ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ ΖΑΧΑΡΑΤΗΣ ΓΚΙΑΦΗ (ΕΝΟΤΗΤΑ ΙΙΙ)

ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ ΖΑΧΑΡΑΤΗΣ ΓΚΙΑΦΗ (ΕΝΟΤΗΤΑ ΙΙΙ) Η παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που οδηγούν στην ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ (Nuclear Factor κb) κατά το μετασχηματισμό των Β-λεμφοκυττάρων από τον ιό Epstein Barr virus (EBV). Ο ιός EBV αποτελεί σημαντικό αιτιολογικό παράγοντα για την ανάπτυξη πολλών ανθρώπινων λεμφωμάτων που προέρχονται από Β-λεμφοκύτταρα, όπως είναι το ιδιαίτερα επιθετικό λέμφωμα Burkitt (BL). Ο ακριβής ρόλος του EBV στη διαδικασία της καρκινικής μετατροπής δεν είναι αποσαφηνισμένος, αλλά περιλαμβάνει την ικανότητά του να μολύνει αποτελεσματικά μη ενεργοποιημένα ανθρώπινα Β λεμφοκύτταρα και να τα μετασχηματίζει σε λεμφοβλαστοειδείς κυτταρικές σειρές που πολλαπλασιάζονται για μεγάλα χρονικά διαστήματα. Η πρωτεΐνη LMP-1 του ιού είναι απαραίτητη για το μετασχηματισμό των Β-λεμφοκυττάρων και εμφανίζει ιδιαίτερα ογκογονικό χαρακτήρα. Ο μετασχηματισμός των Β λεμφοκυττάρων εξαρτάται απόλυτα από την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ, καθώς αναστολή της ενεργοποίησης του NF-κΒ προκαλεί την απόπτωση των μετασχηματισμένων Β-λεμφοκυττάρων. Η LMP-1 μιμείται τα κυτταρικά μηνύματα αύξησης που επάγονται μετά τη σύνδεση του υποδοχέα CD40 με τον προσδέτη του, χωρίς να απαιτεί την ύπαρξη συνδέτη για την επαγωγή σηματοδοτικών μονοπατιών, όπως είναι το κανονικό και το μη-κανονικό μονοπάτι του NF-κΒ. Οι πρωτεΐνες του NF-κΒ βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα όπου αλληλεπιδρούν με ανασταλτικές πρωτεΐνες, γνωστές ως αναστολείς του NF-κΒ (ΙκΒ πρωτεΐνες). Μετά την ενεργοποίηση από διαφορετικά και ποικίλα ερεθίσματα, οι πρωτεΐνες ΙκΒ φωσφορυλιώνονται, ουβικουϊτινώνονται και τελικά αποικοδομούνται από το πρωτεάσωμα. Η αποικοδόμηση των ΙκΒs οδηγεί στην απελευθέρωση του NF-κΒ και στη μετατόπισή του στον πυρήνα, όπου προσδένεται σε συγκεκριμένες αλληλουχίες υποκινητών ή ενισχυτών πάνω στο DNA και ρυθμίζει τη μεταγραφή πολλών γονιδίων, όπως είναι κυτταροκίνες, χημειοκίνες (IL-1α, ΙFNγ), ανοσοϋποδοχείς (μόρια του Μείζονος Συμπλέγματος Ιστοσυμβατότητας τάξης Ι-ΜΗC I), μόρια προσκόλλησης (ICAM, VCAM), μεταγραφικοί παράγοντες (Α20 και IRF1), παράγοντες αύξησης, ένζυμα (λυσοζύμη), ρυθμιστές του 1

κυτταρικού κύκλου (κυκλίνη D1), αντι-αποπτωτικές πρωτεΐνες (BCL-X L ), αναστολείς της απόπτωσης (c-iap1, c-iap2, XIAP). H πειραματική προσέγγιση που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα διατριβή ήταν η πρωτεωμική ανάλυση σε κυτταρικές σειρές ανθρώπινων B-λεμφοκυττάρων από λέμφωμα του Burkitt παρουσία και απουσία του ιού EBV (κυτταρικές σειρές BL41/B95.8 και BL41 αντίστοιχα), προκειμένου να προσδιοριστούν οι μεταβολές που επάγονται σε πρωτεϊνικό επίπεδο από τον EBV, καθώς είναι δυνατό να αποτελέσουν στόχους για διαγνωστικές ή θεραπευτικές προσεγγίσεις σε ανθρώπινα λεμφώματα. Για την πρωτεωμική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν είτε ολικά κυτταρικά εκχυλίσματα είτε πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα, τα οποία αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν αρχικά σύμφωνα με το ισοηλεκτρικό τους σημείο, σε προκατασκευασμένες ταινίες ισοηλεκτρικής εστίασης ευρείας ή στενής περιοχής ph και στη συνέχεια ανάλογα με το μοριακό τους βάρος σε πήκτωμα SDS-πολυακρυλαμιδίου και ανιχνεύθηκαν με χρώση των πηκτωμάτων με νιτρικό άργυρο. Στη συνέχεια, έγινε σύγκριση των ηλεκτροφορητικών προφίλ των δύο κυτταρικών σειρών και απομονώθηκαν τα πρωτεϊνικά στίγματα εκείνα που εμφάνισαν διαφορά στη χρώση με νιτρικό άργυρο μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών. Τα πρωτεϊνικά στίγματα επωάστηκαν με θρυψίνη και τα πεπτίδια που προέκυψαν διαχωρίστηκαν σε τριχοειδείς στήλες χρωματογραφίας υψηλών πιέσεων (nano-hplc). Τα πεπτίδια ιονίστηκαν με νάνο-ηλεκτροψεκασμό (nano-electrospray) και τα φάσματά τους αναλύθηκαν σε φασματογράφο μαζών τύπου ιοντοπαγίδας (ion-trap). Τα δεδομένα κατέληξαν σε βάσεις δεδομένων για την ταυτοποίηση της πρωτεΐνης. Τέλος, οι πρωτεΐνες κατηγοριοποήθηκαν ανάλογα με τη μοριακή τους λειτουργία μέσω βάσεων δεδομένων (Gene-Ontology). Μέσω της τεχνικής της ηλεκτροφόρησης δυο διαστάσεων και της ταυτοποίησης των πρωτεϊνών (με φασματοσκοπία μάζας) που μεταβλήθηκαν εξαιτίας του EBV, βρέθηκαν πρωτεΐνες που μειορυθμίζονται και αυξορυθμίζονται στην EBV (+) κυτταρική σειρά (BL41/B95.8). Το σύνολο των πρωτεϊνικών διαφορών μπορεί να οφείλεται τόσο σε αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των αντίστοιχων γονιδίων, όσο και σε μεταμεταγραφικούς μηχανισμούς ή μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις ή ακόμα και σε ενδοκυτταρικές μετατοπίσεις. 2

Πολλές πρωτεΐνες που βρέθηκαν να αυξορυθμίζονται στην EBV (+) κυτταρική σειρά, μπορεί να εμπλέκονται στην ανάπτυξη λεμφωμάτων και επομένως να αποτελούν νέους στόχους για την καταπολέμηση ασθενειών που σχετίζονται με τον ιό. Μερικές από τις πρωτεΐνες που ταυτοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη είναι ήδη γνωστό ότι επηρεάζονται είτε από τον ιό, είτε από μία ή περισσότερες ιικές πρωτεΐνες. Τέτοιες είναι η αννεξίνη Α6, ο CD40, η βιμεντίνη, η Mx1, η σερπίνη Β9, η ακτίνη, η PGK1, η UCHL1, η Lupus La πρωτεΐνη και η σταθμίνη-1. Υπήρξαν όμως και λίγες πρωτεΐνες οι οποίες βρέθηκαν να μειορυθμίζονται ή να αυξάνονται παρουσία EBV ή ιικών πρωτεϊνών και στη βιβλιογραφία να παρουσιάζεται το αντίθετο αποτέλεσμα. Για παράδειγμα η ενδοπλασμίνη βρέθηκε να μειορυθμίζεται και η D-3-φωσφογλυκερική αφυδρογονάση να αυξορυθμίζεται στην BL41/B95.8 κυτταρική σειρά, σε αντίθεση με μία πρόσφατη εργασία στην οποία εμφανίζεται το αντίθετο αποτέλεσμα στις αντίστοιχες EBV (+) (LCLs) κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν. Πρόσφατα δημοσιεύτηκαν δύο εργασίες οι οποίες παρουσιάζουν πρωτεΐνες αλλά και οικογένειες πρωτεϊνών που εμφανίζονται συχνά σε μελέτες πρωτεωμικής ανάλυσης, ανεξάρτητα από το είδος, τις in vivo ή τις in vitro συνθήκες, τα κύτταρα, τους ιστούς ή τα όργανα που χρησιμοποιούνται και τον πειραματικό στόχο. Μεταξύ αυτών υπάρχουν αρκετές που εντοπίστηκαν στην παρούσα πρωτεωμική ανάλυση, όπως είναι η αλδολάση Α, η υπεροξειρεδοξίνη-6 και οι ενολάσες. Μερικές από αυτές, παρά το γεγονός ότι εμφανίζονται συχνά σε πρωτεωμικές μελέτες, έχουν ιδιαίτερη σημασία και σχετίζονται με τον EBV, όπως συμβαίνει στην περίπτωση της βιμεντίνης, της αννεξίνης VI, της εζρίνης και της σταθμίνης-1. Τέλος από την σύγκριση των πρωτεϊνικών προφίλ των δύο κυτταρικών σειρών, προέκυψαν και πρωτεΐνες οι οποίες δεν σχετίζονται άμεσα με τον EBV ή με το λέμφωμα του Burkitt, όμως παίζουν ιδιαίτερο ρόλο στην κυτταρική αύξηση, στην εμφάνιση καρκίνου, στη ρύθμιση της ακτίνης, στην αναδιοργάνωση του σκελετού και σε άλλες μεταβολικές διαδικασίες. Μερικά παραδείγματα αυτών, αποτελούν η σεπτίνη-11, η πρωτεΐνη SET, η Ran/TC4, η Ly-GDI, η RPIA, η GPI και η dck. Μεταξύ των πρωτεϊνών που βρέθηκαν να μειορυθμίζονται στην EBV (+) κυτταρική σειρά είναι τρεις πρωτεΐνες που ανήκουν στην ίδια οικογένεια: η COMMD2, η COMMD3 και η COMMD9. Η οικογένεια των COMMD πρωτεϊνών ανακαλύφθηκε σχετικά 3

πρόσφατα και αποτελείται από δέκα μέλη. Το κύριο χαρακτηριστικό της οικογένειας αυτής είναι η παρουσία ενός μοναδικού και συντηρημένου μοτίβου που βρίσκεται προς το καρβόξυ-τελικό άκρο και λέγεται περιοχή COMM. Αυτή περιέχει συντηρημένα κατάλοιπα τρυπτοφάνης και προλίνης, είναι πλούσια σε κατάλοιπα λευκίνης και παίρνει μέρος σε πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις. Το πρώτο και καλύτερα χαρακτηρισμένο μέλος που ανακαλύφθηκε από την οικογένεια αυτή είναι η πρωτεΐνη COMMD1 (ή Murr1) η οποία εμπλέκεται σε πολλά και διαφορετικά σηματοδοτικά μονοπάτια (π.χ. εμπλέκεται στο μεταβολισμό του χαλκού, αναστέλλει την αντιγραφή του ιού ΗIV σε ήρεμα CD4 + T κύτταρα, δρα ανασταλτικά στη λειτουργία του ενεργού ενζύμου SOD1, αλληλεπιδρά με τον παράγοντα ΗIF-1α και επιφέρει την αποικοδόμησή του, εμπλέκεται στην ομοιόσταση του νατρίου, επάγει την ουβυκουϊτίνωση και τη αποικοδόμηση του NF-κΒ και αλληλεπιδρά με πλήθος μορίων όπως είναι η ARF, η GCN5 κτλ). Η COMMD1 παρεμποδίζει την ενεργότητα του NF-κB μέσα στον πυρήνα, καθώς προάγει την ουβικουϊτίνωση, την αποικοδόμηση και την απομάκρυνσή του από τις περιοχές-κβ στα γονίδια-στόχους. Εκτός από την πρωτεΐνη COMMD1 και άλλες COMMD πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με NF-κB υπομονάδες. Δεν υπάρχουν πολλές διαθέσιμες πληροφορίες για τις COMMD πρωτεΐνες (COMMD2, COMMD3 και COMMD9) που βρέθηκαν να μειορυθμίζονται στην BL41/B95.8 κυτταρική σειρά. Από αυτές, η επιβεβαίωση της πρωτεϊνικής μειορύθμισής τους στην EBV (+) κυτταρική σειρά (π.χ. με τη χρήση αντισώματος), ήταν εφικτή μόνο για την COMMD9. Η COMMD9 είναι μια πρωτεΐνη που αποτελείται από 198 αμινοξέα, έχει μία περιοχή COMM και δύο ισομορφές (μία μεγάλη και μία μικρότερη). Η COMMD9 βρέθηκε να μειορυθμίζεται στην EBV (+) κυτταρική σειρά μέσω της τεχνικής της δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης. Η διαφορά στην έκφραση της COMMD9 επιβεβαιώθηκε και με την τεχνική του ανοσοστυπώματος κατά Western, σε ολικά κυτταρικά εκχυλίσματα τα οποία είτε αναλύθηκαν απευθείας σε πηκτώματα SDS πολυακρυλαμιδίου, είτε ακολουθήθηκε η τεχνική της δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης. Η μειορύθμιση της COMMD9 πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε και στην LCL σειρά ΙΒ4, μία επιπλέον EBV (+) κυτταρική σειρά που περιέχει τέσσερα με πέντε αντίγραφα του ιικού DNA. Η διαφορική έκφραση της COMMD9 (και για τις δύο ισομορφές της) επιβεβαιώθηκε και σε μεταγραφικό επίπεδο με τις τεχνικές της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης 4

(RT-PCR) και της ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (qpcr). Επιπλέον, εξετάστηκε η διαφορική έκφραση σε επίπεδο mrna όλων των μελών της οικογένειας COMMD μεταξύ των κυτταρικών σειρών BL41 και BL41/B95.8. Οι περισσότερες από τις COMMD πρωτεΐνες βρέθηκαν να μειορυθμίζονται στην EBV (+) κυτταρική σειρά τόσο με την τεχνική RT-PCR (COMMD2, COMMD3, COMMD4, COMMD5, COMMD7, COMMD8, COMMD9 και COMMD10), όσο και με την τεχνική qpcr (COMMD2, COMMD3, COMMD4, COMMD7 και COMMD9). Από τα παραπάνω συμπεραίνεται ότι επτά από τα δέκα μέλη της οικογένειας COMMD φαίνεται να μειορυθμίζονται στην EBV (+) κυτταρική σειρά σε επίπεδο mrna και τουλάχιστον τρεις σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Επειδή οι διαθέσιμες πληροφορίες για την COMMD9 πρωτεΐνη είναι αρκετά περιορισμένες, έγιναν πιλοτικά πειράματα υποκυτταρικού εντοπισμού από τα οποία προέκυψε ότι η COMMD9 είναι κυρίως κυτταροπλασματική και δεν ανιχνεύεται / εντοπίζεται σε πυρηνικά κλάσματα. Επιπλέον η COMMD9 είναι πολύ σταθερή πρωτεΐνη, τουλάχιστον όσον αφορά στις χρησιμοποιούμενες κυτταρικές σειρές, όπως προέκυψε από τα πειράματα με τη χρήση του κυκλοεξαμιδίου (CHX), αναστολέα της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Η COMMD9 δε φαίνεται να επηρεάζεται ούτε από τη χρήση του αναστολέα του πρωτεασώματος MG132. Τέλος, εξετάστηκε η επίδραση της αναστολής του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ με τη χρήση του BAY11-7082, στην έκφραση της COMMD9, σε πρωτεϊνικό και μεταγραφικό επίπεδο, αλλά η έκφραση της COMMD9 δε μεταβλήθηκε. Ένας ακόμα πιθανός τρόπος μειορύθμισης των CΟMMDs στην EBV (+) κυτταρική σειρά είναι μέσω των mirnas. O ιός EBV ήταν ο πρώτος ιός στον οποίον βρέθηκαν mirnas. Μέχρι σήμερα έχει βρεθεί ότι κωδικοποιεί για περίπου 30 mirnas τα οποία επηρεάζουν την έκφραση κυτταρικών και ιικών πρωτεϊνών. Πέρα από τα ιικά mirnas υπάρχουν και τα mirnas του κυττάρου ξενιστή, τα οποία επίσης ρυθμίζουν την έκφραση πρωτεϊνών. Για το λόγο αυτό έγινε προσπάθεια πρόβλεψης των mirnas (ιικών και κυτταρικών) τα οποία ενδεχομένως να χρησιμοποιούν τις COMMD ως στόχους, χρησιμοποιώντας κατάλληλους αλγόριθμους. Αν και αρκετές COMMD πρωτεΐνες φαίνεται να αποτελούν πιθανούς στόχους για mirnas, δεν αποτελούν ιδιαίτερα καλό στόχο για κάποιο συγκεκριμένο ιικό mirna. Όσον αφορά στα κυτταρικά mirnas, 5

βρέθηκε ότι μερικά μέλη της οικογένειας των COMMDs (COMMD2-3-8 και 10) αποτελούν στόχο για αυτά. H πειραματική επιβεβαίωση των παραπάνω προβλεφθέντων στόχων mirnas δεν ήταν εφικτή, καθώς οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη δεν μπορούν εύκολα να μετασχηματιστούν. Ο περιορισμός αυτός δεν επέτρεψε την υλοποίηση και άλλων πειραμάτων όπως είναι η εφαρμογή της τεχνικής του επεμβατικού RNA (sirna) για την αποσιώπηση των COMMD πρωτεϊνών σε Β-λεμφοκύτταρα BL απουσία και παρουσία EBV και την εξέταση των αποτελεσμάτων αυτής της αναστολής στο κύτταρο και στην ενεργότητα του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ. H τεχνική του επεμβατικού RNA (sirna), θα μπορούσε να εφαρμοστεί για την αποσιώπηση και του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ και να εξεταστεί η επίδραση αυτής της αναστολής, στην έκφραση των COMMDs. Εξ αιτίας όμως της δυσκολίας του μετασχηματισμού των Β- κυττάρων χρησιμοποιήθηκε ο αναστολέας ΒΑΥ11-7082 ο οποίος, αν και δεν είναι τόσο αποτελεσματικός όσο η τεχνική του επεμβατικού RNA (sirna), είναι ένας ευρέως διαδεδομένος αναστολέας του NF-κΒ. Λαμβάνοντας υπόψη ότι τρεις από τις δέκα πρωτεΐνες των COMMD πρωτεϊνών βρέθηκαν να μειορυθμίζονται στην EBV (+) κυτταρική σειρά σε πρωτεϊνικό επίπεδο και επτά σε επίπεδο mrna, καθώς και ότι ο ιός EBV επάγει την ενεργοποίηση του NF-κΒ και οι πρωτεΐνες COMMD ρυθμίζουν αρνητικά την ενεργότητα του NF-κΒ μέσω ουβικουϊτίνωσης, προτείνεται ότι ο ιός EBV καταστέλλει την έκφραση συγκεκριμένων COMMD πρωτεϊνών, προκειμένου να διατηρεί ενεργοποιημένο το μονοπάτι του NF-κB και να επιτείνει την ογκογονική σηματοδότηση. Παραμένει να διερευνηθεί ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο ο ιός μειώνει τα επίπεδα έκφρασης των COMMD πρωτεϊνών και το πόσο σημαντικός είναι αυτός ο ρυθμιστικός μηχανισμός για την ανάπτυξη του λεμφώματος του Burkitt και των άλλων ασθενειών που σχετίζονται με τον EBV. 6