ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ ΣΕ ΑΝΟΞΕΙ ΩΤΟ ΧΑΛΥΒΑ ΑΠΟ ΤΗ Salmonella Enteritidis ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΗΣ ΣΕ ΙΑΦΟΡΕΤΙΚΑ ΠΡΟΤΥΠΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ: ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΜΕΣΕΠΙΦΑΝΕΙΑΣ ΥΓΡΟΥ- ΑΕΡΑ ΚΑΙ ΤΗΣ ΙΑΘΕΣΙΜΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΘΡΕΠΤΙΚΩΝ ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ Γκιαούρης Ε. και Νυχάς Γ.-Ι. Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίµων, Τµήµα Επιστήµης και Τεχνολογίας Τροφίµων, Γεωπονικό Πανεπιστήµιο Αθήνας, Ιερά Οδός. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ο σχηµατισµός βιο-υµενίου σε ανοξείδωτο χάλυβα από τη Salmonella Enteritidis PT κατά την ανάπτυξη της σε τρία διαφορετικά πρότυπα συστήµατα επεξεργασίας τροφίµων µελετήθηκε. Για µέσο ανάπτυξης χρησιµοποιήθηκε θρεπτικός ζωµός Tryptone Soy (TSB). Η ικανότητα του µικροοργανισµού να σχηµατίζει βιο-υµένιο πάνω στις επιφάνειες ανοξείδωτου χάλυβα µελετήθηκε για συνολική περίοδο 1 ηµερών στους 20 ο C, κάτω από τρεις διαφορετικές πειραµατικές µεταχειρίσεις: (i) το µέσο ανάπτυξης παρέµενε σταθερό καθ όλη την διάρκεια της περιόδου επώασης (ii) το υλικό ανάπτυξης ανανεωνόταν κάθε δύο µέρες και (iii) το µέσο ανάπτυξης ανανεώνονταν κάθε δύο µέρες και παράλληλα τα πλαγκτονικά κύτταρα από το παλιό µέσο ανάπτυξης µεταφέρονταν στο νέο µέσο. Βρέθηκε πως το βιο-υµένιο αναπτύχθηκε καλύτερα και µεγαλύτερος αριθµός προσκολληµένων κυττάρων (περ. 10 cfu/cm 2 ) ανακτήθηκε όταν ο µικροοργανισµός αναπτύσσονταν σε περιοδικά ανανεώσιµο θρεπτικό µέσο, παρά αν το τελευταίο παρέµενε σταθερό. Ανεξάρτητα από την διαθεσιµότητα των θρεπτικών στοιχείων το βιο-υµένιο αναπτυσσόταν καλύτερα όταν οι µεταλλικές επιφάνειες δεν καλύπτονταν τελείως από το υγρό µέσο ανάπτυξης και µέρος τους βρίσκονταν έτσι στη µεσεπιφάνεια υγρού-αέρα (airliquid interface), παρά όταν οι µεταλλικές επιφάνειες ήταν εξ ολοκλήρου βυθισµένες στο θρεπτικό µέσο (διαφορά της τάξεως των 2- δεκαδικών λογαρίθµων στον αριθµό των προσκολληµένων κυττάρων). Από τα αποτελέσµατα της παρούσης µελέτης διαπιστώνεται πως η ύπαρξη µεσεπιφάνειας υγρού-αέρα και η επάρκεια θρεπτικών στοιχείων ευνοούν το σχηµατισµό βιο-υµενίου από τη σαλµονέλα. Πιθανή επίδραση των πλαγκτονικών κυττάρων στάσιµης φάσης (stationary phase planktonic cells) στον σχηµατισµό βιουµενίου από τα προσκολληµένα κύτταρα (sessile cells) συζητείται επίσης. Λέξεις ευρετηρίασης: βιο-υµένια, σαλµονέλα, ανοξείδωτος χάλυβας, µεσεπιφάνειες, θρεπτική διαθεσιµότητα, quorum sensing. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο όρος βιο-υµένιο χρησιµοποιείται για να περιγράψουµε ένα πληθυσµό µικροοργανισµών που συσσωρεύεται πάνω σε επιφάνειες, συνήθως σε υδατικά περιβάλλοντα (Hood and Zottola, 199). Ο σχηµατισµός βιο-υµενίων έχει σοβαρές επιδράσεις στη βιοµηχανία τροφίµων, καθώς η ύπαρξη τους σε περιβάλλοντα επεξεργασίας τροφίµων µπορεί να προκαλέσει επιµόλυνση των προϊόντων, µειώνοντας έτσι τη διάρκεια συντήρησης τους και αυξάνοντας την πιθανότητα πρόκλησης τροφικών δηλητηριάσεων (Hall-Stoodley et al., 200). Οι προσκολληµένοι σε επιφάνειες µικροοργανισµοί (sessile microorganisms) πλεονεκτούν έναντι των ελευθέρων διαβιούντων-πλαγκτονικών (planktonic) µικροοργανισµών στο ότι είναι πιο δύσκολο να αποµακρυνθούν µηχανικά από τις επιφάνειες και είναι πιο ανθεκτικοί σε απολυµαντικά (Morton et al., 199). Η σαλµονέλα (Salmonella sp.) είναι ένα παθογόνο µικρόβιο που προκαλεί ιδιαίτερα προβλήµατα στις βιοµηχανίες τροφίµων και κυρίως σε αυτές που ασχολούνται µε την
επεξεργασία των πουλερικών (Adams and Moss, 199). Μελέτες που έχουν πραγµατοποιηθεί µέχρι στιγµής έχουν δείξει πως η σαλµονέλα είναι ικανή να προσκολλάται και να σχηµατίζει βιο-υµένια σε διάφορες επιφάνειες (Joseph et al., 2001). Έχει παρατηρηθεί πως η προσκόλληση σε επιφάνειες των βακτηρίων επηρεάζεται από διάφορους παράγοντες, συµπεριλαµβανοµένων: του µέσου ανάπτυξης, της κινητικότητας και της φάσης ανάπτυξης των κυττάρων, του τύπο και των ιδιοτήτων του υλικού προσκόλλησης, της παρουσίας οργανικού υλικού (conditioning film), της θερµοκρασίας, του ph, της διάρκειας της περιόδου επαφής και της παραγωγής εξωκυτταρικών πολυσακχαριτών (Apilanez et al., 199, Chandy and Angles, 2001). εν υπάρχουν παρόλ αυτά αρκετές διαθέσιµες πληροφορίες όσον αφορά την επίδραση της διαθεσιµότητας των θρεπτικών στοιχείων και την πιθανή συνεργιστική ή ανταγωνιστική δράση (cell-to-cell interactions) των πλαγκτονικών µικροοργανισµών στην προσκόλληση και το σχηµατισµό βιο-υµενίου στις επιφάνειες από τα κύτταρα που έρχονται σε επαφή µε αυτές. Στα συστήµατα που χρησιµοποιούνται σήµερα στην εργαστηριακή έρευνα σχετική µε τα βιο-υµένια περιλαµβάνονται συνήθως ανάπτυξη σε επιφάνειες που είναι συνεχώς βυθισµένες σε στατικό ή ρέων µέσο ανάπτυξης (static or flowing growth medium) (Wijeyekoon et al., 200). Αυτά τα συστήµατα προσοµοιάζουν την ανάπτυξη βιο-υµενίων σε µερικές επιφάνειες υπό ορισµένες συνθήκες, αλλά δεν παρέχουν ακριβές πληροφορίες σχετικά µε άλλους τύπους βιο-υµενικών κοινοτήτων. Μέχρι στιγµής η περισσότερη προσοχή έχει εστιαστεί σε βιο-υµένια που προκύπτουν από την αποίκιση στις µεσεπιφάνειες στερεών-υγρών (solid-liquid interfaces), αλλά υπάρχουν και άλλα είδη επιφανειών και µεσεπιφανειών που παρέχουν οικολογική ευκαιρία για τα βακτήρια. Η πιο κοινή από αυτές είναι η µεσεπιφάνεια µεταξύ αέρα και υγρού, η οποία όταν αποικείται παρέχει στα βακτήρια πρόσβαση τόσο στην αέρια (οξυγόνο) όσο και στην υγρή φάση (θρεπτικά στοιχεία). Εντούτοις, οι αποίκιση σε αυτές τις επιφάνειες έχει µελετηθεί ελάχιστα και υπάρχουν λίγα βακτήρια ικανά να αποικίσουν αυτή τη θέση (niche) (Spiers et al., 200). Η γνώση πώς τα παθογόνα προσκολλούνται και επιζούν πάνω στις επιφάνειες είναι λοιπόν πολύ σηµαντική. Προς αυτή την κατεύθυνση, οι σκοποί αυτής της µελέτης ήταν να χρησιµοποιηθούν πρότυπα συστήµατα (model systems) ικανά να µιµηθούν πιθανές βιοµηχανικές συνθήκες επεξεργασίας τροφίµων (βυθισµένη επιφάνεια, ύπαρξη µεσεπιφάνειας υγρού-αέρα, σταθερό / ανανεώσιµο µέσο ανάπτυξης, παρουσία πλαγκτονικών κυττάρων), κάτω από ελεγχόµενες εργαστηριακές συνθήκες, σε µια προσπάθεια να κατανοηθούν καλύτερα οι φυσιολογικοί µηχανισµοί που ευθύνονται για το σχηµατισµό βιο-υµενίου από τη Salmonella Enteritidis πάνω σε ανοξείδωτο χάλυβα. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Επιφάνειες και διαδικασία ανάπτυξης βιο-υµενίου Χρησιµοποιήθηκαν επιφάνειες ανοξείδωτου χάλυβα διαστάσεων cm x 0.cm x 0.1cm, οι οποίες τοποθετήθηκαν ξεχωριστά σε κοντούς δοκιµαστικούς σωλήνες που περιείχαν, είτε ml, είτε.ml TSB, ενοφθαλµισµένο µε τον µικροοργανισµό (10 cfu/ml) και επωάστηκαν για 1 ηµέρες κάτω από διάφορες πειραµατικές συνθήκες για την ανάπτυξη βιο-υµενίου πάνω σε αυτές. Οι επιφάνειες καλύπτονταν τελείως από τα ml θρεπτικού υλικού και αντιθέτως το ανώτερο µέρος τους βρισκόταν στην µεσεπιφάνεια υγρού-αέρα όταν η επώαση τους γινότανε σε.ml. Σε όλες τις περιπτώσεις η επώαση έγινε στους 20 ο C χωρίς ανάδευση. ειγµατοληψίες για την ποσοτικοποίηση του σχηµατιζόµενου βιο-υµενίου πραγµατοποιήθηκαν κάθε µέρα για κάθε µεταχείριση. Πειραµατικές περιπτώσεις και σκέψεις
Αρχικά, ο σχηµατισµός του βιο-υµενίου πάνω στις επιφάνειες µελετήθηκε όταν το µέσο ανάπτυξης παρέµενε σταθερό καθ όλη τη διάρκεια της περιόδου επώασης. Αυτό το σενάριο θα µπορούσε να προσοµοιάζει για παράδειγµα το σχηµατισµό βιο-υµενίου πάνω στους τοίχους µιας βιοµηχανίας τροφίµων, όπου µολυσµένα υπολείµµατα τροφίµων παραµένουν για µεγάλη χρονική περίοδο στο ίδιο µέρος. Στη δεύτερη περίπτωση, µετά από επώαση για ώρες, οι µεταλλικές επιφάνειες αποµακρύνθηκαν ασηπτικά από το θρεπτικό ζωµό, εκπλύθηκαν µε αποστειρωµένο διάλυµα Ringer για την αποµάκρυνση των χαλαρά προσκολληµένων κυττάρων και τοποθετήθηκαν σε νέους κοντούς δοκιµαστικούς σωλήνες µε φρέσκο θρεπτικό υλικό. Αυτή η διαδικασία επαναλήφθηκε 9 φορές, κάθε δεύτερη µέρα. Αυτό το σενάριο προσοµοιάζει, ίσως καλύτερα από το πρώτο, πραγµατικές καταστάσεις που ενδέχεται να υπάρξουν σε µια βιοµηχανία τροφίµων. Τέλος, το βιο-υµένιο αφέθηκε να σχηµατιστεί πάνω στις επιφάνειες όπως στη δεύτερη περίπτωση, αλλά επιπλέον, κάθε δεύτερη µέρα αποµακρύνονταν από τους δοκιµαστικούς σωλήνες η πλαγκτονική καλλιέργεια και παραλαµβάνονταν µε φυγοκέντρηση (10000rpm/10min) τα πλαγκτονικά κύτταρα τα οποία στη συνέχεια µεταφέρονταν στο νέο δοκιµαστικό σωλήνα που περιείχε το φρέσκο θρεπτικό υλικό. Ο κύριος σκοπός της τελευταίας πειραµατικής περίπτωσης ήταν να διερευνηθεί πιθανή ύπαρξη αλληλεπιδράσεων (cell-to-cell interactions) ανάµεσα στα πλαγκτονικά και τα προσκολληµένα κύτταρα. Τα «σινιάλα» µεταξύ των κυττάρων (cellcell signaling) πιστεύεται τελευταία πως αποτελούν σηµαντικό χαρακτηριστικό των µικροβιακών κοινοτήτων και πρόσφατα αποτελέσµατα έχουν δείξει πως επηρεάζουν το σχηµατισµό βιο-υµενίου (Davey and O Toole, 2000). Το φαινόµενο είναι γνωστό µε τον όρο quorum sensing, µέσω του οποίου πιστεύεται πως ρυθµίζεται η έκφραση συγκεκριµένων γονιδίων που κωδικοποιούν για επιθυµητά χαρακτηριστικά / πρωτεΐνες. Ποσοτικοποίηση βιο-υµενίου Ο ποσοτικός προσδιορισµός του σχηµατιζόµενου βιο-υµενίου έγινε µέσω της τεχνικής που περιγράφεται από Giaouris et al. (200), µετά από τροποποίηση. Σε κάθε δειγµατοληψία, οι µεταλλικές επιφάνειες εξήχθησαν από τους δοκιµαστικούς σωλήνες, όπου ήταν εµβαπτισµένες, µε αποστειρωµένη λαβίδα. Εκπλύθηκαν δύο φορές µε 10ml αποστειρωµένου διαλύµατος Ringer µε τη βοήθεια πιπέτας (10x2=20ml), για την αποµάκρυνση των ασθενώς προσκολληµένων κυττάρων. Μεταξύ των δύο εκπλύσεων, οι µεταλλικές επιφάνειες τοποθετήθηκαν για min µέσα σε αποστειρωµένους δοκιµαστικούς σωλήνες µε ml διάλυµα Ringer. Μετά τη δεύτερη έκπλυση οι µεταλλικές επιφάνειες εισήχθησαν σε δοκιµαστικούς σωλήνες που περιείχαν ml αποστειρωµένου διαλύµατος Ringer και από 10 γυάλινα σφαιρίδια (διαµ. -mm). Οι δοκιµαστικοί σωλήνες, µε το Ringer, τα σφαιρίδια και τις µεταλλικές επιφάνειες, στροβιλίστηκαν για 2min σε αναδευτήρα στροβιλισµού (vortex), προκειµένου να αποκολληθεί το βιο-υµένιο. Μετά το στροβιλισµό προσδιορίστηκε το µικροβιακό φορτίο στο διάλυµα Ringer (cfu/ml). Η απαρίθµηση του µικροβιακού φορτίου έγινε µε την τεχνική της επιφανειακής εξάπλωσης (spread plate technique) και απαρίθµησης των σχηµατιζόµενων αποικιών σε τρυβλία Tryptone Soy Agar (TSA), µετά από επώαση στους ο C για 1 ώρες. O αριθµός των αποικιών στα τρυβλία TSA (cfu/ml) µετατράπηκε σε αριθµός κυττάρων βιο-υµενίου πάνω στις µεταλλικές επιφάνειες (cfu/cm 2 ). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της παρούσης µελέτης, όταν οι µεταλλικές επιφάνειες καλύπτονταν τελείως από το θρεπτικό µέσο ανάπτυξης και ο µικροοργανισµός επωάστηκε σε περιοδικά ανανεώσιµο µέσο ανάπτυξης, όπως επίσης και όταν στο φρέσκο θρεπτικό υλικό µεταφέρονταν τα πλαγκτονικά κύτταρα από το παλιό, το βιο-υµένιο έφτασε στα 10 cfu/cm 2 περίπου την 1 η -1 η µέρα (Εικόνα 1Α). Από την άλλη µεριά, όταν το
θρεπτικό µέσο παρέµενε σταθερό, το µέγιστο επίπεδο του βιο-υµενίου ήταν περίπου 10 cfu/cm 2. Παροµοίως, όταν οι µεταλλικές επιφάνειες δεν ήταν εξ ολοκλήρου βυθισµένες στο θρεπτικό µέσο και έτσι µέρος τους ήταν στην µεσεπιφάνεια υγρού-αέρα η προσκόλληση της σαλµονέλας στον χάλυβα ήταν µεγαλύτερη από την 9 η µέρα της επώασης, όταν το θρεπτικό µέσο ανανεώνονταν κάθε δύο µέρες (10 cfu/cm 2 ), απ ότι όταν το θρεπτικό µέσο παρέµενε σταθερό (Εικόνα 1Β). Αυτά τα αποτελέσµατα δείχνουν πως ο σχηµατισµός βιο-υµενίου περιορίζεται από τη θρεπτική διαθεσιµότητα και έτσι φαίνεται πως υψηλά επίπεδα θρεπτικών στοιχείων βοηθούν στο να φτιάξει η σαλµονέλα ισχυρότερο βιο-υµένιο. εν φάνηκε να υπάρχει διαφορά στη ποσότητα του βιο-υµενίου όταν τα πλαγκτονικά κύτταρα από το παλιό θρεπτικό µέσο µεταφέρονταν στο νέο µέσο. Ο αριθµός των προσκολληµένων κυττάρων παρέµεινε σχεδόν ο ίδιος ανεξαρτήτως της ύπαρξης των πλαγκτονικών κυττάρων στάσιµης φάσης. Είναι σηµαντικό να σηµειωθεί πως εκτός της διαθεσιµότητας των θρεπτικών στοιχείων, η ύπαρξη της µεσεπιφάνειας αέρα-υγρού φαίνεται να είναι πολύ σηµαντική και βοηθά τα βακτήρια να προσκολλώνται στις επιφάνειες (Εικόνα 2). Ο σχηµατισµός του βιο-υµενίου βρέθηκε να είναι ευαίσθητος στη διαθεσιµότητα του οξυγόνου (2 λογάριθµοι διαφορά από την η ηµέρα ανάµεσα στις βυθισµένες επιφάνειες και αυτών που είχαν µέρος τους εκτεθειµένο στον αέρα). Τα περισσότερα βακτήρια όταν πολλαπλασιάζονται για 20 γενιές ή περισσότερες µέσα σε χωροταξικά δοµηµένο (spatially structured) περιβάλλον (π.χ. µη-αναδευόµενη υγρή καλλιέργεια µέσα σε δοκιµαστικό σωλήνα), βακτήρια (µεταλλαγµένα στελέχη, mutants) µε αυξηµένη ικανότητα να αποικούν την µεσεπιφάνεια υγρού-αέρα συνήθως ανέρχονται στην επιφάνεια (Solano et al., 2002). Στα βακτήρια Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis και Pseudomonas fluorescens αυτά τα στελέχη παρουσιάζουν αυξηµένη ενεργοποίηση ιδιοτήτων που συνδέονται µε το φαινόµενο της προσκόλλησης και της αποίκησης σε επιφάνειες. Όλα παράγουν πολυµερή κυτταρίνης και σε όλες τις περιπτώσεις αυτά τα πολυµερή αποτελούν την κύρια αιτία της αποίκισης της µεσεπιφάνειας. Εντούτοις, τα πειραµατικά αποτελέσµατα επιτεύχθηκαν χρησιµοποιώντας καθαρή καλλιέργεια µικροοργανισµού και ακόµα κι αν οι φυσικοχηµικές συνθήκες προσεγγίζουν αυτές που συναντιούνται σε µια βιοµηχανία τροφίµων, αυτά τα αποτελέσµατα ίσως να είναι παραπλανητικά έναντι µιας πιο ρεαλιστικότερης κατάστασης, µε µεικτή καλλιέργεια µικροοργανισµών. Η σηµασία αυτής της εργασίας βρίσκεται στην επέκταση της γνώσης µας όσον αφορά την επίδρασης των πιθανών συνθηκών επιµόλυνσης στη προσκόλληση της σαλµονέλας στον βιοµηχανικό εξοπλισµό. Οι µικροοργανισµοί από τις πρώτες ύλες, το περιβάλλον, τους εργαζοµένους ή τα έντοµα και τα τρωκτικά που καταφέρνουν την είσοδο τους στις εγκαταστάσεις µπορούν να γίνουν ενδηµικοί στον εξοπλισµό, επιζώντας των διαδικασιών καθαρισµού και απολύµανσης. Μια καλύτερη κατανόηση των βιο-υµενίων µπορεί να µας παράσχει πολύτιµες πληροφορίες στην πρόληψη του σχηµατισµού τους. A B 0 2 10 12 1 1 1 0 2 10 12 1 1 1
Εικόνα 1. Καµπύλες σχηµατισµού βιο-υµενίου Salmonella Enteritidis πάνω στις επιφάνειες ανοξείδωτου χάλυβα (επώαση: Α. µέσα σε ml TSB, B. µέσα σε.ml TSB) συναρτήσει των ηµερών επώασης στους 20 ο C το µέσο ανάπτυξης ανανεώνονταν κάθε δύο µέρες, το µέσο ανάπτυξης παρέµενε σταθερό και το µέσο ανάπτυξης ανανεώνονταν κάθε δεύτερη µέρα και παράλληλα τα πλαγκτονικά κύτταρα µεταφέρονταν στο φρέσκο µέσο. 0 2 10 12 1 1 1 Εικόνα 2. Καµπύλες σχηµατισµού βιο-υµενίου Salmonella Enteritidis πάνω στις επιφάνειες ανοξείδωτου χάλυβα συναρτήσει των ηµερών επώασης στους 20 ο C (µέσο ανάπτυξης σταθερό) επώαση µέσα σε.ml TSB (ύπαρξη µεσεπιφάνειας υγρού-αέρα), επώαση µέσα σε ml TSB. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Adams M.R. and Moss M.O., 199. Bacterial agents of foodborne illness: Salmonella. In: Food Microbiology, p192-20. The Royal Society of Chemistry. Apilanez I., Gutierrez A. and Diaz M., 199. Effect of surface materials on initial biofilm development. Bioresource Technology,, 22-20. Chandy J.P. and Angles M.L., 2001. Determination of nutrients limiting biofilm formation and the subsequent impact on disinfectant decay. Water Research, (11), 2-22. Cutter L.A., van Schie P.M. and Fletcher M., 200. Adhesion of anaerobic microorganisms to solid surfaces and the effect of sequential attachment on adhesion characteristics. Biofouling, 19(1), 9-1. Davey M.E. and O Toole G.A., 2000. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews, (), -. Giaouris E., Chorianopoulos N. and Nychas G.-J., 200. Application of a novel method to study the effect of temperature, ph and water activity on biofilm formation by Salmonella enterica Enteritidis PT on stainless steel surfaces. Letters in Applied Microbiology Hall-Stoodley L., Costerton J.W., Stoodley P., 200. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Microbiology Reviews, 2, 9-10. Hood S.K. and Zottola E.A., 199. Biofilms in food processing. Food Control, (1), 9-1. Joseph B., Otta S.K., Karunasagar I. and Karunasagar I., 2001. Biofilm formation by Salmonella spp. on food contact surfaces and their sensitivity to sanitizers. International Journal of Food Microbiology,, -2. Morton L.H.G., Greenway D.L.A., Gaylarde C.C. and Surman, 199. Consideration of some implications of the resistance of biofilms to biocides. International Biodeterioration and Biodegradation, 1, 2-29. Wijeyekoon S., Mino T., Satoh H. and Matsuo T., 200. Effects of substrate loading on biofilm structure. Water research,, 29-2.