Ανάπτυξη Mοριακών Tεχνικών Real-Time PCR για την Aνίχνευση Eντεροαιμορραγικών Στελεχών E. coli, Campylobacter jejuni και Salmonella spp.

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "Ανάπτυξη Mοριακών Tεχνικών Real-Time PCR για την Aνίχνευση Eντεροαιμορραγικών Στελεχών E. coli, Campylobacter jejuni και Salmonella spp."

Μαριάμ Κορομηλάς
8 χρόνια πριν
Προβολές:

1 Ανάπτυξη Mοριακών Tεχνικών Real-Time PCR για την Aνίχνευση Eντεροαιμορραγικών Στελεχών E. coli, Campylobacter jejuni και Salmonella spp. 5 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας

2 Η εφαρμογή μοριακών τεχνικών στην ανίχνευση παθογόνων μικροοργανισμών Η ταυτοποίηση ενός μικροοργανισμού παραδοσιακά βασιζόταν σε πολύπλοκες, χρονοβόρες και όχι πάντοτε ακριβείς διαδικασίες καλλιέργειας, εμπλουτισμού και βιοχημικών διεργασιών. Η μεταγονιδιωματική (post-genomic) εποχή Η αποκωδικοποίηση του γoνιδιώματος πολλών παθογόνων μικροοργανισμών, σήμερα, εξασφαλίζει την δυνατότητα μοριακής ταυτοποίησης κάθε είδους ή στελέχους με βάση τη γενετική του σύσταση.

3 Πρόβλεψη υδατογενών επιδημιών H ικανότητα ανίχνευσης παθογόνων μικροοργανισμών (Salmonella, E. Coli O157:H7 και Campylobacter jejuni) με μοριακές τεχνικές (real time-pcr) μπορεί να προβλέψει τις σοβαρές συνέπειες μιας υδατογενούς επιδημίας στον πληθυσμό. Η ικανότητα πρόβλεψης της παρουσίας ενός παθογόνου μικροοργανισμού, λίγες μόλις ώρες μετά την ολοκλήρωση μιας δειγματοληψίας, μπορεί να οδηγήσει στη λήψη έγκαιρων μέτρων προστασίας ενάντια στην εκδήλωση μιας επιδημίας.

μιας υδατογενούς επιδημίας στον πληθυσμό.

4 Escherichia coli O157:H7 Εντεροαιμορραγικό στέλεχος Escherichia coli (ΕΗΕC). Προκαλεί σοβαρές εντερικές λοιμώξεις (αιμορραγικές κολίτιδες), διάρροια και υψηλό πυρετό. 2-7% περιστατικών υποτροπιάζει στο αιμολυτικόουραιμικό σύνδρομο (HUS). Προσβάλει κυρίως παιδιά κάτω των 5 ετών και ηλικιωμένους. Παράγει εντεροτοξίνες (Shiga-like τοξίνες, γονίδια stx1, stx2)

2-7% περιστατικών υποτροπιάζει στο αιμολυτικόουραιμικό σύνδρομο (HUS).

5 Escherichia coli O157:H7 ΕΤΟΣ ΠΕΡΙΟΧΗ ΠΕΡΙΣΤΑΤΙΚΑ ΘΑΝΑΤΟΙ ΠΗΓΗ 1993 ΗΠΑ >700 4 Κρέας 1996 Ιαπωνία Παντζάρια 1999 Αγγλία 88 0 Γάλα 2000 Καναδάς Νερό 2005 Σουηδία Μαρούλι

1996 Ιαπωνία 6000 2 Παντζάρια 1999 Αγγλία 88 0

6 Salmonella spp. Gram αρνητικοί βάκιλοι, προκαλούν εντερικές λοιμώξεις. Είδη: Salmonella enterica (ή Salmonella choleraesuis), Salmonella bongori και Salmonella typhi Κατηγοριοποίηση σε 2000 υποείδη (ορότυποι) ανάλογα με τα σωματικά (Ο) ή βλεφαριδικά (Η) αντιγόνα τους με τη μέθοδο Kauffmann-White. Δυο διακριτές κατηγορίες: τα τυφοειδή είδη/ορότυποι (Salmonella typhi και S. Paratyphi) και τα υπόλοιπα μη τυφοειδή είδη.

Κατηγοριοποίηση σε 2000 υποείδη (ορότυποι) ανάλογα με τα σωματικά (Ο) ή βλεφαριδικά (Η) αντιγόνα τους με

7 Salmonella spp. Τα συμπτώματα της μη τυφοειδούς γαστρεντερίτιδας παρατηρούνται 6 έως 72 ώρες μετά την κατανάλωση μολυσμένου ύδατος ή τροφής. Χαρακτηρίζονται από ήπια διάρροια διάρκειας 3-5 ημερών, πυρετό και κοιλιακά άλγη. Ο τυφοειδής πυρετός πολύ σοβαρή νόσος με συχνά μοιραία κατάληξη. Υδατογενείς επιδημίες τυφοειδούς πυρετού με υψηλό δείκτη θνησιμότητας, έχουν σημειωθεί πολλές φορές στο παρελθόν, σε ολόκληρο τον πλανήτη.

8 Campylobacter jejuni Gram-αρνητικά, σπειροειδή, ραβδόμορφα, μαστιγοφόρα βακτηρίδια που απαιτούν μικροαερόφιλες συνθήκες ανάπτυξης. Αποτελούν μια από τις συχνότερες αιτίες γαστρεντερίτιδας στον κόσμο. Παρουσιάζουν σχετικά υψηλή μολυσματικότητα σε σχέση με άλλους παθογόνους μικροοργανισμούς (1000 βακτήρια αρκούν για να προκαλέσουν λοίμωξη). Οι περισσότερες συμπτωματικές λοιμώξεις συμβαίνουν στη βρεφική και πρώιμη παιδική ηλικία.

Παρουσιάζουν σχετικά υψηλή μολυσματικότητα σε σχέση με άλλους παθογόνους μικροοργανισμούς (1000 βακτήρια

9 Campylobacter jejuni Τα κλινικά συμπτώματα της καμπυλοβακτηριδίωσης χαρακτηρίζονται από κοιλιακό άλγος, διάρροια, εμετό, ρίγος και πυρετό % των περιπτώσεων προκαλούνται υποτροπές με συνέπειες αρθρίτιδα, μηνιγγίτιδα ή σύνδρομο Guillain Barré. Τα πουλερικά αποτελούν σημαντική φυσική δεξαμενή του μικροοργανισμού. Η παρουσία του Campylobacter jejuni στα επιφανειακά νερά, για το λόγο αυτό, εξαρτάται από την παρουσία υδρόβιων πτηνών στις δεξαμενές άντλησης πόσιμου ύδατος. Υδατογενείς επιδημίες καμπυλοβατηριδίωσης με υψηλό δείκτη επίπτωσης έχουν αναφερθεί πολλές φορές στο παρελθόν.

Τα πουλερικά αποτελούν σημαντική φυσική δεξαμενή του μικροοργανισμού.

10 Ανάπτυξη πρωτοκόλλου real-time PCR για την ανίχνευση παθογόνων μικροοργανισμών A. Καλλιέργεια μικροοργανισμών Για την καλλιέργεια των πρότυπων στελεχών των μικροοργανισμών χρησιμοποιήθηκαν δισκία (lenticules) και εκλεκτικά θρεπτικά υλικά. Salmonella spp.: SS-άγαρ, ΧLD-άγαρ (37 C/48 ώρες) E.Coli 0157:H7: Fluorocult άγαρ (37 C/24 ώρες) Campylobacter jejuni: mccda άγαρ (42 C/20 ώρες, μικροαερόβιες συνθήκες) Β. Αραιώσεις και καταμέτρηση αποικιών Για την ποσοτική ανάλυση των μικροοργανισμών χρησιμοποιήθηκαν υγρά καλλιεργητικά μέσα : Tryptic Soy Broth για E. Coli Ο157:H7, Petone Water για Salmonella spp. και Bolton Broth για Campylobacter jejuni. Διαδοχικές αραιώσεις ( ) της 24ωρης καλλιέργειας επωάστηκαν, εκ νέου, στα στερεά καλλιεργητικά υλικά και έγινε καταμέτρηση των αποικιών (cfu/ml).

: SS-άγαρ, ΧLD-άγαρ (37 C/48 ώρες) E.Coli 0157:H7: Fluorocult άγαρ (37 C/24 ώρες) Campylobacter jejuni: mccda άγαρ (42 C/20 ώρες, μικροαερόβιες συνθήκες) Β.

11 Γ. Απομόνωση DNA Πραγματοποιήθηκε απομόνωση DNA από τις αραιώσεις cfu/ml με τη μέθοδο QIAamp (QIAGEN). o 1 ml καλλιέργειας φυγοκεντρήθηκε στις rpm για 5 λεπτά (SIGMA 4K15) και το ίζημα υποβλήθηκε στη διεργασία απομόνωσης βακτηριακού DNA o Το DNA φωτομετρήθηκε στα 260nm για ποσοτικό προσδιορισμό o Πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφορhτική ανάλυση του γενωμικού DNA σε πηκτή αγαρόζης 0.8%.

o 1 ml καλλιέργειας φυγοκεντρήθηκε στις 14000 rpm για 5 λεπτά (SIGMA 4K15) και το ίζημα υποβλήθηκε

12 Δ. Έλεγχος εκκινητών - συμβατική PCR Για την E. Coli O157:H7 χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές 5 - GTAAGTTACACTATAAAGCACCGTCG-3 και 5 -TCTGTGTGGATGGTA ATAAATTTTTG-3, που είναι ειδικοί για το γονίδιο της ιντιμίνης (eaea) και δίνουν ένα προϊόν 106 ζευγαριών βάσεων (bp). Για την Salmonella spp. χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές 5 -GTGAAATTATCG CCACGTTCGGGCAA-3 και 5 -TCATCGCACCGTCAAAG GA ACC-3 που ενισχύουν ένα τμήμα 285 ζευγαριών βάσεων του γονιδίου inva. Για το Campylobacter jejuni χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές 5 TGCTAG TGAGGTTGCAAAAGAATT-3 και 5 TCATTTCGCAAAAAAATC CAAA-3 του γονιδίου hipo που δίνουν ένα προϊόν 100 ζευγαριών βάσεων.

ιντιμίνης (eaea) και δίνουν ένα προϊόν 106 ζευγαριών βάσεων (bp). Για την Salmonella spp.

13 Ποσοτική ανάλυση E. Coli 0157:H7 και Salmonella spp με real-time PCR. Πραγματοποιήθηκαν διαδοχικές αραιώσεις του γενωμικού DNA της E. Coli 0157:H7 (10-1 έως 10-6 ) για την δημιουργία πρότυπης καμπύλης ποσοτικοποίησης. Η αντίδραση real-time PCR πραγματοποιήθηκε σε όγκο 25 μl και περιείχε 1x SYBR Master mix, 2.5 μl DNA και 100nM κάθε εκκινητή.

Coli 0157:H7 (10-1 έως 10-6 ) για την δημιουργία πρότυπης καμπύλης ποσοτικοποίησης.

14 Ε. coli O157:H

17 Salmonella spp

20 Campylobacter jejuni Η πρότυπη καμπύλη μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση και ποσοτικοποίηση άγνωστων (περιβαλλοντικών) δειγμάτων με ευαισθησία 10 4 cfu/ml. H παρουσία αναστολέων στο υγρό διάλυμα Bolton πιθανόν ευθύνεται για τους εν λόγω περιορισμούς.

άγνωστων (περιβαλλοντικών) δειγμάτων με ευαισθησία 10 4 cfu/ml.

21 Αποτελέσματα Η ευαισθησία των αντιδράσεων ποσοτικοποίησης των μικροοργανισμών με τη μέθοδο της real-time PCR ήταν: ~1-3 cfu/ml για την Ε. Coli 0157:H7 και τη Salmonella spp. και ~10 4 cfu/ml για το Campylobacter jejuni.

Σχετικά έγγραφα

ΤΡΟΦΟΓΕΝΕΙΣ ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ

ΤΡΟΦΟΓΕΝΕΙΣ ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ ΤΡΟΦΟΓΕΝΕΙΣ ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ ΔΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΙΣ ΧΗΜΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ ΓΑΣΤΡΕΝΤΕΡΙΚΟΥ ΤΟΞΙΝΕΣ ΦΥΤΙΚΟΣ ΙΣΤΟΣ ΤΟΞΙΝΕΣ ΦΥΚΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ ΖΩΙΚΟΣ ΙΣΤΟΣ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΜΥΚΟΤΟΞΙΝΕΣ ΕΝΤΕΡΟΤΟΞΙΝΕΣ