ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΔΗΜΟΚΡΑΤΙΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ (Τ.Ε.Ι.) ΑΘΗΝΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ: ΑΡΧΙΜΗΔΗΣ ΙΙΙ "Ενίσχυση Ερευνητικών Ομάδων ΤΕΙ" Υποέργο: 23 Τίτλος: «ΣΥΝΘΕΣΗ ΑΝΑΛΟΓΩΝ ΤΗΣ ΥΔΡΟΞΥΤΥΡΟΣΟΛΗΣ (ΗΤ), ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΚΑΙ ΤΩΝ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΩΝ ΙΔΙΟΤΗΤΩΝ ΤΟΥΣ» Επιστημονικός Υπεύθυνος: Σεμιδαλάς Χάρης ΠΑΡΑΔΟΤΕΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΕ ΔΙΕΘΝΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ Τίτλος Παραδοτέου: «3..Α Συγγραφή μιας επιστημονικής εργασίας σε διεθνές περιοδικό ή ανακοίνωση σε επιστημονικό συνέδριο.» Τίτλος επιστημονικής εργασίας : «IN SILICO ΜΕΛΕΤΕΣ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΝΕΩΝ ΑΝΑΛΟΓΩΝ ΤΗΣ ΥΔΡΟΞΥΤΥΡΟΣΟΛΗΣ ΣΤΟ ΕΝΖΥΜΟ ΚΥΚΛΟΞΥΓΕΝΑΣΗ-2 (COX-2)» στο Πλαίσιο του Πακέτου Εργασίας: 3. Ιούνιος 205
Συντάκτες. Πλουμιστή Γενναίου, Υποψ. Διδάκτωρ Χημ. Μηχανικών, ΕΜΠ, Μέλος ΟΕΣ 2. Αναστασία Δέτση, Επίκ. Καθηγήτρια ΕΜΠ, Μέλος ΚΕΟ 3. Παναγιώτης Ζουμπουλάκης, Ερευνητής ΕΙΕ, Μέλος ΚΕΟ 4. Παναγιώτης Καλαϊτζής. Ερευνητής ΜΑΙΧ, Μέλος ΚΕΟ 5. Σοφία Λουπασάκη, Ερευνήτρια ΜΑΙΧ, Μέλος ΟΕΣ 6. Χρίστος Νιξαρλίδης, φοιτητής, Μέλος ΟΕΣ 7. Χάρης Ε. Σεμιδαλάς, Επίκ. Καθηγητής, Μέλος ΚΕΟ 8. Ανδρομάχη Τζάνη, Υποψ. Διδάκτορας Χημ. Μηχανικών, ΕΜΠ
Πίνακας περιεχομένων Σύντομη παρουσίαση της επιστημονικής εργασίας που παρουσιάστηκε στο συνέδριο... 3 Απόσπασμα προγράμματος συνεδρίου... 4 Η επιστημονική εργασία όπως δημοσιεύτηκε στα πρακτικά του συνεδρίου... 6 Διαφάνειες ή Poster παρουσίασης... 9 2
Σύντομη παρουσίαση της επιστημονικής εργασίας που παρουσιάστηκε στο συνέδριο Α. Γενικά στοιχεία συνεδρίου Το Τμήμα Χημικών Μηχανικών του Πανεπιστημίου Πατρών ανέλαβε τη διοργάνωση του 0 ου Πανελλήνιου Επιστημονικού Συνεδρίου (0 ο ΠΕΣΧΜ), το οποίο διεξήχθη στην Πάτρα από τις 4 έως τις 6 Ιουνίου του 205 στο συνεδριακό και πολιτιστικό κέντρο του Πανεπιστημίου. Σε αυτή την προσπάθεια συνεπικουρήθηκε από το Ινστιτούτο Επιστημών Χημικής Μηχανικής του Ιδρύματος Τεχνολογίας και Έρευνας (ΙΤΕ/ΙΕΧΜΗ), ενώ στην Οργανωτική Επιτροπή συμμετείχαν επίσης όλες οι ελληνικές ακαδημαϊκές και ερευνητικές μονάδες, οι οποίες δραστηριοποιούνται σε αυτή την επιστημονική περιοχή. Β. Σύντομη παρουσίαση της επιστημονικής εργασίας που παρουσιάστηκε στο συνέδριο Το ένζυμο κυκλοοξυγονάση είναι υπεύθυνο για τη δημιουργία φλεγμονών που έχουν ως επακόλουθο σοβαρές ασθένειες όπως ο καρκίνος του πεπτικού συστήματος και η καρδιαγγειακή νόσος. Εξετάστηκαν in silico μια σειρά από δομικά ανάλογα της υδροξυτυροσόλης καθώς και η ίδια για την ικανότητα πρόσδεσής τους στο ενεργό κέντρο του ενζύμου κυκλοοξυγονάση. Αυτό θα είχε ως συνέπεια την αναστολή της επιβλαβούς ενζυμικής δραστικότητας. Όλα τα ανάλογα που μελετήθηκαν φαίνεται να έχουν ικανότητα πρόσδεσης στην κυκλοοξυγονάση σχηματίζοντας αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πολικών ομάδων ΟΗ των ενώσεων και των αμινοξέων His90, Arg53, Tyr385 και Tyr355 του ενεργού κέντρου του ενζύμου. Παράλληλα πραγματοποιήθηκαν πειράματα αντιοξειδωτικής δράσης τα αποτελέσματα των οποίων δείχνουν ότι η υδροξυτυροσόλη είναι το πιο δραστικό από τα ανάλογα που εξετάστηκαν ενώ η 2,5-διϋδροξυτυροσόλη είναι το αμέσως επόμενο δραστικό παράγωγο. Η αύξηση του αριθμού των ανθράκων της αλειφατικής αλυσίδας της 3,4-διμεθοξυ-φαινυλαιθανόλης από δύο σε τέσσερεις οδηγεί σε αύξηση της αντιοξειδωτικής δράσης, πιθανότατα λόγω αύξησης της λιποφιλικότητας του μορίου. Τα συμπεράσματα από αυτή τη διερεύνηση θα αξιοποιηθούν περαιτέρω στη σύνθεση νέων βιοδραστικών μορίων με συνδυασμένη αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση. Η εργασία αυτή αναρτήθηκε ως πόστερ αλλά δόθηκε και σε αναλυτική μορφή στην οργανωτική επιτροπή του συνεδρίου. Τα στοιχεία της είναι ανηρτημένα στη διεύθυνση http://www.pesxm0.gr/papers//394 3
Απόσπασμα προγράμματος συνεδρίου 4
5
Η επιστημονική εργασία όπως δημοσιεύτηκε στα πρακτικά του συνεδρίου IN SILICO ΜΕΛΕΤΕΣ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΝΕΩΝ ΑΝΑΛΟΓΩΝ ΤΗΣ ΥΔΡΟΞΥΤΥΡΟΣΟΛΗΣ ΣΤΟ ΕΝΖΥΜΟ ΚΥΚΛΟΟΞΥΓΟΝΑΣΗ-2 (COX-2) Χ. Σεμιδαλάς, Χ. Νιξαρλίδης Εργαστήριο Οργανικής Χημείας, Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων, Τεχνολογικό Ίδρυμα Αθήνας Α. Τζάνη, Π. Γενναίου, Α. Δέτση Εργαστήριο Οργανικής Χημείας, Σχολή Χημικών Μηχανικών, Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο, Πολυτεχνειούπολη Ζωγράφου 5780, Αθήνα Σ. Λουπασάκη, Π. Καλαϊτζής Μεσογειακό Αγρονομικό Ινστιτούτο Χανίων, Διεθνές Κέντρο Ανωτάτων Μεσογειακών Γεωπονικών Σπουδών (ΔΙΚΑΜΓΣ), 7300 Χανιά, Κρήτη Π. Ζουμπουλάκης Ινστιτούτο Βιολογίας, Φαρμακευτικής Χημείας και Βιοτεχνολογίας, Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών, Βασ.Κωνσταντίνου 48, 635, Αθήνα. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία παρουσιάζεται η μελέτη της ικανότητας πρόσδεσης του φυσικού προϊόντος υδροξυτυροσόλη και συνθετικών αναλόγων της στο ενεργό κέντρο του ενζύμου κυκλοοξυγονάση (COX) προκειμένου να διερευνηθούν οι στερεοχημικές και ηλεκτρονικές απαιτήσεις που ευνοούν την πρόσδεση. Επιπλέον, αξιολογήθηκε η αντιοξειδωτική δράση των νέων ενώσεων μέσω της μέτρησης της ικανότητάς τους να δεσμεύουν το υπεροξείδιο του υδρογόνου. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η υδροξυτυροσόλη (HT) αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα φυτοχημικά συστατικά του ελαιόλαδου και του εκχυλίσματος φύλλων ελιάς και διαθέτει μεγάλο εύρος βιολογικής δραστικότητας (αντιοξειδωτική, αντιμικροβιακή, αντιφλεγμονώδη, αντιαθηρωματική κ.ά.). Η κυκλοοξυγονάση (COX) ή συνθετάση της προσταγλανδίνης (PGHS) είναι ένα ένζυμο το οποίο συμμετέχει στη σύνθεση προσταγλανδινών και θρομβοξανών από το αραχιδονικό οξύ. Μέχρι στιγμής η COX υπάρχει σε δύο ισομορφές την COX- και την COX-2 ενώ πρόσφατα έχει περιγραφεί και μια τρίτη ισομορφή η COX-3. Η COX-2 εκφράζεται σε σταθερά επίπεδα στον εγκέφαλο, τους νεφρούς και τα οστά ενώ η έκφρασή της στους υπόλοιπους ιστούς αυξάνεται σε συνθήκες φλεγμονής, υπό την επίδραση των κυτταροκινών και άλλων μεσολαβητών της φλεγμονής [,2,3]. Στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας, εξετάστηκε η ικανότητα πρόσδεσης νέων αναλόγων ενώσεων της υδροξυτυροσόλης (ΗΤ) στο ενεργό κέντρο της πρωτεΐνης 6
κυκλοοξυγονάση. Οι μελέτες αυτές πραγματοποιήθηκαν με σκοπό να μελετηθεί η ικανότητα και ο τρόπος πρόσδεσης των ενώσεων. Τέλος συγκρίθηκε η ικανότητα πρόσδεσης των συνθετικών αυτών μορίων με δύο πεδία δυνάμεων το OPLS_2005 και το MMFFs. Επίσης, προκειμένου να διερευνηθεί περαιτέρω το βιοδραστικό προφίλ των νέων ενώσεων, αξιολογήθηκε η αντιοξειδωτική δράση των μορίων με τη μέθοδο της χημειοφωταύγειας της λουμινόλης, κατά την οποία προσδιορίζεται η ικανότητα ενός μορίου να δεσμεύει το υπεροξείδιο του υδρογόνου. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ (Α) In silico μελέτη πρόσδεσης στην COX-2 Για την παραπάνω μελέτη χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό GLIDE (Maestro, version 8.5, Schrödinger, LLC, 2008) στο ενεργό κέντρο της COX-2 (pdb CX2) με χρήση του λογισμικού προγράμματος MAESTRO 203 GLIDE 6.0 (Schrödinger) και τεχνικές standard (SP) και extra (XP) precision. Η επιλογή της θήκης πρόσδεσης καθώς και η επικύρωση της μεθόδου πραγματοποιήθηκε με βάση το συγκρυσταλλωμένο με την πρωτεΐνη μόριο S-58. Συγκεκριμένα μελετήθηκε η συγγένεια πρόσδεσης των ενώσεων καθώς και οι αλληλεπιδράσεις με κρίσιμα αμινοξέα του ενζύμου που σχετίζονται με την ανασταλτική του δράση. Διερευνήθηκε ο ρόλος των φαινολικών υδροξυλίων κατά την πρόσδεση ενώ σημαντική φαίνεται να είναι η αλληλεπίδραση με την His90 στο σχηματισμό δεσμών υδρογόνου με τις πολικές ομάδες των ενώσεων. Το πρώτο βήμα της πειραματικής πορείας ήταν η προετοιμασία του αρχείου της πρωτεΐνης (protein preparation). Το ένζυμο υπάρχει με την μορφή τετραμερούς, όπου το κάθε μονομερές είναι πρωτεΐνη μήκους 587 αμινοξέων. Από το μοντέλο αυτό απομονώθηκε ένα μέρος του ενζύμου, και διαγράφτηκαν όλα τα μόρια του νερού, μιας που κανένα από αυτά δεν εμφάνιζαν σημαντική δράση στην περιοχή πρόσδεσης. Στη συνέχεια έγινε προσθήκη ατόμων υδρογόνου, που έλειπαν από την πρωτεΐνη και ελαχιστοποιήθηκε η ενέργειά της[4]. Το δεύτερο βήμα περιλαμβάνει τον σχεδιασμό των προσδετών (ligands) και προετοιμασία τους με χρήση του αλγορίθμου ligprep (ligand preparation) για την μοριακή πρόσδεση. Οι προσδέτες ελαχιστοποιήθηκαν γεωμετρικά χρησιμοποιώντας τα πεδία δυνάμεων OPLS_2005 (αλγόριθμος που διαχειρίζεται όλα τα άτομα της ένωσης και τα χαρακτηριστικά τους) και mmff (αλγόριθμος κατάλληλος για οργανικά μόρια)[4]. Βρέθηκαν όλες οι δυνατές καταστάσεις ιοντισμού της ένωσης σε συγκεκριμένο εύρος pη (8 ± ). Το τρίτο βήμα περιλαμβάνει τον σχηματισμό ενός πλέγματος (GRID). Οι μελέτες μοριακής πρόσδεσης έγιναν στο ενεργό κέντρο του ενζύμου (Εικόνα ) που ορίστηκε με ένα κυβικό πλέγμα διαστάσεων,2 Å η κάθε πλευρά. Το ενεργό κέντρο της 7
πρωτεΐνης αποτελείται από τα αμινοξέα His 90, Arg 20, Tyr 355, Tyr 385, Arg 53, Val 523 και Ser 530[4]. Το τέταρτο βήμα περιλαμβάνει τη μοριακή πρόσδεση. Το παραγόμενο πλέγμα χρησιμοποιήθηκε για την πρόσδεση του προσδέτη αναφοράς S58 και των συνθετικών ενώσεων χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο Glide. Οι μελέτες πρόσδεσης πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αρχικά τη μέθοδο SP (Standard precision) και στη συνέχεια οι καλύτερες πόζες επιλέχτηκαν για τη μέθοδο XP (Extra Precision). Τα αποτελέσματα πρόσδεσης εξετάστηκαν περαιτέρω για την κατάλληλη προσαρμογή των προσδετών στο ενεργό κέντρο της πρωτεΐνης. Τέλος ο βαθμός πρόσδεσης ελέγχθηκε τόσο από τους δεσμούς υδρογόνου και τις υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις που σχηματίστηκαν όσο και από τις τιμές των Docking Score και Glide Emodel. Εικόνα : Αλληλεπίδραση του προσδέτη S58 στο ενεργό κέντρο της COX 2. Με κύκλο παρουσιάζονται τα κρίσιμα για την πρόσδεση αμινοξέα. 8
Πίνακας : Αμινοξέα που βρίσκονται σε ακτίνα 3 Å από το S58 και αλληλεπιδράσεις με τον προσδέτη ΑΜΙΝΟΞΕΑ ΥΔΡΟΦΟΒΕΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΔΕΣΜΟΙ ΥΔΡΟΓΟΝΟΥ g53, His90, Leu53, Leu359, Asp68, His90, Asp44, Tyr355, Phe58 (πριν την Val349, Tyr385, Tyr355, Leu352, Tyr355, Asp40, ελαχιστοποίηση) Arg20, Leu352, Ser353, Phe58, Al527 Try387,Ala56, Iso57, Phe58, Val523, Gly526, Ala527, Ser530 His90 (μετά την ελαχιστοποίηση ) Από την κρυσταλλογραφική δομή (Εικόνα 2), προκύπτουν τα ακόλουθα σημεία: Παρατηρήθηκε πως το S58 βρίσκεται μακριά από τον πορφυρινικό δακτύλιο καθιστώντας αδύνατη την αλληλεπίδρασή του με το άτομο Fe (9,4 Å). Τo κύριο αμινοξύ που εμφανίζει δεσμό υδρογόνου είναι η His90. Το φυσικό υπόστρωμα του ενζύμου αποτελεί το αραχιδονικό οξύ. Εικόνα 2: Πρωτεΐνη κυκλοοξυγονάσης - 2 9
Η επικύρωση της μεθόδου πραγματοποιείται για την επιλογή των βέλτιστων παραμέτρων και αλγορίθμων κατά την πρόσδεση. Συγκεκριμένα, επιλέγεται το συγκρυσταλλωμένο μόριο S58 και εξετάζονται τα αποτελέσματα της πρόσδεσης σε σχέση με την κρυσταλλωμένη δομή (Εικόνα 3). Πίνακας 2: Επικύρωση Μεθόδου ΠΡΩΤΕΪΝΗ DOCKING SCORE GLIDE EMODEL CX2-9.644-87,80 Εικόνα 3: Αποτελέσματα από την επικύρωση της μεθόδου πρόσδεσης του S58 στο ενεργό κέντρο της COX 2. Δεξιά παρουσιάζεται η υπέρθεση της κρυσταλλικής δομής με αυτή που προέκυψε από τη μοριακή πρόσδεση. (β) Αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής δράσης μέσω της χημειοφωταύγειας της λουμινόλης. Η μέθοδος χημειοφωταύγειας της λουμινόλης, τροποποιήθηκε για την ανίχνευση και ποσοτικοποίηση του υπεροξειδίου του υδρογόνου.[6] Αυτή η τροποποιημένη μέθοδος, που δε χρησιμοποιεί ένζυμα και δεν απαιτεί λογισμικό για ολοκλήρωση καμπυλών, λόγω της σταθερής έντασης χημειοφωταύγειας που παράγεται, για ένα λογικό χρονικό διάστημα (έως και min), βασίζεται στην καταλυτική οξείδωση της λουμινόλης από Co 2+ και στη χρήση ρυθμιστικού 0
διαλύματος βορικών σε ph 9, παρουσία ΕDTA ως μεταλλικό συμπλοκοποιητή. Το προαναφερθέν επίπεδο ph βρέθηκε να δίνει τα βέλτιστα σήματα, αναφορικά με τη χρονική σταθερότητα, την ένταση και την επαναληψιμότητα. Τα σύμπλοκα του κοβαλτίου με το ΕDTA καταλύουν το σχηματισμό μιας ρίζας υδροξυλίου μέσω της αντίδρασης Fenton: [Co II (EDTA)] 2- + H 2 O 2 [Co III (EDTA)] - + HO - + HO. H μέθοδος της χημειοφωταύγειας της λουμινόλης περιγράφεται από μια σειρά αντιδράσεων, όπου σε βασικό ph, η λουμινόλη μετατρέπεται στο αντίστοιχο μονοανιόν, το οποίο σταθεροποιείται με δομές συντονισμού. Το ανιόν μέσα από διάφορα στάδια, καταλήγει στο σχηματισμό του ενδοϋπεροξειδίου, το οποίο παράγεται σε διεγερμένη κατάσταση και αποβάλλει την περίσσεια ενέργειας υπό μορφή ακτινοβολίας, οπότε μεταπίπτει στη θεμελιώδη ενεργειακή κατάσταση. Ρίζες με οξυγονούχο κέντρο, όπως οι ρίζες υδροξυλίου και αλκοξειδίου, που σχηματίζονται από ομολυτική σχάση του υδροϋπεροξειδίου επίσης, προκαλούν οξείδωση της λουμινόλης, που συνοδεύεται από εκπομπή φωτός. Σε όλες τις διεργασίες φωταύγειας, η ένταση του παραγόμενου φωτός εξαρτάται από το πόσο αποτελεσματική είναι η παραγωγή μορίων στη διεγερμένη κατάσταση, μέγεθος που αντιπροσωπεύεται από την κβαντική απόδοση και την ταχύτητα της αντίδρασης: ΙCI=ΦCI ( da/dt) (ΙCI είναι η ένταση της εκπομπής (φωτόνια/ δευτερόλεπτο), ΦCI είναι η κβαντική απόδοση της χημειοφωταύγειας, da/dt είναι ο ρυθμός με τον οποίο καταναλώνεται η πρόδρομη ένωση Α της διεργασίας). Η μέγιστη ένταση φωτός, εξαρτάται από τη συγκέντρωση του υπεροξειδίου του υδρογόνου και την κβαντική απόδοση. Πειραματική διαδικασία: x μl διαλύματος του δείγματος σε DMSO, προστίθενται σε μίγμα των εξής διαλυμάτων: ρυθμιστικό διάλυμα βορικού οξέος που περιέχει CoCl 2 6H 2 O, 2,63 mg EDTA (διάλυμα Α), διάλυμα λουμινόλης (διάλυμα Β) και διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου (διάλυμα Γ). Η ένταση της χημειοφωταύγειας (I) καταγράφεται όταν επιτευχθεί σταθερή ένταση φωτός (έως min). Το κάθε δείγμα μετρήθηκε σε τρείς συγκεντρώσεις, με προσθήκη κατάλληλου όγκου του διαλύματος των δειγμάτων (0,0 μl-25,0 μl-50,0 μl) και σε κάθε μια από αυτές, πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον τρείς μετρήσεις για εξασφάλιση μεγαλύτερης ακρίβειας. Στη συνέχεια υπολογίζεται ο λόγος Ιο/Ι και γίνονται τα διαγράμματα Ιο/Ι συναρτήσει της συγκέντρωσης του δείγματος (mg/ml). Η εξίσωση που συνδέει τα δύο αυτά μεγέθη, είναι γραμμική (y=ax+b). Από την εξίσωση αυτή υπολογίστηκε η συγκέντρωση του δείγματος (IC 50 ).
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πραγματοποιήθηκαν προσομοιώσεις πρόσδεσης των συνθετικών μορίων -7 (Πίνακας 3) στο ένζυμο της κυκλοοξυγονάσης. Χρησιμοποιήθηκαν 2 διαφορετικά πεδία δυνάμεων κατά την προετοιμασία των προσδετών με σκοπό την σύγκριση τους. Οι παράμετροι διεξαγωγής τους, αλλά και τα αποτελέσματα περιγράφονται παρακάτω: Προσδέτες και προετοιμασία τους: Οι ενώσεις του πίνακα προετοιμάστηκαν για πρόσδεση μέσω του LigPrep 2.6 σε υδατικό περιβάλλον, κοντά στο ph βέλτιστης δράσης της κυκλοξυγονάσης (ph=7-9), βάσει του πεδίου δυνάμεων OPLS2005 και MMFFs Στοιχεία προσομοίωσης: Η προσομοίωση πρόσδεσης έγινε μέσω του Glide 6.0 με τυπική ακρίβεια (XP). 2
Εικόνα 4. Αλληλεπίδραση του προσδέτη 2 με την CX2 σε πεδίο δυνάμεων MMFFs. Εικόνα 5. Αλληλεπίδραση του προσδέτη 4 με την CX2 σε πεδίο δυνάμεων OPLS2005. 3
Εικόνα 6. Αλληλεπίδραση του προσδέτη 4 με την CX2 σε πεδίο δυνάμεων MMFFs. Εικόνα 7. Αλληλεπίδραση του προσδέτη 5 με την CX2 σε πεδίο δυνάμεων OPLS2005. 4
Εικόνα 8. Αλληλεπίδραση του προσδέτη 6 με την CX2 σε πεδίο δυνάμεων MMFFs. Εικόνα 9. Αλληλεπίδραση του προσδέτη 7 με την CX2 σε πεδίο δυνάμεων MMFFs. 5
Τα νέα παράγωγα μελετήθηκαν ως προς την ικανότητά τους να δεσμεύουν το υπεροξείδιο του υδρογόνου, μια από τις δραστικές μορφές οξυγόνου, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο χημειοφωταύγειας της λουμινόλης. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον Πίνακα 4, εκφρασμένα ως IC 50, δηλαδή η συγκέντρωση της ουσίας που προκαλεί 50% ελάττωση της χημειοφωταύγειας της λουμινόλης και επομένως 50% δέσμευση του Η 2 Ο 2. Πίνακας 4: Προσδιορισμός της αντιοξειδωτικής δράσης των νέων ενώσεων με την μέθοδο της χημειοφωταύγειας της λουμινόλης Ικανότητα δέσμευσης του Η ΕΝΩΣΗ 2 Ο 2 IC 50 mg ml - 0,00 ± 0,000 2 0,002 ± 0,002 3 3,26 ± 0,05 4 2,74 ± 0,86 5 6,203 ± 0,0 6 0,66 ± 0,004 7 0,024 ± 0,00 Όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα του Πίνακα, η υδροξυτυροσόλη (2) είναι η ένωση που εμφανίζει τη βέλτιστη αντιοξειδωτική δράση, με IC 50 =0,002 ± 0,002 mg/ml. Η αντικατάσταση των υδροξυ-ομάδων με μεθοξυ-ομάδες (5) οδηγεί σε σημαντική ελάττωση της αντιοξειδωτικής δράσης (IC 50 =6,203 ± 0,0 mg/ml), όπως άλλωστε είναι αναμενόμενο αφού το κατεχολικό σύστημα είναι το δομικό χαρακτηριστικό που ενισχύει την αντιοξειδωτική δράση σε αυτή τη μέθοδο. Η 2,5- διυδροξυτυροσόλη () εμφανίζει επίσης ιδιαίτερα αξιόλογη αντιοξειδωτική δράση με IC 50 =0.00 ± 0,000 mg/ml). Η ακετυλίωση του αλκοολικού υδροξυλίου της αλκοόλης 5 (ένωση 3) έχει ως αποτέλεσμα τη βελτίωση της ικανότητας δέσμευσης του Η 2 Ο 2 (IC 50 =3,26 ± 0,05 mg/ml) σε σχέση με την αρχική αλκοόλη. Η επιμήκυνση της αλειφατικής αλυσίδας της αλκοόλης 5 κατά δύο άτομα άνθρακα (ένωση 4) έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της αντιοξειδωτικής δράσης (IC 50 =2,74 ± 0,86mg/mL) ενώ η απομάκρυνση των μεθοξυ-ομάδων οδηγεί σε ένα ιδιαίτερα δραστικό ανάλογο της υδροξυτυροσόλης, την ένωση 7 με IC 50 =0,024 ± 0,00mg/mL. Η επιμήκυνση της αλειφατικής αλυσίδας της αλκοόλης 5 κατά τέσσερα άτομα άνθρακα και η παρουσία ενός διπλού δεσμού (ένωση 6) έχει επίσης ως αποτέλεσμα το μόριο αυτό να εμφανίζει αξιόλογη αντιοξειδωτική δράση (IC 50 =0,66 ± 0,004mg/mL). 6
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η υδροξυτυροσόλη και έξι συνθετικά ανάλογά της εξετάστηκαν in silico για την ικανότητα πρόσδεσής τους στο ενεργό κέντρο του ενζύμου κυκλοοξυγονάση. Όλα τα ανάλογα που μελετήθηκαν φαίνεται να έχουν ικανότητα πρόσδεσης στην κυκλοοξυγονάση σχηματίζοντας αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πολικών ομάδων (ΟΗ) των ενώσεων και των αμινοξέων His90, Arg53, Tyr385 και Tyr355. Από την επεξεργασία των αποτελεσμάτων μοριακής πρόσδεσης παρατηρούμε να υπάρχει μια διαφορά στο ποσοστό πρόσδεσης συγκριτικά με τα 2 πεδία δυνάμεων. Πιο συγκεκριμένα, στο πεδίο δυνάμεων OPLS2005 καλύτερη ικανότητα πρόσδεσης παρουσιάζουν τα μόρια 4 και 5. Αντίθετα, στο πεδίο δυνάμεων MMFFs καλύτερη ικανότητα πρόσδεσης εμφανίζουν τα μόρια 6, 4, 2 και 7. Συνεπώς καλύτερα αποτελέσματα μοριακής πρόσδεσης στο ενεργό κέντρο της κυκλοοξυγονάσης εμφανίζουν τα μόρια που επεξεργάστηκαν με το MMFFs πεδίο δυνάμεων. Τα αποτελέσματα της αξιολόγησης της αντιοξειδωτικής δράσης δείχνουν ότι η υδροξυτυροσόλη (2) είναι το πιο δραστικό από τα ανάλογα που εξετάστηκαν ενώ η 2,5-διϋδροξυτυροσόλη () είναι το αμέσως επόμενο δραστικό παράγωγο. Η αύξηση του αριθμού των ανθράκων της αλειφατικής αλυσίδας της 3,4-διμεθοξυφαινυλαιθανόλης 5 από δύο σε τέσσερεις οδηγεί σε αύξηση της αντιοξειδωτικής δράσης, πιθανότατα λόγω αύξησης της λιποφιλικότητας του μορίου. Τα συμπεράσματα από αυτή τη διερεύνηση θα αξιοποιηθούν περαιτέρω στη σύνθεση νέων βιοδραστικών μορίων με συνδυασμένη αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση. 7
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [] Simon LS. NSAID: Mechanisms of action. In: Rose BD, editor. UpToDate. 3.2 ed. Wellesley, MA: UpToDate ; 2005 [2] Dubois RN, Abramson SB, Crofford L, Gupta RA, Simon LS, Van De Putte LB, et al. Cyclooxygenase in biology and disease. FASEB J 2:063 73 (998) [3] Zha S, Yegnasubramanian V, Nelson WG, Isaacs WB, De Marzo AM. Cyclooxygenases in cancer: progress and perpective. Cancer Lett 25: 20, (2004) [4] D Mello P., Gadhwal M.K., Joshi U., Shetgir P., Modeling of COX-2 inhibitory activity of flavonoids, Int. J. Pharm. Pharmaceutical Sci. 3: 33-40 (20) [5] Price MLP, Jorgensen WL: Rationale for the observed 2/COX-COX- selectivity of celecoxib from Monte Carlo simulations, Bioorg. Med. Chem. Lett., :54 544, (200) [6] Parejo I., Petrakis C., Kefalas P., A transition metal enhanced luminol chemiluminescence in the presence of a chelator. J. Pharm. Toxicol. Methods. 43: 83-90 (2000) Ευχαριστίες: Η έρευνα χρηματοδοτείται από το Ερευνητικό Πρόγραμμα ΑΡΧΙΜΗΔΗΣ ΙΙΙ, Επιχειρησιακό Πρόγραμμα Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση, ΕΣΠΑ 2007-203 8
Διαφάνειες ή Poster παρουσίασης 9