Τ.Ε.Ι. Ηπείρου Σχολή Τεχνολογίας Γεωπονίας Τμήμα Φυτικής Παραγωγής ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ IN VITRO ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ 3 Ο Θρεπτικά Διαλύματα Δούμα Δήμητρα Άρτα, 2013
ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΕΞΕΛΙΞΗ ΤΩΝ ΘΡΕΠΤΙΚΩΝ ΔΙΑΛΥΜΑΤΩΝ Βάση για την σύνθεση των διαλυμάτων σε καλλιέργειες in vitr αποτέλεσαν τα διαλύματα αλάτων που αναπτύχθηκαν για υδροπονικές καλλιέργειες. Σταθμός στην ιστοκαλιιέργεια αποτελεί το διάλυμα των Murashige & Skg (1962) για καλλιέργεια κάλου καπνού. Αυτοί αργότερα πρότειναν κι άλλα διαλύματα (MS διαλύματα). Σήμερα, υπάρχουν ειδικά υποστρώματα για μονοκοτυλήδονα, για ψυχανθή και σολανώδη, για μορφογένεση ή ανδρογένεση ή για άλλες μορφές ανάπτυξης.
ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΕΞΕΛΙΞΗ ΤΩΝ ΘΡΕΠΤΙΚΩΝ ΔΙΑΛΥΜΑΤΩΝ Η σύνθεση του υποστρώματος ποικίλει ανάλογα με: Το είδος ή την ποικιλία. ιλία. Τον τύπο του υλικού (οφθαλμοί, κάλλος, κύτταρα, έμβρυα κ.ά.). Το στάδιο ανάπτυξης (πολλαπλασιασμός ή ριζοβολία, σχηματισμός κάλου ή αναγέννηση κ.ο.κ.) κ ) Υπόψη πρέπει να ληφθεί: Απαραίτητος είναι ο πειραματισμός σε συνδυασμούς μακροστοιχείων ιχνοστοιχείων ζαχαρόζης ρυθμιστών ανάπτυξης. Το ορμονικό ισοζύγιο Η σύνθεση σε ανόργανα άλατα Η οσμωτική πίεση του υποστρώματος που καθορίζεται από το περιεχόμενο σε μακροστοιχεία, άγαρ και ζάχαρο.
ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Σύνθεση του θρεπτικού διαλύματος: Μακροστοιχεία Ιχνοστοιχεία Βιταμίνες Αμινοξέα ή άλλες αζωτούχες ενώσεις Στερεοποιητές ς( (buffers) Φυτορρυθμιστικές ουσίες Νερό Υδατάνθρακες
ΝΕΡΟ 95 % του υποστρώματος. Απόλυτα καθαρό και άριστης ποιότητας. Για μικροπολλαπλασιασμούς ρουτίνας χρησιμοποιείται απιονισμένο νερό (απαλλαγμένο από τα περισσότεραελεύθερα ρ ρ ιόντα). ) Σε ερευνητικές εργασίες χρησιμοποιείται απεσταγμένο ή δισαπεσταγμένο νερό. Για τον καθαρισμό του νερού από ιόντα και άλατα χρησιμοποιείται η στήλη απιονισμού και η συσκευή απόσταξης. Για τον καθαρισμό του νερού από μικροοργανισμούς χρησιμοποιείται η συσκευή αποστείρωσης (κλίβανος υγρής αποστείρωσης).
ΜΑΚΡΟΣΤΟΙΧΕΙΑ Ν,P,K,Ca,Mg&S Βρίσκονται στο διάλυμα υπό μορφή ιόντων ΑΖΩΤΟ Σχηματίζει τις οργανικές ενώσεις στου κυττάρου Σημασία έχουν οι μορφές που διατίθεται Σημαντικότερη είναι η νιτρική μορφή Προστίθεται όμως και αμμωνιακή μορφή για διατήρηση του ph
ΙΧΝΟΣΤΟΙΧΕΙΑ Κατιόντα: Fe, Cu, Mn, Zn, C, Ni, Al, Na. Ανιόντα: B, I, M, CL. Τα μεταλλικά στοιχεία (Fe, Zn) προσφέρονται με τη μορφή χηλικών ενώσεων. Ως χηλικός παράγοντας χρησιμοποιείται συνήθως το EDTA
ΒΙΤΑΜΙΝΕΣ Ασκούν ευεργετική επίδραση στην καλλιέργεια. Αποσυντίθεται κατά τη διάρκεια της αποστείρωσης (121 ο C). Κυριότερες βιταμίνες στο θρεπτικό διάλυμα είναι: Θειαμίνη (βιταμίνη B1, ανευρίνη), 0,1 5 mg/l Νικοτινικό οξύ (βιταμίνη PP, νιασίνη), 0,1 5 mg/l Πιριδοξίνη (βιταμίνη B6, αδερμίνη),0,1 1mg/l Μυοϊνοσιτόλη οσιτόλη (ινοσιτόλη, μυοϊνοσιτόλη, οσιτόλη, ινοσίτη), ιοσίτη), 100 200 mg/l Ασκορβικό οξύ (βιταμίνη C), 1 100 mg/l Παντοθενικό οξύ ή παντοθενικό διασβέστιο, 0,5 2,5 mg/l Βιοτίνη (βιταμίνη μ η Η),0,01 ) 1mg/l Φολικό οξύ,0,1 5mg/l Ριβοφλαβίνη (βιταμίνη B2, λακτοφλαβίνη), 0,1 10 mg/l Κυανοκοβαλαμίνη (βιταμίνη B12) Κολίνη p αμινοβενζοϊκό οξύ,0,5 1mg/l Τοκοφερόλη (βιταμίνη E), 1 50 mg/l
ΥΔΑΤΑΝΘΡΑΚΕΣ Προστίθενται υπό μορφή ζαχάρων (ζαχαρόζη, γλυκόζη, μαλτόζη, ραφινόζη, φρουκτόζη, γαλακτόζη, μανόζη και λακτόζη). Αποτελούν πηγή άνθρακα. Ρυθμίζουν την οσμωτική πίεση των θρεπτικών στοιχείων στο υπόστρωμα. Η ζαχαρόζη για να χρησιμοποιηθεί από τα φυτά πρέπει πρώτα να διασπαστεί σε εξόζες (κατά τον κλιβανισμό). Η ποσότητα της ζαχαρόζης (2 4 %w/v) εξαρτάται από το είδος της καλλιέργειας.
ΑΜΙΝΟΞΕΑ ΚΑΙ ΑΛΛΕΣ ΑΖΩΤΟΥΧΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ Διεγείρουν την ανάπτυξη τωνκυττάρων.. Ιδιαίτερα χρήσιμα σε καλλιέργειες κυττάρων ή πρωτοπλαστών. Εφοδιάζουν τα κύτταρα με μια άμεσα διαθέσιμη πηγή αζώτου.
ΡΥΘΜΙΣΤΕΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Οργανικές ενώσεις. Σχηματίζονται ενδογενώς. Παρέχονται εξωγενώς με σκοπό την ενίσχυση ή την τροποποίηση της ανάπτυξης. Παράγονται σε μικρές ποσότητες από τους καλλιεργούμενους ιστούς in vitr. ίδ ύ ό ξ ώ ό Το είδοςκαιοιαπαιτούμενες ποσότητες εξαρτώνται από: 1. Το έκφυτο που καλλιεργείται. 2. Το είδος ή την ποικιλία. 3. Τον τύπο μορφογένεσης που επιδιώκεται.
ΡΥΘΜΙΣΤΕΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Κατατάσσονται σε: 1. Αυξίνες. 2. Κυτοκινίνες 3. Γιββεριλίνες.
ΡΥΘΜΙΣΤΕΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Οι πιο συνηθισμένες αυξίνες στην ιστοκαλλιέργεια είναι: ΤΥΠΟΣ ΧΗΜΙΚΗ ΟΝΟΜΑΣΙΑ Μ.Β. IAA (3 ινδολοξικό οξύ) 175.90 IBA (ινδολο 3 βουτιρικό οξύ) 203.24 NAA (Ναφθαλινοξικό οξύ) 186.21 NOA (Ναφθοξυοξικό οξύ) 202.20 p CPA (παρα χλωροφαινοξυοξικό οξύ) 186.60 2,4 D* (διχλωροφαινοξυοξικό οξύ) 221.04 2,4,5 T (Τριχλωροφαινοξυοξικό οξύ) 241.50 IBA και NAA: χρησιμοποιούνται για ριζοβολία. 2,4D και 2,4,5 5 T: χρησιμοποιούνται για δημιουργία και αύξηση κάλων. Διαλύονται συνήθως σε αιθανόλη ή αραιό NaOH.
ΡΥΘΜΙΣΤΕΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Οι πιο συνηθισμένες κυτοκινίνες στην ιστοκαλλιέργεια είναι: ΤΥΠΟΣ ΧΗΜΙΚΗ ΟΝΟΜΑΣΙΑ Μ.Β. BAP (Βενζυλαμινοπουρίνη) 225.30 2 ip* (ισοπεντενυλ αδενίνη) 203.35 Kinetin (φουρφουρυλαμινοπουρίνη) ρ μ ρ 215.22 Ζεατίνη (4 υδροξυ3 μεθυλ τρανς 2 βουτενυλαμινοπουρίνη) 219.25. Θειδιαζουρόν 220.25 Χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό (π.χ. Ζεατίνη και BAP). Διαλύονται σε αραιό HCL ή NaOH.
Επίδραση αυξίνης και κυτοκινίνης στην καλογένεση και μορφογένεση.
ΣΤΑΘΕΡΟΠΟΙΗΤΕΣ (BUFFERS) Άριστη τιμή ph καλλιεργειών in vitr 5,6 με 5,8 για: Ικανοποιητική ανάπτυξη φυτικών ιστών. Διάλυση αλάτων. Πρόσληψη θρεπτικών στοιχείων και ορμονών. Διάλυση άγαρος. Έτσι, είναι απαραίτητη η προσθήκη ουσιών για σταθεροποίηση του ph (=buffers).
ΣΤΑΘΕΡΟΠΟΙΗΤΕΣ (BUFFERS) Παραδείγματα: ταρταρικός σίδηρος αντί FeSO 4 7H 2 O Ca(PO 4 ) 2 και KNO 3 αντί Ca(NO 3 )2 4H 2 O αμινοξέα μίγμα KH 2 PO 4 και K 2 HPO 4 διαλυτό φωσφορικό ασβέστιο μίγμα νιτρικών και αμμωνιακών ιόντων succinic acid ketglutaric acid citric acid
ΣΤΕΡΕΟΠΟΙΗΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Στερεά υποστρώματα: Ως στερεοποιητικός παράγοντας χρησιμοποιείται το άγαρ, που παράγει ζελατίνη. Χρησιμοποιούνται ευρέως για εγκατάσταση εκφύτων, για καλλιέργειες ρουτίνας κάλων ή φυτικών οργάνων και για μακροχρόνια διατήρηση καλλιεργειών. Απαιτούν γυάλινα δοχεία. Μόνο η κατώτερη επιφάνεια του εκφύτου βρίσκεται σε επαφή με το υπόστρωμα. Τροποποιείται έτσι η σύνθεση ύθ του υποστρώματος κοντά στο έφ έκφυτο. Αυξάνεται η συγκέντρωση των τοξικών μεταβολιτών που ανταλλάσσονται μεταξύ υποστρώματος και ιστού ή μεταξύ των κάλων.
ΣΤΕΡΕΟΠΟΙΗΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Το άγαρ έχει τα εξής πλεονεκτήματα: Σχηματίζει με το νερό ζελατίνη που είναι σταθερή στις θερμοκρασίες ρασίες επώασης. Η ζελατίνη δεν διασπάται από τα φυτικά ένζυμα. Το άγαρ δεν αντιδρά με τα συστατικά του θρεπτικού διαλύματος. Το άγαρ έχει όμως και μειονεκτήματα: Η ανάπτυξη είναι βραδύτερη απ ότι σε υγρή καλλιέργεια. Η αύξηση του ξηρού βάρους είναι αντιστρόφως ανάλογη της συγκέντρωσης του άγαρος.
ph ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ Το ph του μέσου πρέπει να: 1. Επιτρέπει την λειτουργία των μεμβρανών (ανταλλαγή ιόντων). 2. Επιτρέπει την σταθεροποίηση του ph του κυτοπλάσματος. 3. Ελέγχει την διαλυτότητα των αλάτων του μέσου. 4. Επηρεάζει την πρόσληψη των στοιχείων του μέσου και τις δραστηριότητες των ρυθμιστών αύξησης. 5. Επηρεάζει την ικανότητα πήξης του άγαρος.
ph ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ Το ph: 1. Μεταβάλλεται κατά την διάρκεια της καλλιέργειας. 2. Επηρεάζεται από την προσθήκη άγαρος. 3. Έχει περιορισμένο ενεργό όριο. 4. Ρυθμίζεται χρησιμοποιώντας το NaOH ήτοhcl ακριβώς πριν την αποστείρωση. 5. Μετράται με ph μετρα ή δείκτες χρώματος. 6. Αλλάζει συχνά με την αποστείρωση.
ph ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ Γι αυτό η ρύθμιση του ph μπορεί να γίνει και μετά την αποστείρωση, ως εξής: 1. Ξεχωρίζουμε ένα μικρό δείγμα από το διάλυμα. 2. Το αποστειρώνουμε. 3. Αποστειρώνουμε και το βασικό διάλυμα. 4. Ρυθμίζουμε το ph στο δείγμα με 0,1 N αποστειρωμένο NaOH ή HCl. 5. Υπολογίζουμε την απαιτούμενη ποσότητα αποστειρωμένου αλκάλεως ή οξέως. 6. Την προσθέτουμε στο βασικό διάλυμα σε ασηπτικές συνθήκες.
ph ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ Επίδραση του ph στην ανάπτυξη Το ph του διαλύματος: Πρέπει να κυμαίνεται από 4,0 μέχρι 7,2 στις καλλιέργειες in vitr. Επηρεάζει τη μορφογένεση και τη μορφή του κάλου Επηρεάζει την πρόσληψη νιτρικών και αμμωνιακών ιόντων Επηρεάζει την πρόσληψη και/ή διαθεσιμότητα άλλων ανόργανων αλάτων και οργανικών μορίων
ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ΘΡΕΠΤΙΚΟΥ ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ Υπόψη πρέπει να έχουμε τα εξής: 1. Για εργασίες ρουτίνας το απλά απεσταγμένο νερό είναι αρκετό. Για πειραματικούς σκοπούς απαιτείται διπλά απεσταγμένο νερό. 2. Γιαόλεςτιςχημικέςενώσειςπρέπειναξέρουμετηνχημικήσύνθεσηκαιτο ΜΒ (εκτόςζαχαρόζηςστηνθέσητηςοποίαςχρησιμοποιούμεεπεξεργασμένη λευκή ζάχαρη). 3. Η διάλυση των χημικών ενώσεων γίνεται στο H 2 O ακολουθεί ρύθμιση του ph και πρόσθεση άγαρος. 4. Ακολουθεί αποστείρωση σε υγρό κλίβανο (autclave). 5. Η ρύθμιση όξινου γίνεται με αποστειρωμένο οξύ μετά τον κλιβανισμό. λβ 6. Η αποστείρωση ορισμένων βιταμινών και ρυθμιστών αύξησης πρέπει να γίνεται με ειδικά φίλτρα.
ΑΠΟΘΕΜΑΤΙΚΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ (1/3) Είναι διαλύματα με όλα τα χημικά συστατικά που θέλουμε σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από τις κανονικές. αοιές. 1. Αποθεματική διάλυση μακροστοιχείων Συνήθως σε συγκέντρωση 10 φορές μεγαλύτερη από την κανονική. Για να παρασκευάσουμε 1 λίτρο κανονικού διαλύματος χρησιμοποιούμε 100 ml αποθεματικού διαλύματος και το αραιώνουμε στο 1 λίτρο. Τα αποθεματικά διαλύματα διατηρούνται στο ψυγείο για μερικές μ μ ηρ ψ γ γ μ ρ ς εβδομάδες ή στην κατάψυξη για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα.
ΑΠΟΘΕΜΑΤΙΚΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ (2/3) 2. Αποθεματική διάλυση ιχνοστοιχείων (εκτός Fe) Συνήθως σε συγκέντρωση 100 φορές μεγαλύτερη από την κανονική. Γιαναπαρασκευάσουμε1 λίτρο κανονικού διαλύματος χρησιμοποιούμε 10 ml αποθεματικού διαλύματος και το αραιώνουμε στο1 λίτρο. Τα αποθεματικά διαλύματα διατηρούνται στο ψυγείο για 2 12μήνες ή στην κατάψυξη, σε δόσεις, από τις οποίες παρασκευάζουμε 1 λίτρο διαλύματος από την κάθε μία. 3. Αποθεματική διάλυση σιδήρου Παρασκευάζουμε το διάλυμα ζυγίζοντας έτοιμο άλας με Na ή K του Fe/EDTA σε μορφή σκόνης. Παρασκευάζουμε 1 λίτρο αποθεματικής διάλυσης x100 σύμφωνα με τα επίπεδα τουms διαλύματος, απότοοποίοπαίρνουμε10 ml, κάθε φορά, για να παρασκευάσουμε 1 λίτρο υποστρώματος.
ΑΠΟΘΕΜΑΤΙΚΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ (3/3) 4. Αποθεματική διάλυση βιταμινών και αμινοξέων Συνήθως σε συγκέντρωση 100 φορές ή 1000 φορές μεγαλύτερη από την κανονική. Για να παρασκευάσουμε 1 λίτρο κανονικού διαλύματος, χρησιμοποιούμε 10 ml ή 1mlαποθεματικού διαλύματος αντίστοιχα και το αραιώνουμε στο 1 λίτρο. Βιταμίνες που δεν διαλύονται στο νερό, παρασκευάζονται ιδιαιτέρως. Τα αποθεματικά διαλύματα διατηρούνται στο ψυγείο ή την κατάψυξη σε μικρές ποσότητες. 5. Αποθεματική διάλυση ορμονών Είναι αναγκαίο να παρασκευάζονται σε διαφορετικές διαλύσεις για κάθε ορμόνη σε συγκεντρώσεις 100 φορές μεγαλύτερες από την κανονική. Οι αυξίνες αποθηκεύονται στους 4 ή 20 C(απεριόριστα)και διαλύονται με την προσθήκη KOH, NOHή NaOH ή NH 3. Οι κυτοκινίνες αποθηκεύονται στους 20 C και διαλύονται με την προσθήκη λίγων σταγόνων 0,1 1 N HCl με ελαφρά θέρμανση ή με την προσθήκη μικρής ποσότητας dimethylsulfxide lf id (DMSO).
Ανακεφαλαίωση της μεθόδου παρασκευής 1 λίτρου MS (1962) θρεπτικού διαλύματος.
Σχηματική ήπαρασκευή ήθρεπτικού ύδιαλύματος.