ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ & ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ & ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Ο αυξητικός παράγοντας HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) ενεργοποιεί έμμεσα τον υποδοχέα ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Δήμητρα Τριπολιτσιώτη Βιολόγος ΠΑΤΡΑ, Απρίλιος 2013 1

ΕΓΚΡΙΣΗ ΜΕ ΥΠΟΓΡΑΦΕΣ Τα μέλη της Τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Κωνσταντίνος Φλυτζάνης..Αναστάσιος Μίντζας Αναπληρωτής καθηγητής...καθηγητής Ο Επιβλέπων καθηγητής Παναγιώτης Κατσώρης Καθηγητής 2

3

Abstract ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 7 ABSTRACT... 8 ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 10 Αυξητικοί Παράγοντες... 10 Καρκίνος... 10 Αυξητικοί παράγοντες και καρκινογένεση... 11 FGFs... 12 TGFβ... 13 IGFs... 13 VEGF... 14 EGF και TGFa... 14 Αυξητικοί παράγοντες με συγγένεια για την ηπαρίνη... 15 HARP (Heparin affin Regulatory Peptide)... 15 Γενικά... 15 Δομή του γονιδίου HARP... 16 Έκφραση κατά την ανάπτυξη... 17 Πρωτεϊνική δομή της HARP... 18 Βιολογικές Δράσεις της HARP... 21 Μιτογόνος δράση της HARP... 22 HARP και διαφοροποίηση... 22 HARP και αγγειογένεση... 23 HARP και καρκίνος... 24 HARP και καρκίνος του προστάτη... 25 Προστάτης... 26 Μοντέλα μελέτης καρκίνου του προστάτη... 31 Βιολογικά ενεργές περιοχές της HARP... 33 Υποδοχείς της HARP και μεταγωγή σήματος... 34 Πρωτεογλυκάνες Θειικής Ηπαράνης (Heparan Sulfate Proteoglycans, HSPGs). 35 SDC3 (Syndecan-3)... 35 4

Abstract RPTPβ/ζ (Receptor-Like Protein Tyrosine Phosphatase β/ζ)... 39 Anaplastic Lymphoma kinase (ALK)... 42 ΣΚΟΠΟΣ... 48 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ... 51 Ανακαλλιέργεια κυττάρων... 51 Μέτρηση κυττάρων σε αιμοκυτταρόμετρο Neubauer... 53 Κατάψυξη κυττάρων... 54 Απόψυξη κυττάρων... 56 Σταθερή διαμόλυνση NIH3T3 κυττάρων με cdna... 57 Απομόνωση και καθαρισμός της HARP από το θρεπτικό μέσο των κυττάρων... 60 Παροδική διαμόλυνση PC3 κυττάρων με παρεμβαλλόμενο RNA... 62 Εκχύλιση πρωτεϊνών από κύτταρα σε καλλιέργεια... 64 Προσδιορισμός της συγκέντρωσης πρωτεϊνών σε διάλυμα... 65 Ανοσοκατατακρήμνιση με σφαιρίδια... 67 Συγκατακρήμνιση με σφαιρίδια (Glutathione S-transferase pulldown)... 69 Ανάλυση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου σε αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE)... 71 Χρώση πηκτώματος πολυακρυλαμιδίου... 74 Ανάλυση κατά Western... 75 Εμφάνιση ανοσοστυπωμάτων... 78 Ποσοτικοποίηση ανοσοστυπωμάτων... 78 Αποδέσμευση αντισωμάτων και επαναχρησιμοποίηση ανοσοστυπωμάτων... 79 Απομόνωση ολικού RNA από κύτταρα... 80 Προσδιορισμός της συγκέντρωσης του RNA... 82 Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης... 83 Ανάλυση της έκφρασης γονιδίων με τη χρήση συνδυασμένης αντίστροφης μεταγραφής και αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-PCR).... 84 Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων... 86 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 89 Απομόνωση και καθαρισμός HARP ευκαρυωτικής προέλευσης... 89 Ταυτοποίηση της μορφής του υποδοχέα ALK που φωσφορυλιώνεται... 91 Παροδική μείωση της έκφρασης του υποδοχέα RPTPβ/ζ στα... 92 PC3 κύτταρα με χρήση sirna... 92 5

Abstract Χρησιμοποίηση κυττάρων που έχουν σταθερά μειωρυθμισμένα τα επίπεδα έκφρασης του RPTPβ/ζ... 94 Ο αυξητικός παράγοντας HARP επηρεάζει τη φωσφορυλίωση... 95 του υποδοχέα ALK... 95 Επίδραση του υποδοχέα RPTPβ/ζ στην επαγόμενη από τη HARP... 97 φωσφορυλίωση του ALK... 97 Ταυτοποίηση των περιοχών του αυξητικού παράγοντα HARP που αλληλεπιδρούν με τον RPTPβ/ζ ή/και τον ALK... 99 ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 103 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 109 6

Abstract ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) είναι ένας αυξητικός παράγοντας που δεσμεύεται στην ηπαρίνη και εμπλέκεται στη ρύθμιση της κυτταρικής διαφοροποίησης, του κυτταρικού πολλαπλασιασμού καθώς και της αγγειογένεσης. Υψηλές συγκεντρώσεις του αυξητικού παράγοντα HARP έχουν βρεθεί σε ανθρώπινους καρκινικούς όγκους, σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, όπως επίσης και σε ορό ασθενών με διάφορους τύπους καρκίνου. Επιπλέον, είναι γνωστό ότι η HARP αποτελεί υπόστρωμα για διάφορα πρωτεολυτικά ένζυμα του κυτταρικού μικροπεριβάλλοντος, με αποτέλεσμα την παραγωγή ενεργών πεπτιδίων που μπορούν να έχουν παρόμοιες ή και αντίθετες δράσεις από το ολικό μόριο. Η HARP ασκεί τις βιολογικές τις δράσεις ύστερα από πρόσδεση στους διαμεμβρανικούς υποδοχείς SDC3, RPTPβ/ζ και ALK. Παρά την ταυτοποίηση του υποδοχέα ALK ως λειτουργικού υποδοχέα της HARP, μέχρι σήμερα υπάρχουν αντικρουόμενες απόψεις αναφορικά με την αλληλεπίδρασή του με τη HARP. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η αλληλεπίδραση του αυξητικού παράγοντα HARP και του υποδοχέα ALK σε καρκινικά κύτταρα PC3 ανθρώπινου προστάτη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η HARP επάγει τη φωσφορυλίωση του ALK σε κύτταρα PC3, ωστόσο δεν είχε καμία επίδραση στην ενεργοποίηση του συγκεκριμένου υποδοχέα σε κύτταρα PC3 στα οποία είχε μειωθεί η συσσώρευση του RPTPβ/ζ. Παράλληλα χρησιμοποιήθηκαν ανασυνδυασμένα πεπτίδια που είχαν εκφραστεί ως πρωτεΐνες σύντηξης με τη θειοτρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) και αντιστοιχούσαν σε περιοχές του αυξητικού παράγοντα HARP [P(9-110), P(9-59), P(60-110)] που προκύπτουν ύστερα από πέψη με πλασμίνη. Ύστερα από πειράματα συγκατακρήμνισης βρέθηκε ότι ο ALK αλληλεπιδρά ισχυρά με το πεπτίδιο P(60-110) αποτέλεσμα το οποίο προέκυψε και ύστερα από μεωρύθμιση των επιπέδων έκφρασης του RPTPβ/ζ. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία καταδεικνύεται η έμμεση αλληλεπίδραση του υποδοχέα ALK και του αυξητικού παράγοντα HARP, η οποία βρέθηκε ότι διαμεσολαβείται από τον υποδοχέα RPTPβ/ζ. Αποδεικνύεται επίσης ότι παρόλο που η αλληλεπίδραση των δύο αυτών μορίων δεν είναι ικανή να οδηγήσει στη φωσφορυλίωση του υποδοχέα ALK, τα δύο αυτά μόρια αλληλεπιδρούν βιοχημικά καθώς η αλληλουχία 60-110 των αμινοξέων της HARP αλληλεπιδρά ισχυρά και με τις δύο μορφές του υποδοχέα, με μοριακό βάρος 220 και 140 kda αντίστοιχα. 7

Abstract ABSTRACT HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) is a heparin-binding growth factor, involved in the regulation of cell differentiation, cell proliferation as well as in angiogenesis. Elevated concentrations of HARP have been detected in malignancies, in cancer cell lines, as well as in the plasma of patients with different types of cancer. It is also known that HARP is substrate for different proteases of the cell microenvironment, leading to the production of biological active peptides which can exert similar or even opposite biological activities to HARP. HARP exerts its biological actions after binding to the transmembrane receptors SDC3, RPTPβ/ζ and ALK. Even though ALK has been defined as a functional HARP receptor, contradictory results have been published concerning HARP-ALK interaction. In the present work, we studied the interaction of HARP growth factor with ALK transmembrane receptor using PC3 prostate cancer cells. It was shown that HARP induces the phosphorylation of ALK in PC3 cells, however no effect on ALK activation was observed in PC3 cells after RPTPβ/ζ knockdown. We also used recombinant gst-fused peptides corresponding to various fragments of HARP [P(9-110), P(9-59), P(60-110)] which result after cleavage with plasmin. After GST pulldown assays it was shown that ALK strongly binds to the P(60-110), result that was also taken after RPTPβ/ζ knockdown. Cumulatively, our results indicate that HARPinduced ALK phosphorylation is mediated by RPTPβ/ζ. It is also demonstrated that HARP interacts biochemically with ALK, since P(60-110) strongly binded both species of ALK (220 and 140 kda). 8

Abstract 9

Εισαγωγή ΕΙΣΑΓΩΓΗ Αυξητικοί Παράγοντες Οι αυξητικοί παράγοντες είναι πολυπεπτίδια με σχετικά μικρά μοριακά βάρη (έως 50 kda) και είναι ρυθμιστές κυτταρικών διεργασιών όπως η κυτταρική ανάπτυξη, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός και η κυτταρική διαφοροποίηση, αλληλεπιδρώντας με ειδικούς υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης. Αποτελούν μόρια σηματοδότησης μεταξύ των κυττάρων, με τρόπο παρόμοιο με εκείνο των ορμονών. Ωστόσο, σε αντίθεση με τις ορμόνες, η δράση των αυξητικών παραγόντων είναι πιο εντοπισμένη και πραγματοποιείται με διάχυση στους γειτονικούς ιστούς είτε διεγείροντας τα ίδια κύτταρα που τους εκκρίνουν, είτε διαφορετικά είδη κυττάρων (αυτοκρινής και παρακρινής τρόπος δράσης αντιστοίχως). Παρόλο που διαφέρουν ως προς την ειδικότητα και λειτουργία τους, οι αυξητικοί παράγοντες στην πλειοψηφία τους επηρεάζουν μία πληθώρα επιθηλιακών αλλά και μεσεγχυματικών κυττάρων (Deuel, 1987). Καρκίνος Ο καρκίνος είναι ένα γενετικό νόσημα που προκύπτει από αλλαγές σε συγκεκριμένα γονίδια. Οι αλλαγές αυτές προέρχονται από μεταλλάξεις του DNA σε σωματικά κύτταρα κατά τη διάρκεια ζωής του ατόμου και προκαλούν ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό και μετάσταση. Εξ αιτίας του ανεξέλεγκτου πολλαπλασιασμού, τα κύτταρα δημιουργούν μία συμπαγή μάζα, κατάσταση που χαρακτηρίζεται ως καλοήθης νεοπλασία και δεν εγκυμονεί μεγάλους κινδύνους. Περεταίρω αλλαγές των κυττάρων έχουν ως αποτέλεσμα την αλλαγή της μορφολογίας τους, την έλλειψη προσανατολισμού και την ακόμη μεγαλύτερη αύξηση του πολλαπλασιασμού τους, μεταβολή που χαρακτηρίζεται ως δυσπλασία. Σε επόμενο στάδιο, τα κύτταρα που εμφανίζουν δυσπλασία, συχνά αυξάνονται σε ακόμη μεγαλύτερο βαθμό και παρουσιάζουν εντονότερες ανωμαλίες στη μορφολογία τους, χωρίς όμως να 10

Εισαγωγή εισβάλλουν σε άλλους ιστούς. Η κατάσταση αυτή είναι γνωστή ως in situ καρκίνωμα και είναι ένα στάδιο πριν την εμφάνιση κακοήθους όγκου. Η σταθερότητα του in situ καρκινώματος παγιώνεται μέσω της δημιουργίας αγγείων από προϋπάρχοντα, διαδικασία που λέγεται αγγειογένεση. Στη συνέχεια συνήθως κάποια κύτταρα αρχίζουν και αποσπώνται από την εστία του όγκου, εισβάλλοντας σε παρακείμενους ιστούς, ενώ μέσω της κυκλοφορίας και της λέμφου μεταναστεύουν σε διάφορα σημεία του σώματος. Η κατάσταση αυτή είναι γνωστή ως μετάσταση και οι όγκοι που έχουν την ιδιότητα μετάστασης λέγονται κακοήθεις. Οι καρκίνοι του επιθηλίου ονομάζονται καρκινώματα, οι καρκίνοι του συνδετικού ιστού σαρκώματα και των κυττάρων του αίματος λεμφώματα και λευχαιμίες. Σχεδόν το 90% των καρκίνων του ανθρώπου είναι καρκινώματα (σε αυτά συμπεριλαμβάνονται οι καρκίνοι του δέρματος, του παχέος εντέρου, των πνευμόνων, του στήθους και του προστάτη) και το ποσοστό αυτό ίσως σχετίζεται με την ικανότητα των επιθηλιακών κυττάρων α) να πολλαπλασιάζονται με μεγαλύτερη συχνότητα από τα άλλα κύτταρα και β) να έρχονται περισσότερο σε επαφή με διάφορα φυσικά και χημικά καρκινογόνα σε σχέση με τα κύτταρα άλλων ιστών (Μαρμάρας & Λαμπροπούλου, 2005). Αυξητικοί παράγοντες και καρκινογένεση Οι αυξητικοί παράγοντες είναι απαραίτητοι για τη μετάδοση ενδοκυτταρικών μηνυμάτων κυτταρικής αύξησης με σκοπό τη φυσιολογική λειτουργία των κυττάρων. Μέχρι σήμερα δεν είναι γνωστό κανένα είδος κυττάρου που να μπορεί να πολλαπλασιασθεί απουσία τέτοιων μηνυμάτων. Αυτός είναι και ο λόγος για τον οποίο η ανάπτυξη φυσιολογικών κυττάρων σε καλλιέργεια εξαρτάται από την εξωγενή προσθήκη αυξητικών παραγόντων και μορίων της εξωκυττάριας ύλης, σε αντίθεση με την καλλιέργεια των καρκινικών κυττάρων τα οποία παράγουν τα δικά τους μηνύματα. Η απόκτηση αυτοεπάρκειας σε μηνύματα κυτταρικής αύξησης έχει ως αποτέλεσμα την απεξάρτηση των καρκινικών κυττάρων από το μικροπεριβάλλον και τη διατάραξη της ομοιόστασης του ιστού. Η ενεργοποίηση ογκογονιδίων οδηγεί στη μετάβαση από τον παρακρινή τρόπο δράσης των αυξητικών παραγόντων που κατά κανόνα παρατηρείται στα 11

Εισαγωγή φυσιολογικά κύτταρα, στον αυτοκρινή τρόπο δράσης που παρατηρείται στα καρκινικά κύτταρα. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η παραγωγή του PDGF και του TGFα στην περίπτωση γλοιοβλαστώματος ή σαρκωμάτων (Fedi et al., 1997). Ένας άλλος τρόπος απόκτησης αυτο-επάρκειας σε μηνύματα κυτταρικής αύξησης είναι αλλαγές σε διαμεμβρανικούς υποδοχείς αυξητικών παραγόντων. Αυτές οι αλλαγές μπορεί να οδηγήσουν σε υπερέκφραση των υποδοχέων με αποτέλεσμα την απόκριση σε αυξητικούς παράγοντες που βρίσκονται σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις ή σε αλλαγές στη δομή τους που τους επιτρέπουν την ενεργοποίησή τους απουσία προσδέματος. Είναι γνωστό ότι σε περιπτώσεις καρκίνου του στομάχου και του μαστού έχει παρατηρηθεί υπερέκφραση του υποδοχέα του EGF (EGFR/erbB) (Slamon et al., 1987), ενώ έχει βρεθεί και μια τροποποιημένη του μορφή που ενεργοποιείται απουσία προσδέματος (Fedi et al., 1997). Τα καρκινικά κύτταρα μπορούν επίσης να αλλάξουν το είδος των ιντεγκρινών που εκφράζουν, ευνοώντας αυτές που μετάγουν σήματα επιβίωσης (Lukashev and Werb, 1998). Επιπλέον αλλαγές στα μόρια μεταγωγής σήματος που ενεργοποιούνται από υποδοχείς αυξητικών παραγόντων ή από ιντεγκρίνες, οδηγούν σε απόκτηση αυτο-επάρκειας σε μηνύματα κυτταρικής αύξησης. Το 25% όλων των τύπων καρκίνου έχουν μεταλλαγμένη την πρωτεΐνη Ras, ενώ στην περίπτωση του καρκίνου του παχέως εντέρου το ποσοστό αυτό ανεβαίνει στο 50%, με το άλλο 50% να είναι πρωτεΐνες που ενεργοποιούν τη Ras (Kinzler et al., 1996). Οι αυξητικοί παράγοντες που ομαδοποιούνται στις οικογένειες των VEGFs, των FGFs, των IGFs και TGFs είναι οι κυριότεροι αυξητικοί παράγοντες που εμπλέκονται στην καρκινογένεση. FGFs Οι αυξητικοί παράγοντες ινοβλαστών (Fibroblast Growth factors, FGFs), συνιστούν μία από τις μεγαλύτερες οικογένειες αυξητικών παραγόντων. Ενώ μέχρι σήμερα έχουν απομονωθεί 23 διαφορετικοί FGFs, που παρουσιάζουν 35-50% ομολογία ως προς την αμινοξική τους αλληλουχία, (Powers et al., 2000) μόνο τέσσερις διαφορετικοί τύποι υποδοχεών έχουν ταυτοποιηθεί για τους συγκεκριμένους αυξητικούς παράγοντες (Johnson & Williams, 1993) Αποτελούνται από μία εξωκυττάρια περιοχή δέσμευσης του προσδέματος, μία διεμεμβρανική και μία ενδοκυττάρια περιοχή με ενεργότητα κινάσης τυροσίνης. Μετά την έκκριση ή/και απελευθέρωσή τους από τα κύτταρα, οι FGFs δεσμεύονται ισχυρά σε 12

Εισαγωγή πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης (Heparan Sulfate Proteoglycans, HSPGs) (βλ. παρακάτω). Η ηπαρίνη και πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης παίζουν σημαντικό ρόλο συνυποδοχέων των FGFs, δεδομένου ότι διευκολύνουν το σχηματισμό του συμπλόκου FGF/ FGFR (Powers et al., 2000). Ο FGF-2 παίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία καρκινογένεσης, ενώ η ικανότητά του να διεγείρει την αγγειογένεση τον καθιστά μόριο-κλειδί τόσο στη ανάπτυξη των πρωτογενών όγκων, όσο και στη μεταστατική τους ικανότητα (Nicholson & Theodorescu, 2004). Αυξημένη έκφραση του FGF2 έχει συσχετιστεί και με την ανάπτυξη καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη και συγκεκριμένα με διέγερση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του στρώματος (Ropiquet et al., 1999). Η έκφραση και από τα επιθηλιακά κύτταρα σχετίζεται με την ανάπτυξη καρκίνου, επάγοντας τον πολλαπλασιασμό, την αγγειογένεση και τη μεταστατική ικανότητα (Hellawell et al., 2002). TGFβ Η οικογένεια των αυξητικών παραγόντων TGF-β (Transforming Growth Factors-beta) περιλαμβάνει τρεις ισομορφές, τον TGF-β1, τον TGF-β2 και τον TGFβ3, ενώ οι αντίστοι υποδοχείς που έχουν χαρακτηριστεί είναι οι ΤβRI και ΤβRII. Τα μέλη της οικογένειας αυτής έχουν χαρακτηριστεί μόρια-στόχοι για τη θεραπεία του καρκίνου (Arteaga et al., 2006). Γονιδιακές μεταλλάξεις των TβRI και ΙΙ έχουν βρεθεί σε καρκίνους του οισοφάγου, των ωοθηκών καθώς και του εγκεφάλου (Kaklamani et al., 2004). Επίσης, ο TGF-β επάγει τη δημιουργία EMT φαινοτύπου μέσω του σηματοδοτικού μονοπατιού των Smads μεταγραφικών παραγόντων (Thuault et al., 2006) IGFs Η οικογένεια των IGFs (Insulin-like Growth Factors) αποτελείται από πολυπεπτίδια που έχουν ομολογία με την ινσουλίνη. Περιλαμβάνει τον IGF-1 και τον IGF-2, καθώς και τους αντίστοιχους υποδοχείς τους IGF-1R και IGF-2R. Στην οικογένεια αυτή ανήκουν επίσης έξι πρωτεΐνες που δεσμεύουν IGFs (IGFBP 1-6) και κάποιες πρωτεάσες των προσδενόμενων πρωτεϊνών. Οι IGFs έχει βρεθεί ότι είναι θετικοί ρυθμιστές της διεισδυτικότητας των ενδοθηλιακών κυττάρων, καθώς επίσης και της έκφρασης του HIF-1 (Hypoxia Inducible Factor-1), γεγονότα που έχουν ως 13

Εισαγωγή αποτέλεσμα την απαγωγή της αγγειογένεσης (Shigematsu et al., 1999, Kondo et al., 2003) VEGF Η οικογένεια των VEGFs (Vascular Endothelial Growth Factors) αποτελείται από 6 μέλη (VEGF-A, B, C, E και PLGF) Oι παράγοντες αυτοί εκφράζονται στα θηλαστικά, με εξαίρεση των VEGF-E ο οποίος βρίσκεται στο DNA του ιού orf (Ogawa et al., 1998). Τα μόρια που έχουν χαρακτηριστεί μέχρι σήμερα ως υποδοχείς των VEGFs είναι οι: VEGFR-1 ή Flt-1, VEGFR-2 ή KDR/Flk-1, VEGFR-3 ή Flt-4, η Neuropilin και οι πρωτεογλυκάνες θεϊκής ηπαράνης. Οι εν λόγω αυξητικοί παράγοντες είναι σημαντικοί ρυθμιστές της αγγειογένεσης. Ως γνωστόν, οι νεοσχηματισμένοι συμπαγείς όγκοι χρειάζονται την παροχή θρεπτικών συστατικών και οξυγόνου για να αναπτυχθούν, για τον λόγο αυτό, υπερέκφραση του VEGF έχει συσχετισθεί με ιδιαίτερα επιθετικούς καρκίνους. Έρευνες έχουν δείξει ότι o VEGF επάγει τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων και την αγγειογένεση in vivo (Ferrara et al., 2003), ενώ αυξημένα επίπεδα VEGF έχουν παρατηρηθεί σε ορό ασθενών με διάφορες μορφές καρκίνου (Kondo et al., 1994), συμπεριλαμβανομένου και του καρκίνου του μαστού (Toi et al., 1994). EGF και TGFa Ο EGF και ο TGF-α παρουσιάζουν δομικές ομοιότητες και διαθέτουν τον ίδιο υποδοχέα, τη διαμεμβρανική κινάση τυροσίνης EGFR (erbb1/her1). Η συμμετοχή των αυξητικών αυτών παραγόντων καθώς και του EGFR στον καρκίνο, καταδεικνύεται από έρευνες σύμφωνα με τις οποίες η ταυτόχρονη έκφραση των TGFa, EGF και EGFR συνδυάζεται με ιδιαίτερα επιθετικούς καρκίνους του μαστού (Umenkita et al., 2000). Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι ο TGF-α δρα αυτοκρινώς μέσω του EGFR σε καρκινικά κύτταρα ωοθηκών και το μονοπάτι μεταγωγής σήματος που ενεργοποιείται φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Morishige et al. 1991). 14

Εισαγωγή Αυξητικοί παράγοντες με συγγένεια για την ηπαρίνη Πειράματα χρωματογραφίας συγγένειας απέδειξαν ότι πολλοί από τους παραπάνω αυξητικούς παράγοντες προσδένονται στην ηπαρίνη. Έχει επίσης προταθεί ότι τόσο η ηπαρίνη, όσο και οι πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης (HSPGs), παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των βιολογικών δράσεων των αυξητικών παραγόντων καθώς και της συσσώρευσής τους στην επιφάνεια του κυττάρου (Vlodavsky et al., 1987). Η συσσώρευση αυξητικών παραγόντων στο κυτταρικό μικροπεριβάλλον προϋποθέτει την ύπαρξη μηχανισμών για τη βιοδιαθεσιμότητα τους. Για το λόγο αυτό, σε ορισμένες περιπτώσεις παθολογικών καταστάσεων που παρατηρείται τροποποίηση της σύστασης του εξωκυττάριου υλικού, παρατηρείται επίσης αλλαγή στην κυτταρική αύξηση και λειτουργία εν γένει. Ένας μεγάλος αριθμός αυξητικών παραγόντων που δεσμεύονται στην ηπαρίνη, ανάμεσά τους και η HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) (Li et al., 1990, Courty et al., 1991), αναγράφονται παρακάτω: Hepatocyte Growth Factor (HGF) Heparin Binding Epidermal Growth Factor (HB-EGF) Fibroblast Growth Factors (FGFs) Platelet-Derived Growth Factors (PDGFs) Transforming Growth Factors (TGFs) Vascular Endothelial Growth Factors (VEGFs) Μidkine (ΜΚ) Heparin Affin RegulatoryPeptide (HARP) HARP (Heparin affin Regulatory Peptide) Γενικά Η HARP είναι μια εκκρινόμενη, υψηλά συντηρημένη πρωτεΐνη που ανήκει σε μία νέα σχετικά οικογένεια αυξητικών παραγόντων με συγγένεια για την ηπαρίνη. Στην ίδια οικογένεια ανήκει η Midkine (MK) (Kadomatsu et al, 1988), ένας αυξητικός παράγοντας που εμφανίζει υψηλή ομολογία (περίπου 50%) με τη HARP 15

Εισαγωγή (Amet et al, 2001), καθώς και η ομόλογη αυτής στα πτηνά RI-HB (Retinoic acid Induced Heparin Binding protein) (Raulais et al., 1991). Η HARP απομονώθηκε παράλληλα από πολλές διαφορετικές ερευνητικές ομάδες και για το λόγο αυτό απαντάται στη βιβλιογραφία με πολλές ονομασίες (Pleiotrophin, Heparin-Βinding Growth-Associated Molecule, Osteoblast Specific Factor-1, Heparin-binding neurotrophic factor). Ωστόσο, ύστερα από την αλληλούχιση του γονιδίου αλλά και της αμινοξικής της αλληλουχίας, έγινε φανερό ότι όλες αυτές οι ονομασίες αντιστοιχούσαν στον ίδιο παράγοντα. Δομή του γονιδίου HARP Το cdna της HARP είναι πολύ συντηρημένο ανάμεσα στον άνθρωπο, το ποντίκι και τον αρουραίο (Li et al., 1990) ενώ η ομοιότητα στην εναλλαγή ιντρονίων και εξονίων στο γονίδιο της HARP στον άνθρωπο και το zebrafish και της HARP και της midkine στο ποντίκι, οδηγεί στο συμπέρασμα ότι τα μόρια αυτά προέρχονται από κοινό πρόγονο. Το γονίδιο της HARP στον άνθρωπο περιλαμβάνει πάνω από 65 kb, περιέχει τουλάχιστον επτά εξόνια, το ελάχιστο μεγεθός του αντιστοιχεί σε 42 kb και εντοπίζεται στη θέση q33, στο 7 ο χρωμόσωμα (Li et al., 1992). Tο mrna της HARP εντοπίζεται σε πέντε εξόνια και έχει μέγεθος 1650 νουκλεοτίδια. Η αλληλουχία του πεπτιδίου σινιάλου, καθώς και των πρώτων πέντε αμινοξέων εντοπίζονται στο εξόνιο 2, ενώ το μεγαλύτερο μέρος της κωδικής αλληλουχίας της πρωτεΐνης της HARP εντοπίζεται στα εξόνια 3 και 4 (Kretchmer et al., 1993). Ο υποκινητής της HARP δεν περιέχει την αλληλουχία ΤΑΤΑ, αλλά περιέχει μια αλληλουχία CAAT, τέσσερις περιοχές πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα MyoD (myogenic differentiation) (Εικόνα 1.1), δυο του AP-1 (activator protein 1), μια του πυρηνικού παράγοντα GT1 (στοιχείο απόκρισης στον ορό (SRE) και μια περιοχή πρόσδεσης για τον homebox A5 (HOXA5). Υπάρχουν και πιθανές θέσεις για την πρόσδεση μεταγραφικών παραγόντων, όπως του πυρηνικού υποδοχέα κb (ΝFκB), του CREB binding protein (CBP), του παράγοντα απόκρισης στον ορό (CArG box) και του ρετινοϊκού οξέος (RARE/TRE/VDE), κάτι το οποίο χρήζει περαιτέρω διερεύνησης (Li et al., 1992; Kretchmer et al., 1993; Polytarchou et al., 2005). Έχει αναφερθεί πιθανότητα 16

Εισαγωγή πρόσδεσης του Sox10, αλλά η ακριβής περιοχή δεν έχει ακόμα διευκρινιστεί (Lee et al., 2008). Εικόνα 1.1: Απεικόνιση του υποκινητή του γονιδίου της HARP. Διακρίνεται η περιοχή CAAT καθώς και οι θέσεις αναγνώρισης από μεταγραφικούς παράγοντες (Papadimitriou et al., 2004). Έκφραση κατά την ανάπτυξη Η έκφρασή της HARP επηρεάζεται από διάφορους παράγοντες όπως ο FGF2, το ρετινοϊκό οξύ και τα ανδρογόνα, ακολουθώντας συγκεκριμένο αναπτυξιακό πρότυπο κατά την εμβρυική ανάπτυξη (Wellstein et al., 1992). Κατά την ενήλικη ζωή τα επίπεδα έκφρασή της είναι ιδιαίτερα χαμηλά και περιορίζεται σε συγκεκριμένους ιστούς, με εξαίρεση τις περιπτώσεις τραυματισμών και καρκίνου, όπου παρατηρείται ραγδαία αύξηση. Πειράματα in situ υβριδοποίησης έδειξαν ότι η HARP εκφράζεται σε πολλούς νευροεξωδερμικούς και μεσοδερμικούς ιστούς (Vanderwinden et al., 1992) υποδηλώνοντας ότι το μόριο αυτό εμπλέκεται σε διαδικασίες όπως η νευριδίωση, η κυτταρική μετανάστευση και η οργανογένεση. Αυξημένα επίπεδα έκφρασης της HARP παρατηρούνται κυρίως κατά την μετεμβρυική περίοδο στο αναπτυσόμενο νευρικό σύστημα. Το mrna της HARP έχει εντοπιστεί στα νευρικά εμβρυικά κύτταρα αλλά και σε μη νευρωνικούς κυτταρικούς τύπους όπως τα στροκύτταρα και τα κύτταρα Schwann (Vanderwinden et al., 1992). Επιπλέον, η HARP φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη δημιουργία των νευρομυικών συνάψεων, καθώς συμμετέχει στη συσσώρευση υποδοχέων ακετυλοχολίνης (Peng et al, 1995). Εκτός από το νευρικό σύστημα η HARP συμμετέχει και σε αλληλεπιδράσεις επιθηλίου μεσεγχύματος. Εντοπίζεται στη βασική μεμβράνη και τις κυτταρικές 17

Εισαγωγή μεμβράνες επιθηλιακών κυττάρων αναπτυσσόμενων οργάνων, καθώς και σε αισθητήρια όργανα, στα μαλλιά, στις καταβολές των άκρων, στον αναπτυσσόμενο μετάνεφρο, στο πεπτικό και το αναπνευστικό σύστημα (Mitsiadis et al., 1995). Το mrna της HARP εκφράζεται επίσης σε πρόδρομα κύτταρα οστών και χόνδρων καθώς και στα κύτταρα Leydig των όρχεων. (Imai et al., 1998; Dreyfus et al., 1998). Σύμφωνα με μελέτες, η HARP εμπλέκεται και στη ρύθμιση της αναπαραγωγικής διαδικασίας. Συμμετέχει στη ρύθμιση του έμμηνου κύκλου (Milhiet et al., 1998), ενώ η έκφραση της HARP φαίνεται να επηρεάζει και τη διαδικασία της σπερματογένεσης. Τέλος, η HARP έχει συσχετιστεί και με τον καρκίνο του προστάτη. Όπως προαναφέρθηκε, η έκφραση της HARP αυξάνεται ύστερα από τραυματισμό, τοπική ισχαιμία ή φλεγμονή και είναι ιδιαίτερα αυξημένη σε ενδοθηλιακά κύτταρα, μακροφάγα, και αστροκύτταρα, η παρουσία της δε στα τελευταία την καθιστά και ως νευρωνικό μετατραυματικό δείκτη. Πρωτεϊνική δομή της HARP Η HARP, όπως προκύπτει από μελέτη του cdna της, είναι ένα υψηλά συντηρημένο πολυπεπτίδιο 168 αμινοξέων (Li et al., 1990) που φέρει μία αμινοτελική, μία καρβοξυτελική και μία κεντρική περιοχή. Το ακραίο τμήμα του αμινοτελικού άκρου περιέχει 32 υδρόφοβα αμινοξέα τα οποία αποτελούν το πεπτίδιο σινιάλο. Αρχικά η HARP απομονώθηκε από μήτρα βοός ως πολυπεπτίδιο 136 αμινοξέων (Li et al., 1990), και έφερε την αλληλουχία ΝΗ2-GKKEKP στο αμινοτελικό της άκρο. Ωστόσο, ύστερα από απομόνωση του αυξητικού παράγοντα από διάφορες ερευνητικές ομάδες, το πεπτίδιο που προέκυψε διέφερε από το αρχικό στην παρουσία τριών επιπλέον αμινοξέων, φέροντας την αλληλουχία ΝΗ2- AEAGKKEKP στο αμινοτελικό άκρο. Τα τρία επιπλέον αμινοξέα προκύπτουν ύστερα από πέψη του πεπτιδίου σινιάλου σε διαφορετικό σημείο (Εικόνα 1.2). Επιπλέον υποθέσεις που έχουν γίνει, προτείνουν ότι τη σωστή διαμόρφωση της HARP δίνει το εκτεταμένο κατά τρία αμινοξέα πολυπεπτίδιο, το οποίο συμπεριλαμβάνεται και στην ομόλογη με τη HARP πρωτεΐνη MK (Midkine) (Laaroubi et al., 1994). 18

Εισαγωγή To 24% των αμινοξέων της HARP είναι βασικά (20,6% λυσίνες, 3,7% αργινίνες), ομαδοποιημένα στο καρβοξυτελικό και αμινοτελικό άκρο (Εικόνα 1.3) και παραπέμπουν στο κοινό μοτίβο συνδεδεμένων κατιοντικών αμινοξέων διαφόρων αυξητικών παραγόντων με συγγένεια για την ηπαρίνη. Θεωρούνται σημαντικά για την πρόσδεση της HARP στην ηπαρίνη και την εξωκυττάρια ύλη (Bohlen et al., 1991; Li et al., 1990), ενώ προσδίδουν στο μόριο συμπεριφορά θετικά φορτισμένου μορίου με pi = 10,1. Εικόνα 1.2: Αμινοξική αλληλουχία της HARP. Το υπογραμμισμένο τμήμα αντιστοιχεί στο πεπτίδιο σινιάλο. Με * σημειώνονται τα δύο σημεία στα οποία μπορεί να πραγματοποιηθεί η πέψη και απομάκρυνση του πεπτιδίου σινιάλου. Πέψη σε διαφορετικά σημεία έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ώριμων μορίων με διαφορετικό αριθμό αμινοξέων στο αμινοτελικό άκρο. Ύστερα από ηλεκτροφορητική (SDS-PAGE) ανάλυση της HARP, βρέθηκε ότι το μοριακό βάρος του μορίου είναι 18 kda. Παρ όλα αυτά, πειράματα πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (Nuclear Magnetic Resonance, NMR), απέδειξαν ότι το μοριακό βάρος της HARP κυμαίνεται στα 15,291 kda (Hampton et al., 1992). Η διαφορά αυτή οφείλεται στο μεγάλο ποσοστό της HARP σε βασικά αμινοξέα, με αποτέλεσμα, κατά την ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτικές συνθήκες, στο μόριό της να προσροφάται περισσότερο SDS και έτσι, λόγω μειωμένης κινητικότητας να αυξάνεται το φαινομενικό μοριακό βάρος της πρωτεΐνης. Σύμφωνα με πειράματα NMR, βρέθηκε ότι η HARP αποτελείται από δύο κεντρικές περιοχές οι οποίες συνδέονται μεταξύ τους μέσω ενός ελαστικού συνδέσμου. Κάθε κεντρική περιοχή συγκροτείται από τρεις αντιπαράλληλες β- πτυχωτές επιφάνειες που αντιστοιχούν στα αμινοξέα 18-27, 32-39, 48-57, 70-78, 83-91 και 101-110 (Εικόνες 1.3 & 1.4) και συνδέονται με δισουλφιδικούς δεσμούς. Στη 19

Εισαγωγή δημιουργία των συνολικά πέντε δισουλφιδικών δεσμών του μορίου της HARP συμμετέχουν δέκα κυστεΐνες, Οι δισουλφιδικές γέφυρες δημιουργούνται μεταξύ των: Cys15- Cys44, Cys23- Cys53, Cys30- Cys57, Cys67-Cys 99 και Cys77-Cys109 και συμβάλλουν σημαντικά στη σταθερότητα του μορίου κατά την τροποποίηση του pη ή κατά την επίδραση με οργανικούς διαλύτες. Ωστόσο καθιστούν τη HARP ευαίσθητη σε αναγωγικές συνθήκες. Η ύπαρξη αυτών των δέκα κυστεϊνών εξηγεί τη δυσκολία απομόνωσης ανασυνδυασμένης HARP (από προκαρυωτικούς οργανισμούς) με σωστή δομή και πλήρη βιολογική δράση (Kuo et al.,1992). Τόσο το αμινοτελικό, όσο και το καρβοξυτελικό άκρο της HARP είναι πλούσια σε λυσίνες και σχηματίζουν τυχαίες περιελίξεις (Μerenmies et al., 1990). Η απουσία κλασικών θέσεων Ν-γλυκοσιλίωσης (Hampton et al, 1992) οδηγεί στο συμπέρασμα ότι δεν υφίσταται μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, κάτι που επιβεβαιώνεται και με φασματομετρικές μεθόδους (Kuo et al, 1992). Εικόνα 1.3: Λειτουργικές περιοχές της HARP: Σχηματική απεικόνιση των TSR επαναλαμβανόμενων περιοχών, των β-φύλλων και των πλούσιων σε λυσίνες περιοχών της ανθρώπινης HARP, οι οποίες υποδεικνύονται με αριθμούς κάτω από την ευθύγραμμη απεικόνιση του μορίου της HARP. 20

Εισαγωγή Εικόνα 1.4: Αναπαράσταση του μορίου της HARP ύστερα από ανάλυση NMR. Διακρίνονται οι δύο κεντρικές περιοχές του μορίου που συγκροτούνται από δύο ομάδες τριών αντιπαράλληλων β-φύλλων, καθώς και τα δύο άκρα του μορίου, που σχηματίζουν τυχαίες περιελίξεις. Αξίζει να αναφερθεί ότι οι αντιπαράλληλες β-πτυχωτές επιφάνειες, είναι κοινές και στη Midkine (MK) και αντιστοιχούν στις επαναλαμβανόμενες περιοχές της θρομβοσπονδίνης τύπου Ι (Thrombospondin Type I repeat, TSR) (Εικόνα 1.3) (Kilpelainen et al., 2000). Οι τελευταίες, εμπεριέχονται σε διάφορες πρωτεΐνες και δικαιολογούν τη δέσμευσή τους στην ηπαρίνη. Υποψήφια για την ιδιότητα αυτή είναι τα συντηρημένα μοτίβα τρυπτοφάνης-κυστεΐνης. Βιολογικές Δράσεις της HARP Η HARP απαντάται και ως πλειοτροπίνη (Pleiotrophin, PTN), ονομασία που αντικατοπτρίζει την πλειάδα των βιολογικών δράσεων που ασκεί σε διάφορους κυτταρικούς τύπους. Η επαγωγή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της κυτταρικής μετανάστευσης, της κυτταρικής διαφοροποίησης, ο σχηματισμός των οστών, η χονδρογένεση, η σπερματογένεση, η ογκογένεση και η αγγειογένεση, είναι μερικές από τις βιολογικές δράσεις που έχουν αποδοθεί στη HARP. 21

Εισαγωγή Μιτογόνος δράση της HARP Παρά το γεγονός ότι η HARP επάγει τον πολλαπλασιασμό σε μία πλειάδα κυτταρικών τύπων, όπως ενδοθηλιακά, (Papadimimitriou et al., 2000), ηπατικά, κερατινοκύτταρα, επιθηλιακά, και ινοβλάστες (Fang et al., 1992), η μιτογόνος δράση της HARP δεν έχει επιβεβαιωθεί πλήρως. Οι θεωρίες που έχουν διατυπωθεί υποστηρίζουν ότι η συγκεκριμένη δράση οφείλεται στην επιμόλυνση της HARP με άλλους αυξητικούς παράγοντες, όπως οι FGFs, κατά τη διάρκεια της απομόνωσης (Hampton et al., 1992). Επιπλέον, έχει προταθεί ότι το σημείο πέψης του πεπτιδίου σινιάλου της HARP επηρεάζει τις βιολογικές δράσεις του μορίου, με την αλληλουχία που υπερτερεί κατά τρία αμινοξέα στο αμινοτελικό άκρο (ΝΗ 2 -AEAGKKEKP) να θεωρείται υπεύθυνη για τη μιτογόνο δράση της HARP (Bernard-Pierrot et al., 2001). Πρόλα αυτά, έρευνες έχουν αποδείξει ότι η μιτογόνος δράση της HARP είναι ανεξάρτητη των FGFs (Souttou et al., 1997), καθώς και ότι η παρουσία των τριών επιπλέον αμινοξέων στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης δεν αποτελεί καθοριστικό παράγοντα για την μιτογόνο δράση του μορίου. (Papadimitriou et al., 2000). Τέλος, είναι γεγονός ότι η μιτογόνος δράση της HARP εξακολουθεί και είναι υπό αμφισβήτηση, καθώς υπάρχουν αντικρουόμενα αποτελέσματα ανάλογα με το εκάστοτε είδος της HARP που χρησιμοποιείται, αλλά και με τον υπό μελέτη κυτταρικό τύπο. Όπως αναλύεται παρακάτω, υπάρχουν διάφορα τμήματα της HARP που ασκούν μία ποικιλία βιολογικών δράσεων. Συνεπώς, οι διαφορετικές αποκρίσεις στο μόριο της HARP θα μπορούσαν να οφείλονται στη διαφορική δράση ξεχωριστών τμημάτων του μορίου. (Polycratis et al., 2004) HARP και διαφοροποίηση Η HARP είναι γνωστό ότι παίζει σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση και την οργάνωση του εγκεφάλου, συμμετέχοντας σε διαδικασίες όπως η προέκταση των νευριτών (Rauvala et al., 1989), η ανάπτυξη της μνήμης (Amet et al., 2001), η μορφογένεση των ινών Purkinje στην αναπτυσόμενη παρεγκεφαλίδα (Tanaka et al., 2003), αλλά και η δημιουργία των νευρομυικών συνάψεων (Peng et al., 1995) 22

Εισαγωγή Εμπλέκεται επίσης και στην οστεογένεση, επάγοντας τη μετανάστευση οστεοβλαστών καθώς και τη χονδρογένεση στα αναπτυσόμενα άκρα της όρνιθας (Imai et al., 1998; Dreyfus et al., 1998). Τέλος, φαίνεται να επηρεάζει τη μορφογένεση του μαστικού αδένα (Ledoux et al., 1997) αλλά και τη διαδικασία της σπερματογένεσης, δεδομένου ότι διαμόλυνση εμβρυοβλαστών ποντικών με ανενεργές μορφές της HARP είχε ως αποτέλεσμα τη δημιουργία στείρων μυών (Zhang et al., 1997). HARP και αγγειογένεση Ως αγγειογένεση ορίζεται η διαδικασία σχηματισμού νέων αγγείων από προϋπάρχοντα. Αγγειογένση κάτω από αυστηρό έλεγχο παρατηρείται στο αναπαραγωγικό σύστημα των θυληκών ατόμων στα θηλαστικά και κατά την επούλωση πληγών, ενώ σε παθολογικές καταστάσεις όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα, η αγγειογένεση καθίσταται ανεξέλεγκτη. Επιπλέον, η αγγειογένεση παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση και ανάπτυξη των καρκινικών όγκων. Τα καρκινικά κύτταρα επάγουν την δημιουργία νέων αγγείων για να διατηρηθούν, να αναπτυχθούν και να μεταναστεύσουν. Ο ρόλος της HARP στην φυσιολογική αγγειογένεση προτάθηκε για πρώτη φορά όταν εντοπίσθηκε, τόσο η πρωτεΐνη όσο και το mrna της, σε ενδοθηλιακά κύτταρα από μαστικό αδένα ανθρώπου (Ledoux et al., 1997), σε ενδομήτριο αρουραίου (Milhiet et al., 1998) και σε ανθρώπινο προστάτη (Vacherot et al., 1999). Ωστόσο, ακόλουθες μελέτες απέδειξαν το ρόλο της HARP τόσο στην in vitro όσο και στην in vivo αγγειογένεση. Σε in vitro μελέτες, η HARP έχει την ικανότητα επαγωγής του πολλαπλασιασμού, και της διαφοροποίησης των ενδοθηλιακών κυττάρων, καθώς και του σχηματισμού από ενδοθηλιακά κύτταρα, δικτύου ψευδαγγείων σε πήκτωμα κολλαγόνου και matrigel. Η in vivo αγγειογενετική δράση της HARP έχει διαπιστωθεί στο σύστημα της χοριοαλλαντοϊδικής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας (Papadimitriou et al., 2001) και σε εμφυτεύματα matrigel σε ποντίκια (Papadimitriou et al., 2000) (Papadimitriou et al., 2000) Τέλος, μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζει και η παρατήρηση της άμεσης αλληλεπίδρασης της HARP με τον VEGF 165 με αποτέλεσμα την αναστολή της δράσης του τελευταίου (Heroult et al., 2004). 23

Εισαγωγή Επιπλέον, έχει παρατηρηθεί ότι τα επίπεδα έκφρασής της HARP είναι διαφορετικά κατά τη διάρκεια του έμμηνου κύκλου με τα μέγιστα ποσοστά να παρατηρούνται κατά την έναρξή του (Milhiet et al., 1998). HARP και καρκίνος Η καρκινογένεση είναι μια πολυσύνθετη διαδικασία που περιλαμβάνει τη μετατροπή των φυσιολογικών κυττάρων σε καρκινικά (μια διαδικασία που καλείται μετασχηματισμός, transformation), την απώλεια ικανότητας διαφοροποίησης των κυττάρων και τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό τους. Οι παραπάνω αποκρίσεις, πιθανολογείται ότι πυροδοτούνται από αυξητικούς παράγοντες που εκκρίνονται από τα καρκινικά κύτταρα, παίζοντας καθοριστικό ρόλο στην επακόλουθη ανάπτυξη και μετάσταση των καρκινικών όγκων. Ο πιθανός ρόλος της HARP στον καρκίνο, προτάθηκε μετά από απομόνωση του αυξητικού αυτού παράγοντα από το θρεπτικό μέσο καλλιεργειών επιθηλιακών κυττάρων καρκίνου του μαστού (MDA-MB-231). (Fang et al., 1992). Υψηλά επίπεδα έκφρασης της HARP έχουν παρατηρηθεί σε διάφορους τύπους καρκίνου του εγκεφάλου, όπως μηνιγγιώματα, νευροβλαστώματα, γλοιοβλαστώματα, και μελανώματα. Τέλος, η έκφραση της HARP έχει συσχετιστεί και με διαδικασίες που προηγούνται της ανάπτυξης νεοπλασίας του ήπατος (Kohashi et al., 2002). Σύμφωνα με τα παραπάνω, η HARP φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση. Υπερέκφραση της HARP σε κυτταρική σειρά NIH 3T3 ινοβλαστών οδήγησε σε καρκινικό φαινότυπο, συμπέρασμα που προέκυψε ύστερα από μελέτη τεσσάρων ανεξαρτήτων μεταξύ τους κριτηρίων: Τον αριθμό των κυττάρων όταν είναι προσκολλημένα σε υπόστρωμα. Τον σχηματισμό εστιών προσκόλλησης. Την ανάπτυξη των κυττάρων σε συνθήκες ανεξάρτητες από προσκόλληση. Τον σχηματισμό όγκων σε αθυμικά ποντίκια (Chauhan et al., 1993). Προκύπτει συνεπώς το συμπέρασμα ότι η HARP προκαλεί μετασχηματισμό των NIH3T3 ινοβλαστών, οδηγώντας σε αποδιοργάνωση του κυτταροσκελετού και ανεξέλεγκτη αύξηση, επάγωντας την καρκινογένεση. Σε συμφωνία με τα παραπάνω, βρέθηκε ότι το θρεπτικό μέσο καλλιέργειας κυττάρων SW-13, που είχαν διαμολυνθεί με το cdna της HARP, επάγει τον πολλαπλασιασμό SW-13 κυττάρων, ενδοθηλιακών κυττάρων και ινοβλαστών. Επιπλέον, τα κύτταρα SW-13 απέκτησαν 24

Εισαγωγή αυτονομία στην ανάπτυξή τους σε πήκτωμα soft agar, και προκάλεσαν την εγκαθίδρυση και ανάπτυξη όγκων σε αθυμικά ποντίκια (Fang et al., 1992). Επίσης, σε καρκινικά κύτταρα μαστού ανθρώπου που είχαν διαμολυνθεί με ανενεργή μορφή της HARP, παρατηρήθηκε ανάσχεση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και του σχηματισμού αποικιών σε πήκτωμα soft agar, ενώ ταυτόχρονα ανεστάλη πλήρως ο σχηματισμός όγκων σε αθυμικά ποντίκια (Zhang et al., 1997). Τα αποτελέσματα αυτά προτείνουν ότι η συστατική έκφραση της HARP θα μπορούσε να είναι καθοριστικής σημασίας για τον επιθετικό φαινότυπο καρκίνων του μαστού in vivo. Στον άνθρωπο, αυξημένα επίπεδα HARP έχουν ανιχνευθεί στον ορό αθενών με διάφορους τύπους καρκίνου, όπως καρκίνο του παγκρέατος, γλοιβλάστωμα, γλοίωμα και μελάνωμα, καθώς και στα πρώτα στάδια εμφάνισης καρκίνου των όρχεων (Souttou et al., 1998; Soulie et al., 2004; Wu et al., 2005; Aigner et al., 2003). Επίσης, αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν στον ορό αίματος ασθενών με χρόνια παγκρεατίτιδα, μια ασθένεια που συνήθως προηγείται του καρκίνου του παγκρέατος (Klomp et al., 2002). Δεδομένου ότι σε πολλές από τις παραπάνω περιπτώσεις καρκίνων τα επίπεδα της HARP μειώνονται αισθητά ύστερα επό επιτυχή απομάκρυνση του όγκου, γίνεται προφανές ότι η ταυτοποίηση της HARP ως διαγνωστικού δείκτη τέτοιου είδους ασθενειών, θα είχε μεγάλη κλινική αξία. HARP και καρκίνος του προστάτη Ο αυξητικός παράγοντας HARP φαίνεται να έχει σχέση και με τον καρκίνο του προστάτη. Κλινικές μελέτες έδειξαν αυξημένα επίπεδα HARP στον ορό αίματος ασθενών με τον συγκεκριμένου τύπου καρκίνο (Fang et al., 1992; Souttou et al., 1998). Το mrna της HARP εντοπίζεται στα κύτταρα του ινομυώδους στρώματος τόσο σε φυσιολογικούς, όσο και υπερπλασμένους ή καρκινικούς προστατικούς ιστούς. Παρόλα αυτά, ιδιαίτερο ενδιαφέρον αποτελεί το γεγονός ότι ενώ η πρωτεΐνη HARP δεν ανιχνεύεται στα επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη υπό φυσιολογικές συνθήκες, η παρουσία της είναι έντονη στο επιθήλιο των καρκινικών ιστών, υποδηλώνοντας τον παρακρινή τρόπο δράση της (Vacherot et al., 1995). Ο καρκίνος του προστάτη είναι πολύ συχνός, αφού περίπου ένας στους δέκα άνδρες θα αναπτύξει καρκίνο του προστάτη κατά τη διάρκεια της ζωής του. Αποτελεί σήμερα ένα από τα σημαντικότερα ιατρικά προβλήματα στον άνδρα. Είναι υπεύθυνος 25

Εισαγωγή έως και για το 9% όλων των θανάτων από καρκίνο στον άνδρα και τη δεύτερη συχνότερη μορφή καρκίνου μετά τον καρκίνο του πνεύμονα, που προσβάλλει τον ανδρικό πληθυσμό στις ανεπτυγμένες χώρες. Καθώς ο μέσος όρος ζωής αυξάνεται, αναμένεται ότι θα αυξηθούν επίσης τόσο η επίπτωση όσο και η θνησιμότητα από τον καρκίνο του προστάτη. Σήμερα οι έρευνες δείχνουν ότι το 60-70% όλων των ανδρών που φτάνουν στην ηλικία των 80 ετών παρουσιάζουν μικροσκοπικά στοιχεία καρκίνου του προστάτη. Επειδή τα συμπτώματα εμφανίζονται όταν πλέον ο καρκίνος έχει εξαπλωθεί πέραν του προστάτη, είναι απαραίτητοι οι τακτικοί έλεγχοι. Προστάτης Ο προστάτης είναι ένα αδενομυώδες όργανο που μαζί με τους ουρηθρικούς και τους βολβουρηθραίους αδένες, συγκροτεί τους κύριους αδένες του αρσενικού ουρογεννητικού ανθρώπινου συστήματος. Οι ζώνες (περιοχές) από τις οποίες αποτελείται ο προστατικός αδένας απεικονίζονται στην εικόνα 1.5 (McNeal, 1980): Κεντρική Ζώνη: Καταλαμβάνει το 25% του προστατικού όγκου και βρίσκεται στη βάση του αδένα. Περιφερική Ζώνη: Καταλαμβάνει το 70% του προστατικού όγκου και αποτελεί κοινό σημείο εμφάνισης ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας και καρκινώματος Μεταβατική Ζώνη: Καταλαμβάνει το 5% του προστατικού όγκου και σε περιπτώσεις καλοήθους υπερπλασίας μεγενθύνεται μαζί με το υπερκείμενο ινομυώδες στρώμα. Ινομυώδες στρώμα: Αποτελείται από λεία μυϊκά κύτταρα, ινοβλάστες, εδραία μακροφάγα, ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων, νευρικές απολήξεις και λεμφαγγεία. 26

Εισαγωγή Εικόνα 1.5: Απεικόνιση περιοχών προστατικού αδένα σε τομή Ο προστάτης περιβάλλεται από την κάψα, η οποία είναι πλούσια σε φλεβικά αιμοφόρα αγγεία και συνεχίζεται σε ινομυώδη διαφράγματα στο εσωτερικό, όπου 30-50 σωληνοκυψελιδωτοί αδένες είναι βυθισμένοι σε ινομυώδες στρώμα. Το ινομυώδες στρώμα αποτελείται από ένα εσωτερικό στρώμα λείων μυικών ινών και ένα εξωτερικό κάλυμμα κολλαγόνου. Ο προστάτης φέρει εκκριτικά αδένια που εκβάλλουν στην ουρήθρα, η οποία διατρέχει τον αδένα σε όλο του το μήκος. Τα προστατικά αδένια και οι πόροι αναπτύσσονται μέσα σε στηρικτικό στρώμα από ινοβλάστες, κολλαγόνο και λείες μυϊκές ίνες. Το επιθήλιο του προστάτη αποτελείται από τρεις κατηγορίες κυττάρων: τα εκκριτικά, τα βασικά και τα νευροενδοκρινή (Εικόνα 1.6) (De Marzo et al., 1998). Τα εκκριτικά κύτταρα, βρίσκονται στο εσωτερικό των κυψελίδων. Έχουν κυλινδρικό σχήμα, διάφανο κυτταρόπλασμα και ικανότητα έκκρισης διαφόρων προϊόντων, όπως το ειδικό προστατικό αντιγόνο (Prostate Specific Antigen, PSA), την όξινη προστατική φωσφατάση (Prostatic Acid Phosphatase, PAP) και την όξινη βλέννα. Ως πλήρως διαφοροποιημένα κύτταρα, έχουν τον χαμηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού. Τα βασικά κύτταρα βρίσκονται πάνω από τη βασική μεμβράνη. Εμφανίζουν τον εντονότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού, στερούνται υποδοχέων των προϊόντων των εκκριτικών κυττάρων, καθώς επίσης και των ανδρογόνων. Θεωρούνται προγονικά κύτταρα των επιθηλιακών κυττάρων. Χαρακτηριστικό των βασικών 27

Εισαγωγή κυττάρων είναι οι μεγάλου μεγέθους κερατίνες της κυτταρικής επιφάνειάς τους, η απουσία των οποίων αποτελεί διαγνωστικό κριτήριο αδενοκαρκινώματος, κατά το οποίο λείπουν τα βασικά κύτταρα. Τα νευροενδοκρινή κύτταρα θεωρείται ότι ρυθμίζουν παρακρινώς ή ενδοκρινώς την αύξηση και τη λειτουργία των εκκριτικών κυττάρων, μέσω διαφόρων νευροπεπτιδίων που παράγουν, τα οποία επηρεάζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Εικόνα 1.6: Σχηματική αναπαράσταση της σύστασης του επιθηλίου του προστάτη. Ο προστάτης περιέχει μερικούς ομαλούς μυς που λειτουργούν υποβοηθητικά στην αποβολή του σπέρματος κατά την εκσπερμάτωση. Εκτός από αυτό, ως εξωκρινής αδένας έχει ως κύρια λειτουργία του την έκκριση αλκαλικού υγρού, που περιέχει κυρίως κιτρικό οξύ και ασβέστιο. Κατά την εκσπερμάτωση η κάψα του προστάτη συσπάται ταυτόχρονα με το σπερματικό πόρο με αποτέλεσμα το προστατικό έκκριμα να προστίθεται στο σπερματικό υγρό, γεγονός μείζονος σημασίας για την επιτυχή γονιμοποίηση του ωαρίου (Guyton, 1984), καθώς το υγρό του σπερματικού πόρου είναι όξινο και τα τοιχώματα του κόλπου είναι επίσης όξινα (ph 4,5), συνεπώς θα απέτρεπαν την επιβίωση των σπερματοζωαρίων τα οποία έχουν ph άριστης κινητικότητας περίπου 6-6,5. Ο προστάτης υπάρχει στο έμβρυο ήδη από τη δωδέκατη εβδομάδα της κύησης, καθίσταται όμως λειτουργικά ενεργός κατά την εφηβεία. Μετέπειτα αύξηση του μεγέθους του οφείλεται σε καλοήθη υπερπλασία του προστάτη και απαντάται σε ποσοστό 50% σε άνδρες άνω των 60 ετών. Περεταίρω αλλαγές στην αλληλεπίδραση μεταξύ κυττάρων επιθηλίου/στρώματος, συνοδευόμενες από χρωμοσωματικές 28

Εισαγωγή ανωμαλίες και διαταραχές του κυτταρικού κύκλου, οδηγούν σε καρκίνο του προστάτη (Cunha et al, 1983). Στην αύξηση το προστατικού αδένα συμβάλλουν ενδοκρινείς παράγοντες (ανδρογόνα και στεροειδείς ορμόνες) και αυξητικοί παράγοντες. Τα ανδρογόνα είναι ο σημαντικότερος παράγοντας ρύθμισης της ανάπτυξης του προστάτη. Υπάγονται στην κατηγορία των στεροειδών ορμονών και ο ρόλος τους έγκειται στον σχηματισμό των δευτερογενών χαρακτηριστικών του φύλλου και συνεπώς στην διαφοροποίηση και ωρίμανση των ανδρικών αναπαραγωγικών οργάνων. Η τεστοστερόνη είναι το κύριο ανδρογόνο και παράγεται από τα κύτταρα Leydig των όρχεων, υπό την επίδραση της ωχρινοτρόπου ορμόνης LH (Leutenizing Hormone), η οποία βρίσκεται υπό τον έλεγχο της LHRH (Lutenizing Hormone Releasing Hormone), που εκκρίνεται από τον υποθάλαμο. Πηγή ανδρογόνων αποτελεί και ο φλοιός των επινεφριδίων. Συγκεκριμένα, η φλοιοεπινεφριδιοτρόπος ορμόνη (Adrenocorticotropic Hormone, ACTH), μέσω του υποθαλάμου ρυθμίζει την έκκριση της ανδροστερόνης και της ανδροστενοδιόνης, οι οποίες δρουν επικουρικά στο ρόλο των ανδρογόνων των όρχεων. Ο υποδοχέας των ανδρογόνων (Androgen Receptor, AR) απαντάται αρχικά στα κύτταρα του στρώματος και μετά την ολοκλήρωση της ανάπτυξης του αδένα, συναντάται και στα επιθηλιακά. Ανδρογόνα εκκρίνονται από επιθηλιακά κύτταρα και κύτταρα του στρώματος και δρουν στα παρακείμενα επιθηλιακά κύτταρα. Μετά την είσοδό τους στον προστάτη, τα ανδρογόνα και η τεστοστερόνη μεταβολίζονται σε διυδροστερόνη (DHT) από το ένζυμο 5-α-αναγωγάση. Η διυδροστερόνη δρα παρακρινώς από τα βασικά και τα κύτταρα του στρώματος στα παρακείμενα επιθηλιακά. Είναι πολύ πιο δραστική από την τεστοστερόνη και είναι το κύριο ένζυμο που είναι υπεύθυνο για τη φυσιολογική ανάπτυξη του προστάτη. Εισέρχεται στον πυρήνα των βασικών κυττάρων και των κυττάρων του στρώματος και αφού δεσμευθεί σε ειδικές πρωτεΐνες, οδηγείται σε ρυθμιστικές αλληλουχίες των γονιδίων στόχων (EGF, PDGF, κ.α.), επάγοντας τη μεταγραφή τους (Gelman, 2002). Επίδραση στην αύξηση του προστατικού αδένα έχουν και τα οιστρογόνα, το 75% των οποίων προκύπτει από τροποποίηση των ανδρογόνων, και το υπόλοιπο 25% συντίθεται από τον προστάτη (Syrigos, 2001). Ακόμη, στον ορμονολογικό έλεγχο του προστάτη, περιλαμβάνονται και ορμόνες όπως η προλακτίνη, η αυξητική, η θηλακιοτρόπος (FSH) και η ωχρινοτρόπος ορμόνη (LH). 29

Εισαγωγή Ο ρόλος των αυξητικών παραγόντων στον προστάτη, είναι επικουρικός στη δράση των ορμονών. Κατά την ανάπτυξη του αδένα, παρατηρούνται αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κυττάρων του στρώματος και των επιθηλιακών κυττάρων, μέσω αυξητικών παραγόντων που δρουν αυτοκρινώς ή παρακρινώς. Σταδιακά, αυτό το πρότυπο έκφρασης είναι δυνατό να μεταβληθεί, οδηγώντας σε ανάπτυξη καρκίνου. Οι αυξητικοί παράγοντες που παίζουν συμμετέχουν στην ανάπτυξη του προστάτη απεικονίζονται παρακάτω: Εικόνα 1.7: Οι κυριότεροι αυξητικοί παράγοντες και οι αντίστοιχοι υποδοχείς που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και ομοιόσταση του φυσιολογικού προστάτη. Ωστόσο, είναι πιθανόν με τη πάροδο της ηλικίας, να παρατηρηθεί αύξηση του όγκου του προστάτη, κατάσταση που ονομάζεται καλοήθης υπερπλασία του προστάτη (Benign Prostate Hyperplasia, BPH). Η αύξηση αυτή προκαλείται τόσο από διαταραχή της αναλογίας κυττάρων επιθηλίου/στρώματος, λόγω της μειωμένης απόπτωσης στα κύτταρα του στρώματος (Claus et al., 1997), αλλά και λόγω αύξησης της αναλογίας οιστρογόνων/ανδρογόνων (Κrieg et al., 1995). Περαιτέρω διαταραχές των αναλογιών που προαναφέρθηκαν, με ταυτόχρονη συσσώρευση χρωμοσωματικών ανωμαλιών και πολλαπλών αλλαγών στο πρότυπο έκφρασης και δράσης διαφόρων αυξητικών παραγόντων και των υποδοχέων τους, οδηγούν στην ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη. 30

Εισαγωγή Μοντέλα μελέτης καρκίνου του προστάτη Ο καρκίνος του προστάτη εμφανίζεται με μεγάλη συχνότητα στον άνθρωπο και σπανίως στα ζώα, πράγμα που σημαίνει πως δεν υπάρχει κάποιο ιδανικό μοντέλο μελέτης. Ένα τέτοιο μοντέλο θα έπρεπε να παρουσιάζει μικρό χρόνο γενιάς, να είναι ορμονο-εξαρτώμενο, να εμφανίζει αυξημένα επίπεδα PSA και να δίνει μεταστάσεις σε λεμφαδένες και οστά. Ένα τέτοιο μοντέλο προσεγγίζει αυτό των τρωκτικών, που έχουν όμως κάποιες δομικές διαφορές με τον άνθρωπο όσον αφορά τον προστάτη (ο προστάτης τους είναι χωρισμένος σε λοβούς). Παρ όλα αυτά, πέραν του ότι είναι φθηνά στη χρήση, στα τρωκτικά υπάρχει και η δυνατότητα πρόκλησης ανδρογονοεξαρτώμενου καρκινικού προστάτη, καθιστώντας τα ως πολύτιμα μοντέλα μελέτης. Τα διαγονιδιακά ζώα επίσης χρησιμοποιούνται για τη μελέτη του καρκίνου του προστάτη και προσφέρουν τη δυνατότητα εισαγωγής ξένου DΝA και τη μελέτη των κυτταρικών αλληλεπιδράσεων σε in vivo σύστημα. Το σύστημα TRAMP (Transgenic Adenocarcinoma Mouse Prostate) χρησιμοποιείται για τη μελέτη του καρκίνου του προστάτη. Ευρέως χρησιμοποιούμενες είναι οι κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη, οι οποίες εκτός από την PC-93 (που έχει προέλθει από πρωτογενή όγκο), προέρχονται από μεταστάσεις. Αναλύονται παρακάτω: Η κυτταρική σειρά PC-3 η οποία αποτελεί και το βιολογικό υλικό της παρούσας μελέτης, απομονώθηκε από καρκίνο του προστάτη με μετάσταση στην οσφυική μοίρα της σπονδυλικής στήλης και η διάγνωση, ήταν τόσο στα αρχικά στάδια, όσο και στη μετάσταση, ελαφρώς διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα. Παρουσιάζουν χρωμοσωμικές ανωμαλίες, όπως πολυπλοειδίες και έλλειψη του Υ φυλετικού χρωμοσώματος, ενώ έχουν τη δυνατότητα ογκογένεσης σε αθυμικά ποντίκια. Εκφράζουν TGF, b-fgf και EGFR και FGFR, επάγοντας αυτοκρινώς την ανάπτυξή τους. Αξίζει να αναφερθεί ότι επίδραση με το μόριο κυτταρικής προσκόλλησης επιθηλιακών κυττάρων C-CAM σε μετασχηματισμένα με C-CAM ποντίκια, μείωσε την ογκογένεση που προκαλούν τα κύτταρα αυτά. Τέλος, παρόμοια με τα DU-145, εκφράζουν υποδοχείς της τρανσφερρίνης (Webber et al., 1997). 31

Εισαγωγή Η κυτταρική σειρά DU-145 απομονώθηκε από καρκίνο του προστάτη με μετάσταση στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα και η αρχική διάγνωση ήταν ελαφρώς διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα, ενώ η μετάσταση χαρακτηρίστηκε ως μετρίως διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα με ελάχιστα διαφοροποιημένα κύτταρα. Τα DU-145 είναι ορμονο-εξαρτώμενα και έχουν χρόνο διπλασιασμού περίπου 34 ώρες, ενώ η μετάσταση εκτός από το Κ.Ν.Σ. γίνεται και στα οστά. Εκφράζουν τον υποδοχέα της τρανσφερρίνης, πρωτεΐνη που επάγει την ανάπτυξή τους και την μετάστασή τους στα οστά, επίσης εκφράζουν EGF, TGF-α και τον κοινό υποδοχέα τους EGFR σε υψηλές συγκεντρώσεις, υποδηλώνοντας έναν αυτοκρινή τρόπο ρύθμισης του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Ακόμη, παράγουν b-fgf, IGF-1, TGF-β, τους αντίστοιχους υποδοχείς και διεγείρονται και από εξωγενείς β-b-fgf, IGF-1 και TGF-β. Η κυτταρική σειρά LNCap απομονώθηκε από καρκίνο του προστάτη με μετάσταση σε λεμφικό αδένα και η διάγνωση ήταν μετρίως διαφοροποιημένος καρκίνος του προστάτη. Τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται ανά 60-72 ώρες και έχουν χρωμοσωματικό αριθμό 76. Παράγουν PSA, PAP, ενώ έχουν την ιδιότητα ογκογένεσης σε αθυμικά ποντίκια. Χαρακτηριστικό του είναι η μετάλλαξη στους υποδοχείς ανδρογόνων, με αποτέλεσμα τη δέσμευση οιστρογόνων.. Εκφράζουν TGF-α, EGF, ενώ ο κοινός τους υποδοχέας EGFR βρίσκεται υπό ορμονών. Επίδραση με EGF και b-fgf επάγει την ανάπτυξη των κυττάρων, ενώ εξωγενής TGF-β επηρεάζει μόνο τη δράση των EGF και TGF-α (Webber et al., 1997). Πίνακας 1.1: Έκφραση αυξητικών παραγόντων και υποδοχέων τους σε καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου προστάτη 32

Εισαγωγή. +, χαμηλά επίεδα, +++ υψηλά επίπεδα, -, μη ανιχνεύσιμα επίπεδα. Βιολογικά ενεργές περιοχές της HARP Ο εντοπισμός των περιοχών της HARP που είναι υπεύθυνες για τις βιολογικές δράσεις του μορίου είναι πολύ σημαντικός. Μελέτες έχουν δείξει ότι διαφορετικές περιοχές του μορίου μπορεί να έχουν ίδιες ή και αντίθετες δράσεις με αυτές της HARP. Προκειμένου να μελετηθεί η σχέση δομής-δράσης του αυξητικού αυτού παράγοντα, έχουν παρασκευαστεί ανασυνδυασμένες τροποποιημένες μορφές του, καθώς και συνθετικά πεπτίδια. Αρκετές έρευνες έχουν εστιαστεί στο καρβοξυτελικό άκρο της HARP. Έχει βρεθεί ότι τα δύο πλούσια σε λυσίνη άκρα της HARP μπορούν να επάγουν την αγγειογένεση τόσο in vitro όσο και in vivo (Papadimitriou et al, 2000). Επιπλέον, το τμήμα που περιλαμβάνει τα τελευταία 8 αμινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου του μορίου θεωρείται πολύ σημαντικό για τη μιτογόνο δράση της HARP, ενώ τα τελευταία 25 αμινοξέα της καρβουτελικής περιοχής φαίνεται να ευθύνονται για τη δράση της HARP στην αγγειογένεση και για τη δέσμευση του μορίου στον υποδοχέα ALK (anaplastic lymphoma kinase). (Bernard-Pierrot et al., 2001, 2002). Επίσης, έχει βρεθεί ότι το πεπτίδιο που αντιστοιχεί στην καρβοξυτελική κεντρική περιοχή της HARP (αμινοξέα 65-97) καταστέλλει τη μιτογόνο και αγγειογενετική δράση της HARP, είτε μέσω ανταγωνισμού για την ηπαρίνη (Hamma-Kourbali et al., 2008), είτε παρεμποδίζοντας τον VEGF 165 να αλληλεπιδράσει με τον υποδοχέα του (Heroult et al., 2004). 33

Εισαγωγή Σύμφωνα με πρόσφατες παρατηρήσεις της ερευνητικής μας ομάδας, το πεπτίδιο που αποτελείται από τα αμινοξέα 122-131 του καρβοξυτελικού άκρου της HARP αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ, παρεμποδίζοντας αρκετές από τις βιολογικές δράσεις του μορίου όπως η επαγόμενη από τη HARP αγγειογένεση in vivo, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η κυτταρική προσκόλληση και η κυτταρική μετανάστευση σε καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου προστάτη (Diamantopoulou et al., 2010). Αναφορικά με το αμινοτελικό άκρο της HARP, τα αμινοξέα 1-40 βρέθηκε ότι σχηματίζουν ετεροδιμερή με με τη HARP, εμποδίζοντας τη δράση της. Τόσο σε κυτταρικές σειρές από καρκίνο μαστού, όσο και σε κυτταρικές σειρές από γλοιοβλάστωμα, η τροποποιημένη αυτή μορφή αναστέλλει την ανάπτυξη και την αγγείωση όγκων σε ποντίκια (Zhang et al., 1997). Είναι πλέον γνωστό ότι η HARΡ αποτελεί υπόστρωμα διαφόρων ενζύμων του κυτταρικού μικροπεριβάλλοντος όπως η πλασμίνη, η MMP-2, η τρυψίνη και η χυμοτρυψίνη. (Delbe et al., 1995). Πέψη με πλασμίνη πέπτει το μόριο της HARP με αποτέλεσμα τη δημιουργία πέντε διαφορετικών πεπτιδίων που επηρεάζουν με διαφορετικό τρόπο την αγγειογένεση in vivo και in vitro Ωστόσο, in vitro πειράματα έδειξαν ότι μόνο η μία εκ των δύο περιοχών με δομή β-πτύχωσης επάγει την αγγειογένεση (Polykratis et al., 2004). Ενδιαφέρουσα είναι και η παρατήρηση ότι οι μορφές της HARP που προκύπτουν μετά από πρωτεόλυση εντοπίζονται στο θρεπτικό μέσο από ενδοθηλιακά κύτταρα (Papadimitriou et al., 2004). Τέλος, Η HARP αποτελεί υποστρωμα και για την MMP-2 παράγοντας τρία πεπτίδια που καταστέλλουν τη μιτογόνο και χημειοτακτική δράση της HARP (Dean et al., 2007). Υποδοχείς της HARP και μεταγωγή σήματος Παρόμοια με άλλους αυξητικούς παράγοντες, η HARP ασκεί τις βιολογικές τις δράσεις ύστερα από αλληλεπίδραση με διαμεμβρανικούς υποδοχείς. Η αλληλεπίδραση αυτή έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του υποδοχέα, ο οποίος επηρεάζει την ενεργότητα συγκεκριμένων ενδοκυτταρικών μορίων τελεστών, τα οποία με τη σειρά τους επηρεάζουν την ενεργότητα άλλων μορίων. Η ενεργοποίηση συνήθως περιλαμβάνει φωσφορυλίωση/απόφωσφορυλίωση συγκεκριμένων θέσεων 34

Εισαγωγή των μορίων-στόχων. Με τον τρόπο αυτόν ξεκινά ένας καταρράκτης αντιδράσεων, που ως τελικό στόχο έχει την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων και την κυτταρική απόκριση. Αναφορικά με τη HARP, έχουν χαρακτηριστεί τρεις υποδοχείς. Η SDC3, ο ALK και ο RPTPβ/ζ (Εικόνα 1.8). Εικόνα 1.8: Υποδοχείς της HARP Πρωτεογλυκάνες Θειικής Ηπαράνης (Heparan Sulfate Proteoglycans, HSPGs) H HARP, όπως έχει αναφερθεί, παρουσιάζει υψηλή συγγένεια με την ηπαρίνη. Εκτός όμως από την ηπαρίνη, προσδένεται και στις αλυσίδες θειικής ηπαράνης των πρωτεογλυκανών της κυτταρικής επιφάνειας και του εξωκυττάριου υλικού. Επίσης, μελέτες έδειξαν ότι συνδέεται με τη θειική δερματάνη και τη θειική χονδροϊτίνη, όχι όμως με τη θειική κερατάνη (Vacherot et al, 1999). SDC3 (Syndecan-3) Στις πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης, ανήκουν και οι συνδεκάνες, που στα θηλαστικά συγκροτούν μια οικογένεια τεσσάρων πρωτεϊνών (συνδεκάνη-1, συνδεκάνη-2 ή fibroglycan, συνδεκάνη-3 ή N-syndecan, συνδεκάνη-4 ή 35

Εισαγωγή rydican/amphiglycan), ενώ το γονίδιο συνδεκάνης συναντάται επίσης και στη D. melanogaster, καθώς και στον σκώληκα C. elegans (Rapraeger, 2001). Χρησιμεύουν ως συνυποδοχείς και εμπλέκονται στην κυτταρική προσκόλληση, στη μετανάστευση, καθώς και στη μεταγωγή σήματος μέσω διαφόρων αυξητικών παραγόντων. Οι γλυκοσαμινογλυκάνες θειικής ηπαράνης, στις συνδεκάνες 1 και 3 μπορούν να υποκατασταθούν και από αλυσίδες θειικής χονδροϊτίνης (Εικόνα 1.9). Εικόνα 1.9: Συνδεκάνες. Απεικονίζονται οι πρωτεΐνες της οικογένειας των συνδεκανών και οι αλυσίδες γλυκοσαμινογλυκανών (GAGs). CS: Chondroitin sulfate, HS: Heparan sulfate. Διακρίνονται επίσης οι επιμέρους περιοχές (εξωκυττάρια, διαμεμβρανική, εσωκυττάρια, σταθερή, μεταβλητή), καθώς και η περιοχή που υφίσταται πέψη προκειμένου να πραγματοποιηθεί ο διμερισμός (shedding domain). Η συνδεκάνη-3 (SDC3) μοριακού βάρους40 kda, ανιχνεύεται κυρίως στο νευρικό σύστημα και στα οστά. Μελέτες έχουν δείξει ότι η SDC3 είναι ένας από τους υποδοχείς της HARP (Raulo et al., 1994). Η αλληλεπίδραση της HARP με τη συνδεκάνη-3 είναι σχετικά ισχυρή (σταθερά διάστασης Kd=0.6 nm), εξαρτάται από τις αλυσίδες γλυκοζαμινογλυκανών που φέρει η πρωτεΐνη και πραγματοποιείται μέσω των κεντρικών περιοχών της HARP που διαθέτουν ομολογία με τις επαναλαμβανόμενες περιοχές θρομβοσπονδίνης τύπου 1 (ΤSR 1) (Kinnunen et al.,1998a). 36

Εισαγωγή Το μόριο της συνδεκάνης περιλαμβάνει μια εξωκυττάρια περιοχή που συνδέεται με αλυσίδες θειικής ηπαράνης, μια διαμεμβρανική περιοχή, και μια κυτταροπλασματική περιοχή που φέρει δύο σταθερές περιοχές (C1, C2) με μία ενδιάμεση μεταβλητή (V) περιοχή (Εικόνα 1.9). Η διαμεμβρανική περιοχή και τα σταθερά (C1, C2) μέρη της κυτταροπλασματικής περιοχής, είναι υψηλά συντηρημένα. Αντιθέτως, τα εξωκυττάρια και τα μεταβλητά (V) μέρη των πρωτεϊνών, διαφέρουν ανάλογα με το μέλος της οικογένειας των συνδεκανών. Η συνδεκάνη-3 του ποντικού δομείται από 442 αμινοξέα και είναι η μεγαλύτερη από τις συνδεκάνες των θηλαστικών. Η εξωκυττάρια πλευρά της που φέρει 200 αμινοξέα πλούσια σε σερίνη, θρεονίνη και προλίνη, φέρει 3-8 θέσεις πρόσδεσης αλυσίδων θειικής ηπαράνης οι οποίες αποτελούν και το 50% του μοριακού της βάρους. Οι αλυσίδες θειικής ηπαράνης, που είναι γραμμικά πολυμερή εναλασσόμενου υαλουρονικού οξέος, L-ιδουρονικού οξέος και μονάδων γλυκοσαμινών, ουσιαστικά προσδίδουν ειδικότητα στην πρόσδεση με μόριαπροσδέτες, όπως FGFs, HARP, πρωτεάσες και λιποπρωτεΐνες. Στο κατώτερο άκρο της εξωκυττάριας περιοχής, βρίσκεται μια περιοχή που μπορεί να πεφθεί από πρωτεάσες (shedding domain), συμβάλλοντας με αυτόν τον τρόπο στο διμερισμό της συνδεκάνης και τη μεταγωγή σήματος. Το διαμεμβρανικό και το κυτταροπλασματικό είναι τα πλέον συντηρημένα της οικογένειας. Η διαμεμβρανική περιοχή περιέχει ένα μοτίβο αλανίνης-γλυκίνης που παίζει ρόλο στο διμερισμό της SDC3. Το κυτταροπλασματικό κομμάτι (28-34 αμινοξέα) αποτελείται από τρία τμήματα: C1 (Conserved part), V (Variable part), C2 (C-terminal part). Φωσφορυλίωση τυροσινών και σερινών καθενός από αυτά τα τμήματα ρυθμίζει την αλληλεπίδραση με ειδικό τρόπο μιας σειράς κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών. Πολλές από αυτές, όπως η CASK, η syntenin και η synectin αλληλεπιδρούν μέσω των PDZ περιοχών τους με τη C2 περιοχή της SDC3. Οι μεταβλητές (V) περιοχές δεν επηρεάζουν τις δράσεις της πρωτεΐνης με κάποιο συγκεκριμένο τρόπο, εντούτοις φαίνεται να διαδραματίζουν κάποιο ρόλο στα μονοπάτια σηματοδότησης του μορίου κατά τη δημιουργία εστιών προσκόλλησης. Η συνδεκάνη-3, αν και δεν παρουσιάζει ενζυμική δραστηριότητα, χρησιμεύει και ως συνυποδοχέας, υποβοηθώντας την πρόσδεση αυξητικών παραγόντων στους υποδοχείς τους και τη μεταγωγή σήματος. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η οικογένεια των FGFs: Ο FGF καθώς και ο υποδοχέας του FGFR, συνδέονται με τις 37

Εισαγωγή αλυσίδες θειικής ηπαράνης της συνδεκάνης-3 και έτσι ενεργοποιείται το σύμπλεγμα FGF-FGFR (Rapraeger, 2001, Kaksonen et al, 2002). Εικόνα 1.10: Σχηματική αναπαράσταση των σηματοδοτικών μονοπατιών που προκύπτουν από την πρόσδεση της HARP στην Ν-συνδεκάνη. Η συνδεκάνη-3 εντοπίζεται σε περιοχές επέκτασης των κυττάρων και σε σημεία κυτταρικής προσκόλλησης, υποδεικνύοντας ότι αποτελεί μόριο κλειδί στην κυτταρική προσκόλληση και τη μετανάστευση. Συγκεκριμένα, κατά την επέκταση νευρικών κυττάρων και νευραξόνων, η δέσμευση της HARP στη συνδεκάνη-3 προκαλεί την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, μέσω της οικογένειας των Src κινασών, της cortactin και της β-τουμπουλίνης. Αυτό συμβαίνει με την πρόσδεση της HARP στην SDC3, το διμερισμό της τελευταίας, τη δέσμευση της cortactin στο κυτταροπλασματικό τμήμα της SDC3, την trans-φωσφορυλίωση της κινάσης Src από την cortactin και την αλληλεπίδραση στη συνέχεια της Src με τη β-τουμπουλίνη με τελικό αποτέλεσμα την επέκταση των νευρικών κυττάρων (Kinnunen et al., 1998b). Επιπλέον, ύστερα από μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας (Diamantopoulou et al., 2012), η συνδεκάνη χαρακτηρίστηκε ως θετικός ρυθμιστής των βιολογικών δράσεων της HARP, δεδομένου ότι μειωρύθμιση των επιπέδων έκφρασης της συνδεκάνης-3 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου προστάτη οδήγησε σε μείωση της κυτταρικής προσκόλλησης και μετανάστευσης. 38

Εισαγωγή RPTPβ/ζ (Receptor-Like Protein Tyrosine Phosphatase β/ζ) Ο RPTPβ/ζ ανήκει στις πρωτεογλυκάνες θειικής χονδροϊτίνης, εκφράζεται κυρίως στο κεντρικό νευρικό σύστημα και έχει χαρακτηριστεί ως υποδοχέας της HARP. Η εξωκυττάρια πλευρά του RPTPβ/ζ στο ακραίο τμήμα της (αμινοτελικό άκρο) παρουσιάζει μεγάλη ομοιότητα με το ένζυμο καρβονική ανυδράση (CAH). Ακολουθείται από μία όμοια με την ινονεκτίνη ΙΙΙ (FNIII) αλληλουχία και από μια περιοχή πλούσια σε σερίνες και γλυκίνες, σημείο στο οποίο θεωρείται ότι προσδένονται οι αλυσίδες της θειικής χονδροϊτίνης. Η πρόσδεση της HARP οφείλεται κατά ένα μεγάλο μέρος στις αλυσίδες θειικής χονδροϊτίνης του υποδοχέα, αφού η επίδραση με χονδροϊτινάση, μείωσε την αλληλεπίδραση HARP-RPTPβ/ζ (Maeda et al., 1996). Το εξωκυτταρικό τμήμα συνδέεται μέσω της διαμεμβρανικής περιοχής με την κυτταροπλασματική, η οποία περιλαμβάνει μία PDZ περιοχή και δύο περιοχές με καταλυτική δράση φωσφατάσης τυροσίνης, με την πλησιέστερη στη διαμεμβρανική περιοχή να είναι και η πιο ενεργή (Maeda et al, 1996). Εικόνα 1.11: Ισομορφές του RPTPβ/ζ. Διακρίνεται η περιοχή που παρουσιάζει ομοιότητα με το ένζυμο καρβονική ανυδράση (CAH), η αλληλουχία της ινονεκτίνης ΙΙΙ 39

Εισαγωγή (FN), οι περιοχές με δράση φωσφατάσης (D1, D2) και οι αλυσίδες θειικής χονδροϊτίνης (Chondroitn sulfate, CS). Μέχρι σήμερα έχουν ανιχνευθεί τρεις διαφορετικές ισομορφές του RPTPβ/ζ - δυο διαμεμβρανικές και μια εκκρινόμενη, οι οποίες είναι αποτέλεσμα εναλλακτικής ωρίμανσης του μεταγράφου (Εικόνα 1.11). Η εκκρινόμενη μορφή, γνωστή και ως φωσφακάνη, ή 6Β4, αντιπροσωπεύει την κύρια πρωτεογλυκάνη θειικής χονδροϊτίνης στον εγκέφαλο, και θεωρείται μια τροποποιημένη μορφή διαμεμβρανικού υποδοχέα με δράση φωσφατάσης τυροσινών β/ζ (Receptor-like Protein Tyrosine Phosphatase β/ζ). Πειράματα δέσμευσης με τη φωσφακάνη, κατέδειξαν δύο περιοχές, μία χαμηλής (Kd=3 nm) και μια υψηλής (Kd=0.25 nm), συγγένειας με τη HARP. Ο RPTPβ/ζ εκφράζεται νωρίς κατά την ανάπτυξη του φλοιού, υποδηλώνοντας έτσι ρόλο στη μετανάστευση των νευριτών. Τόσο οι διαμεμβρανικές ισομορφές, όσο και η εκκρινόμενη, ανιχνεύονται στο αναπτυσσόμενο νευρικό σύστημα και θεωρείται ότι παίζουν ρόλο στη μετανάστευση και τον προσανατολισμό των νευρώνων. Οι διαμεμβρανικές ισομορφές απαντώνται σε ζώνες πολλαπλασιασμού, σε κώνους μετανάστευσης των κυττάρων και στα αστροκύτταρα, ενώ η φωσφακάνη κατανέμεται σε μεγάλες ποσότητες σε ολόκληρο τον εγκέφαλο. Αυτό υποδηλώνει ότι η αλληλεπίδραση των κυττάρων με το νευροεπιθήλιο τα διαφοροποιεί ούτως ώστε να μεταναστεύσουν και να εκκρίνουν φωσφακάνη προκειμένου να συμβάλλουν στην προέκταση των νευριτών (Maeda et al., 1998). Εκτός από τη HARP, Ο RPTPβ/ζ αλληλεπιδρά και με άλλα μόρια, όπως ο FGF2. Ακόμη, τόσο η φωσφακάνη, όσο και η διαμεμβρανικές ισομορφές του RPTPβ/ζ είναι δυνατό να αλληλεπιδράσουν με μόρια κυτταρικής προσκόλλησης (Cell Adhesion Molecules CAMs) όπως N-CAM, Ng-CΑΜ και τενασίνη, που εμπλέκονται στη ρύθμιση της προσκόλλησης και της προέκτασης των νευριτών. (Rauvala et al., 2000). Ο RPTPβ/ζ είναι μόριο με ενδογενή δράση φωσφατάσης (Meng et al., 2000). Θεωρείται ότι η HARP επάγει τον διμερισμό του ή τον ολιγομερισμό του, προκαλώντας την αυτοαποφωσφορυλίωσή του και αυξάνοντας τα επίπεδα φωσφορυλίωσης των υποστρωμάτων του. Μερικά από τα υποστρώματα του RPTPβ/ζ είναι η β-κατενίνη, η β-αντουσίνη, η Fyn και η GIT1/Cat1 για παράδειγμα (Pariser et al., 2005a,b,c). Αλληλεπίδραση της HARP με τον RPTPβ/ζ αυξάνει τα επίπεδα 40

Εισαγωγή φωσφορυλίωσης της β-κατενίνης, εμποδίζοντας την αλληλεπίδρασή της με την α- κατενίνη και συνεπώς με τις καντερίνες, μόρια τα οποία παίζουν πρωτεύοντα ρόλο στην διακυτταρική σύνδεση (Perez-Pinera et al., 2006). Στο ίδιο μοτίβο κινείται και η β-αντουσίνη, της οποίας η φωσφορυλίωση αποσταθεροποιεί τον κυτταροσκελετό και συγκεκριμένα τα ινίδια ακτίνης (Pariser et al., 2005b). Υπερέκφραση του RPTPβ/ζ έχει παρατηρηθεί σε πολλούς καρκίνους, όπως του προστάτη, του στομάχου, του λάρυγγα κ.α. Σύμφωνα με πρόσφατες αναφορές της ερευνητικής μας ομάδας (Diamantopoulou et al., 2012), ο RPTPβ/ζ φαίνεται να παίζει ρόλο αρνητικού ρυθμιστή της επαγόμενης από τη HARP μετάστασης καρκινικών κυττάρων ανθρώπινου προστάτη. Μειωρύθμιση των επιπέδων έκφρασης του συγκεκριμένου υποδοχέα είχε ως αποτέλεσμα τη δημιουργία EMT φαινοτύπου. Επιπλέον, ο RPTPβ/ζ φαίνεται να αντισταθμίζει τη δράση της Συνδεκάνης-3. Σε καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου προστάτη με σταθερά μειωμένα τα επίπεδα έκφρασης του RPTPβ/ζ παρατηρήθηκε η αύξηση της κυτταρικής προσκόλλησης και μετανάστευσης, μέσω του μονοπατιού μεταγωγής σήματος των κινασών Src και FAK (Εικόνα 1.12). Εικόνα1.12: Ο RPTPβ/ζ είναι αρνητικός ρυθμιστής των βιολογικών δράσεων της HARP και αντισταθμίζει τη δράση της Συνδεκάνης-3 (Diamantopoulou et al., 2012). 41

Εισαγωγή Anaplastic Lymphoma kinase (ALK) O ALK είναι ένας διαμεμβρανικός υποδοχέας 220 kda με ενεργότητα κινάσης τυροσίνης, ο οποίος μαζί με την 110 kda κινάση τυροσίνης των λευκοκυττάρων (LTK, leukocyte tyrosine kinase) ανήκει στην υπεροικογένεια των υποδοχέων ινσουλίνης, λόγω της υψηλής αμινοξικής ομολογίας τους. Ο ALK αρχικά ανακαλύφθηκε ως τμήμα μιας ογκογενετικής χιμαιρικής κινάσης τυροσίνης, της νουκλεοφοσμίνης (nucleophosmin, NPM-ALK) που εκφράζεται στα αναπλαστικά μεγαλοκυτταρικά λεμφώματα non Hodgikn s (Morris et al., 1997). Δύο μορφές του ALK έχουν εντοπιστεί, με μοριακά βάρη 220 και 140 kda (Moog-Lutz et al., 2005, Iwahara et al., 1997; Morris et al., 1997), με τη δεύτερη να προκύπτει από την πρώτη ύστερα από πρωτεόλυση. Ο μέχρι πρότινος ορφανός υποδοχέας ALK εκφράζεται τόσο στο κεντρικό, όσο και στο περιφερικό νευρικό σύστημα (Pulford et al., 1997). H μεγαλύτερη έκφραση παρατηρείται στον εγκέφαλο νεογέννητων θηλαστικών, υποδηλώνοντας πιθανή συμμετοχή του στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος. Επειδή όμως η έκφρασή του παραμένει σε υψηλά επίπεδα και μετά την ενηλικίωση, πιθανόν να παίζει ρόλο και στο σχηματισμό και τη διατήρηση των νευρομυικών συνάψεων (Morris et al., 1997). Έρευνες έχουν δείξει τν έκφραση του ALK σε ινοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα, καθώς και σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από καρκίνους παγκρέατος και στήθους, μελανώματα, νευροβλαστώματα (Stoica et al., 2002), γλοιώματα (Powers et al., 2002) και λεμφώματα (Delsol et al., 1997 Ο ALK είναι ο πλέον πρόσφατα χαρακτηρισμένος υποδοχέας της HARP (Stoica et al., 2001). Το πρότυπο έκφρασής του ALK είναι παρόμοιο με της HARP. Η σύνδεσή του με τη HARP είναι πολύ ειδική (Kd=32 ± 9 pm) και πραγματοποιείται στην εξωκυτταρική περιοχή, μέσω του καρβοξυτελικού άκρου του υποδοχέα, και συγκεκριμένα των αμινοξέων 111-136 (Bernard-Pierrot et al., 2002). Τη δέσμευση της PTN στον υποδοχέα ακολουθεί αλληλεπίδραση και ενεργοποίηση των Shc και IRS1 (Stoica et al., 2001; Fujimoto et al., 1996; Bischof et al., 1997), ενώ η Grb2 δεσμεύεται έμμεσα στον υποδοχέα, μέσω των συμπλόκων, που μπορεί να περιλαμβάνουν και άλλες πρωτεΐνες εκτός της Shc (Piccinini et al., 2002). Η σημασία του μονοπατιού της PI3K για τη μιτογόνο δράση του ALK επιβεβαιώνεται από αναφορές που δείχνουν ότι η PI3K είναι απαραίτητη για τη δράση της χιμαιρικής πρωτεΐνης NPM-ALK (Slupianek et al., 2001) και βασική για τη μιτογόνο και αγγειογενετική δράση της PTN (Souttou et al., 2001). Η διαφοροποίηση των νευριτών 42

Εισαγωγή μετά από πρόσδεση της HARP στον ALK μπορεί να επιτευχθεί και μέσω του μονοπατιού των MAP κινασών οι οποίες είναι υπεύθυνες και για την αντιαποπτωτική σηματοδότηση της HARP στους ινοβλάστες (Bowden et al., 2002). Χαρακτηριστικό του γονιδίου του ALK είναι οι χρωμοσωμικές μετατοπίσεις, (Πίνακας 1.2) παρουσιάζοντας συχνά σύντηξη του κυτταροπλασματικού του τμήματος με άλλα μόρια, συνήθη φαινόμενα σε πολλές μορφές καρκίνου (αναπλαστικό μεγαλοκυτταρικό λέμφωμα, φλεγμονώδης μυοϊνοβλαστικλος καρκίνος, διάχυτο Β-μεγαλοκυτταρικό λέμφωμα, μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα) (Duyster et a., 2001). Ο ALK είναι μια διαμεμβρανική πρωτείνη με μοριακό βάρος περίπου 200 kda με ενεργότητα κινάσης τυροσίνης, και αποτελείται από μια εξωκυττάρια, μια διαμεμβρανική και μια κυτταροπλασματική περιοχή (Εικόνα 1.13) Η εξωκυττάρια περιοχή περιέχει μια LDL (Low-Density Lipoprotein) περιοχή, μια περιοχή πλούσια σε γλυκίνες, και δύο MAM περιοχές, οι οποίες ανάμεσα στην οικογένεια υποδοχέων με ενεργότητα κινάσης τυροσίνης, απαντώνται μόνο στον ALK. Ανιχνεύονται σε πρωτείνες όπως οι memprins, σε υποδοχείς με ενεργότητα φωσφατάσης τυροσίνης, και φαίνεται να εμπλέκονται στις κυτταρικές αλληλεπιδράσεις. Η διαμεμβρανική περιοχή είναι ο σύνδεσμος εξωκυττάριας και κυτταροπλασματικής περιοχής. Η τελευταία αποτελείται από 18 τυροσίνες που είναι θέσεις δυνητικής φωσφορυλίωσης του υποδοχέα (Palmer et al., 2009). 43

Εισαγωγή Εικόνα 1.13: Σχηματική απεικόνιση των επιμέρους περιοχώς του ALK. Η αμινοτελική περιοχή φέρει δύο MAM περιοχές και μία LDLa (low-density lipoprotein class A) περιοχή. Η κυτταροπλασματική περιοχή, αποτελείται από την περιοχή με ενεργότητα κινάσης τυροσίνης Αναγράφοται επίσης και τα αμινοξέα που αντιστοιχούν σε κάθε περιοχή. (Huret & Senon, 2003). Παρά την ταυτοποίηση του ALK ως λειτουργικού υποδοχέα για την HARP, λίγα είναι γνωστά για τη μεταγωγή σήματος ύστερα από ενεργοποίησή του από τη HARP (Εικόνα 1.14). Ωστόσο, αντικρουόμενα αποτελέσματα υπάρχουν μέχρι και σήμερα αναφορικά με το εάν ο ALK είναι υποδοχέας της HARP. Μελέτες με αντισώματα αγωνιστές για τον υποδοχέα, οδήγησαν στην ενεργοποίηση του ALK και των ERK1/2, σε αντίθεση με τη HARP (Mathivet et al., 2007), ενώ μελέτες με αντισώματα ανταγωνιστές δεν ανέστειλαν τη μεταγωγή σήματος από τη HARP (Moog-Lutz et al., 2005; Stylianou et al., 2009). Επιπλέον, στη Drosophila ως προσδέτης για τον ALK έχει χαρακτηρισθεί η πρωτεΐνη Jelly belly, η οποία δεν παρουσιάζει καμία ομολογία με κάποια πρωτεΐνη στον άνθρωπο, ενώ η Miple 2 που είναι η ομόλογη της HARP στη Drosophila αδυνατεί να ενεργοποιήσει τον ALK (Englund et al., 2003, 2006). Παρόλο που η Jelly belly ενεργοποιεί τον ALK στη Drosophila, αδυνατεί να ενεργοποιήσει τον ALK στα PC12 κύτταρα (Yang et al., 2007). Έρευνες επίσης υποστηρίζουν ότι μία μόνο από τις δυο μορφές της HARP που έχουν προσδιοριστεί προσδένεται στον ALK και επάγεται ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων στο γλοιοβλάστωμα (Lu et al., 2005). Τέλος, ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχει το γεγονός ότι για τον ALK προτάθηκε ένας νέος μηχανισμός ενεργοποίησης υποδοχέων με ενεργότητα κινάσης τυροσίνης, μέσω του οποίου ο ALK ενεργοποιείται με έναν έμμεσο τρόπο από τη HARP. Σύμφωνα με τη συγκεκριμένη μελέτη, δεν παρατηρήθηκε καμία αλληλεπίδραση του ALK με τη HARP. Ωστόσο, βρέθηκε ότι σε κατάσταση ηρεμίας, ο RPTPβ/ζ αλληλεπιδρά και αποφωσφορυλιώνει τον ALK. Μετά από επίδραση με HARP, ο RPTPβ/ζ διμερίζεται, χάνει την ενδογενή δράση φωσφατάσης που έχει, με αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων φωσφορυλίωσης του ALK και την ενεργοποίησή του (Perez-Pinera et al., 2007). 44

Εισαγωγή Εικόνα 1.14: Σχηματική αναπαράσταση των σηματοδοτικών μονοπατιών που προκύπτουν από την πρόσδεση της πλειοτροπίνης Συνδεκάνη-3 (Mikelis et al., 2007). Πίνακας 1.2. Χρωμοσωμικές μετατοπίσεις του ALK σε διάφορες μορφές καρκίνου. Χρωμοσωματική μετατόπιση t(2;5)(p23;q35) t(1;2)(q25;p23) Συντηκόμενη Χιμαιρική Είδος Θέση στο κύτταρο πρωτεΐνη πρωτεΐνη καρκίνου ALCL, Νουκλεοφοσμίνη NPM ALK Πυρήνας, κυτ/σμα DLBCL TPM3 Τροπομυοσίνη-3 Κυτταρόπλασμα ALCL, IMT ALK t(2;3)(p23;q21) TFG TFG ALK Κυτταρόπλασμα ALCL inv(2)(p23;q35) ATIC ATIC ALK Κυτταρόπλασμα ALCL, IMT t(2;17)(p23;q23) CLTC1 CLTC1 ALCL, IMT, Κυτταρόπλασμα ALK DLBCL t(2;x)(p23;q11 Κυτταρική Μυοσίνη MSN ALK 12) μεμβράνη ALCL t(2;19)(p23;p13) Τροπομυοσίνη-4 TPM4 ALK Κυτταρόπλασμα ALCL 45

Εισαγωγή inv(2)(p21;p23) EML4 EML4 ALK Άγνωστη NSCLC ALCL: αναπλαστικό μεγαλοκυτταρικό λέμφωμα, IMT: φλεγμονώδης μυοϊνοβλαστικλος καρκίνος, DLBCL: διάχυτο Β-μεγαλοκυτταρικό λέμφωμα, NSCLC: μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα. Εικόνα 1.15: Αναπαράσταση του μοντέλου που έχει προταθεί για την έμμεση ενεργοποίηση του ALK από τη HARP μέσω του υποδοχέα RPTPβ/ζ. (Α) Σε κατάσταση ηρεμίας στα κύτταρα, ο RPTPβ/ζ αποφωσφορυλιώνει τον ALK. (Β) Η επίδραση με HARP οδηγεί στον ομοδιμερισμό του RPTPβ/ζ, την απενεργοποίηση του, και τη διακοπή αποφωσφορυλίωσης του ALK. Ακολούθως, ο ALK μπορεί να ομοδιμεριστεί, με αποτέλεσμα την αυτοφωσφορυλίωσή του και την ενεργοποίηση του αντίστοιχου μονοπατιού μεταγωγής σήματος. 46

Σκοπός 47

Σκοπός ΣΚΟΠΟΣ Η HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) είναι ένας αυξητικός παράγοντας με συγγένεια για την ηπαρίνη. Πρόκειται για μία εκκρινόμενη, υψηλά συντηρημένη πρωτεΐνη, η οποία εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό κατά τη διάρκεια της εμβρυικής και μετεμβρυικής περιόδου, ενώ κατά την ενήλικη ζωή η έκφρασή της περιορίζεται σε συγκεκριμένους ιστούς, με εξαίρεση τις περιπτώσεις τραυματισμού και καρκίνου, που σημειώνεται ραγδαία αύξηση. Η HARP απαντάται και ως «πλειοτροπίνη», ονομασία που της έχει αποδοθεί εξαιτίας της πλειάδας των βιολογικών δράσεων που ασκεί σε διάφορους κυτταρικούς τύπους. Έρευνες έχουν δείξει ότι η HARP παίζει σημαντικό ρόλο σε διαδικασίες όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η κυτταρική διαφοροποίηση, η αγγειογένεση και η καρκινογένεση. Η HARP ασκεί τις βιολογικές της δράσεις ύστερα από πρόσδεση σε διαμεμβρανικούς υποδοχείς. Οι μέχρι σήμερα χαρακτηρισμένοι υποδοχείς της HARP είναι η Συνδεκάνη-3 (Syndecan-3, SDC3), ο RPTPβ/ζ (Receptor Protein Tyrosine Phosphatase β/ζ) και ο ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase). Ο ALK είναι διαμεμβρανικός υποδοχέας με ενεργότητα κινάσης τυροσίνης. Παρόλο που έχει ταυτοποιηθεί ως λειτουργικός υποδοχέας του αυξητικού παράγοντα HARP, υπάρχουν αντικρουόμενα αποτελέσματα σχετικά με την αλληλεπίδρασή του και την ενεργοποίησή του από τη HARP. Πολλές αναφορές υποστηρίζουν ότι η HARP αλληλεπιδρά με τον ALK, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του υποδοχεά και τη φωσφορυλίωση ενδοκυτταρικών μορίων μεταγωγής σήματος που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την κυτταρική διαφοροποίηση (Mikelis et al., 2007; Stoica et al., 2001). Αρκετές είναι ωστόσο οι μελέτες που υποστηρίζουν ότι ο ALK δεν αποτελεί υποδοχέα της HARP. Επιπλέον έχει προταθεί ότι η αλληλεπίδραση των δύο μορίων εξαρτάται από τη μορφή της HARP (Moog-Lutz et al., 2005; Mathivet et al., 2007). Ενδιαφέρον αποτελεί και ένα πρόσφατο μοντέλο έμμεσης ενεργοποίησης του ALK, σύμφωνα με το οποίο ο υποδοχέας ενεργοποιείται ύστερα από πρόσδεση της HARP στον RPTPβ/ζ (Perez-Pinera et al., 2007). Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση της αλληλεπίδρασης του αυξητικού παράγοντα HARP και του διαμεμβρανικού υποδοχέα ALK. Πιο 48

Σκοπός συγκεκριμένα, μελετήθηκε σε επίπεδο φωσφορυλίωσης το εάν ο ALK ενεργοποιείται από τη HARP. Ακολούθως, διερευνήθηκε ο μηχανισμός ενεργοποίησης του ALK, εξετάζοντας εάν o ALK φωσφορυλιώνεται άμεσα από τη HARP, ή έμμεσα ύστερα από πρόσδεση της HARP στον RPTPβ/ζ. Ως μοντέλο μελέτης χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά PC3 που έχει απομονωθεί από καρκίνο ανθρώπινου προστάτη με μετάσταση στη σπονδυλική στήλη. Τα PC3 κύτταρα εκφράζουν τους υποδοχείς ALK και RPTPβ/ζ του αυξητικού παράγοντα HARP. Συνεπώς, προκειμένου να μελετηθεί ο ρόλος του RPTPβ/ζ στην επαγόμενη από τη HARP φωσφορυλίωση του υποδοχέα ALK, χρησιμοποιήθηκαν καρκινικά κύτταρα PC3 ανθρώπινου προστάτη, καθώς επίσης και κύτταρα PC3 στα οποία είχε πραγματοποιηθεί μειωρύθμιση της συσσώρευσης του RPTPβ/ζ. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η HARP αποτελεί υπόστρωμα διαφόρων πρωτεολυτικών ενζύμων του κυτταρικού μικροπεριβάλλοντος, με αποτέλεσμα την παραγωγή πεπτιδίων που μπορεί να παρουσιάζουν παρόμοιες ή και διαφορετικές δράσεις με τη HARP. Συνεπώς, η παραγωγή πεπτιδίων που αντιστοιχούν σε επιμέρους περιοχές της HARP χρησιμεύει στη μελέτη της δομής/δράσης του συγκεκριμένου αυξητικού παράγοντα. Συνεπώς, με σκοπό τον προσδιορισμό των περιοχών του αυξητικού παράγοντα HARP που αλληλεπιδρούν με τους υποδοχείς RPTPβ/ζ και ALK, χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα PC3 και κύτταρα PC3 με σταθερά μειωρυθμισμένα τα επίπεδα έκφρασης του RPTPβ/ζ και ελέγθηκε μέσω πειραμάτων συγκατακρήμνισης, η αλληλεπίδραση των δύο υποδοχέων με πεπτίδια που αντιστοιχούν σε επιμέρους περιοχές της HARP. Επιπλέον στόχος των πειραμάτων αυτών ήταν και ο έλεγχος της άμεσης ή έμμεσης αλληλεπίδρασης του αυξητικού παράγοντα HARP με τον υποδοχέα ALK. 49

Υλικά και Μέθοδοι 50

Υλικά και Μέθοδοι ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Ανακαλλιέργεια κυττάρων Η ανακαλλιέργεια των κυττάρων αποσκοπεί στη διατήρηση του απαραίτητου προς μελέτη βιολογικού υλικού. Τα κύτταρα τα οποία καλλιεργούνται σε στερεό υπόστρωμα, αφήνονται να αναπτυχθούν μέχρι να καλύψουν το 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου κυτταροκαλλιέργειας, κατάσταση κατά την οποία η ανάπτυξή τους δεν επηρεάζεται από την έλλειψη χώρου. Σε πολλά είδη κυττάρων, η έλλειψη χώρου, αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τροποποιεί τις μεταβολικές τους διαδικασίες με τρόπο και αποτελέσματα που δεν έχουν πλήρως διασαφηνιστεί (contact inhibition). Επομένως η ανακαλλιέργεια πρέπει να γίνεται σε τακτά χρονικά διαστήματα, ανάλογα με το είδος της κυτταρικής σειράς, έτσι ώστε να διασφαλίζεται η ομαλή ανάπτυξη των κυττάρων. Η αποκόλληση των κυττάρων από το υπόστρωμά είναι δυνατή με μηχανικό τρόπο ή με ενζυμική αποκόλληση. Κατά την τελευταία περίπτωση συνήθως χρησιμοποιείται διάλυμα τρυψίνης, το οποίο διασπά τις συνδέσεις των κυττάρων μεταξύ τους αλλά και με το στερεό τους υπόστρωμα. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά PC3. Επίσης χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα PC3 σταθερά επιμολυνθέντα (stably transfected) με πλασμίδιο στο οποίο έχει κλωνοποιηθεί αλληλουχία για την παραγωγή shrna συμπληρωματικού του mrna του RPTPβ/ζ (PC3 RPTPβ/ζ ). Το συγκεκριμένο πλασμίδιο φέρει επιπλέον γονίδιο για ανθεκτικότητα έναντι της νεομυκίνης. Υλικά & Διαλύματα Διάλυμα PBS (Phosphate Buffered Saline) Πλήρες Υγρό Θρεπτικό μέσο για τα κύτταρα (RPMI) 10% v/v Ορός νεογέννητου βοός (Fetal Bovine Serum, FBS) 51

Υλικά και Μέθοδοι 100 U/ml Πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη RPMI-1640 Τρυψίνη/EDTA (0.05 %-0.02 % σε PBS χωρίς Ca 2+ ) Διαδικασία Παρατήρηση του τρυβλίου κυτταροκαλλιέργειας στο μικροσκόπιο. Η εικόνα των κυττάρων είναι ενδεικτική της κατάστασης στην οποία βρίσκονται. Κύτταρα που είναι προσκολλημένα στο τρυβλίο θεωρούνται υγιή και ζωντανά, ενώ αυτά που επιπλέουν είναι κατά πάσα πιθανότητα νεκρά. Μεταφορά του τρυβλίου σε θάλαμο νηματικής ροής όπου είναι δυνατή η εργασία υπό στείρες συνθήκες. Αναρρόφηση υπό κενό του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας με πιπέτα Pasteur. Ξέπλυμα των κυττάρων με PBS δύο φορές. Με την διαδικασία αυτή απομακρύνονται τυχόν εναπομείναντα ίχνη ορού, τα οποία περιέχουν αναστολείς της τρυψίνης. Προσθήκη 1 ml διαλύματος τρυψίνης για την αποκόλληση των κυττάρων και επώαση στους 37 0 C για 2-5 min. Τα κύτταρα δεν θα πρέπει να μείνουν για διάστημα πλέον των 10 λεπτών στο διάλυμα τρυψίνης διότι μειώνεται η βιωσιμότητά τους. Παρατήρηση της αποκόλλησης των κύττάρων στο μικροσκόπιο. Τα κύτταρα έχουν αποκτήσει στρογγυλό σχήμα και αιωρούνται. Αναστολή της δράσης της τρυψίνης με προσθήκη διπλάσιου (ως προς τον όγκο της τρυψίνης) όγκου πλήρους θρεπτικού μέσου. Μεταφορά του εναιωρήματος των κυττάρων σε αποστειρωμένο σωλήνα των 15 ml και φυγοκέντρηση στα 500 g για 4 min στους 25 0 C. Αναρρόφηση υπο κενό του θρεπτικού μέσου με πιπέτα Pasteur. Προσθήκη 2 ml RPMI και επαναιώρηση του ιζήματος των κυττάρων μέχρι να μην είναι ορατά συσσωματώματα. Μεταφορά 10 μl από το εναιώρημα των κυττάρων σε αιμοκυτταρόμετρο Neubauer, για τον υπολογισμό του αριθμού των κυττάρων. 52

Υλικά και Μέθοδοι Για κάθε ανακαλλιέργεια χρησιμοποιούνται 80.000-100.000 κύτταρα ανά ml πλήρους θρεπτικού μέσου, εκτός από τις περιπτώσεις που τα κύτταρα θα χρησιμοποιηθούν σε ειδικά πειράματα. Για τα κύτταρα PC3-RΜ4, ισχύει η ίδια πειραματική πορεία ανακαλλιέργειας, με τη διαφορά ότι στο πλήρες θρεπτικό μέσο προστίθεται το αντιβιοτικό νεομυκίνη G418 σε τελική συγκέντρωση 600 μg/ml. Μέτρηση κυττάρων σε αιμοκυτταρόμετρο Neubauer Είναι η πιο άμεση, απλή και αποδοτική μέθοδος μέτρησης κυττάρων που βρίσκονται σε εναιώρημα. Το αιμοκυτταρόμετρο (Εικόνα 2.1) είναι μια τροποποιημένη και διαβαθμισμένη αντικειμενοφόρος πλάκα, που περιέχει δυο κατάλληλα επεξεργασμένες, λείες επιφάνειες. Σε κάθε μια απ αυτές διακρίνεται μια διαγράμμιση σε μορφή τετραγωνισμένου πλέγματος, το οποίο αποτελείται από 9 κύρια τετράγωνα με μήκος πλευράς 1 mm (συνεπάγεται ότι το εμβαδόν του τετραγώνου είναι 1 mm 2 ). 53

Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα 2.1: Αιμοκυτταρόμετρο Neubauer. Παρουσιάζεται σχηματικά και ο τρόπος υπολογισμού των κυττάρων. Το καθένα από αυτά τα τετράγωνα ορίζεται από τρεις παράλληλες γραμμές που απέχουν μεταξύ τους μόλις 2,5 μm, που χρησιμεύουν για τον καθορισμό της θέσης των κυττάρων (το αν αυτά βρίσκονται μέσα ή έξω από το πλέγμα). Το κάθε τετράγωνο εμφανίζει διαβαθμίσεις (χωρίζεται σε μικρότερα τετράγωνα) που εξυπηρετούν την ευκολότερη μέτρηση των κυττάρων. Το αιμοκυτταρόμετρο εμφανίζει δυο ίσου μεγέθους, λείες, προεξέχουσες επιφάνειες, με επίπεδο παράλληλο με τις διαγραμμισμένες, που ονομάζονται «ράχες», και στις οποίες στηρίζεται η καλυπτρίδα. Οι διαγραμμισμένες επιφάνειες βρίσκονται 0,1 mm χαμηλότερα από τις «ράχες». Μεταξύ της εξωτερικής πλευράς κάθε τετραγωνισμένης γυαλισμένης επιφάνειας και των σημείων που στηρίζεται η καλυπτρίδα υπάρχει μια κοίλη επιφάνεια (αυλάκωση). Στην κοίλη αυτή επιφάνεια τοποθετείται το κυτταρικό εναιώρημα, το οποίο με τριχοειδικά φαινόμενα απλώνεται στην τετραγωνισμένη επιφάνεια. Ο όγκος του κυτταρικού εναιωρήματος που θα καλύπτει ένα από τα εννέα τετράγωνα είναι 0,1 mm 3 (1,0 mm 2 x 0,1 mm) ή 1 x 10-4 ml. Έτσι, η συγκέντρωση των κυττάρων στο αρχικό εναιώρημα (σε κύτταρα / ml) είναι: Μέτρηση στο ένα από τα κύρια τετράγωνα x 10.000. Κατάψυξη κυττάρων Η διατήρηση των ζωικών κυττάρων για μεγάλο χρονικό διάστημα είναι δυνατή με τη διατήρησή τους σε υγρό άζωτο, σε θερμοκρασίες μεταξύ -135 0 C και - 175 0 C. Για την επιτυχή διατήρηση τους, είναι απαραίτητο να βρίσκονται σε καλή μεταβολική κατάσταση πριν από την ψύξη τους και για το λόγο αυτό -κατά γενικό κανόνα- η ψύξη των κυττάρων πραγματοποιείται όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου. Επιπλέον, η ψύξη των κυττάρων πραγματοποιείται βαθμιαία (περίπου 1 0 C ανά ώρα) μέχρι η θερμοκρασία τους να φτάσει ένα κρίσιμο σημείο (-20 0 C), προκειμένου να αποφευχθεί ο σχηματισμός πάγου στο εσωτερικό 54

Υλικά και Μέθοδοι τους και να ελαχιστοποιηθεί η απώλεια νερού. Επίσης, για να αποφευχθεί ο σχηματισμός πάγου στο εσωτερικό των κυττάρων, καταψύχονται παρουσία διμέθυλου-σουλφοξειδίου (DMSO). Υλικά & Διαλύματα DMSO (dimethylsulfoxide) Πλήρες υγρό θρεπτικό μέσο για κύτταρα (RPMI) Ορός νεογέννητου βοός (fetal bovine serum, FBS) Ειδικά φιαλίδια για την ψύξη των κυττάρων (cryovials) Ειδικό δοχείο ψύξης κυττάρων που περιέχει ισοπροπανόλη και επιτρέπει την ήπια αρχική ψύξη των κυττάρων Δοχείο ψύξης κυττάρων (υγρό άζωτο) Διαδικασία Αποκόλληση των κυττάρων από τον πυθμένα του τρυβλίου στο οποίο καλλιεργούνται, φυγοκέντρηση στα 500 g για 4 min στους 25 0 C, επαναιώρηση σε ορό και υπολογισμός του αριθμού των κυττάρων με την βοήθεια αιμοκυτταρόμετρου όπως περιγράφεται παραπάνω. Υπολογισμός του όγκου στον οποίο βρίσκονται επαναιωρημένα 1.000.000-3.000.000 κύτταρα. Ο αριθμός αυτός είναι αντιπροσωπευτικός για να έχουμε ένα ικανοποιητικό ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων, μετά την διαδικασία παγώματος-ξεπαγώματος. Μεταφορά του όγκου που υπολογίσαμε σε ένα cryovial που περιέχει DMSO σε συγκέντρωση 10% του τελικού όγκου και πολύ γρήγορη ανάδευσή των διαλυμάτων προκειμένου να επιτευχθεί η ομοιογενής κατανομή του DMSO. Στο cryovial σημειώνεται ο κυτταρικός τύπος, η γενιά που θα είναι τα κύτταρα όταν ξεπαγώσουν, η ημερομηνία ψύξης και ο αριθμός των κυττάρων. 55

Υλικά και Μέθοδοι Τοποθέτηση των κυττάρων σε σύστημα ελεγχόμενης ψύξης με ισοπροπανόλη στους -80 0 C για 24-48 h, προκειμένου να επιτευχθεί η σταδιακή ψύξη των κυττάρων που συμβάλλει στην μεγαλύτερη βιωσιμότητά τους. Τοποθέτηση των κυττάρων σε δοχείο αποθήκευσης με υγρό άζωτο έως ότου απαιτηθεί η επαναχρησιμοποίησή τους. Απόψυξη κυττάρων Κατά τη διαδικασία αυτή, κύτταρα τα οποία έχουν παραμείνει παγωμένα ακόμα και για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα, είναι δυνατόν να επανακαλλιεργηθούν. Η διαδικασία γίνεται υπό άσηπτες συνθήκες και όσο το δυνατόν ταχύτερα, προκειμένου να μειωθεί χρονικά η έκθεση των κυττάρων στο DMSO, το οποίο δρα τοξικά στα κύτταρα. Υλικά & Διαλύματα Διάλυμα PBS (Phosphate Buffered Saline) RPMI Πλήρες υγρό θρεπτικό µέσο για κύτταρα (RPMI) Ειδικά τρυβλία κυτταροκαλλιέργειας Διαδικασία Αφαίρεση του φιαλιδίου των κυττάρων που επιθυμούμε από το υγρό άζωτο. Επώαση των κυττάρων με ανακίνηση σε υδατόλουτρο 37 0 C έως ότου ξεπαγώσουν. Η διαδικασία αυτή πρέπει να ολοκληρωθεί σε 1-1,5min. Μεταφορά σε σωλήνα των 15 ml που περιέχει 9 ml RPMI όσο το δυνατό πιο γρήγορα. Το στάδιο αυτό αποσκοπεί στην αραίωση του DMSO στο οποίο 56

Υλικά και Μέθοδοι βρίσκονται τα κύτταρα και το οποίο σε θερμοκρασία δωματίου είναι τοξικό για αυτά. Φυγοκέντρηση στα 500g για 4 min στους 25 0 C. Απομάκρυνση του υπερκείμενου θρεπτικού μέσου με πιπέτα Pasteur, επαναιώρηση του ιζήματος των κυττάρων σε 10 ml RPMI και φυγοκέντρηση στα 500 g για 4 min στους 25 0 C. Απομάκρυνση του υπερκείμενου και επαναιώρηση του ιζήματος των κυττάρων σε 10 ml πλήρους θρεπτικού μέσου. Μεταφορά των κυττάρων σε τρυβλίο κυτταροκαλλιέργειας. Παρατήρηση στο μικροσκόπιο και μεταφορά σε θάλαμο επώασης όπου αναπτύσσονται τα κύτταρα. Μετά το πέρας 24 ωρών ανανεώνεται το θρεπτικό μέσο των κυττάρων ούτως ώστε να απομακρυνθούν τα νεκρά κύτταρα. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής: Παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο. Αναρρόφηση υπό κενό του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας με πιπέτα Pasteur. Ξέπλυμα των κυττάρων με PBS δύο φορές. Προσθήκη 10 ml διαλύματος πλήρους θρεπτικού μέσου Τοποθέτηση των κυττάρων σε θάλαμο επώασης που αναπτύσονται τα κύτταρα. Σταθερή διαμόλυνση NIH3T3 κυττάρων με cdna Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε σταθερή διαμόλυνση των NIH3T3 ινοβλαστών για την υπερέκφραση του γονιδίου της HARP. Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με κατιονικά λιπίδια που έφεραν τον πλασμιδιακό φορέα pcdna3 (Promega), στον οποίο είχε κλωνοποιηθεί αλληλουχία του cdna της HARP (pcdna3-harp). Κατά τη διαδικασία αυτή, είναι απαραίτητοι οι πειραματισμοί προκειμένου να εντοπισθεί η κατάλληλη συγκέντρωση του πλασμιδιακού DNA, η κατάλληλη ποσότητα του αντιδραστηρίου διαμόλυνσης, καθώς και η αρχική συγκέντρωση των 57

Υλικά και Μέθοδοι κυττάρων που θα χρησιμοποιηθούν, καθώς οι παράγοντες αυτοί είναι δυνατόν να επηρεάσουν τόσο το ποσοστό της διαμόλυνσης, αλλά και την παρατηρούμενη τοξικότητα. Υλικά & Διαλύματα Ελάχιστο θρεπτικό μέσο για τα κύτταρα (DMEM). Πλήρες Θρεπτικό Μέσο (DMEM). 10% v/v Ορός νεογέννητου βοός (Fetal Bovine Serum, FBS). 100 U/ml Πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη. DMEM Θρεπτικό μέσο επιλογής Θρεπτικό μέσο Opti-MEM 600 μg/ml G418 Κατιονικά Λιπίδια Fugene6 (Promega) Πλασμιδιακός φορέας έκφρασης pcdna3 (Invitrogen) με κλωνοποιημένη την αλληλουχία για την παραγωγή της αλληλουχίας του cdna της HARP (pcdna3-harp). Πλασμιδιακός φορέας έκφρασης pcdna3 Διάλυμα Α. 20 mm Hepes ph 7.4. 2 M NaCl. 1 mm PMSF. 5 mm EDTA. 1 μg/ml απροτινίνη ΔΙΑΛΥΜΑ Β. 20 mm Hepes ph 7.4. 0.5 M NaCl ΔΙΑΛΥΜΑ Γ. 20 mm Hepes ph 7.4 58

Υλικά και Μέθοδοι Διαδικασία Αποκόλληση των κυττάρων από τον πυθμένα του τρυβλίου και υπολογισμός του αριθμού τους με αιμοκυτταρόμετρο Neubauer, όπως έχει ήδη περιγραφεί. Μεταφορά σε μικροπλακίδια κυτταροκαλλιέργειας τέτοιου αριθμού κυττάρων ώστε μετά από 24 h να καλύπτουν το 30-60% της επιφάνειας της μικροκυψελίδας σύμφωνα με τον πίνακα. Διάλυση με έντονη ανάδευση σε σωληνάριο eppendorf, επιθυμητής ποσότητας Fugene6 στην αντίστοιχη ποσότητα θρεπτικού μέσου Opti-MEM (Πίνακας) και επώαση για 5 min στους 25 0 C. Προσθήκη αντίστοιχης ποσότητας πλασμιδιακού DNA (Πίνακας 2.1) και επώαση για 15 min στους 25 0 C. Μεταφορά του συμπλόκου Fugene6 / πλασμιδιακό DNA στο τρυβλίο κυτταροκαλλιέργειας στο οποίο αναπτύσονται τα κύτταρα που προορίζονται για διαμόλυνση. Επώαση για 48 h σε απόλυτη υγρασία στους 37 0 C, σε ατμόσφαιρα 5% CO 2. Επίδραση με το θρεπτικό μέσο επιλογής των μετασχηματισμένων κυττάρων. Το θρεπτικό μέσο επιλογής ανανεώνεται κάθε 2 ημέρες. Παρατήρηση της ύπαρξης αποικιών σε χρονικό διάστημα τεσσάρων εβδομάδων. Αποκόλληση των κυττάρων της κάθε αποικίας χωριστά με pipette-tip και ανακαλλιέργεια αρχικά σε μικροπλακίδια κυτταροκαλλιέργειας 24 μικροκυψελίδων και στη συνέχεια σε μικροπλακίδια κυτταροκαλλιέργειας 6 μικροκυψελίδων. Συλλογή του υπερκείμενου θρεπτικού μέσου των κυττάρων κάθε κλώνου και απομόνωση της εκκρινόμενης HARP με τη μέθοδο ανοσοκατακρήμνισης με σφαιρίδια ηπαρίνης-αγαρόζης. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής:. Επώαση των κυττάρων σε 10 ml πλήρους θρεπτικού μέσου μέχρι να καλυφθεί το 96% της επιφάνειας του τρυβλίου.. Αφαίρεση του θρεπτικού μέσου των κυττάρων και προσθήκη ελάχιστου θρεπτικού μέσου (DMEM).. Επώαση των κυττάρων για 24 h, σε απόλυτη υγρασία, στους 37 0 C, σε ατμόσφαιρα 5% CO 2. 59

Υλικά και Μέθοδοι. Συλλογή του θρεπτικού μέσου και προσθήκη διαλύματος Α σε τέτοια ποσότητα ώστε η τελική συγκέντρωση του NaCl να είναι 0.5Μ.. Προσθήκη 50 μl σφαιριδίων ηπαρίνης-αγαρόζης και ανακίνηση στους 4 0 C για 16 h.. Φυγοκέντρηση στα 1.000 g για 5 min.. Απομάκρυνση του υπερκειμένου και επαναιώρηση των σφαιριδίων σε 10 ml διαλύματος Γ. Φυγοκέντρηση στα 1.000 g για 5 min (x2).. Απομάκρυνση του υπερκειμένου και επαναιώρηση των σφαιριδίων σε 10 ml διαλύματος B. Φυγοκέντρηση στα 1.000 g για 5 min (x2).. Προσθήκη διαλύματος διαλυτοποίησης δειγμάτων ηλεκτροφόρησης.. Ανάλυση των πρωτεϊνών σε SDS-PAGE και ταυτοποίηση της HARP κατά Western.. Επιλογή των κλώνων με τη μέγιστη ποσότητα εκκρινόμενης HARP. Πίνακας 2.1: Ενδεικνυόμενες συνθήκες για τη διαμόλυνση κυττάρων. 96 κυψελίδες 24 κυψελίδες 12 κυψελίδες 6 κυψελίδες Αριθμός κυττάρων 0.2-1 x 10 4 1.2-6 x 10 4 0.25-1 x 10 5 0.6-2.5 x 10 5 Fugene6 0,2 μl 1 μl 2 μl 5 μl Opti-MEM 5 μl 20 μl 50 μl 100 μl Πλασμιδιακό DNA 40 ng 200 ng 400 ng 1 μg Τελικός όγκος 100 μl 500 μl 1 ml 2 ml Απομόνωση και καθαρισμός της HARP από το θρεπτικό μέσο των κυττάρων Η HARP εκφράζεται σε κύτταρα NIH3T3 σταθερά επιμολυνθέντα (stably transfected) με με το πλασμίδιο pcdna3-harp (Invitrogen, Leek, Netherlands) στο οποίο έχει κλωνοποιηθεί η αλληλουχία του cdna της HARP. Η καλλιέργεια των 60

Υλικά και Μέθοδοι κυττάρων πραγματοποιείται σε θρεπτικό μέσο DMEM και ακολουθεί απομόνωση της HARP από το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο. Υλικά & Διαλύματα PBS Πλήρες Θρεπτικό Μέσο (DMEM) Τρυβλία κυτταροκαλλιέργειας 600 cm 2 (χωρητικότητας 90 ml θρεπτικού μέσου). Ρυθμιστικό διάλυμα HEPES, 20 mm, ph=7,4 NaCl Αναστολείς πρωτεασών:. EDTA, PMSF: 1 mm. Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 μg/ml Ρυθμιστικό Διάλυμα HEPES 20 mm, ph=7,4 που περιέχει 2 M NaCl Ρυθμιστικό Διάλυμα HEPES, 20 mm, ph=7,4 που περιέχει 0,5 Μ NaCl Στήλη Heparin-Sepharose (10 ml) της Amersham Pharmacia Biotech. Στήλη mono-s της Amersham Pharmacia Biotech Διαδικασία Απόψυξη των κυττάρων NIH3T3 (clone HMH-C9) όπως έχει περιγραφεί και καλλιέργειά τους σε τρυβλία κυτταροκαλλιέργειας 100 cm 2. Ανακαλλιέργεια των κυττάρων σε τρυβλία κυτταροκαλλιέργειας 600 cm 2 όταν αυτά καλύψουν το 80% της επιφάνειας του τρυβλίου. (16 τρυβλία κυτταροκαλλιέργειας 600 cm 2, 80.000 κύτταρα / ml θρεπτικού μέσου). Συλλογή του υπερκείμενου θρεπτικού μέσου όταν τα κύτταρα καλύψουν το 96% του τρυβλίου κυτταροκαλλιέργειας 600 cm 2. Προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος HEPES ph=7,4 ώστε η τελική συγκέντρωση στο διάλυμα να είναι 20 mm. 61

Υλικά και Μέθοδοι Λαμβάνοντας υπ όψιν τον τελικό όγκο του διαλύματος, καθώς και ότι η αρχική περιεκτικότητά του σε NaCl είναι ήδη 0,15Μ, η ιοντική ισχύς του διαλύματος ρυθμίζεται σε 0,5 Μ NaCl και προστίθενται οι αναστολείς πρωτεασών σε συγκεντρώσεις που αναγράφονται στο παραπάνω υποκεφάλαιο με τίτλο «Υλικά & Διαλύματα». Μεταφορά του παραπάνω διαλύματος σε 10 ml στήλης Heparin-Sepharose με ροή 0,5 ml / min. Επώαση για 16 h στους 4 0 C. Μετά την προσρόφηση των πρωτεϊνών στην ακίνητη φάση της κολώνας ηπαρίνης, πραγματοποιείται εξαντλητική έκπλυση της στήλης με διάλυμα 20 mm HEPES, ph=7,4 το οποίο περιέχει 0,5Μ ΝαCl. Έκλουση των πρωτεϊνών, χρησιμοποιώντας διάλυμα HEPES 20 mm, ph=7,4 το οποίο περιέχει 2 Μ NaCl. Μεταφορά του προκύπτοντος διαλύματος σε κολώνα mono-s, η οποία έχει προηγουμένως εξισορροπηθεί με διάλυμα 50 mm Tris-HCL ph=7,4. Έκλουση των πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας διάλυμα 50 mm Tris-HCL, ph=7,4 το οποίο περιέχει 2Μ NaCl και με ταχύτητα έκλουσης 0,5 ml / min. Συλλογή των κλασμάτων που εκλούονται από τη στήλη και προσδιορισμός των κλασμάτων στα οποία περιέχεται HARP, καθώς και εκτίμηση της ποσότητας HARP που περιέχεται σε αυτά. Παροδική διαμόλυνση PC3 κυττάρων με παρεμβαλλόμενο RNA Κατά την πειραματική αυτή διαδικασία πραγματοποιήθηκε παροδική διαμόλυνση των PC3 κυττάρων με παρεμβαλόμενες αλληλουχίες RNA (sirna), προκειμένου να μειωθεί η συσσώρευση των μεταγράφων του RPTPβ/ζ. Η μεταφορά των sirnas στο εσωτερικό των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με μια νέα τεχνολογία διαμόλυνσης, την αντίστροφη διαμόλυνση (siport NeoFX, Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 62

Υλικά και Μέθοδοι Υλικά & Διαλύματα Διάλυμα PBS (Phosphate Buffered Saline) Πλήρες υγρό θρεπτικό μέσο για τα κύτταρα Θρεπτικό μέσο Οpti-MEM I siport NeoFX Silencer Select sirna RPTPβ/ζ Διαδικασία Αποκόλληση των κυττάρων από το πυθμένα του τρυβλίου και υπολογισμός του αριθμού τους με αιμοκυτταρόμετρο Neubauer, όπως έχει ήδη περιγραφεί. Διάλυση επιθυμητής ποσότητας siport NeoFX στον ενδεικνυόμενο όγκο Οpti-MEM (Πίνακας 2.2) για 10 min στους 25 0 C. Διάλυση επιθυμητής ποσότητας sirna στον ενδεικνυόμενο όγκο Οpti-MEM. Ανάμιξη με ήπια ανακίνηση, του διαλύματος του siport NeoFX με το διάλυμα του sirna και επώαση για 10 min στους 25 0 C. Μεταφορά των συμπλόκων διαμόλυνσης σε μικροκυψελίδα μικροπλακιδίου κυτταροκαλιέργειας. Προσθήκη επιθυμητού αριθμού από το εναιώρημα των κυττάρων σε τελικό όγκο που ενδείκνυται στον πίνακα 2.3. Τα κύτταρα χρησιμοποιούνται περαιτέρω είτε για την απομόνωση του ολικού RNA, είτε για ανάλυση του πρωτεϊνικού τους περιεχομένου, είτε για λειτουργικά πειράματα. Πίνακας 2.2: Ενδεικνυόμενες συνθήκες για τη διαμόλυνση κυττάρων με sirna 96 κυψελίδες 24 κυψελίδες 12 κυψελίδες 6 κυψελίδες siport NeoFX 0.5 μl 1 μl 3 μl 5 μl Opti-MEM 10 μl 25 μl 50 μl 100 μl Όγκος κυττάρων 80 μl 450 μl 900 μl 2300 μl 63

Υλικά και Μέθοδοι Αριθμόςκυττάρων 8 x 10 3 4.5 x 10 4 9 x 10 4 2.3 x 10 5 Τελικός όγκος 100 μl 500 μl 1000 μl 2500 μl Πίνακας 2.3: Συνθήκες για τη διαμόλυνση PC3 κυττάρων Συγκέντρωση Silencer Αριθμός siport NeoFX (μl) Select sirna κυττάρων PC3 5 μl 30 nm 1,5 x 10 5 Πίνακας 2.4: Αλληλουχίες sirnas RPTPβ/ζ, Νοηματική αλληλουχία Αντι-νοηματική αλληλουχία 5 -AAAUGCGAAUCCUAAAGCGUU-3 5 -AACGCUUUAGGAUUCGCAUUU-3 Εκχύλιση πρωτεϊνών από κύτταρα σε καλλιέργεια Η ανάλυση και μελέτη των πρωτεϊνών έγινε σε ολικά εκχυλίσματα από τις καλλιέργειες των κυττάρων. Κατά τη διαδικασία αυτή τα κύτταρα λύονται με διάλυμα το οποίο περιέχει μη ιοντικό απορρυπαντικό, προκειμένου να λυθούν οι μεμβράνες των κυττάρων, και αναστολείς πρωτεϊνασών για να προστατευθούν οι πρωτεΐνες από πρωτεολυτική διάσπαση. Με τη διαδικασία αυτή οι πρωτεΐνες εκχυλίζονται διατηρώντας την τριτοταγή τους δομή. Υλικά & Διαλύματα Διάλυμα Ομογενοποίησης (Lysis Buffer) (ph=7,8) 50 mm Tris 150 mm NaCl 64

Υλικά και Μέθοδοι 1 mm EDTA 1% v/v TritonX-100 1 mm PMSF Πριν από κάθε χρήση προστίθεται 1 mm ορθοβαναδικό νάτριο, 1 μg/ml απροτινίνη και 1 μg/ml λουπεπτίνη. Διαδικασία Απομάκρυνση του υπερκείμενου θρεπτικού μέσου της κυτταροκαλλιέργειας. Έκπλυση των κυττάρων 2 φορές με παγωμένο PBS. Προσθήκη 0,75 ml Lysis Buffer ανά 1.000.000-3.000.000 κύτταρα Aπόξυση της επιφάνειας του τρυβλίου κυτταροκαλλιέργειας με cell scrapper και επώαση για 5 min στον πάγο. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται συνολικά τρεις φορές. Συλλογή του δείγματος, μεταφορά σε eppendorfs και περαιτέρω ομογενοποίηση με υπερήχους. Συλλογή και φυγοκέντρηση του δείγματος σε 10.700g στους 4 0 C για 4 min. Λήψη του υπερκείμενου ομογενοποιήματος το οποίο χρησιμοποιείται άμεσα ή αποθηκεύεται στους -80 0 C. Προσδιορισμός της συγκέντρωσης πρωτεϊνών σε διάλυμα Η εύρεση της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών που περιέχονται σε ένα διάλυμα γίνεται εύκολα με χρωματομετρικές μεθόδους, ή με την μέτρηση της οπτικής απορρόφησης των δειγμάτων στα 280 nm. Οι μέθοδοι Bradford & Lowry και BCA χρησιμοποιούνται πιο συχνά για τον υπολογισμό μικρών ποσοτήτων πρωτεϊνών. Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος BCA (bichichoninic acid) (BCA protein assay kit, PIERCE) (Sorensen & Brodbeck, 1986), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η μέθοδος BCA βασίζεται στην αντίδραση του Cu 2+ με πρωτεΐνες που περιέχονται σε αλκαλικό διάλυμα με αποτέλεσμα την αναγωγή του Cu 2+ σε Cu 1+ και τελικώς την αντίδραση του Cu 1+ με το bichinchoninic acid (BCA) και τον σχηματισμό ιώδους 65

Υλικά και Μέθοδοι συμπλόκου. Η αντίδραση σχηματισμού χρώματος επηρεάζεται κυρίως από την παρουσία τριών αμινοξέων (κυστεΐνης, τυροσίνης, τρυπτοφάνης) στην αμινοξική αλληλουχία κάθε πρωτεΐνης, καθώς και από την παρουσία του πεπτιδικού δεσμού. Το χρώμα είναι ανάλογο της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών και παρουσιάζει μέγιστο απορρόφησης στα 562 nm. Με τη μέθοδο BCA είναι δυνατό να μετρηθούν συγκεντρώσεις πρωτεϊνών μεταξύ 25-2000 μg. Για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης αγνώστου δείγματος χρησιμοποιείται πρότυπη καμπύλη, η οποία κατασκευάζεται με τη βοήθεια γνωστών συγκεντρώσεων αλβουμίνης ορού βοός (Bovine Serum Albumin, BSA) σύμφωνα με τον Πίνακα 2.5. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η πρότυπη πρωτεΐνη διαλύεται σε ίδιας σύστασης ρυθμιστικό διάλυμα (Diluent), στο οποίο είναι διαλυμένες οι πρωτεΐνες του αγνώστου συγκέντρωσης διαλύματος. Πίνακας 2.5: Κατασκευή πρότυπης καμπύλης για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης πρωτεϊνών σε διάλυμα, μέσω της μεθόδου BCA. Ν ο Eppendorf μl BSA (2 mg/ml) ml Diluent C τελ. (μg/ml) 1 300 0 2000 2 375 125 1500 3 325 325 1000 4 175 (από το δ/μα 2) 175 750 5 325 (από το δ/μα 3) 325 500 6 325 (από το δ/μα 5) 325 250 7 325 (από το δ/μα 6) 325 125 8 100 (από το δ/μα 7) 400 25 9 0 400 0 Διαδικασία Κατασκευή πρότυπης καμπύλης, σύμφωνα με τον Πίνακα 2.5. Ποσότητα 25 μl από κάθε πρότυπο ή άγνωστο δείγμα μεταφέρεται σε διαφορετικές θέσεις πλακιδίου ELISA. 66

Υλικά και Μέθοδοι Προσθήκη 0,2 ml από το μίγμα των αντιδραστηρίων BCA A και B σε αναλογία 50:1 (Αντιδραστήριο Α: 1g C 20 H 10 N 2 Na 2 O 4, 2g Na 2 CO 3, 0.16 g Na 2 C 4 H 4 O 6, 0.4 g NaOH, 0.95 g NaHCO 3, V 100 ml DH 2 O ph=11,25, Αντιδραστήριο Β: 0,4 g CuSO 4-5H 2 O V 10 ml dh 2 O). Ανακίνηση του πλακιδίου για 30 Επώαση για 30 min στους 37 0 C Μέτρηση της απορρόφησης σε μήκος κύματος 595 nm. Από την πρότυπη καμπύλη υπολογίζεται η συγκέντρωση της πρωτεΐνης που περιέχεται στα άγνωστα δείγματα. Ανοσοκατατακρήμνιση με σφαιρίδια Η ανοσοκατακρήμνιση αποτελεί μία μορφή χρωματογραφίας συγγένειας. Σε αυτήν, ως στερεή φάση χρησιμοποιούνται σφαιρίδια σεφαρόζης ή αγαρόζης. Πάνω στα σφαιρίδια βρίσκεται ομοιοπολικά δεσμευμένη πρωτεΐνη Α, μια πρωτεΐνη βακτηριακής προέλευσης, με μεγάλη συγγένεια για την Fc περιοχή ορισμένων τύπων IgG ανοσοσφαιρινών. Με τη χρήση της δημιουργείται ένα σύμπλοκο σφαιριδίωνπρωτεΐνης Α - αντισωμάτων στο οποίο δεσμεύεται επιλεκτικά το αντιγόνο που θέλουμε να κατακρημνίσουμε. Το σύμπλοκο αυτό είναι δυνατό να συλλεχθεί μετά από φυγοκέντρηση και οι πρωτεϊνες που υπάρχουν σε αυτό να αποδεσμευτούν με τη χρήση αποδιατακτικών παραγόντων. Υλικά & Διαλύματα Διάλυμα Έκπλυσης (Wash Buffer) (ph=7,8). 50 mm Tris. 150 mm NaCl. 1 mm EDTA. 1% v/v TritonX-100. 1 mm PMSF 67

Υλικά και Μέθοδοι Διάλυμα ομογενοποίησης. Εναιώρημα 50% πρωτεΐνης Α σεφαρόζης (Sepharose CL-4B, GE Healthcare Life Sciences). Wash Buffer 3% w.w BSA (Bovine Serum Albumin). Πίνακας 2.6: Συνθήκες ανοσοκατακρήμνισης και αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν Αντίσωμα Εταιρεία Χρησιμοποιούμενη αραίωση (Diluent: Wash Buffer) ALK (51-3900, rabbit) Invitrogen 1:150 Διαδικασία 1. Ξέπλυμα των σφαιριδίων σεφαρόζης-α 4 φορές με διάλυμα έκπλυσης για 10 min στους 4 o C πριν από κάθε χρήση. 2. Επώαση (25-40 μl ανά δείγμα) ενυδατωμένων σφαιριδίων σεφαρόζης-α με αντίσωμα έναντι του αντιγόνου που θέλουμε να ανοσοκατακρημνίσουμε (Πίνακας 2.6) στους 4 0 C για 16 h. 3. Φυγοκέντρηση του δείγματος (500 g για 1 min) και απόρριψη του υπερκειμένου. 4. Ξέπλυμα των σφαιριδίων σεφαρόζης-α με διάλυμα έκπλυσης για 10 min στους 4 o C 5. Προσθήκη 0,5 ml Wash Buffer 3% BSA και επώαση στους 25 0 C για 30. Το στάδιο αυτό αποσκοπεί στην παρεμπόδιση μη ειδικής δέσμευσης πρωτεϊνών στην επιφάνεια των σφαιριδίων. 6. Ξέπλυμα των σφαιριδίων σεφαρόζης-α 3 φορές με διάλυμα έκπλυσης για 10 min στους 4 o C. 7. Λύση κυττάρων που έχουν καλύψει πλήρως την επιφάνεια ενός τρυβλίου. 8. Συλλογή του πρωτεϊνικού εκχυλίσματος και υπολογισμός της ποσότητας των ολικών πρωτεϊνών με τη μέθοδο Bradford. 68

Υλικά και Μέθοδοι 9. Προσθήκη 500 μg από το πρωτεϊνικό εκχύλισμα σε σωληνάριο eppendorf που περιέχει 25-40 μl σφαιρίδίων σεφαρόζης-α τα οποία έχουν κορεστεί με BSA (ύστερα από επώασή τους σε Wash buffer 3% BSA για 30 min στους 25 0 C). 10. Επώαση στους 4 0 C για 4 h. Στο στάδιο αυτό απομακρύνονται τυχόν πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν μη ειδικά με τα σφαιρίδια πρωτεΐνης Α- σεφαρόζης που έχουν κορεστεί με BSA. 11. Φυγοκέντρηση του δείγματος (500 g για 1 min) και συλλογή του υπερκειμένου. 12. Προσθήκη του υπερκειμένου του προηγούμενου σταδίου (πρωτεϊνικό εκχύλισμα) στα σφαιρίδια protein A-sepharose που περιέχουν το αντίσωμα έναντι του αντιγόνου που θέλουμε να ανοσοκατακρημνίσουμε (στάδιο 6). 13. Επώαση για 16 h στους 4 0 C. 14. Φυγοκέντρηση του δείγματος (500 g για 1 min) και απομάκρυνση του υπερκειμένου. 15. Ξέπλυμα των σφαιριδίων σεφαρόζης-α 4 φορές με διάλυμα έκπλυσης για 10 min στους 4 o C. 16. Προσθήκη διαλύματος διαλυτοποίησης δειγμάτων ηλεκτροφόρησης και ηλεκτροφορητική ανάλυση των πρωτεϊνών σε SDS-PAGE. Συγκατακρήμνιση με σφαιρίδια (Glutathione S-transferase pulldown) Τα πειράματα συγκατακρήμνισης συνιστούν μία μέθοδο, η οποία επιτρέπει τη διερεύνηση της δυνατότητας των διαφόρων πρωτεϊνών να αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Μας δίνει επίσης και μία πρώτη εκτίμηση για το πόσο ισχυρή είναι η αλληλεπίδραση αυτή. Η τεχνική Glutathione S-transferase (GST) pulldown στηρίζεται στη δυνατότητα καθήλωσης διαφόρων πρωτεϊνών σύντηξης με GST σε σφαιρίδια σεφαρόζης, επικαλυμένα με γλουταθειόνη, με την οποία η GST παρουσιάζει αγχιστεία. Η καθηλωμένη πρωτεΐνη μπορεί να δεσμεύσει άλλες πρωτεΐνες οι οποίες είτε βρίσκονται σε καθαρή μορφή, είτε περιέχονται σε συνολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα και με τις οποίες παρουσιάζει αγχιστεία. 69

Υλικά και Μέθοδοι Στην παρούσα εργασία ως μέσο καθήλωσης χρησιμοποιήθηκαν σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης για τη δέσμευση τροποποιημένων πεπτιδίων της HARP που είχαν εκφραστεί ως πρωτεΐνες σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST). Στα πειράματα αναφοράς έγινε δέσμευση καθαρής GST στα σφαιρίδια.. Υλικά & Διαλύματα Διάλυμα Έκπλυσης (Wash Buffer) (ph=7,8). 50 mm Tris. 150 mm NaCl. 1 mm EDTA. 1% v/v TritonX-100. 1 mm PMSF Εναιώρημα 50% γλουταθειόνης-σεφαρόζης (Glutathione Sepharose 4B, GE Healthcare Life Sciences) Διαδικασία 1. Ξέπλυμα των σφαιριδίων γλουταθειόνης-σεφαρόζης 4 φορές με διάλυμα έκπλυσης για 10 min στους 4 o C πριν από κάθε χρήση. 2. Λύση κυττάρων που έχουν καλύψει πλήρως την επιφάνεια ενός τρυβλίου. 3. Συλλογή του πρωτεϊνικού εκχυλίσματος και υπολογισμός της ποσότητας των ολικών πρωτεϊνών με τη μέθοδο Bradford. 4. Προσθήκη 500 μg από το πρωτεϊνικό εκχύλισμα σε σωληνάριο eppendorf που περιέχει 50 μl ενυδατωμένων σφαιριδίων γλουταθειόνης-σεφαρόζης και 25 μg καθαρής GST πρωτεΐνης. 5. Επώαση για 4 h στους 4 0 C. Το στάδιο αυτό αποσκοπεί στην απομάκρυνση τυχόν πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με τα σφαιρίδια ή/και με την πρωτεΐνη GST (Preclearing). 6. Φυγοκέντρηση του δείγματος (500 g για 1 min) και συλλογή του πρωτεϊνικού εκχυλίσματος. 70

Υλικά και Μέθοδοι 7. Προσθήκη του precleared πρωτεϊνικού εκχυλίσματος (υπερκείμενο του προηγούμενο σταδίου) σε σωληνάρια eppendorf που περιέχουν ενυδατωμένα σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης και 10 μg από κάθε τροποποιημένο πεπτίδιο της HARP (GST-pray protein). 8. Επώαση στους 4 0 C για 16 h. 9. Φυγοκέντρηση του δείγματος (500 g για 1 min) και απομάκρυνση του υπερκειμένου. 10. Ξέπλυμα των σφαιριδίων γλουταθειόνης-σεφαρόζης 4 φορές με διάλυμα έκπλυσης για 10 min στους 4 o C 11. Προσθήκη 60 μl διαλύματος διαλυτοποίησης δειγμάτων ηλεκτροφόρησης και ηλεκτροφορητική ανάλυση των πρωτεϊνών σε SDS-PAGE. Ανάλυση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου σε αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) Η τεχνική της ηλεκτροφόρησης στηρίζεται στην αρχή της κίνησης φορτισμένων μορίων κάτω από την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό μακρομορίων όπως πρωτεΐνες και νουκλεϊκά οξέα. Ο διαχωρισμός αυτός μπορεί να γίνει σε πηκτώματα, ένα από τα οποία είναι το πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου. Το πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου σχηματίζεται με πολυμερισμό μονομερούς ακρυλαμιδίου κατά την διάρκεια του οποίου ενσωματώνονται κατά διαστήματα μόρια Ν-Νμεθυλεν-δις-ακρυλαμιδίου, ενώνοντας διαφορετικές αλυσίδες πολυμερισμένου ακρυλαμιδίου. Καταλύτης για την αντίδραση του πολυμερισμού αποτελεί το ΝΝΝ Ν -τετραμεθυλεθυλενοδιαμίνη (TEMED), ενώ απαραίτητη είναι και η παρουσία ελεύθερων ριζών οξυγόνου που προκύπτουν από τα υπερθειϊκά ιόντα (S 2 O -2 3 ). Ηλεκτροφόρηση μπορεί να γίνει παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων όπως το SDS. Το SDS δεσμευόμενο σε πρωτεΐνες με σταθερή αναλογία βάρους (1,4 gr SDS ανά gr πρωτεΐνης), τους προσδίδει αρνητικό φορτίο, με αποτέλεσμα να καταστρέφεται η δευτεροταγής δομή τους και να αποκαλύπτονται οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες τους. Η επιπλέον χρήση αναγωγικών παραγόντων -όπως είναι η διθειοθρεϊτόλη (DTT) ή η β-μερκατοαιθανόλη- έχει ως αποτέλεσμα την αναγωγή των 71

Υλικά και Μέθοδοι δισουλφιδικών δεσμών των πρωτεϊνών. Η πλήρης αποδιάταξη των πρωτεϊνών επιτυγχάνεται με θέρμανση των πρωτεϊνικών δειγμάτων για 3-5 λεπτά στους 100 0 C, παρουσία όλων των παραπάνω αποδιατακτικών παραγόντων. Επειδή το ποσό του SDS που δεσμεύεται ανά μονάδα βάρους κάθε πρωτεΐνης είναι σταθερό, όλες οι πρωτεΐνες έχουν το ίδιο φορτίο και η ανάλυση γίνεται με βάση το μοριακό τους μέγεθος. Υλικά & Διαλύματα 1,5 M Tris-HCl ph 8,8 0,5 M Tris-HCl ph 6,8 Ρυθμιστικό διάλυμα διαλυτοποίησης δειγμάτων ( 2Χ ). 0.25 Μ Tris-HCl. 4% w/v SDS. 40% w/v Γλυκερόλη. 50 mm DTT (Τελική συγκέντρωση ανά δείγμα). 0.05% w/v Μπλε της βρωμοφαινόλης Η διθειοθρεϊτόλη (DTT) προστίθεται λίγο πριν την χρήση του ρυθμιστικού διαλύματος διαλυτοποίησης δειγμάτων. Ρυθμιστικό διάλυμα διαλυτοποίησης δειγμάτων ( 5Χ ). 0.25 Μ Tris-HCl. 10% w/v SDS. 50% w/v Γλυκερόλη. 50 mm DTT (Τελική συγκέντρωση ανά δείγμα). 0.05% w/v Μπλε της βρωμοφαινόλης Η διθειοθρεϊτόλη (DTT) προστίθεται λίγο πριν την χρήση του ρυθμιστικού διαλύματος διαλυτοποίησης δειγμάτων. Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροδίων (5Χ). 0,25 Μ Tris-Cl. 2 Μ Γλυκίνη. 0,5% w/v SDS Διάλυμα ακρυλαμιδίου / Μεθυλεν-δις-ακρυλαμιδίου 30% (30:1) 72

Υλικά και Μέθοδοι. Ακρυλαμίδιο (30 g). Δις-ακρυλαμίδιο (1 g). Aπεσταγμένο Η2Ο (μέχρι τελικού όγκου 100 ml) Διάλυμα 10% w/v SDS Διάλυμα 20% w/v υπερθεϊικού αμμωνίου TEMED Διαδικασία Συγκρότηση του συστήματος των γυάλινων πλακών, ώστε να δημιουργηθεί ο χώρος υποδοχής του πηκτώματος πολυακρυλαμιδίου και τοποθέτησή του στη συσκευή ηλεκτροφόρησης. Παρασκευή 15ml πηκτώματος διαχωρισμού της επιθυμητής πυκνότητας (5%, 7,5%, 10% και 17,5%) (πίνακας 2.7). Μεταφορά του πηκτώματος στο χώρο υποδοχής των γυάλινων πλακών. Προσθήκη ενός στρώματος dh 2 Ο. Μετά τον πολυμερισμό του πηκτώματος, απομακρύνεται το ddh 2 Ο και προστίθεται 5 ml από το πήκτωμα πακεταρίσματος (Πίνακας 2.8) στην επιφάνεια του οποίου τοποθετείται ειδική μήτρα, ώστε μετά τον πολυμερισμό να απομακρυνθεί και να δημιουργηθούν οι θέσεις για την τοποθέτηση των δειγμάτων. Θέρμανση των δειγμάτων στους 100 0 C για 3 min. Φυγοκέντρηση στα 10.700g για 4 min. Μεταφορά ίσης ποσότητας ολικών πρωτεϊνών από κάθε δείγμα στις κατάλληλες θέσεις υποδοχείς που έχουν σχηματισθεί στο πήκτωμα πακεταρίσματος. Γέμισμα της συσκευής ηλεκτροφόρησης με ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροδίων. Τροφοδότηση του κυκλώματος με συνεχές ρεύμα σταθερής έντασης 0,04 Α. Πίνακας 2.7. Σύσταση πηκτώματος διαχωρισμού. 5% 7,5% 10% 17,5% 73

Υλικά και Μέθοδοι ddh 2 O 8,4ml 7,15 ml 5,9 ml 2,15 ml 30%ακρυλαμίδιο 2,5 ml 3,75 ml 5 ml 8,75 ml 1,5Μ Τris ph 8.8 3,8 ml 3,8 ml 3,8 ml 3,8 ml 10% SDS 0,15 ml 0,15 ml 0,15 ml 0,15 ml 20% AMPS 0,15 ml 0,15 ml 0,15 ml 0,15 ml TEMED 0,006 ml 0,006 ml 0,006 ml 0,006 ml Πίνακας 2.8. Σύσταση πηκτώματος πακεταρίσματος. 3,5% 5% ddh 2 O 3,69 ml 3,4 ml 30%ακρυλαμίδιο 0,581 ml 0,83 ml 0,5Μ Τris ph 6.8 0,63 ml 0,63 ml 10% SDS 0,05 ml 0,05 ml 20% AMPS 0,05 ml 0,05 ml TEMED 0,005 ml 0,005 ml Χρώση πηκτώματος πολυακρυλαμιδίου Υλικά & Διαλύματα Διάλυμα χρωστικής Coomasie Brilliant Blue. 30% v/v Mεθανόλη. 10% v/v Oξικό οξύ. 0.5% w/v Coomasie R-250 Αποχρωστικό διάλυμα. 30% v/v Mεθανόλη. 10% v/v Oξικό οξύ 74

Υλικά και Μέθοδοι Διαδικασία Εμβάπτιση του πηκτώματος σε διάλυμα χρωστικής Coomasie, μέχρι να πραγματοποιηθεί πλήρης χρώση του πηκτώματος (περίπου 90 λεπτά), υπό συνεχή και ήπια ανακίνηση. Αποχρωματισμός του πηκτώματος με επώαση υπό ανακίνηση σε αποχρωστικό διάλυμα. Το διάλυμα ανανεώνεται σε τακτά χρονικά διαστήματα, μέχρις ότου να μην υπάρχει μη ειδική χρώση στο πήκτωμα. Διατήρηση του πηκτώματος σε διάλυμα οξικού οξέος μέχρι να φωτογραφηθεί. Ανάλυση κατά Western Με την ανάλυση Western, μπορούμε να πιστοποιήσουμε την ύπαρξη μιας οποιασδήποτε πρωτεΐνης, αρκεί να έχουμε αντισώματα έναντι αυτής. Αρχικά το δείγμα αναλύεται σε SDS-PAGE και ακολουθεί μεταφορά, κατά την οποία οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες μεταφέρονται από το πήκτωμα της ηλεκτροφόρησης σε ειδική μεμβράνη (PVDF) υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Οι μεμβράνες αυτές έχουν την ικανότητα να προσροφούν τις πρωτεΐνες, οι οποίες δεσμεύονται ισχυρά, κυρίως με υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. Μετά από την κάλυψη των κενών θέσεων της μεμβράνης (blocking) πραγματοποιείται επώαση της μεμβράνης με ειδικό έναντι του υπό μελέτη αντιγόνου αντίσωμα. Στη συνέχεια, η μεμβράνη επωάζεται με αντίσωμα που αναγνωρίζει την Fc περιοχή του πρώτου αντισώματος. Το δεύτερο αντίσωμα είναι σεσημασμένο με ένζυμο, οπότε είναι δυνατή η ανίχνευση του συμπλόκου αντιγόνου-αντισώματος μετά από την προσθήκη κατάλληλου υποστρώματος και μεθόδου ανίχνευσης (χημειοφωταύγεια). Υλικά & Διαλύματα Ρυθμιστικό διάλυμα για τη συσκευή μεταφοράς πρωτεϊνών (10Χ) 75

Υλικά και Μέθοδοι. 400 mm Γλυκίνη. 500 mm Tris-base. 0,37% w/v SDS Το διάλυμα διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου και αραιώνεται πριν από τη χρήση του με αναλογία ρυθμιστικού διαλύματος:dη 2 Ο:μεθανόλη ίση με 1:7:2. Ρυθμιστικό διάλυμα TBS ph 7,6 (10Χ). 200 mm Tris-base. 1,36 Μ NaCl Μεμβράνη PVDF (polyvinylidene fluoride) Αποβουτυρομένο γάλα σε σκόνη (Regilait) Bovine Serum Albumin Ρυθμιστικό διάλυμα TBS 0.1% Tween- 20 ph 7,6 (ΤΒS-T) Σύστημα Χημειοφωταύγειας Διαδικασία Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφορητικής ανάλυσης, γίνεται τοποθέτηση του πηκτώματος διαχωρισμού σε κατάλληλη συσκευή, για μεταφορά των πρωτεϊνών από το πήκτωμα, σε μεμβράνη PVDF. Εφαρμογή σταθερής ένταση ρεύματος 400 ma για 4 h. Τα δείγματα μεταφέρονται από τον αρνητικό στο θετικό πόλο. Επώαση της μεμβράνης με διάλυμα δέσμευσης, προκειμένου να παρεμποδιστεί η μη ειδική δέσμευση των αντισωμάτων. Ξέπλυμα της μεμβράνης 3 φορές για 5 min με διάλυμα TBS-T σε θερμοκρασία δωματίου. Επώαση της μεμβράνης σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει το πρώτο αντίσωμα σε συνθήκες που φαίνονται στον Πίνακα 2.9. Ξέπλυμα της μεμβράνης 3 φορές για 5 min με διάλυμα TBS-T σε θερμοκρασία δωματίου. Επώαση της μεμβράνης σε ρυθμιστικό διάλυμα 2 ου αντισώματος, που περιέχει το δεύτερο αντίσωμα, σε συνθήκες που φαίνονται στον Πίνακα 2.9. Ξέπλυμα της μεμβράνης 3 φορές για 5 min με διάλυμα TBS-T σε 76

Υλικά και Μέθοδοι θερμοκρασία δωματίου και ξέπλυμα 1 φορά για 5 λεπτά με TBS. Εμφάνιση του ανοσοστυπώματος της πρωτεΐνης στη μεμβράνη με σύστημα χημειοφωταύγειας. Πίνακας 2.9: Συνθήκες των αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν στα ανοσοστυπώματα που πραγματοποιήθηκαν ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ Δέσμευση Συνθήκες 1 ου Ab Ρυθμιστικό δ/μα 1 ου Ab Συνθήκες 2 ου Ab...RPTPβ/ζ 5% γάλα TBS-T 1h 37 0 C 1:500 O/N 4 0 C TBS-T Anti-rat 1:10000 1h 37 0 C...HSC70 (K-19) 5% γάλα TBS-T 1h 37 0 C 1:1000 O/N 4 0 C 3% γάλα TBS-T Anti-rabbit 1:5000 1h 37 0 C...HARP...5% γάλα...tbs-t 1h 37 0 C 1:1000 O/N 4 0 C 3% γάλα TBS-T...Anti-goat 1:10000 1h 37 0 C...ALK...5% γάλα...tbs-t 1h 37 0 C 1:1000 O/N 4 0 C 3% γάλα TBS-T...Anti-rabbit...1:5000 1h 37 0 C...phospho ALK... 5% γάλα......tbs-t 1h 37 0 C 1:1000 O/N 4 0 C 3% γάλα TBS-T...Anti-rabbit...1:5000 1h 37 0 C...GST...5% γάλα...tbs-t 1h 37 0 C 1:1000 O/N 4 0 C 3% γάλα TBS-T...Anti-goat 1:10000 1h 37 0 C 77

Υλικά και Μέθοδοι...PY...5% BSA...TBS-T 1h 37 0 C 1:5000 O/N 4 0 C 1% BSA TBS-T...Anti-mouse 1:10000 1h 37 0 C Εμφάνιση ανοσοστυπωμάτων Προκειμένου να καταστεί ορατό το σύμπλοκο πολυπεπτιδικής αλυσίδαςπρώτου-δεύτερου αντισώματος με συζευγμένη υπεροξειδάση, η μεμβράνη επωάζεται με ένα κατάλληλο υπόστρωμα της υπεροξειδάσης το οποίο παράγει φως (σύστημα χημειοφωταύγειας). Τα σημεία στα οποία υπάρχει το σύμπλοκο, ανιχνεύονται με έκθεση της μεμβράνης σε φωτοευαίσθητο φιλμ Kodak RX-OMat. Το παραγόμενο με χειμειοφωταύγεια φως δρα τοπικά στο φιλμ, το οποίο στη συνέχεια εμφανίζεται και σταθεροποιείται (εμφάνιση και στερέωση του φιλμ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Kodak, USA). Το σύστημα της ενισχυμένης χηµειοφωταύγειας (Enhanced Chemeluminescence ECL) χρησιμοποιήθηκε σύµφωνα µε της οδηγίες του κατασκευαστή. Ποσοτικοποίηση ανοσοστυπωμάτων Μετά την ολοκλήρωση της εμφάνισης του ανοσοστυπόματος, το φιλμ ψηφιοποιήθηκε και η ψηφιακή εικόνα ποσοτικοποιήθηκε με χρήση του λογισμικού ανάλυσης εικόνας Scion image (Scion Corporation, USA). Για την κάθε ζώνη υπολογίστηκε το συνολικό εμβαδόν και ένταση. Τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν, ώστε να παρουσιάζονται τιμές που αντιπροσωπεύουν τελικά ανάλυση ίσων ποσοτήτων πρωτεϊνών. 78

Υλικά και Μέθοδοι Αποδέσμευση αντισωμάτων και επαναχρησιμοποίηση ανοσοστυπωμάτων Η ανάπτυξη τεχνικών ανίχνευσης αντιγόνων σε ανοσοστυπώματα που βασίζονται στη μέθοδο της χημειφωταύγειας, παρέχει τη δυνατότητα επαναχρησιμοποίησης των μεμβρανών. Είναι λοιπόν δυνατή για ανίχνευση πρωτεϊνών με διαφορετικά αντισώματα, καθώς δεν έχει πραγματοποιηθεί αλλοίωση της μεμβράνης αλλά και των μεταφερομένων σε αυτήν πρωτεϊνών. Κατά τη διαδικασία της αποδέσμευσης των αντισωμάτων (stripping) η μεμβράνη επωάζεται σε ζέον ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει αποδιατακτικούς παράγοντες (SDS, β- μερκαπτοαιθανόλη). Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η διάσπαση του συμπλόκου αντιγόνου-αντισώματος και η απελευθέρωση των αντισωμάτων από την μεμβράνη. Οι μοναδικές πρωτεΐνες που παραμένουν δεσμευμένες στη μεμβράνη είναι εκείνες οι οποίες είναι δεσμευμένες ισχυρά σ αυτήν λόγω των υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων κατά την ηλεκτρομεταφορά τους. Στη συνέχεια, η μεμβράνη ξεπλένεται εξαντλητικά προκειμένου να απομακρυνθούν οι αποδιατακτικοί παράγοντες, πραγματοποιείται εκ νέου κορεσμός των θέσεων δέσμευσης της μεμβράνης και επώαση με τα επιθυμητά αντισώματα. Υλικά & Διαλύματα Διάλυμα αποδέσμευσης αντισωμάτων. 62,5 mm Tris-HCl ph 6.8. 20 % w/v SDS. 100 mm β-μερκαπτοαιθανόλη Διαδικασία Ξέπλυμα της μεμβράνης 3 φορές για 5 min με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-Τ. Επώαση της μεμβράνης για 30 min στους 56 0 C, με το διάλυμα αποδέσμευσης του αντισώματος. Ξέπλυμα της μεμβράνης 8 φορές με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-Τ. Επώαση της μεμβράνης με ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης. 79

Υλικά και Μέθοδοι Απομόνωση ολικού RNA από κύτταρα Για την απομόνωση RNA έχει αναπτυχθεί μια πληθώρα από διαφορετικές τεχνικές. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε ολοκληρωμένο σύστημα (kit) απομόνωσης RNA της Macherey-Nagel (NucleoSpin RNA II), με το οποίο η απομόνωση του RNA πραγματοποιείται εύκολα και σε σύντομο χρονικό διάστημα, με προσρόφηση των νουκλεικών οξέων σε ειδικές στήλες χρωματογραφίας. Το σύστημα αυτό επιτρέπει επίσης την απομόνωση του RNA σε θερμοκρασία δωματίου, γεγονός που καθιστά τη διαδικασία πιο γρήγορη. Λόγω της ιδιαίτερης ευαισθησίας του RNA σε νουκλεάσες που μπορούν να το πέψουν, οι κινήσεις πρέπει να είναι ιδιαίτερα προσεκτικές και τα διαλύματα και τα υλικά που χρησιμοποιούνται σε όλα τα στάδια της απομόνωσης και χειρισμού του δείγματος γενικότερα, πρέπει να είναι αποστειρωμένα και απαλλαγμένα από RNAάσες. Διαδικασία Καλλιέργεια κυττάρων σε τρυβλία κυτταρικής καλλιέργειας ή σε μικροπλακίδια πολλαπλών μικροκυψελίδων, μέχρι την τελική επιθυμητή συγκέντρωση κυττάρων ανά cm 2. Αφαίρεση του θρεπτικού υλικού των κυττάρων υπό κενό. Έκπλυση των κυττάρων 2 φορές με PBS. Προσθήκη διαλύματος τρυψίνης. Ο όγκος του διαλύματος τρυψίνης που προστίθεται εξαρτάται από τη συνολική επιφάνεια του τρυβλίου ή της μικροκυψελίδας στο οποίο περιέχονται τα κύτταρα τα οποία επιθυμούμε να συλλέξουμε. Επώαση των κυττάρων με το διάλυμα τρυψίνης στους 37 0 C για περίπου 1-3 λεπτά. Αναστολή της δράσης της τρυψίνης με ίσο όγκο θρεπτικού μέσου καλλιέργειας των κυττάρων το οποίο περιέχει ορό. Μεταφορά των κυττάρων σε σωληνάριο eppendorf του 1,5 ml ή σωληνάριο των 15 ml (εξαρτάται από τον όγκο της τρυψίνης που απαιτείται για την 80

Υλικά και Μέθοδοι αποκόλληση των κυττάρων από το στερεό τους υπόστρωμα και επομένως από το συνολικό όγκο στον οποίο έχουν συλλεχθεί τα κύτταρα). Συλλογή των κυττάρων με φυγοκέντρηση (1.000 g, 1 min). Απόρριψη του υπερκειμένου θρεπτικού μέσου και ταχεία ψύξη των κυττάρων (ίζημα) με την εμβάπτισή τους άμεσα σε υγρό άζωτο. Διατήρηση του ιζήματος των κυττάρων στους -80 0 C μέχρι να χρησιμοποιηθεί. Λύση των κυττάρων με 350 μl διαλύματος λύσης το οποίο περιέχει β- μερκαπτοαιθανόλη και ομογενοποίηση του δείγματος με έντονη ανάδευση. Μεταφορά του ομογενοποιήματος των κυττάρων σε στήλη με φίλτρο και συλλογή του διαλύματος των νουκλεϊκών οξέων με φυγοκέντρηση (11.000 g, 1 min). Απόρριψη της στήλης και προσθήκη 350 μl αιθανόλης (70% v/v) στο διάλυμα που έχει συλλεχθεί. Ανάμιξη με ήπια ανάδευση. Μεταφορά του διαλύματος (~700 μl) σε νέα στήλη και φυγοκέντρηση (11.000 g, 30 sec). Σε αυτό το στάδιο τα νουκλεϊκά οξέα προσροφούνται στη στήλη και οι πρωτεϊνες διέρχονται από τη στήλη και συλλέγονται σε σωληνάριο eppendorf. Αφαλάτωση της στήλης-φίλτρου στο οποίο περιέχονται τα νουκλεϊκά οξέα με τη προσθήκη 350 μl διαλύματος αφαλάτωσης (membrane desαlting solution) και φυγοκέντρηση (11.000 g, 1 min). Προσθήκη στην επιφάνεια του φίλτρου διαλύματος DNάσης και επώαση του φίλτρου σε αυτό το διάλυμα για 15 min. Αναστολή της DNάσης με την προσθήκη 200 μl διαλύματος αναστολής της στην επιφάνεια του φίλτρου. Φυγοκέντρηση (11.000 g, 30 sec) και μεταφορά του φίλτρου σε νέο σωληνάριο eppendorf. Προσθήκη 600 μl διαλύματος έκλουσης του DNA (RA3). Φυγοκέντρηση (11.000 g, 30 sec), απόρριψη του εκλούματος και προσθήκη στην επιφάνεια του φίλτρου εκ νέου 350 μl από διάλυμα έκλουσης του DNA. Φυγοκέντρηση (11.000 g, 2 min) και μεταφορά του φίλτρου σε νέο σωληνάριο eppendorf. 81

Υλικά και Μέθοδοι Έκλουση του RNA με προσθήκη 60 μl H 2 O το οποίο είναι απαλλαγμένο από RNAάσες στην επιφάνεια του φίλτρου και φυγοκέντρηση (11.000 g, 1 min). Διατήρηση του RNA στους -80 0 C μέχρι να χρησιμοποιηθεί. Προσδιορισμός της συγκέντρωσης του RNA Στο διάλυμα ολικού RNA, προκειμένου να χρησιμοποιηθεί για περαιτέρω αναλύσεις, πραγματοποιείται προσδιορισμός της συγκέντρωσης και καθαρότητας του RNA με φασματοφωτομετρική μέθοδο. Διαδικασία Αραίωση μέρους του διαλύματος ολικού RNA με mqh 2 Ο. Μεταφορά του διαλύματος σε κυψελίδα φωτόμετρου κατασκευασμένη από χαλαζία. Σε δεύτερη κυψελίδα τοποθετείται mqh 2 Ο, που χρησιμοποιείται ως τυφλό για το μηδενισμό του φωτομέτρου. Φωτομέτρηση του δείγματος σε δύο διαφορετικά μήκη κύματος, στα 260nm που απορροφούν τα νουκλεϊκά οξέα και στα 280nm που απορροφούν οι πρωτεΐνες. Υπολογισμός της συγκέντρωσης του RNA από τον εξής τύπο:...συγκέντρωση RNA=O.D. 260nm x 40 x αραίωση Η συγκέντρωση δίνεται σε ng/μl. Ο συντελεστής 40 προέρχεται από το γεγονός ότι ένα διάλυμα RNA συγκέντρωσης 40 ng/μl έχει στα 260nm απορρόφηση 1. Ο λόγος της οπτικής απορρόφησης στα 260nm ως προς την οπτική απορρόφηση στα 280nm αποτελεί δείγμα της καθαρότητας του δείγματος. Αν ο λόγος αυτός είναι μικρότερος του 1,8 τότε η περιεκτικότητα του δείγματος σε πρωτεΐνες είναι υψηλή και μπορεί να προκαλέσει προβλήματα στις περαιτέρω αναλύσεις. 82

Υλικά και Μέθοδοι Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης Προκειμένου να ελεγχθεί η ποιότητα του διαλύματος ολικού RNA, πραγματοποιείται ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Η ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα αγαρόζης είναι η κύρια μέθοδος που χρησιμοποιείται για την ανάλυση των νουκλεϊκών οξέων. Στα πηκτώματα αγαρόζης, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα γραμμικών μορίων έχει βρεθεί ότι είναι αντιστρόφως ανάλογη του λογαρίθμου του μοριακού τους βάρους. Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα εξαρτάται επίσης και από τη συγκέντρωση της αγαρόζης στο πήκτωμα. Υλικά & Διαλύματα 5Χ TBE. 225 mm Tris-Borate. 5 mm EDTA ph 8.0 Βρωμιούχο αιθίδιο 10 mg/ml (Το διάλυμα φυλάσσεται στους 40C στο σκοτάδι και ο χειρισμός του γίνεται με προσοχή γιατί είναι ισχυρό μεταλλαξιγόνο). 2Χ Διάλυμα δειγμάτων RNA. 20% Φυκόλη. 0,3% Μπλε της βρωμοφαινόλης. 0,3% Μπλε του ξυλενίου Διαδικασία Διαμόρφωση κατάλληλης μήτρας, διαστάσεων 13 Χ 11,5 cm. Προσθήκη της κατάλληλης ποσότητας αγαρόζης σε 40 ml διαλύματος ηλεκτροφόρησης 0,5Χ ΤΒΕ. Διάλυση της αγαρόζης, με θέρμανση. 83

Υλικά και Μέθοδοι Ψύξη του διαλύματος αγαρόζης αργά σε θερμοκρασία 50-60 0 C και προσθήκη σε αυτό διαλύματος βρωμιούχου αιθιδίου σε τελική συγκέντρωση 0,5 μg/ml. Στερεοποίηση του διαλύματος στη μήτρα. Προσθήκη στα δείγματα του RNA διαλύματος δειγμάτων 6Χ. Προσθήκη των δειγμάτων στα κατάλληλα διαμορφωμένα φρεάτια της μήτρας. Ανάλυση των δειγμάτων σε οριζόντια συσκευή ηλεκτροφόρησης υπό σταθερή τάση ρεύματος 60 V. Ανάλυση της έκφρασης γονιδίων με τη χρήση συνδυασμένης αντίστροφης μεταγραφής και αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-PCR). Για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης, έχει αναπτυχθεί μία πλειάδα τεχνικών, όπως είναι η ανάλυση κατά Southern, η in situ υβριδοποίηση και η χρήση συνδυασμένης αντίστροφης μεταγραφής και αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-PCR). Η RT-PCR αποτελεί την μέθοδο εκλογής σε πολλές περιπτώσεις σήμερα, καθώς: α) παρουσιάζει υψηλή ευαισθησία, β) είναι αρκετά απλή και γρήγορη στην εφαρμογή της και γ) σε αντίθεση με άλλες τεχνικές δεν απαιτεί την χρήση ραδιοϊσοτόπων για την εφαρμογή της. Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στη χρησιμοποίηση ειδικών εναρκτήριων αλληλουχιών για το γονίδιο του οποίου θέλουμε να μελετήσουμε την έκφραση, ώστε από το mrna του να δημιουργηθεί το συμπληρωματικό του DNA (cdna) με τη βοήθεια κατάλληλων ενζύμων. Το τμήμα του δίκλωνου DNA που δημιουργείται ενισχύεται στην συνέχεια με την τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και αναλύεται κατάλληλα. Στην εργασία αυτή για την ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων με την τεχνική RT-PCR χρησιμοποιήθηκε το ολοκληρωμένο σύστημα αντιδραστηρίων (kit) OneStep RT-PCR της εταιρίας QIAGEN. Υλικά & Διαλύματα Ρυθμιστικό διάλυμα 5X 84

Υλικά και Μέθοδοι Διάλυμα νουκλεοτιδίων (10 mm για κάθε αλληλουχία) Νοηματική (sence) εναρκτήρια αλληλουχία Aντινοηματική (antisence) εναρκτήρια αλληλουχία Enzyme Mix Rnase free H 2 O Διαδικασία Χρησιμοποίηση 250 ng ολικού RNA για την πραγματοποίηση κάθε αντίδρασης RT-PCR. Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιούνται σε τελικό όγκο 25 μl. Ανάμιξη σε σωληνάριο κατάλληλο για την πραγματοποίηση αντιδράσεων PCR, των αντιδραστηρίων με τη σειρά και τις ποσότητες που αναγράφονται στον πίνακα 2.10. Οι εναρκτήριες αλληλουχίες που χρησιμοποιήθηκαν φαίνονται στον πίνακα Μ11. Μεταφορά των σωληναρίων σε μηχάνημα εκτέλεσης αντιδράσεων PCR (PCR cycler). Επώαση των δειγμάτων στους 50 0 C για 30 min προκειμένου να πραγματοποιηθεί η αντίστροφη μεταγραφή και η παραγωγή μονόκλωνου cdna. Επώαση των δειγμάτων στους 95 0 C για 15 min προκειμένου να πραγματοποιηθεί να απενεργοποιηθεί η αντίστροφη μεταγραφάση, να ενεργοποιηθεί η HotStarTaq Dna πολυμεράση και να αποδιαταχθεί το cdna με τη μήτρα του. Ακολουθεί η σύνθεση της δεύτερης αλυσίδας cdna και η επέκτασή του. Τα δείγματα επωάζονται στους 94 0 C για 1 min προκειμένου να πραγματοποιηθεί η αποδιάταξη των δίκλωνων μορίων. Στη συνέχεια τα δείγματα επωάζονται σε κατάλληλη θερμοκρασία για 30 sec προκειμένου να πραγματοποιηθεί η επανασύνδεση των εναρκτήριων αλληλουχιών με το συμπληρωματικό τμήμα του cdna. Τέλος, τα δείγματα επωάζονται στους 72 0 C για 1 min προκειμένου να πραγματοποιηθεί ο πολυμερισμός και η επιμήκυνση των εναρκτήριων 85

Υλικά και Μέθοδοι αλληλουχιών. Οι συνθήκες των αντιδράσεων που χρησιμοποιήθηκαν για RPTPβ/ζ και την GAPDH φαίνονται στον πίνακα 2.11. Επώαση των δειγμάτων στους 72 0 C για 10 min προκειμένου να πραγματοποιηθεί η τελική επιμήκυνση τυχόν ημιτελών τμημάτων. Πίνακας 2.10. Ποσότητες των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται για την πραγματοποίηση των αντιδράσεων RT-PCR. Αντιδραστήρια Όγκος Τελική συγκέντρωση Rnase free H 2 O μέχρι τελικού όγκου 25 μl Χ μl Ρυθμιστικό διάλυμα 5X 5 μl 1Χ Διάλυμα νουκλεοτιδίων (10 mm έκαστο) 1 μl 400 μm Νοηματική εναρκτήρια αλληλουχία 25 pmol 0,6 μμ Aντινοηματική εναρκτήρια αλληλουχία 25 pmol 0,6 μμ Enzyme mix 1 μl 0,1 u/μl 250 ng RNA Υ μl Τελικός όγκος 25 μl Πίνακας 2.11. Αλληλουχία και χαρακτηριστικά των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν κατά τις αντιδράσεις Rt-PCR που πραγματοποιήθηκαν. Αλληλουχία T m Αριθμός κύκλων Μέγεθος προϊόντος RPTPβ/ζ 5 -TTCTGTGCTCTGACAACCCTTA-3 RPTPβ/ζ 5 -AGGAAGAGGAAAACAATGCTCA-3 62 0 C 34 301bp GAPDH GAPDH 5 -CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3 5 -TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3 58 0 C 22 1101 bp Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων Τα αποτελέσματα προέρχονται από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα μεταξύ τους πειράματα, εκτελεσμένα εις τριπλούν. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του unpaired t-test. Οι συγκρίσεις (μέση τιμή ± 86

Υλικά και Μέθοδοι σταθερό σφάλμα) έγιναν μεταξύ της κάθε πειραματικής ομάδας και το αντίστοιχου μάρτυρα. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001. 87

Υλικά και Μέθοδοι 88

Αποτελέσματα ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Απομόνωση και καθαρισμός HARP ευκαρυωτικής προέλευσης Η HARP, όπως ήδη έχει αναφερθεί, αποτελείται από μία αμινοτελική, μία καρβοξυτελική και δύο κεντρικές περιοχές. Κάθε κεντρική περιοχή συγκροτείται από τρεις αντιπαράλληλες β-πτυχωτές επιφάνειες που συνδέονται με δισουλφιδικούς δεσμούς, οι οποίοι συμβάλλουν στη σταθερότητα του μορίου της HARP. Στη δημιουργία των συνολικά πέντε δισουλφιδικών δεσμών συμμετέχουν δέκα κυστεΐνες. Έρευνες έχουν δείξει ότι στην ύπαρξη αυτών των δέκα κυστεϊνών οφείλεται η δυσκολία απομόνωσης ανασυνδυασμένης HARP από προκαρυωτικά συστήματα, με κατάλληλη τριτοταγή δομή και πλήρη βιολογική δράση (Kuo et al.,1992), εξαιτίας της απουσίας των μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων στους προκαρυωτικούς οργανισμούς. Ωστόσο, σύμφωνα με παρατηρήσεις από την ερευνητική μας ομάδα, η ανασυνδυασμένη HARP προκαρυωτικής προέλευσης είναι βιολογικά ενεργή και επηρεάζει την ενεργότητα μορίων μεταγωγής σήματος (Diamantopoulou et al., 2012) Στην παρούσα εργασία, με σκοπό να ελεγθεί το εάν η ανασυνδυασμένη HARP ευκαρυωτικής προέλευσης παρουσιάζει διαφορετικές βιολογικές δράσεις σε σχέση με τη HARP που έχει παραχθεί σε προκαρυωτικά κύτταρα, πραγματοποιήθηκε απομόνωση και καθαρισμός HARP από το υπερκείμενο θρεπτικό μέσω NIH3T3 ινοβλαστών που είχαν διαμολυνθεί με το cdnaτης HARP. Σε κύτταρα NIH3T3 (κλώνος HMH-C9) πραγματοποιήθηκε σταθερή διαμόλυνση με πλασμίδιο pcdna3 (Invitrogen) το οποίο έφερε την αλληλουχία του cdna της HARP (pcdna3-harp). Αρχικά τα κύτταρα HMH-C9 καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία κυτταροκαλλιέργειας 600 cm 2 και η πρωτεΐνη απομονώθηκε από το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο (95 ml ανά τρυβλίο) ως εξής: Ύστερα από συλλογή του θρεπτικού μέσου ακολούθησε χρωματογραφία συγγένειας με την ηπαρίνη (heparinsepharose). Κατά το στάδιο αυτό το πρωτεϊνικό κλάσμα εμπλουτίστηκε στις πρωτεΐνες που έχουν συγγένεια με την ηπαρίνη. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής (σε στήλη mono-s, βλ. «Υλικά & Μέθοδοι») και η έκλουση της HARP πραγματοποιήθηκε σε συγκέντρωση άλατος 0,8-1,2 Μ. 89

Αποτελέσματα Στην Εικόνα 3.1(Β) παρουσιάζεται το χρωματογράφημα που προέκυψε κατά την απομόνωση της HARP, όπου διακρίνονται τα κλάσματα έκλουσης από τη στήλη ιοντοανταλλαγής. Ακολούθως, τα κλάσματα που απομονώθηκαν από τη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) και εξετάστηκε το περιεχόμενό τους σε πρωτεΐνη μετά από ανάλυση κατά Western. Στην Εικόνα 3.1(Α) παρουσιάζεται το αποτέλεσμα αυτής της ανάλυσης. Όπως φαίνεται στην εικόνα, το μοριακό βάρος της πρωτεΐνης HARP που έχει απομονωθεί είναι μεγαλύτερο των 15 kda, υποθέτουμε λοιπόν ότι πρόκειται για τη μορφή που φέρει τα τρία επιπλέον αμινοξέα στο αμινοτελικό άκρο. Η HARP που απομονώθηκε με τη διαδικασία αυτή χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια προκειμένου να διερευνηθεί η επίδρασή της σε λειτουργίες των κυττάρων PC3, αλλά και να διευκρινιστεί το εάν υπάρχει κάποια ουσιαστική διαφορά στις βιολογικές δράσεις που ασκεί η HARP ανάλογα με το σύστημα από το οποίο έχει παραχθεί (προκαρυωτικής/ευκαρυωτικής προέλευσης). Εικόνα 3.1: (Α) Χρωματογράφημα που προέκυψε ύστερα από την απομόνωση της HARP με τη χρήση χρωματογραφίας ιοντοανταλλαγής. Η έκλουση 90

Αποτελέσματα πραγματοποιήθηκε με κλίση συγκέντρωσης NaCl. Όπως φαίνεται και από το χρωματογράφημα, η HARP απομονώνεται σε ένα εύρος συγκεντρώσεων NaCl 0,8-1,2 Μ, εξ αιτίας της ύπαρξης στο μόριο αρκετών περιοχών μέσω των οποίων μπορεί να αλληλεπιδράσει με διαφορετική ισχύ με τη ρητίνη. (Β) Ανάλυση κατά Western κλασμάτων της χρωματογραφίας mono-s από την απομόνωση της HARP. Οι αριθμοί αντιστοιχούν στα εκλουόμενα κλάσματα της χρωματογραφίας. Για την ταυτοποίηση του μορίου χρησιμοποιήθηκαν ειδικά αντισώματα έναντι της HARP. Ταυτοποίηση της μορφής του υποδοχέα ALK που φωσφορυλιώνεται Όπως έχει ήδη αναφερθεί, ο υποδοχέας ALK είναι μία διαμεμβρανική πρωτεΐνη με δράση κινάσης τυροσίνης που ενεργοποιείται μέσω αυτοφωσφορυλίωσης ύστερα από διμερισμό του υποδοχέα. Δύο μορφές του ALK έχουν εντοπιστεί, 220 kda και 140 kda, με τη δεύτερη να προκύπτει μέσω της πρώτης ύστερα από πρωτεόλυση (Moog-Lutz et al., 2005). Προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση του αυξητικού παράγοντα HARP στην φωσφορυλίωση του υποδοχέα ALK, ελέγχθηκαν αρχικά τα ποσοστά φωσφορυλίωσης που υφίστανται οι επιμέρους περιοχές του. Κύτταρα PC3 καλλιεργήθηκαν μέχρι να καλύψουν το 80% της επιφάνειας του τρυβλίου κυτταροκαλλιέργειας, ακολούθησε λύση με διάλυμα λύσης (βλ. «Υλικά & Μέθοδοι») και εκχύλιση των ολικών πρωτεϊνών. Σε 400 μg του ολικού ακατέργαστου πρωτεϊνικού εκχυλίσματος πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση με πολυκλωνικό αντίσωμα ένατι του ALK. Στη συνέχεια τα ανοσοϊζήματα αναλύθηκαν ηλεκτροφορητικά σε 5% SDS-PAGE και μετά από ανάλυση κατά Western ανιχνεύθηκε η ύπαρξη του υποδοχέα στη μη φωσφορυλιωμένη του μορφή, αλλά και στην ενεργή φωσφορυλιωμένη του μορφή, χρησιμοποιώντας ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του φωσφορυλιωμένου ALK ή πολυκλωνικά αντισώματα έναντι φωσφορυλιωμένων τυροσινών. Στην εικόνα 3.2 (Δ) παρουσιάζονται τα διάφορα θραύσματα που προκύπτουν ύστερα από πρωτεόλυση του ALK (180, 220, 120 και 140 kda). Αντιθέτως, όπως φαίνεται στην εικόνα 3.2 (Α,Β,Γ), το κλάσμα του υποδοχέα ALK που φωσφορυλιώθηκε αντιστοιχεί σε πρωτεΐνη μοριακού βάρους 140 kda, αποτέλεσμα 91

Αποτελέσματα που προέκυψε χρησιμοποιώντας μονοκλωνικό (phosphoalk Y1096) αλλά και πολυκλωνικά αντισώματα έναντι φωσφορυλιωμένων τυροσινών (phosphoalk Y1064, PY20). Τα παραπάνω αποτελέσματα οδηγούν στο συμπέρασμα ότι το κλάσμα του ALK που υφίσταται φωσφορυλίωση στα PC3 κύτταρα αντιπροσωπεύεται από την πρωτεΐνη με μοριακό βάρος 140 kda. Εικόνα 3.2: Ταυτοποίηση της μορφής του υποδοχέα ALK που φωσφορυλιώνεται. Σε πρωτεϊνικά εκσχυλίσματα PC3 κυττάρων πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση με πολυκλωνικά αντισώματα έναντι του ALK. Ακολούθησε ανάλυση κατά Western χρησιμοποιώντας (A) μονοκλωνικό αντίσωμα anti (phosphoalk Y1096) και (Β) πολυκλωνικό αντίσωμα anti (phosphoalk 1064) έναντι του φωσφορυλιωμένου ALK, (Γ) πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι φωσφορυλιωμένων τυροσινών (PY 1020), (Δ) πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι του ALK. Παροδική μείωση της έκφρασης του υποδοχέα RPTPβ/ζ στα PC3 κύτταρα με χρήση sirna Ο αυξητικός παράγοντας HARP ασκεί τις βιολογικές του δράσεις δεσμευόμενος στους διαμεμβρανικούς του υποδοχείς. Οι μέχρι σήμερα χαρακτηρισμένοι υποδοχείς της HARP είναι ο RPTPβ/ζ, ο ALK και η Συνδεκάνη-3. Όπως ήδη έχει αναφερθεί, παρά την ταυτοποίηση του ALK ως λειτουργικού 92

Αποτελέσματα υποδοχέα της HARP, αρκετές είναι οι αναφορές που αντικρούουν το αποτέλεσμα αυτό, υποστηρίζοντας ότι η μια μόνο από τις δυο μορφές της HARP που έχουν προσδιοριστεί προσδένεται στον ALK (Lu et al., 2005). Πρόσφατα προτάθηκε ένα μοντέλο έμμεσης αλληλεπίδρασης του υποδοχέα ALK με τη HARP, σύμφωνα με το οποίο ο ALK δεν αλληλεπιδρά άμεσα με την HARP, αλλά τα βασικά επίπεδα φωσφορυλίωσης και η ενεργοποίησή του ρυθμίζονται από το μoνοπάτι μεταγωγής σήματος που διεγείρει η πρόσδεση της HARP στον RPTPβ/ζ. Σύμφωνα με το μοντέλο αυτό, σε κύτταρα που έχουν διεγερθεί με HARP, ο RPTPβ/ζ απενεργοποιείται και δεν αποφωσφορυλιώνει τις θέσεις αυτοφωσφορυλίωσης του ALK, με αποτέλεσμα την άμεση αύξηση της αυτοφωσφορυλίωσης του υποδοχέα και την ενεργοποίηση των βιολογικών δράσεων της HARP (Perez-Pinera et al., 2007). Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε ο ρόλος του υποδοχέα RPTPβ/ζ στην επαγόμενη από τη HARP φωσφορυλίωση του ALK. Ως μοντέλο μελέτης χρησιμοποιήθηκε η καρκινική κυτταρική σειρά PC3 που προέρχεται από μετάσταση καρκινικών κυττάρων ανθρώπινου προστάτη. Από προηγούμενες μελέτες είναι γνωστό το ότι τα PC3 κύτταρα εκφράζουν τους υποδοχείς RPTPβ/ζ και ALK, για το λόγο αυτό απετέλεσαν χρήσιμο μοντέλο μελέτης στη διερεύνηση της άμεσης ή έμμεσης (μέσω του RPTPβ/ζ) ενεργοποίησης του υποδοχέα ALK από τη HARP. Προκειμένου να διαλευκανθεί ο ρόλος του RPTPβ/ζ στην επαγόμενη από τη HARP ενεργοποίηση του ALK, πραγματοποιήθηκε μειωρύθμιση της συσσώρευσης του συγκεκριμένου υποδοχέα σε κύτταρα PC3. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκε η RNAi τεχνολογία. Σύμφωνα με αυτή, μικρά δίκλωνα μόρια RNA, τα sirnas, εισέρχονται στο εσωτερικό του κυττάρου με τη βοήθεια λιπόφιλων μορίων, με αποτέλεσμα τη μείωση της συσσώρευσής του συγκεκριμένου mrna-στόχου. Κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν με sirna έναντι του RPTPβ/ζ και μετά από 48 h επώασης, ακολούθησε απομόνωση του ολικού RNA των κυττάρων. Σε 250 ng από το ολικό RNA των κυττάρων πραγματοποιήθηκε RT-PCR με ειδικές εναρκτήριες αλληλουχίες έναντι του mrna του RPTPβ/ζ, τα προϊόντα της οποίας ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης (Εικόνα 3.3). Για την ομαλοποίηση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε RT-PCR με ειδικές εναρκτήριες αλληλουχίες ειδικά σχεδιασμένες έναντι του mrna της GAPDH. 93

Αποτελέσματα Εικόνα 3.3: Μειωρύθμιση της συσσώρευσης των μεταγράφων του RPTPβ/ζ σε PC3 κύτταρα. Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με sirna ειδικά σχεδιασμένο έναντι του συγκεκριμένου υποδοχέα και μετά την πάροδο 48 h απομονώθηκε το ολικό RNA τους. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε RT-PCR με εναρκτήριες αλληλουχίες ειδικά σχεδιασμένες έναντι του RPTPβ/ζ, τα προϊόντα των οποίων ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης. Χρησιμοποίηση κυττάρων που έχουν σταθερά μειωρυθμισμένα τα επίπεδα έκφρασης του RPTPβ/ζ Με σκοπό να μελετηθεί ο ρόλος του υποδοχέα RPTPβ/ζ στην ενεργοποίηση του ALK από τη HARP χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα PC3siRPTPβ/ζ, αλλά και κύτταρα PC3RM4. Τα τελευταία είναι κυτταρα σταθερά επιμολυνθέντα (stably transfected) με πλασμίδιο στο οποίο έχει κλωνοποιηθεί αλληλουχία για την παραγωγή shrna συμπληρωματικού του mrna του RPTPβ/ζ. Προκειμένου να ελέγξουμε σε επίπεδο πρωτεΐνης την καταστολή των επιπέδων έκφρασης του RPTPβ/ζ τόσο στα PC3siRPTPβ/ζ, όσο και στα PC3RM4 κύτταρα σε σχέση με τα φυσιολογικά, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν μέχρι να καλύψουν το 80% της επιφάνειας τρυβλίου και στη συνέχει λύθηκαν με διάλυμα λύσης. Ακολούθως τα δείγματα αναλύθηκαν ηλεκτροφορητικά σε 5% SDS-PAGE και μετά από ανάλυση κατά Western προσδιορίστηκαν τα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα RPTPβ/ζ. Όπως φαίνεται στην εικόνα 3.4, τα επίπεδα έκφρασης του RPTPβ/ζ είναι μειωμένα τόσο στα PC3siRPTPβ/ζ (~40%), όσο και στα PC3RM4 κύτταρα (~70%). 94

Αποτελέσματα Εικόνα 3.4: Έλεγχος καταστολής των επιπέδων έκφρασης του RPTPβ/ζ σε επίπεδο πρωτεΐνης στα PC3siRPTPβ/ζ και PC3RM4 κύτταρα σε σχέση με τα PC3. Κύτταρα PC3, PC3siRPTPβ/ζ, PC3RM4 καλλιεργήθηκαν μέχρι να καλύψουν το 80% της επιφάνειας του τρυβλίου, ακολούθησε λύση και 5% ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE. Μετά από κατά Western ανάλυση πιστοποιήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης του RPTPβ/ζ με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του RPTPβ/ζ. Η πρωτεΐνη HSC70 χρησιμοποιήθηκε ως πρωτεΐνη για την ομαλοποίηση των αποτελεσμάτων. Ο αυξητικός παράγοντας HARP επηρεάζει τη φωσφορυλίωση του υποδοχέα ALK Όπως έχει ήδη αναφερθεί, ο υποδοχέας ALK έχει ταυτοποιηθεί ως λειτουργικός υποδοχέας του αυξητικού παράγοντα HARP. Η δέσμευση της HARP στον ALK οδηγεί σε αντιαποπτωτική δράση όπως επίσης και στην ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού των MAPK κινασών σε NIH3T3 ινοβλάστες, με τελικό αποτέλεσμα τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Ορισμένα σηματοδοτικά μόρια που εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία είναι οι κινάσες PI3K και Src, αλλά και η PLC. (Wang et al., 1997; Stoica et al., 2001; Bowden et al., 2002; Powers et al., 2002). Προκειμένου να επιβεβαιωθεί η φωσφορυλίωση του ALK από τη HARP σε καρκινικά κύτταρα PC3 ανθρώπινου προστάτη ώστε να διαλευκανθεί η άμεση ή έμμεση αλληλεπίδρασή του με τη HARP, ακολουθήθηκε η εξής διαδκασία: Κύτταρα PC3 καλλιεργήθηκαν μέχρι να καλύψουν το 80% της επιφάνειας του τρυβλίου κυτταροκαλλιέργειας και στη συνέχεια το θρεπτικό τους μέσο ανανεώθηκε με νέο 95

Αποτελέσματα που δεν περιείχε ορό. Ακολούθησε επώαση των κυττάρων με 100 ng/ml HARP για 30 min. Στη συνέχεια τα κύτταρα λύθηκαν με διάλυμα λύσης και αφού προσδιορίστηκε η συγκέντρωσή τους με τη μέθοδο Bradford, πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση σε 400 μg από τις ολικές πρωτεΐνες κάθε δείγματος με πολυκλωνικά αντισώματα έναντι του ALK. Μετά από ηλεκτροφορητική ανάλυση των ανοσοϊζημάτων σε 7,5% SDS-PAGE και ανάλυση κατά Western με ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του φωσφορυλιωμένου ALK, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του υποδοχέα. Η πρωτεΐνη ALK χρησιμοποιήθηκε ως πρωτεΐνη για την ομαλοποίηση των αποτελεσμάτων. Όπως φαίνεται στην εικόνα 3.5, η HARP προκάλεσε μέσα σε 30 min την επαγωγή της φωσφορυλίωσης του ALK σε ποσοστό 200% με δοσοεξαρτώμενο και στατιστικά σημαντικό τρόπο. Εικόνα 3.5: Η HARP επάγει τη φωσφορυλίωση του υποδοχέα ALK. Κύτταρα επωάστηκαν για 30 min με 100 ng/ml HARP. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε λύση των κυττάρων και ανοσοκατακρήμνιση με πολυκλωνικά αντισώματα έναντι του ALK. Μετά από ηλεκτροφόρηση σε 7,5% SDS-PAGE και ανάλυση κατά Western, προσδιορίσθηκε η φωσφορυλίωση του υπδοχέα με ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της φωσφορυλιωμένης Υ1096. Ο ALK χρησιμοποιήθηκε ως πρωτεΐνη μάρτυρας. 96

Αποτελέσματα Στην εικόνα φαίνεται η επίδραση των 30 min, χρόνος που παρατηρήθηκε το μέγιστο της ενεργοποίησης. Τα αποτελέσματα είναι η μέση τιμή ± το τυπικό σφάλμα από τρία τουλάχιστον ανεξάρτητα πειράματα. * p<0.05 Επίδραση του υποδοχέα RPTPβ/ζ στην επαγόμενη από τη HARP φωσφορυλίωση του ALK Με σκοπό να διερευνηθεί ο ρόλος του υποδοχέα RPTPβ/ζ στην ενεργοποίηση του ALK από τη HARP, ελέγθηκε το ποσοστό φωσφορυλίωσης του ALK σε κύτταρα PC3 στα οποία είχε παροδικά μειωρυθμιστεί η συσώρευση μεταγράφων του RPTPβ/ζ (PC3siRPTPβ/ζ), καθώς επίσης σε κύτταρα PC3 (PC3RM4). Κύτταρα PC3siRPTPβ/ζ καθώς επίσης και PC3RM4 καλλιεργήθηκαν μέχρι να καλύψουν το 80% τρυβλίου κυτταροκαλλιέργειας και στη συνέχεια το θρεπτικό τους μέσο ανανεώθηκε με νέο που δεν περιείχε ορό. Ακολούθησε επώαση των κυττάρων με 100 ng/ml HARP για 30 min. Ακολούθως τα κύτταρα λύθηκαν με διάλυμα ομογενοποίησης και σε 400 μg από τις ολικές πρωτεΐνες κάθε δείγματος πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση με πολυκλωνικά αντισώματα έναντι του ALK. Μετά από ηλεκτροφορητική ανάλυση των ανοσοϊζημάτων σε 7,5% SDS- PAGE και ανάλυση κατά Western με ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του φωσφορυλιωμένου ALK, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του υποδοχέα. Η πρωτεΐνη ALK χρησιμοποιήθηκε ως πρωτεΐνη για την ομαλοποίηση των αποτελεσμάτων. Όπως φαίνεται στην εικόνα 3.6, σε κύτταρα με μειωμένη τη συσσώρευση του RPTPβ/ζ ο αυξητικός παράγοντας HARP δεν επηρέασε τη φωσφορυλίωση του υποδοχέα ALK, γεγονός που μας οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η παρουσία του RPTPβ/ζ διαμεσολαβεί τη φωσφορυλίωση του ALK από τη HARP. 97

Αποτελέσματα Εικόνα 3.6: Ο RPTPβ/ζ διαμεσολαβεί την επαγόμενη από τη HARP φωσφορυλίωση του υποδοχέα ALK. (Α) Κύτταρα PC3siRPTPβ/ζ και (Β) PC3RM4 επωάστηκαν για 30 min με με συγκέντρωση HARP 100 ng/ml και στη συνέχεια λύθηκαν 98

Αποτελέσματα και απομονώθηκε το ολικό εκχύλισμα πρωτεΐνών. Σε 400 μg πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση με πολυκλωνικά αντισώματα έναντι του ALK. Ύστερα από SDS-PAGE και ανάλυση κατά Western, προσδιορίστηκε η φωσφορυλίωση του υπδοχέα με ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της φωσφορυλιωμένης Υ1096. Ο ALK χρησιμοποιήθηκε ως πρωτεΐνη μάρτυρας. Στην εικόνα φαίνεται η επίδραση των 30 min, χρόνος που παρατηρήθηκε το μέγιστο της ενεργοποίησης. Τα αποτελέσματα είναι η μέση τιμή ± το τυπικό σφάλμα από τρία τουλάχιστον ανεξάρτητα πειράματα. Ταυτοποίηση των περιοχών του αυξητικού παράγοντα HARP που αλληλεπιδρούν με τον RPTPβ/ζ ή/και τον ALK Στο πλαίσιο μελέτης δομής/δράσης του αυξητικού παράγοντα HARP και στην προσπάθεια ανακάλυψης πεπτιδίων που παρουσιάζουν αντίθετες βιολογικές δράσεις με αυτές της HARP, έχουν συντεθεί διάφορες τροποποιημένες της μορφές, καθώς και διάφορα πεπτίδια. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν τρία πεπτίδια, P(9-110), P(9-59) και P(60-110) που αντιστοιχούν στην κεντρική περιοχή της HARP, αντιπροσωπεύοντας τις περιοχές του αυξητικού παράγοντα που σχηματίζουν β- πτυχωτές επιφάνειες και έχουν ομολογία με τις TSR περιοχές της θρομβοσπονδίνης τύπου 1. Μελέτες έχουν δείξει ότι τα παραπάνω πεπτίδια προκύπτουν ύστερα από πέψη της HARP με πλασμίνη και MMP-2, αναστέλλοντας τη μιτογόνο δράση του αυξητικού παράγοντα και επηρεάζοντας με διαφορετικό τρόπο την αγγειογένεση in vitro και in vivo (Dean et al., 2007, Polycratis et al., 2004). Τα παραπάνω πεπτίδια κατασκευάστηκαν ως πρωτεΐνες σύντηξης με την πρωτεΐνη τρανσφεράση της γλουταθειόνης (glutathione S-transferase, GST) (Polycratis et al., 2004) και χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα συγκατακρήμνισης με σφαιρίδια γλυταθειόνης, προκειμένου να διερευνηθεί η άμεση ή έμμεση (μέσω του RPTPβ/ζ) ενεργοποίηση του ALK από τη HARP. Στην εικόνα 3.6 απεικονίζονται οι πρωτεΐνες σύντηξης με GST που αντιπροσωπεύουν επιμέρους περιοχές της HARP. 99

Αποτελέσματα Εικόνα 3.7: Ανάλυση κατά Western των τροποποιημένων μορφών της HARP που χρησιμοποιήθηκαν. Απεικονίζονται σχηματικά τα πεπτίδια σύντηξης με την πρωτεΐνη τρανσφεράση της γλουταθειόνης (glutathione S-transferase, GST) που αντιπροσωπεύουν τα ενδεικνυόμενα τμήματα της HARP. Συγκριτικά απεικονίζεται η πρωτεΐνη HARP, καθώς και η πρωτεΐνη τρανσφεράση της γλουταθειόνης. Η ανάλυση κατά Western πραγτατοποιήθηκε με ειδικό πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της GST. Αρχικά, κύτταρα PC3 και PC3RM4 καλλιεργήθηκαν μέχρι να καλύψουν το 80% τρυβλίου κυτταροκαλλιέργειας και στη συνέχεια λύθηκαν με διάλυμα ομογενοποίησης. Ακολούθως σε 400 μg ολικών πρωτεϊνών από κάθε δείγμα πραγματοποιήθηκε επώαση με σφαιρίδια γλουταθειόνης και πεπτίδια σύντηξης με GST [P(9-110)-GST, P(9-59-GST), P(60-110)-GST]. Παράλληλα πραγματοποιήθηκε και επώαση ολικών πρωτεϊνών με σφαιρίδια γλουταθειόνης και GST πρωτεΐνης. Όπως φαίνεται στην εικόνα 3.8, ο ALK αλληλεπιδρά ισχυρά με το πεπτίδιο P(60-110) τόσο στα PC3, όσο και στα PC3RM4 κύτταρα. 100

Αποτελέσματα Εικόνα 3.8: Αλληλεπίδραση του P(9-59), του P(60-110) και του P(9-110) με τον RPTPβ/ζ και τον ALK σε κύτταρα PC3 (A) και κύτταρα PC3RM4 (B). (1) Κατακρήμνιση ολικών πρωτεϊνών με σφαιρίδια γλουταθειόνης τα οποία είχαν κορεστεί με GST(9-110). (2)Κατακρήμνιση ολικών πρωτεϊνών σφαιρίδια γλουταθειόνης τα οποία είχαν κορεστεί με GST(9-59). (3) Κατακρήμνιση ολικών πρωτεϊνών σφαιρίδια γλουταθειόνης τα οποία είχαν κορεστεί με GST(60-110). (4) Επώαση ολικών πρωτεϊνών με σφαιρίδια γλουταθειόνης τα οποία είχαν κορεστεί με GST. Τα ιζήματα αναλύθηκαν ηλεκτροφορητικά σε 5% SDS-PAGE και μετά από ανάλυση κατά Western ανιχνεύτηκε η ύπαρξη του RPTPβ/ζ, του ALK και της GST με αντισώματα έναντι αυτών. 101