Η Επίδραση του Σιδήρου σε Βλαστικές, Φυσιολογικές και Βιοχηµικές Παραµέτρους κατά το Μικροπολλαπλασιασµό Υποκειµένων Εσπεριδοειδών

Αριθµός εργασίας: #2004_1 Τύπος εργασίας: Πρωτότυπη εργασία Τοµέας: Φυτική Παραγωγή > Φυσιολογία - Βιοχηµεία Λήψη: Ιανουάριος 2004 Αποδοχή: Μάιος 2004 Η Επίδραση του Σιδήρου σε Βλαστικές, Φυσιολογικές και Βιοχηµικές Παραµέτρους κατά το Μικροπολλαπλασιασµό Υποκειµένων Εσπεριδοειδών [Επίδραση Σιδήρου σε Υποκείµενα Εσπεριδοειδών] Μυλωνά Αντιγόνη a, Κορτέσσα ηµάση-θεριού b, Βασίλειος Χουλιάρας b, Λαµπρινή Βαρίτη a, Σοφία Γκούβρα c και Αθανάσιος N. Μολασσιώτης b a Τµήµα Ανθοκοµίας Αρχιτεκτονικής Τοπίου, ΤΕΙ Ηπείρου, 47100 Άρτα Ελλάς b Εργαστήριο ενδροκοµίας, Τµήµα Γεωπονίας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης, 54124 Θεσσαλονίκη, Ελλάς c Τµήµα Φυτικής Παραγωγής, ΤΕΙ Ηπείρου, 47100 Άρτα Ελλάς! Χουλιάρας Βασίλειος ιεύθυνση Γεωργίας Άρτας, 47100, Άρτα, Ελλάς e-mail: vashulagro@hotmail.com Περίληψη Εκφυτα των υποκειµένων των εσπεριδοειδών Νεραντζιά, C. taiwanica και Swingle Citrumelo εγκαταστάθηκαν σε στερεό υποστρωµα ΜS που αποτελούνταν από κατάλληλη συγκέντρωση των ρυθµιστών αύξησης ΙΑΑ και ΒΑ, 20 g/l σουκρόζης ενώ διέφερε η µορφή και η συγκέντρωση του σιδήρου (-Fe (0 ppm Fe), Fe-EDDHA (5.6 ppm), FeCl 3 (5.6 ppm), Fe-EDTA (5.6 ppm)). Η µη προσθήκη σιδήρου στο υπόστρωµα προκάλεσε σηµαντική χλώρωση στα φυτά και µικρό αριθµό πλαγίων βλαστών ανά έκφυτο. Η µορφή του σιδήρου Fe-EDTA αποδείχθηκε τοξική και έδωσε µικρό αριθµό πλαγίων βλαστών. H εφαρµογή του σιδήρου ως FeCl 3 καθίσταται προδευτικά επωφελής ως προς τη χλώρωση σιδήρου, δίνει τον ιδιο αριθµό πλαγίων βλαστών µε την επέµβαση της µη προσθήκης σιδήρου, αλλα και το µεγαλύτερο µήκος πλαγίων βλαστών από όλες τις υπόλοιπες επεµβάσεις. Η µορφή του σιδήρου Fe- EDDHΑ αποδείχθηκε η καλύτερη ως προς την εµφάνιση των φυτών και τον αριθµό των πλαγίων βλαστών. O αριθµός των πλαγίων βλαστών κατά το µικροπολλαπλασιασµό βρίσκεται σε αρνητική συσχέτιση µε το µήκος τους. Η συγκέντρωση των ενζύµων επηρεάστηκε τόσο από τη µορφή όσο και από τη συγκέντρωση του σιδήρου στα τρία υποκείµενα. Τα ένζυµα αυτά µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως βιοχηµικοί δείκτες της χλώρωσης σιδήρου. Λέξεις κλειδιά: εσπεριδοειδή, σίδηρος, µικροπολλαπλασιασµός, υπεροξειδάση, καταλάση Εισαγωγή εν υπάρχει αρκετή βιβλιογραφία που να αναφέρεται στην επίδραση του σιδήρου στο µικροπολλαπλασιασµό των διαφόρων καλλιεργειών και ιδιαιτέρως των εσπεριδοειδών. Επίδραση του σκευάσµατος του σιδήρου που να επιδρά στις ενζυµικές µεταβολες της βάσης του µικροµοσχεύµατος µε επακόλουθο τη ριζοβολία (Fe-EDDHA), τη δηµιουργία κάλλου (FeCl 3 ) ή τη µη βιοσύνθεση ριζικών καταβολών κατά την έλλειψη σιδήρου (-Fe) ή τη νέκρωση των µικροµοσχευµάτων όταν ο σίδηρος εφαρµοστεί µε τη µορφή Fe-EDTA έχει αναφερθεί στα εσπεριδοειδή (Dimassi et al., 2003). εν υπάρχει βιβλιογραφία που να αναφέρεται στη συµβολή των σιδηροπρωτεϊνών καταλάση και υπεροξειδάση στο µικροπολλαπλασιασµό των εσπεριδοειδών. AgroThesis ISSN 1109-7981 3

Σκοπός της εργασίας αυτής ήταν η επίδραση της µορφής σιδήρου στον αριθµό των πλαγίων βλαστών κατά το µικροπολλαπλασιασµό υποκειµένων εσπεριδοειδών (Nεραντζιά, Swingle Citrumelo, C. taiwanica), στο βαθµό χλώρωσης και στην ενεργότητα των σιδηροπρωτεϊνών υπεροξειδάση και καταλάση. Κατά το παρόν πείραµα δεν αποτελεί στόχο η εύρεση της ιδανικής συγκέντρωσης των ορµονών που θα έχει ως αποτέλεσµα το µέγιστο αριθµό πλαγίων βλαστών κατά το µικροπολλαπλασιασµό των εκφύτων των συγκεκριµένων υποκειµένων των εσπεριδοειδών. Υλικά και µέθοδοι Βλαστικές κορυφές των υποκειµένων των εσπεριδοειδών C. taiwanica, Swingle Citrumelo και Νεραντζιά, αφού απολυµάνθηκαν µε διαλυµα που αποτελούνταν από NaOCl (2.5%), benomyl (1%) και streptomycin (0.01%), και ξεπλύθηκαν 3 φορές µε απεσταγµένο νερό, τοποθετήθηκαν σε υπόστρωµα εγκατάστασης MS (που περιείχε 20g/l σακχαρόζη 8g/l άγαρ, ενώ το ph ρυθµίστηκε στο 5.8, χωρίς ρυθµιστές αυξησης) για 4 εβδοµάδες και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε υποστρώµατα ΜS όπου διέφερε η µορφή (FeCl 3, Fe-EDDHA, Fe-EDTA) και η συγκέντρωση του σιδήρου (0, 5.6 ppm). Οι ορµόνες που προστέθηκαν ήταν 1mg BA, 0.25 mg ΙΑΑ και 0,05 mg GA 3. Χρησιµοποιήθηκαν 15 έκφυτα (βλαστικές κορυφές) για κάθε επέµβαση και κάθε υποκείµενο. Υπολογίστηκαν τα εξής: I. ο βαθµός χλώρωσης στα φύλλα των υποκειµένων στις διάφορες επεµβάσεις II. ο αριθµός και το µήκος των βλαστών ανά έκφυτο (35 ηµέρες µετά την εγκατάσταση των εκφύτων σε υποστρώµατα MS όπου χορηγήθηκαν οι µορφές σιδήρου FeCl 3, Fe-EDDHA και χωρίς σίδηρο και 25 ηµέρες σε υπόστωµα MS µε χορηγούµενη µορφή σιδήρου την Fe-EDTA). III. χλωροφύλλη (α και β) (µετρήθηκαν φωτοµετρικά στα 649 και 665 nm αφού εκχυλίστηκαν µε αιθανόλη, τοποθετήθηκαν σε υδατόλουτρο µέχρι τον πλήρη αποχρωµατισµό των φυταρίων, ενώ οι περιεκτικότητες υπολογίστηκαν σύµφωνα µε τις εξισώσεις των Wintermans και Mots (1965)). IV. η ενεργότητα των υπεροξειδασών (διαλυτές και wall-bound υπεροξειδάσες συνολικά). Η ποσοτικός προσδιορισµός της υπεροξειδάσης έγινε σύµφωνα µε τη µεθοδολογία των Ngo και Lenhoff (1980) σε φασµατοφωτόµετρο UV-1601, σε µήκος κύµατος 590 nm. Για την παρασκευή του διαλύµατος DMAB, η ένωση διαλύθηκε αρχικά σε µισό όγκο αιθανόλης (καθαρότητας 96 %) και στη συνέχεια (µετά την πλήρη διάλυση) προστέθηκε ο υπόλοιπος µισός όγκος (µέχρι τα 100 ml συνολικά) µε απιονισµένο νερό. Στη δοκιµή εφαρµοζόταν 5-20 µl του υπερκειµένου διαλύµατος έπειδή συνήθως τα δείγµατα παρουσίαζαν υψηλή δραστηριότητα υπεροξειδασών. Μία µονάδα ενζυµικής δράσης (U) ορίστηκε ως η αύξηση της απορρόφησης κατά 0.01 µονάδες ανά δευτερόλεπτο. Η ενζυµική δράση εκφραζόταν στη συνέχεια σε g. νωπού βάρους ανά λεπτό (U / g.ν.β. / min). V. το ένζυµο καταλάση (floating-disk method σύµφωνα µε τον Wang (1995). 30 µl του υπερκείµενου στρώµατος εφαρµοζόταν σε δίσκους διαµέτρου 1cm, του ηθµού GF 52 (Schleicher and Schuell) και τοποθετούνταν σε δοκιµαστικούς σωλήνες Lamott (µε επίπεδο πυθµένα). Ακολουθούσε προσθήκη 20 ml απιονισµένου νερού που περιείχαν 1.5 ml διαλύµατος 30% H 2 O 2. Η όλη δοκιµή γινόταν σε θερµοκρασία 20 o C. Χρονοµετρούνταν η διάρκεια ανόδου του δίσκου στην επιφάνεια. Η καµπύλη αναφοράς έγινε σύµφωνα µε το χρόνο ανόδου 1-4 µονάδων καθαρής καταλάσης του εµπορίου (bovine catalase, Sigma). Υπερκείµενα εκχυλίσµατα υψηλότερης δράσης καταλάσης αραιώνονταν µε απιονισµένο νερό αναλογικά, µέχρι να επιτευχθεί χρόνος ανόδου του φίλτρου ίσος µε 1-4 µονάδες της καταλάσης του εµπορίου. Η ενζυµική δράση εκφραζόταν στη συνέχεια σε g. νωπού βάρους ανά λεπτό (U / g. Ν.Β. / min). Μονάδα καταλάσης ορίζεται η διάσπαση 1 µmol H 2 O 2 / min σε ph 7.0 και θερµοκρασία 25 o C Η εκχύλιση των ενζύµων έγινε σύµφωνα µε την παρακάτω διαδικασία. Φυτάρια των τριών υποκειµένων των εσπεριδοειδών λειοτριβήθηκαν µε ανάλογη ποσότητα σε µl του διαλύµατος NaH 2 PO4 0,05M και 1% ΝaCl, ph 6.5 ενώ προστέθηκε και 2.5% PVPP. Για τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων χρησιµοποιήθηκε η ANOVA και το κριτήριο Duncn σε επίπεδο σηµαντικότητας Ρ=0.05. Αποτελέσµατα και συζήτηση Σύµφωνα µε τον πίνακα 1, η µη προσθήκη Fe στο διάλυµα MS προκάλεσε σηµαντική χλώρωση στα έκφυτα. Η ανόργανη µορφή σιδήρου FeCl 3 προκάλεσε ελαφριά χλώρωση, η χηλική µορφή του σιδήρου Fe-EDDHA έδωσε βαθύ πράσινο χρωµατισµό, ενώ η προσθήκη της χηλικής µορφής Fe-EDTA έδωσε AgroThesis ISSN 1109-7981 4

τιµές χλωροφύλλης στα έκφυτα ελαφρώς υψηλότερες της αντίστοιχης συγκέντρωσης της ανόργανης µορφής του σιδήρου στα υποκείµενα C. taiwanica και Swingle Citrumelo. Στα έκφυτα της Νεραντζιάς, οι τιµές της χλωροφύλλης δεν ήταν στατιστικώς σηµαντικές µεταξύ των µορφών σιδήρου FeCl 3 και Fe- EDTA. Στατιστικώς σηµαντικές διαφορές ως προς τη συγκέντρωση των χλωροφυλλών a+b στα έκφυτα, παρουσιάστηκαν µεταξύ των τριών υποκειµένων στην ίδια επέµβαση Fe (µορφή και συγκέντρωση σιδήρου). Πίνακας 1. Η επίδραση διαφόρων µορφών σιδήρου στη συγκέντρωση της χλωροφυλλών a+b σε έκφυτα των υποκειµένων C.Taiwanica, Citrumelo, και Νεραντζιάς (Ρ=0.05) [The effect of various Fe forms on chlorophylls a+b concentration in explants of the rootstocks C.Taiwanica, Citrumelo and Sour Orange (Ρ=0.05)] Επέµβαση Τ. C. N. 0 ppm Fe 5,56b 4,38a 6,25c 5.6 ppm FeCl 3 6,70d 6,18c 7,42f 5.6 ppm Fe-EDDHA 10,58h 9,83g 10,75h 5.6 ppm Fe-EDTA 7,35f 6,88de 7,12ef Πίνακας 2. Βαθµός χλώρωσης σε φύλλα εκφύτων του υποκειµένου C. taiwanica που αναπτύχθηκαν σε υποστρώµατα ιστοκαλλιέργειας µε διαφορετική µορφή και συγκέντρωση σιδήρου σε διάφορα χρονικά διαστήµατα από την έναρξη του πειράµατος [Degree of chlorosis in leaves of C. taiwanica explants grown in MS tissue culture substrates with different Fe form and concentration in various time intervals after the start of the experiment] ηµέρες -Fe FeCl 3 Fe-EDDHA Fe-EDTA 15 2 1,75 0,5 0,75 25 2,5 1,5 0 1,25 35 3,5 1,25 0,25 - Σύµφωνα µε τον πίνακα 2, είναι εµφανής η αρνητική επίδραση της παραµονής των µικροµοσχευµάτων στο υπόστρωµα, όταν ο σίδηρος εφαρµόζεται µε τη µορφή Fe-EDTA, για διάστηµα µεγαλύτερο των 25 ηµερών. Mετά από 32 ηµέρες παραµονής των εκφύτων στο υπόστρωµα ΜS όπου ο σίδηρος εφαρµόστηκε µε τη µορφή Fe-EDΤA, τα έκφυτα νεκρώθηκαν. Πιθανώς, η µορφή αυτή του σιδήρου δρα τοξικά. Αντίθετα, αποδεικνύεται σχετικά επωφελής η παραµονή των εκφύτων σε υπόστρωµα όπου ο σίδηρος εφαρµόζεται µε τη µορφή FeCl 3, αν και η µορφή αυτή του σιδήρου είναι ανόργανη. Είναι όµως εµφανής, η υπεροχή της χηλικής µορφής του σιδήρου Fe-EDDHA. Aντίθετα η µορφή Fe-EDTA αν και προκαλεί σηµαντική χλώρωση δεν καθίσταται τοξική για τα υποκείµενα ροδακινιάς και ιδίως το GF-677. (Μολασιώτης, προσωπ. επικοιν.). Πίνακας 3. Αριθµός και µήκος βλαστών ανά έκφυτο σε τρία υποκείµενα εσπεριδοειδών σε διάφορες επεµβάσεις σιδήρου (Ρ=0.05) [Number and length of shoots per explant of three Citrus rootstocks in MS tissue culture media with different Fe treatments (P=0.05)] αριθµ. βλαστ. µεσ. µήκ. βλ. (cm) Υποκείµενο T. C. N. Τ. C. N. Επέµβαση -Fe 1.6bc 1.4ab 1.8cd 1.7bc 1.9cde 1.5ab FeCl 3 1.5bc 1.2a 1.6bc 2.0def 2.2ef 2.3f Fe-EDTA 1.8cd 1.6bc 2.0d 1.5ab 1.6bc 1.5ab Fe-EDDHA 2.8e 2.7e 2.9e 1.3a 1.3ab 1.2ab Η µορφή του σιδήρου επηρέασε σηµαντικά το µήκος και των αριθµό των µασχαλιαίων βλαστών ανά εκφυτο και σε κάθε υποκείµενο και µεταξύ των τριών υποκειµένων (Πιν. 3). Η εφαρµογή του σιδήρου µε AgroThesis ISSN 1109-7981 5

την οργανική µορφή Fe-EDDHA αύξησε σηµαντικά τον αριθµό των βλαστών ανά έκφυτο, ενώ η ανόργανη µορφή έδωσε το µικρότερο αριθµό βλαστών, αλλά αύξησε σηµαντικά το µέσο µήκος τους.. Σύµφωνα µε τους Dimassi et al. (2003), η επιδραση της χηλικής µορφής του σιδήρου Fe-EDDHA προκαλεσε τα µεγαλύτερα ποσοστά ριζοβολίας στα τρια υποκείµενα εσπεριδοειδών, ενώ και κατά το µικροπολλαπλασιασµό των υποκειµένων των εσπεριδοειδών που µελετήθηκαν στο παρόν πείραµα εδωσε το µεγαλύτερο αριθµό πλαγίων βλαστών. Παρατηρήθηκε αντιστρόφως ανάλογη σχέση µεταξύ του αριθµού των µασχαλιαίων βλαστών και του µήκους τους και στα τρία υποκείµενα (Σχ.1). Mήκος βλαστών (cm) 2,4 2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 y = 2,3344x -0,6198 R 2 = 0,9268 1 1,5 2 2,5 3 Aριθµός βλαστών Σχήµα 1. Η συσχέτιση του αριθµού των πλαγίων βλαστών κατά το µικροπολλαπλασιασµό κορυφών του υποκειµένου Νεραντζιά σε υποστρώµατα µε διαφορετικές µορφές και συγκεντρώσεις σιδήρου κι του µήκους τους [The corellation between lateral shoot number and their length through micropropagation of shoot tips of the rootstock Sour Orange in MS tissue culture media with different Fe forms and concentrations] Η ανόργανη µορφή του σιδήρου δηµιουργεί σύµπλοκα στο υπόστρωµα τα οποία προκαλούν µείωση της πρόσληψής του (Θεριός, προσωπ. επικοιν.). Στο παρόν πείραµα, η ανόργανη µορφή του σιδήρου FeCl3 προκάλεσε χλώρωση η οποία όµως µειώθηκε σταδιακά, αύξησε σηµαντικά το µήκος των πλαγίων βλαστών, έδωσε όµως το µικρότερο αριθµό πλαγίων βλαστών (Πιν. 3). ιαπιστώθηκε ότι η χρήση της χηλικής µορφής σιδήρου Fe-EDDHA προκάλεσε σηµαντική ανάσχεση της κυριαρχίας κορυφής, γι υτό το λόγο έδωσε το µεγαλύτερο αριθµό πλαγίων βλαστών. Ελαφριά χλώρωση σε σχέση µε το υπόλοιπο φυτό, άρχισε να εµφανίζεται στα φύλλα βάσης των βλαστών των φυταρίων, 32 ηµέρες µετά τον εµβολιασµό στο υπόστρωµα, όταν ο σίδηρος εφαρµόστηκε µε τη µορφή Fe-EDDHA. Πίνακας 4. Η ενεργότητα της καταλάσης (U / g.f.w. / min) σε έκφυτα του υποκειµένου C. Taiwanica που καλλιεργήθηκαν σε υποστρώµατα ιστοκαλλιέργειας MS όπου διέφερε η µορφή και η συγκέντρωση του σιδήρου σε διάφορα χρονικά διαστήµατα από την έναρξη του πειράµατος [Catalase activity (U/g.f.w./min) in explants of the rootstock C. taiwanica grown in MS tissue culture substrates with different Fe form and concentration in different time intervals after the start of the experiment] ηµέρες -Fe FeCl 3 Fe-EDDHA Fe-EDTA 15 14.5b 15.3c 16.2d 15.9d 25 14.2b 16.2d 24.0g 14.5b 35 13a 17.1e 21.4f - Η µορφή και η συγκέντρωση του σιδήρου επηρέασε στατιστικώς σηµαντικά την ενεργότητα της καταλάση και των υπεροξειδασών στις διάφορες επεµβάσεις σιδήρου σε κάθε ένα από τα τρία υποκείµενα των εσπεριδοειδών που µελετήθηκαν. Στους πίνακες 4 και 5 αναφέρονται οι ενεργότητες των ενζύµων στο υποκείµενο C. taiwanica. Παρόµοια ήταν η επιδραση των µορφών του σιδήρου και στα υποκείµενα Νεραντζιά (C. aurantium) και Swingle Citrumelo (µη παρουσιαζόµενα αποτελέσµατα). Υπήρξαν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές ως προς αυτά τα δύο ένζυµα και µεταξύ των τριών υποκειµένων. Yψηλότερη ενεργότητα των δύο ενζύµων εµφανίστηκε στα έκφυτα όπου ο σίδηρος AgroThesis ISSN 1109-7981 6

εφαρµόστηκε µε την οργανική µορφή Fe-EDDHA, ακολουθούσαν τα έκφυτα όπου ο σίδηρος εφαρµόστηκε µε την ανόργανη µορφή FeCl 3, ενώ τα έκφυτα όπου δεν χορηγήθηκε σίδηρος στα υποστρώµατα µικροπολλαπλασιασµού ΜS έδειξαν τη χαµηλότερη ενεργότητα και για τα δύο ένζυµα (Πιν. 4, 5). Παρόµοια αποτελέσµατα ως προς την ευεργετική επίδραση τόσο στη ριζοβολία όσο και στη µικροπολλαπλασισµό του υποκειµένου ροδακινιάς, GF-677 (Μολασιώτης, 2004). Το γεγονός αυτό πιθανόν να οφείλεται στη διαφορετική αναγωγική ικανότητα των τριών υποκειµένων, καθώς και στην διαφορετική ικανότητα να αποδεσµεύουν το σίδηρο από τη φυτοφερριτίνη όπου βρίσκεται αποθηκευµένος (Βriat, 1996). Πειράµατα µέτρησης της αναγωγικής ικανότητας διαφόρων υποκειµένων εσπεριδοειδών σε µείγµα αµµου-περλίτη στην επέµβαση Fe συµφωνούν µε την παρατήρηση αυτή (Chouliaras, 2002). Πίνακας 5. Η ενεργότητα των υπεροξειδασών (διαλυτών και wall bound) (U / g.f.w. / min) σε έκφυτα του υποκειµένου C. Taiwanica που καλλιεργήθηκαν σε υποστρώµατα ιστοκαλλιέργειας MS µε διαφορετική µορφή και συγκέντρωση σιδήρου σε διάφορα χρονικά διαστήµατα από την έναρξη του πειράµατος [Peroxidase (soluble and ionically bound in cell walls) activity (U/g.f.w./min) in explants of the rootstock C. taiwanica grown in MS tissue culture substrates with different Fe form and concentration in different time intervals after the start of the experiment] ηµέρες -Fe FeCl 3 Fe-EDDHA Fe-EDTA 15 4.7d 5.2e 5.4ef 5.3e 25 4.2c 5.4ef 6.2g 3.2a 35 3.8b 5.7f 6.9h - H στατιστική ανάλυση στους πίνακες 4, 5 έγινε για επίπεδο σηµαντικότητας Ρ=0.05 Παρατηρείται υψηλή αρνητική συσχέτιση του βαθµού χλώρωσης σιδήρου µε τα επίπεδα της καταλάσης και των υπεροξειδασών. Χλωρωτικά έκφυτα µε βαθµό χλώρωσης τουλάχιστον 2.5 παρουσιάζουν ενεργότητα των ενζύµων καταλάση και υπεροξειδάση µικρότερη των 14.5 και 4.5 U / g.f.w./ min, αντίστοιχα (µη παρουσιαζόµενα δεδοµένα). Παρόµοια επίπεδα ενεργότητας των δύο ενζύµων παρουσιάστηκαν σε φύλλα µε βαθµό χλώρωσης σιδήρου υψηλότερου του 2.5 στα παραπάνω υποκείµενα εσπεριδοειδών σε πείραµα θερµοκηπίου (Chouliaras, 2002). Ο βαθµός χλώρωσης σιδήρου, στις συγκενκριµένες πειρµατικές συνθήκες, βρέθηκε ότι συσχετίζεται αρνητικά µε την καταλάση (ο γραµµικός συντελεστής συσχέτισης είναι -0.928 και στατιστικά σηµαντικός και ο µη παραµετρικός συντελεστής συσχέτισης είναι αρνητικός ( 0.962) και στατιστικά σηµαντικός, Ρ=0.005). Ο βαθµός χλώρωσης σιδήρου των εκφύτων συσχετιζόταν επίσης αρνητικά µε το ένζυµο υπεροξειδάση (ο γραµµικός και ο µη παραµετρικός συντελεστής συσχέτισης ήταν -0.932 και 0.976 αντίστοιχα, στατιστικά σηµαντικοί, Ρ=0.005). Έτσι, η καταλάση και η υπεροξειδάση µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως βιοχηµικοί δείκτες της χλώρωσης σιδήρου. Το συµπέρασµα αυτό έρχεται σε συµφωνία µε τα ευρήµατα του Bar-Akiva (1971) και των Bar-Akiva και συνεργατών (1967). Επιπρόσθετα, η έρευνα πρέπει να επικεντρωθεί ως προς τις ισοµορφές των υπεροξειδασών (διαλυτών και δεσµευµένων στα κυτταρικά τοιχώµατα) και της καταλάσης που µεταβολίζονται ή βιοσυντίθενται εκ νέου ώστε τα προκληθεί η διαφοροποίηση των πλαγίων βλαστών και πως οι διάφορες µορφές του σιδήρου επιδρούν στις διάφορες ισοµορφές των δύο αυτών ενζύµων. Ο συνδιασµός των ορµονών ΒΑ, κινετίνης και ΝΑΑ φαίνεται ότι είναι ουσιώδης για τη δηµιουργία µεγάλου αριθµού πλαγίων βλαστών κατά την ιστοκαλλιέργεια διαφόρων ειδών των εσπεριδοειδών (Singh et al., 1994). Επιπλέον η αφαίρεση της κορυφής και η τοποθέτιση των µικροµοσχευµάτων σε πλάγια θέση εδωσε καλύτερα αποτελέσµατα στην πραγωγή βλαστών στη γαρδένια (Χατζηλαζάρου κ.α., 1998). Φαίνεται ότι κυρίως η έλλειψη της αυξίνης ΝΑΑ και δευτερευόντως η µη χρήση της κινητίνης στο υπόστρωµα µικροπολλαπλασιασµού των υποκειµένων που χρησιµοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία, επέδρασε αρνητικά στη δηµιουργία µεγάλου αριθµού πλαγίων βλαστών στις βλαστικές κορυφές. Όµως, όπως προαναφέρθηκε στην εισαγωγή ο κύριος σκοπός του πειράµατος δεν ήταν η ανεύρεση του ιδανικού υποστρώµατος για την ιστοκαλλιέργεια των εσπεριδοειδών αλλά η µελέτη της επίδρασης διαφόρων µορφών σιδήρου στο µικροπολλαπλασιασµό. Η µείωση της συγκέντρωσης των αλάτων σε ½ ή ¼ επέδρασε δυσµενώς στην αναβλάστηση του φυτού Ebenus cretica (Hatzilazarou κ.α., 2001), ενώ ενδείκνυται και η χρήση του υποστρώµατος WPM αντί του MS (Economou κ.α., 1999) και να ελεγχθεί η AgroThesis ISSN 1109-7981 7

αποτελεσµατικότητά του τροποποιηµένο ως προς τη συγκέντρωση και τη χρήση διαφόρων ανόργανων ή οργανικών ενώσεων σιδήρου. Είναι εµφανής η διαφορετική συµπεριφορά των εκφύτων όταν ό σίδηρος εφαρµόζεται στο υπόστρωµα ιστοκαλλιέργειας µε τη µορφή Fe-EDTA σε αντίθεση τη µορφή FeSO 4 + Na 2 EDTA (αρχική µορφή µε την οποία ο σίδηρος εφαρµόζεται στο υπόστρωµα MS; Μετζάκης, 1998) καθώς η πρώτη αποδείχθηκε τοξική για τα έκφυτα των εσπεριδοειδών. Συµπεράσµατα 1. Ο βαθµός χλώρωσης σιδήρου συσχετίζεται αρνητικά µε την καταλάση και τις ολικές υπεροξειδάσες στη συγκέντρωση των 5.6 ppm σιδήρου στο υπόστρωµα. Τα ένζυµα αυτά µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως βιοχηµικοί δείκτες της χλώρωσης σιδήρου. 2. Όταν ο σίδηρος εφαρµόζεται µε την οργανική µορφή Fe-EDTA µετά από 28 ηµέρες καλλιέργειας σε υπόστρωµα MS, δρα τοξικά. Προτείνεται στην περίπτωση αυτή η εφαρµογή του σιδήρου µε την τυπική µορφή που εφαρµόζεται στο υπόστρωµα MS (FeSO 4 + Na 2 EDTA). 3. H εφαρµογή του σιδήρου ως FeCl 3 καθίσταται προδευτικά επωφελής ως προς τη χλώρωση σιδήρου, δίνει όµως το µικρότερο αριθµό πλαγίων βλαστών. 4. Ο αριθµός των πλαγίων βλαστών κατά το µικροπολλαπλασιασµό βρίσκεται σε αρνητική συσχέτιση µε το µήκος τους. 5. Το σκέυασµα µε το οποίο εφαρµόζεται ο σίδηρος φαίνεται να παίζει πιο σηµαντικό ρόλο από ότι αναµφισβήτητα παίζει ο ίδιος ο σίδηρος. Συνιστάται η αντικατάσταση οποιασδήποτε µορφής σιδήρου µε την Fe-EDDHA. Βιβλιογραφία A. Bar-Akiva, 1971. Functional aspects of mineral nutrients in use for evaluation of plant nutrient requirement. In: R. M. Samish (Ed.), Recent Advances in Plant Nutrition, Vol. 1, pp. 115-142. A. Bar-Akiva, M. Kaplan, R. Lavon, 1967. The use of biochemical indicator for diagnosing micronutrient deficiencies of grapefruit trees under field conditions. Agrochimica, 11: 283-288. J.F. Briat, 1996. Roles of ferritin in plants. J. Plant Nutr., 19 (8/9): 1331-1342. V. Chouliaras, 2002. The effect of iron on physiological and biochemical parameters in Citrus. Ph.D. Thesis, Aristotle University of Thessaloniki, pp. 220, 221. K. Dimassi, V. Chouliaras, Gr. Diamantidis and I. Therios (2003). Effect of Iron and auxins on peroxidase activity and rooting performance of three Citrus rootstocks in vitro. Journal of Plant Nutrition, 26 (4): 1023-1034. Α. Economou, S. Hatzilazarou, S. Karahallios and P. Ralli (1999). Propagtion of Vitex agnus-castus by tissue culture. IV Intern. Symp. On New Floricultural Crops, Chania (Greece), 22-27/5/99, Acta Hortic. 541: 147-151. S. Hatzilazarou, A. Economou, T. Antoniou and P. Ralli (2001). Regeneration of Ebenus cretica in vitro. J. Prop. Ornamental plants, 1: 25-27.. Μετζάκης (1998). Καλλιέργειες σε υποστρώµατα, 209-214. Α.N.Molassiotis (2004). Study of Fe deficiency in Peach tree. Ph. D. Thesis, Aristotle University of Thessaloniki, 2004. T.T. Ngo, H.M. Lenhoff, 1980. A sensitive and versatile chromogenic assay for peroxidase and peroxidase-coupled reactions. Anal. Biochem., 105: 389-397. S. Singh, B.K. Ray, S. Bhattachariya, P.C. Deka, 1994. In vitro propagation of C. reticulata Blanco and C.limon Burm. f. HortSci., 29 (3): 214-216. Σ. Χατζηλαζάρου, Α. Οικονοµου και Ε. Μακρίδου (1998). Μελετη της µεγιστοποίησης παραγωγής βλαστών in vitro στη γαρδένια. Πρακτικά Ε.Ε.Ε.Ο., 7: 417-420. J.F Wintermans, A. Mots., 1965. Spectrophotometric characteristics of chlorophylls a and b and pheophytins in ethanol. Bioch. Biophys. Acta., 109: 448-453. C.Y. Wang, 1995. Effect of temperature preconditioning on catalase, peroxidase and superoxide dismutase in chilled zucchini squash. Postharv. Biol. Technol., 5: 67-76. AgroThesis ISSN 1109-7981 8

Paper No: #2004_1 Type of contribution: Original Paper Discipline: Crop science > Physiology - Biotechnology Received: January 2004 Approved: May 2004 Summary The Effect of Iron on Vegetative, Physiological and Biochemical Parameters through Micropropagation of Citrus Rootstocks [] Milona Antigoni a, Kortessa Dimassi-Theriou b, Vassilios Chouliaras b, Labrini Variti a, Sofia Gouvra c and Athanasios N. Molassiotis b a Department of Floriculture and Landscape Architecture, TEI of Epirus, 47100 Arta Greece b Laboratory of Pomology, Department of Horticulture, Aristotle University of Thessaloniki, 54124 Thessaloniki, Greece c Department of Horticulture, TEI of Epirus, 47100 Arta, Greece! Chouliaras Vassilios Perfecture of Arta Agriculture Department, 47100, ARTA, GREECE e-mail: vashulagro@hotmail.com Abstract Explants of the Citrus rootstocks Sour Orange (C. aurantium), Swingle Citrumelo and C. taiwanica after disinfection in solution consisted of NaOCl, benlate and streptomycin and washed three times with distilled water, were established in sterilized full ΜS, consisted of 20 g/l sucrose and solidified with 8 g/l agar. The substrate was additionally consisted of specific hormonal composition (suitable for micropropagation). The form and the concentration of Fe in the substrate varied as follows: (-Fe (0 ppm Fe), Fe-EDDHA (5.6 ppm), FeCl 3 (5.6 ppm), Fe-EDTA (5.6 ppm)). The pre-collection spraying of the mother plants with mixture of fungicide and antibiotic proved important in order to avoid contamination during cultivation period in the MS media. After 32 days in culture the explants tht treated with Fe-EDTA did not survive. On the other hand the explants treated with FeCl3 showed a slow development, whereas Fe-EDDHA proved to be the most suitable form of Fe for explant development. Fe form influenced the number and the length of lateral shoots per microcutting, the degree of chlorosis, as well as the catalase and peroxidase activity between the three rootstocks and between treatments. Fe-EDDHA treated explants showed a significantly greater number of lateral shoots (2.8-2.9), while FeCl 3 treated explants showed the least number (not significantly differed to Fe treatment) but higher length. The number of the lateral shoots was reversibly proportionate to their length The lack of Fe did not influence significantly the number of lateral shoots, but the explants showed a significant degree of chlorosis and significant decline on peroxidase and catalase activity. C. aurantium explants proved to be highly resistant to Fe chlorosis in Fe treatment, while Citrumelo explants were the most sensitive. Fe-EDDHA caused higher enzymatic activity than FeCl 3, while Fe explants showed the lowest enzymatic activity. Fe-EDTA caused gradual decline in enzymatic activity, as the explants finally died, due to a possible toxic effect. The degree of chlorosis was negatively related to catalase and peroxidase activity. However, substantial Fe chlorosis was related to 4.5 and 14.5 U/ g.f.w./ min of peroxidase and catalase activity, respectively. Peroxidase and catalase activity could be used as biochemical markers of Fe chlorosis in Citrus microcuttings. The replacement of other Fe forms with Fe-EDDHA seems to be critical in tissue culture of Citrus rootstocks, as well as the avoidance of using Fe in the form of Fe-EDTA (unless in the form of FeSO 4 + Na 2 EDTA). Keywords: Citrus, Fe-EDDHA, iron, micropropagation, peroxidase, catalase AgroThesis ISSN 1109-7981 9