C Yoghurt, 5 o C -> > Crème, 20 o C Ringer, 5 o C -> > Yoghurt -> > Milk, 5 o C Milk, 5 o C -> > Yoghurt -> > Milk, 5 o C Yoghurt, 5 o C -> > Crème, 5 o C Yoghurt, 5 o C -> > Milk, 5 o C log CFU/ml 6 5 4 3 2 1 0 0 5 10 15 20 25 30 35 DAYS
Απολύµανση βιοϋµενίων σχηµατισµένων σε γάλα στους 5 o C
Γενικό συµπέρασµα Η µακρόχρονη παραµονή βιοϋµενίων στις επιφάνειες επεξεργασίας εγκυµονεί κινδύνους ισχυρής προσκόλλησης-ανεπαρκούς ανάκτησης µε κλασσικές µεθόδους ανίχνευσης µε αποτέλεσµα την υπερεκτίµηση της αποτελεσµατικότητας των µεθόδων εξυγίανσης
Ευχαριστίες Χαραλαµπία Μπελέσση Υποψήφια ιδάκτωρ European Integrated Project BIOTRACER
Ευχαριστώ για την προσοχή σας
4 3,5 3 2,5 log cfu/ml 2 1,5 1 0,5 0 Βιουµενικός πληθυσµός 0,99 0,97 0,96 Ενεργότητες Σχηµατισµός Βιοϋµενίου Βιοϋµενικός πληθυσµός στους 5 ο C(µαύρες ράβδοι) και τους 20 ο C (άσπρες ράβδοι) στις 3 a w Planktonics 5C 10 9 Πλαγκτωνικός πληθυσµός στους 5 ο C και τις ενεργότητες 0,99 (µαύρες ράβδοι), 0,97 (άσπρες ράβδοι) και 0,96 (γκρίζες ράβδοι) log cfu/ml 8 7 6 5 4 3 2 0.99 0.97 0.96 1 0 0 5 9 14 18 Εν εργότητες
4,5 3,5 2,5 log cfu/ml 2 1,5 0,5 Βιουµενικός πληθυσµός 5C µετά από θερµική επεξεργασία(60 C,20 min,day 19) 4 3 1 0 0,99 0,97 0,96 Ενεργότητες Χωρ Επ ανάληψη 1η Επ ανάληψη 2η Επ ανάληψη 3η Χωρίς θερµική επεξεργασία(day 10) Θερµική επεξεργασία Σχηµατισµός: 5 ο C, 19d Θ. Ε.: 20 ο C, 20 min Βιουµενικός πληθυσµός 20C µετά από θερµική επεξεργασία (60 min,day 12) 6 5 Σχηµατισµός: 20 ο C, 12d Θ. Ε.: 20 ο C, 20 min log cfu/ml 4 3 2 Επανάληψη 1η Επανάληψη 2η Επανάληψη 3η 1 Χωρίς θερµική επεξεργασία (day 7) 0 0,99 0,97 0,96 Ενεργότητες
Βιουµενικός πληθυσµός (day 19, 5C) log cfu/ml 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0,99 0,97 0,96 Χωρίς απολύµανση Απολύµανση 1 min Απολύµανση 2 min Απολύµανση 3 min Απολύµανση Σχηµατισµός: 5 ο C, 19d Α.: 1, 2, 3 min, PAA Ενεργ ότητες Βιουµενικός πληθυσµός (day 12,20C) 6 5 Σχηµατισµός: 20 ο C, 19d A.: 1, 2, 3 min, PAA log cfu/ml 4 3 Χωρίς απολύµανση Απολύµανση 1 min 2 Απολύµανση 2 min 1 Απολύµανση 3 min 0 0,99 0,97 0,96 Εν εργότητες
Ανθεκτικότητα Βιοϋµενίων 10 9 (α) Nonadapted Planktonic Biofilms-προ απολ/σης 10 9 (β) Acid adapted Planktonic Biofilms-προ απολ/σης 8 Biofilms-H2O 8 Biofilms-H2O Log C F U /m l o r c m 2 7 6 5 4 3 Biofilms-Cl (200ppm) Biofilms-QUAT (1.5%) Biofilms-PAA (2.5%) Log CFU/ml or cm2 7 6 5 4 3 Biofilms-Cl (200ppm) Biofilms-QUAT (1.5%) Biofilms-PAA (2.5%) 2 2 1 1 0 0 4 8 12 Μέρες 0 0 4 8 12 Μέρες Πληθυσµός αιωρούµενων κυττάρων (planktonic) προ απολύµανσης και επιβίωση βιοϋµενικών κυττάρων, κατόπιν επώασης σε TSB µε ph 7.0 για 12 µέρες στους 4 C και πλύση µε νερό ή απολύµανση µε διαφορετικά απολυµαντικά για 6 λεπτά
Ανθεκτικότητα Βιοϋµενίων 9 8 (α) Nonadapted Planktonic Biofilms-προ απολ/σης 9 8 (β) Acid adapted Planktonic Biofilms-προ απολ/σης L og C F U /m l o r c m 2 7 6 5 4 3 Biofilms-H2O Biofilms-Cl (200ppm) Biofilms-QUAT (1.5%) Biofilms-PAA (2.5%) L og C F U /m l o r c m 2 7 6 5 4 3 Biofilms-H2O Biofilms-Cl (200ppm) Biofilms-QUAT (1.5%) Biofilms-PAA (2.5%) 2 2 1 1 0 0 4 8 12 Μέρες 0 0 4 8 12 Μέρες Πληθυσµός αιωρούµενων κυττάρων (planktonic) προ απολύµανσης και επιβίωση βιοϋµενικών κυττάρων, κατόπιν επώασης σε TSB µε ph 5.0 για 12 µέρες στους 4 C και πλύση µε νερό ή απολύµανση µε διαφορετικά απολυµαντικά για 6 λεπτά
Προσκόλληση L. monocytogenes σε κουπόνια
Αποκόλληση Μεταφορά βακτηρίων σε νέες επιφάνειες ή σε ευαίσθητο ξενιστή Αυθόρµητη συµπεριφορά, εξαρτώµενη από συνθήκες ροής ή έλλειψης θρεπτικών Έγκυρη αποίκηση νέας βιοθέσης (niche) πρίν ο χώρος και τα θρεπτικά περιοριστούν 3 διαφορετικοί τρόποι διάδοσης