Ευρωπαϊκή Επιτροπή, Ευρωπαϊκό Κοινοτικό Ταμείο. Ελληνική Δημοκρατία, Υπουργείο Ανάπτυξης Υγείας. Αναλυτική Περίληψη Διδακτορικής Διατριβής

Transcript

1 Ευρωπαϊκή Επιτροπή, Ευρωπαϊκό Κοινοτικό Ταμείο Ελληνική Δημοκρατία, Υπουργείο Ανάπτυξης Υγείας Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας Ιατρικής Πανεπιστήμιο Κρήτης Σχολή Επιστημών Τμήμα Πρόγραμμα Ενίσχυσης του Ερευνητικού Δυναμικού (Π.ΕΝ.Ε.Δ) 2003 Αναλυτική Περίληψη Διδακτορικής Διατριβής Μελέτη της μη-γενωμικής δράσης του TGF-β και της ακτιβίνης σε διάφορες κυτταρικές διεργασίες που επιτελούνται σε καρκινικά κύτταρα μέσω των πρωτεϊνών Rho και του κυτταροσκελετού της ακτίνης Παπαδημητρίου Ελπίδα-Έλσα Επιβλέπων: Στουρνάρας Χρήστος, Καθηγητής Βιοχημείας Εργαστήριο Βιοχημείας Τομέας Βασικών Επιστημών Ηράκλειο 2011

2 Ο μετασχηματίζων αυξητικός παράγοντας-β (ΤGF-β) ρυθμίζει πολλές πτυχές της κυτταρικής συμπεριφοράς, όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση και η μεταναστευτικότητα, διαδικασίες οι οποίες χρειάζονται την ενεργή αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης και των μικροσωληνίσκων, αλλά και τη ρύθμιση της συσταλτικότητας του κυττάρου. Ο ΤGF-β έχει δειχθεί, ότι ρυθμίζει τη σύντομη και μακροχρόνια αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης μέσω των Rho GΤΡασών σε μία ποικιλία κυτταρικών τύπων, όπως ινοβλάστες, επιθηλιακά και λεία μυϊκά κύτταρα. Ένα σύνολο άμεσων γονιδίων στόχων του ΤGF-β έχει αναφερθεί, ότι ρυθμίζει τη μακρόχρονη ενεργοποίηση των Rho GΤΡασών και την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης, όπως η α-λεία μυϊκή ακτίνη, η RhoB GΤΡάση και η Net1 GEF (guanine exchange factor). Παρόλα αυτά οι μηχανισμοί που διέπουν τη ρύθμιση της πρώιμης και καθυστερημένης ενεργοποίησης των Rho GΤΡασών από τον ΤGF-β παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστοι. Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η αποσαφήνιση των μοριακών μηχανισμών που ελέγχουν τη γρήγορη και τη μακρόχρονη ενεργοποίηση της Rho GΤΡάσης από τον ΤGF-β, καθώς και η διερεύνηση του ρόλου τους στην αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης και σε βιολογικές αποκρίσεις, όπως η επιθηλιομεσεγχυματική μετατροπή (EMΤ) και η διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων. Αρχικά, μελετήθηκε η ενεργοποίηση της RhoA από τον ΤGF-β στην καρκινική κυτταρική σειρά χοριοκαρκινώματος JΕG3. Προηγούμενες μελέτες στο εργαστήριο έδειξαν ότι σε ινοβλάστες Swiss 3Τ3 η RhoA ενεργοποιείται ταχύτατα από τον ΤGF-β (εντός 5 λεπτών) με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του μονοπατιού ROCK-LΙΜK2-cofilin που έχει ως αποτέλεσμα την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης. Στην παρούσα μελέτη αναζητήθηκε ο μηχανισμός που συνδέει το σύμπλοκο των υποδοχέων του ΤGF-β (ΤβRΙ και ΤβRΙΙ) με τη γρήγορη ενεργοποίηση της RhoA. Πολλές από τις δράσεις του ΤGF-β μεσολαβούνται από τις πρωτεΐνες τελεστές Smad2 και Smad3, οι οποίες φωσφορυλιώνονται από τον ΤβRΙ υποδοχέα και αφού ολιγομεριστούν με τη Smad4 πρωτεΐνη μεταφέρονται στον πυρήνα όπου και ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση διαφόρων γονιδίων στόχων. Με σκοπό να διερευνηθεί ο ρόλος των Smad πρωτεϊνών στο μηχανισμό της γρήγορης ενεργοποίησης της RhoA από τον ΤGF-β, επιλέχθηκε η καρκινική σειρά JΕG3, διότι δεν εκφράζει ενδογενώς τη Smad3 (Smad3-/-). Αρχικά μελετήθηκε η ενεργοποίηση της RhoA από τον ΤGF-β σε αυτό το κυτταρικό σύστημα και βρέθηκε ότι ακολουθείται παρόμοια κινητική με τους Swiss 3Τ3 ινοβλάστες, με τη RhoA να ενεργοποιείται ήδη μετά από 5 λεπτά επίδρασης με ΤGF-β. Ακολούθως μελετήθηκε η ενεργοποίηση της RhoA μετά από αποσιώπηση της Smad2 με τη χρήση ειδικού sirna ή με τη χρήση του αναστολέα του υποδοχέα τύπου Ι του ΤGF-β (ΤβRΙ) SΒ και βρέθηκε ότι τόσο η αποσιώπηση της Smad2 όσο και η αναστολή του υποδοχέα ΤβRΙ δεν επηρέασε την ενεργοποίηση της RhoA μετά από 5 λεπτά επίδρασης με ΤGF-β. Οδηγηθήκαμε στο συμπέρασμα επομένως, ότι η ενεργοποίηση της RhoA δεν εξαρτάται από τις Smad2/3 πρωτεΐνες. Από τη βιβλιογραφία είναι γνωστό ότι πολλοί από τους ενεργοποιητές των μικρών Rho GΤΡασών ρυθμίζονται από μονοπάτια στα οποία συμμετέχουν κινάσες τυροσίνης, για το λόγο αυτό χρησιμοποιήσαμε τον γενικό αναστολέα κινασών τυροσίνης, γενιστεϊνη, ώστε να διαπιστώσουμε αν στο μονοπάτι ενεργοποίησης της RhoA από τον ΤGF-β εμπλέκονται κινάσες τυροσίνης. H υπόθεση αυτή επιβεβαιώθηκε, δεδομένου ότι η χρήση της γενιστεϊνης είχε σαν αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση της ενεργοποίησης της RhoA από τον ΤGF-β. Ακολούθως μελετήθηκε η επίδραση του ΤGF-β στα επίπεδα φωσφορυλίωσης της Src κινάσης, μίας από τις πιο γνωστές κινάσες τυροσίνης που έχει βρεθεί σε άλλα συστήματα ότι ρυθμίζεται από τον ΤGF-β. Πράγματι και στο δικό μας σύστημα ο ΤGF-β οδήγησε σε μία πολύ γρήγορη ενεργοποίηση της Src κινάσης (ρτyr418) μόλις μετά από 5 λεπτά επίδρασης. Στη

3 συνέχεια, με χρήση του αναστολέα της οικογένειας των Src κινασών PP2 δείχθηκε ότι η Src κινάση είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση της RhoA από τον TGF-β. Βιβλιογραφικά η Src κινάση έχει συνδεθεί με τη φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση της GEF πρωτεΐνης Vaν2. Με βάση αυτή τη γνώση, αρχικά μελετήθηκε η πιθανή ενεργοποίηση της Vaν2 από τον TGF-β χρησιμοποιώντας μία τεχνική κατακρήμνισης συγγένειας χρησιμοποιώντας σφαιρίδια αγαρόζης που φέρουν μία μεταλλαγμένη μορφή της RhoA (RhoA-G17A) που έχει πολύ μεγάλη συγγένεια για τις GEF πρωτεΐνες και βρέθηκε ότι η Vaν2 πράγματι ενεργοποιείται από τον TGF-β μόλις μετά από 5 λεπτά επίδρασης. Τέλος, με χρήση ειδικού sirna που στοχεύει στη Vaν2 δείχθηκε ότι η αποσιώπηση της Vaν2 είχε σαν αποτέλεσμα τη μείωση της ενεργοποίησης της RhoA από τον TGF-β. Συνολικά δείχθηκε ότι στη γρήγορη ενεργοποίηση της RhoA από τον TGF-β εμπλέκεται η Src κινάση (της οποίας o μηχανισμός ενεργοποίησης παραμένει ασαφής, αλλά υπάρχουν ενδείξεις ότι προέρχεται από τον TβRΙΙ υποδοχέα του TGF-β) και η GEF Vaν2. Κατά την διερεύνηση της μακρόχρονης ρύθμισης της RhoA από τον TGF-β, μελετήθηκε ο ρόλος του TGF-β στη ρύθμιση του γονιδίου της Net1, ενός GEF της RhoA, ο οποίος είχε ήδη αναφερθεί στη βιβλιογραφία ότι αποτελεί μεταγραφικό στόχο του TGFβ. H μελέτη αυτή δεν περιορίστηκε μόνο στη ρύθμιση της Net1 από τον TGF-β σε μεταγραφικό επίπεδο, αλλά παράλληλα διερευνήθηκε ο ρόλος της Net1 στην ενεργοποίηση της RhoA καθώς και σε βιολογικές αποκρίσεις, όπως η επιθηλιομεσεγχυματική μετατροπή (epithelial mesenchymal transition, EMT) και η μετανάστευση. H Net1 είναι μία πρωτεΐνη GEF που έχει, σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, ειδικότητα μόνο για τις Rho πρωτεΐνες και όχι για τις Rac1 και Cdc42. Επίσης αποτελεί ενδιαφέρον ότι συναντάται σε δύο ισομορφές, την ισομορφή 1, Net1, και την ισομορφή 2, Net1A. Οι δύο ισομορφές διαφέρουν μεταξύ τους μόνο στο αμινοτελικό άκρο τους και διαθέτουν τις ίδιες DH και PH δομικές περιοχές, που είναι υπεύθυνες για την δράση τους ως GEFs ως προς τις Rho πρωτεΐνες. Επίσης αποτελεί ενδιαφέρον ότι η Net1 είναι μία GEF που απαντάται κατά κανόνα στον πυρήνα και λιγότερο στο κυτταρόπλασμα. Σε αντίθεση με άλλες GEF πρωτεΐνες, όπως η Vaν2 που μελετήθηκε στον πρώτο πακέτο εργασίας, η Net1 δε χρειάζεται κάποια φωσφορυλίωση ή άλλη μετα-μεταφραστική τροποποίηση για να ενεργοποιηθεί και η ρύθμιση της έγκειται στη ρύθμιση του κυτταρικού εντοπισμού της. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η έκφραση και των δύο ισομορφών της Net1 με ποσοτική RT-PCR πραγματικού χρόνου (qrt-pcr) σε διάφορες φυσιολογικές και καρκινικές κυτταρικές σειρές. Από τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν αρχικά, παρατηρήθηκε ότι στα HaCaT κερατινοκύτταρα επάγεται από τον TGF-β η Net1A ισομορφή και όχι η Net1, κάτι που επίσης επιβεβαιώθηκε πολύ αργότερα και στα καρκινικά κύτταρα μαστού MDAMB231 και σε μικρότερο βαθμό στα καρκινικά κύτταρα προστάτη DU145. Στα επόμενα πειράματα μας εστιάσαμε στα HaCaT κερατινοκύτταρα, τα οποία αποτελούν ένα καλό κυτταρικό μοντέλο για τη μελέτη των μονοπατιών του TGF-β. Διερευνήθηκαν τα mrna επίπεδα της Net1A και της Net1 μετά από επώαση με TGF-β για διάφορους χρόνους από 1 ώρα 48 ώρες και βρέθηκε ότι ο TGF-β οδηγεί σε αύξηση των mrna επιπέδων της Net1A μετά από 3 ώρες επώασης, κάτι που φαίνεται να διατηρείται σε αρκετά αυξημένα επίπεδα μέχρι και τις 48 ώρες. Αντίθετα, τα επίπεδα του mrna της Net1 ισομορφής δεν αυξάνονται, ενώ αντιθέτως μετά από τις 12 ώρες ελαττώνονται σημαντικά και καταστέλλονται σε πολύ μεγάλο βαθμό μέχρι τις 48 ώρες. Στη συνέχεια, μελετήθηκε ο ρόλος του μονοπατιού των Smad στη μεταγραφική ενεργοποίηση της Net1A. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήθηκαν πειράματα υπερέκφρασης των αγρίου τύπου μορφών των πρωτεϊνών Smad2 και Smad3 με χρήση ανασυνδιασμένων αδενοϊών, καθώς και πειράματα αποσιώπησης των Smad2 και

4 Smad3 με ειδικά sirna μόρια τα οποία στοχεύουν επιλεκτικά τη Smad2 ή τη Smad3. Και από τις δύο προσεγγίσεις καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι κυρίως η Smad3 και σε μικρότερο βαθμό η Smad2 παίζει σημαντικό ρόλο στην επαγωγή της έκφρασης της Net1A από τον TGF-β. Ακολούθως, διερευνήθηκε η πιθανή εμπλοκή και άλλων μονοπατιών πέρα από το κλασικό μονοπάτι των Smad στη μεταγραφική ρύθμιση του γονιδίου της Net1. Είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία, ότι ο TGF-β πέρα από το κλασικό μονοπάτι των Smad πρωτετνών, ενεργοποιεί και ένα σύνολο άλλων μονοπατιών, όπως τα μονοπάτια των ΜAPK (mitogene activated protein kinases) Erk, p38, JNK, το μονοπάτι της PI3K και το μονοπάτι της ROCK/LΙΜΚ2/cofilin. Για να διερευνήσουμε το ρόλο αυτών των μονοπατιών στη μεταγραφική ενεργοποίηση της Net1A, χρησιμοποιήθηκε μία σειρά αναστολέων που επιλεκτικά μπλοκάρουν αρκετά από τα παραπάνω μονοπάτια. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκε σαν θετικό δείγμα ελέγχου ο αναστολέας του υποδοχέα τύπου Ι του TGF-β (TβRI), SB431542, καθώς και ο αναστολέας της ΜEK1 κινάσης UO126, ο αναστολέας της JNK κινάσης SP600125, ο αναστολέας της PI3K κινάσης LY και της ROCK κινάσης Y Από τους παραπάνω αναστολείς εκτός από τον αναστολέα του υποδοχέα του TGF-β (TβRI), SB431542, βρέθηκε επίσης ότι ο αναστολέας της ΜEK κινάσης, UO126 μειώνει τη μεταγραφική ενεργοποίηση της Net1A μετά από επώαση με TGF-β για 3 ώρες. Οι υπόλοιποι αναστολείς είχαν μηδαμινό ή πολύ μικρό αποτέλεσμα. Παράλληλα, μελετήθηκε εάν η μεταγραφική ενεργοποίηση της Net1A έναντι της Net1 ισομορφής είναι αποτέλεσμα ύπαρξης κάποιου άλλου υποκινητή που αποκρίνεται στον TGF-β επιλεκτικά ή αποτέλεσμα εναλλακτικού ματίσματος που ρυθμίζεται από τον TGF-β. Στην υπόθεση αυτή μας οδήγησε η παρατήρηση, ότι το mrna της Net1Α ισομορφής διαφέρει από το mrna της Net1 ισομορφής στο 5 άκρο, όπου τα τρία πρώτα εξόνια που είναι παρόντα στο mrna της Net1 έχουν αντικατασταθεί από μία αλληλουχία η οποία εντοπίζεται στο 3 ο ιντρόνιο του γονιδίου της Net1. Για το λόγο αυτό κλωνοποιήσαμε τον υποκινητή της Net1 (-909 βάσεις από το +1 που υποδηλώνει την έναρξη της μεταγραφής έως +57 βάσεις μετά) και τον υποθετικό υποκινητή της Net1A (- 926 βάσεις από το +1 που υποδηλώνει την 1 η βάση του mrna της Net1A έως +126 βάσεις μετά) σε σύζευξη με το γονίδιο της λουσιφεράσης (luciferase) με σκοπό τη διεξαγωγή πειραμάτων μέτρησης της ενεργότητας αυτών των υποκινητών μετά από διέγερση με TGF-β, μέσω μέτρησης της ενεργότητας της λουσιφεράσης (luciferase activity). Στα πλαίσια αυτών των πειραμάτων μετρήθηκε η ενεργότητα των παραπάνω υποκινητών σε HaCaT κερατινοκύτταρα μετά από υπερέκφραση των Smad2/Smad4, Smad3/Smad4 και του συνεχώς ενεργού υποδοχέα τύπου Ι του TGF-β, ALK5-ca. Από τα πειράματα αυτά βρέθηκε ότι κατά κύριο λόγο η υπερέκφραση του συνεχώς ενεργού υποδοχέα ALK5-ca, οδήγησε στη μέγιστη ενεργοποίηση του υποκινητή της Net1. Αντίθετα, ο υποθετικός υποκινητής της Net1A δεν ενεργοποιήθηκε σε καμία από τις παραπάνω συνθήκες. Τα παραπάνω αποτελέσματα μας οδήγησαν στο συμπέρασμα, ότι τουλάχιστον η περιοχή που κλωνοποιήθηκε ως υποθετικός υποκινητής της Net1A, δεν αποκρίνεται στους τελεστές του μονοπατιού του TGF-β και ότι η επιλεκτική αύξηση των επιπέδων mrna της Net1A ισομορφής οφείλεται κατά πάσα πιθανότητα σε μεταμεταγραφική ρύθμιση από τον TGF-β. Γνωρίζοντας ότι και οι δύο ισομορφές βρίσκονται κατά βάση στον πυρήνα και λιγότερο στο κυτταρόπλασμα, διερευνήθηκε εάν η επαγωγή της Net1A από τον TGF-β οδηγεί σε αύξηση των κυτταροπλασματικών της επιπέδων, δεδομένου, ότι η ενεργοποίηση της RhoA λαμβάνει χώρα στο κυτταρόπλασμα. Από πειράματα ανάλυσης πυρηνικών και κυτταροπλασματικών εκχυλισμάτων κατέστη σαφές, ότι πέρα από τα πυρηνικά, αυξάνονται και τα κυτταροπλασματικά επίπεδα της Net1A μετά από επίδραση με TGF-β (3 ώρες) ενώ τα επίπεδα της Net1 ισομορφής παρέμειναν σταθερά τόσο στο

5 πυρηνικό όσο στο κυτταροπλασματικό κλάσμα. Με χρήση ειδικών sirna τα οποία επιλεκτικά στοχεύουν σε κάθε μία ισομορφή και με πειράματα κατακρήμνισης συγγένειας της ενεργού RhoA δείχθηκε ότι η ενεργοποίηση της RhoA από τον TGF-β (6 ώρες) εξαρτάται από τη Net1A ισομορφή και όχι από τη Net1. Επομένως οδηγηθήκαμε στο συμπέρασμα ότι η αύξηση των κυτταροπλασματικών επιπέδων της Net1A σχετίζεται με την ενεργοποίηση της RhoA. Ενδιαφέρον αποτελεί το γεγονός ότι ενώ τα επίπεδα mrna της Net1A παραμένουν σε υψηλά επίπεδα μέχρι και τις 48 ώρες, τα πρωτετνικά επίπεδα δεν ακολουθούν αυτή την κινητική και ελαττώνονται μετά τις 24 ώρες επίδρασης με TGF-β. Πρόσφατα αναφέρθηκε στη βιβλιογραφία, ότι η πρωτεΐνη Net1A έχει μικρό χρόνο ημίσειας ζωής και ότι υπόκειται σε αποικοδόμηση από το πρωτεόσωμα. Διαπιστώσαμε, ότι και στο δικό μας κυτταρικό σύστημα, τα HaCaT κερατινοκύτταρα, η Net1A (και η Net1) έχει μικρό χρόνο ημίσειας ζωής και διερευνήσαμε την πιθανότητα τα χαμηλά πρωτετνικά επίπεδα της Net1A μετά από 24 ώρες επώασης με TGF-β σε σχέση με τα υψηλά επίπεδα mrnα, να οφείλονται σε στόχευση της Net1A για αποικοδόμηση από το πρωτεόσωμα. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήθηκαν πειράματα με χρήση του αναστολέα του πρωτεοσώματος MG132 και τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την υπόθεση ότι σε μακρόχρονη επίδραση με TGF-β (24 ώρες) η Net1A στοχεύεται για αποικοδόμηση από το πρωτεόσωμα, ενώ η Net1 ισομορφή μειώνεται σε mrna επίπεδο στους χρόνους αυτούς. Οι περισσότερες γνώσεις μας για τη Net1 πρωτεΐνη προέρχονταν από βιοχημικές μελέτες που χρησιμοποιούσαν υπερεκφρασμένες αγρίου τύπου και μεταλλαγμένες μορφές της πρωτεΐνης. Ελάχιστες μελέτες έχουν διερευνήσει το ρόλο της ενδογενούς πρωτεΐνης. Πολύ πρόσφατα δύο πολύ σημαντικές έρευνες έδειξαν ότι η Net1 πρωτεΐνη παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της πολικότητας των επιθηλιακών κυττάρων. Στη μία από αυτές τις μελέτες δείχθηκε ότι η Net1 ρυθμίζει την ενεργότητα της RhoA τοπικά στη βασική μεμβράνη των επιθηλιακών κυττάρων, η οποία ελέγχoντας ένα δίκτυο μικροσωληνίσκων διατηρεί την πολικότητα των επιθηλιακών κυττάρων. H μελέτη αυτή τονίζει ότι τα επίπεδα της Net1 μειώνονται κατά τα πρώτα στάδια της επιθηλιομεσεγχυματικής μετατροπής (ΕΜΤ). Στη δεύτερη μελέτη δείχθηκε ότι η Net1 παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των διακυτταρικών συνδέσεων που μεσολαβούνται από την E-Cadherin. Δεδομένου ότι στο σύστημα μας ο TGF-β προκαλεί μείωση των πρωτετνικών επιπέδων και των δύο ισομορφών μετά από ώρες, διερευνήσαμε το ρόλο της Net1 (Net1A και Net1) στην επιθηλιο-μεσεγχυματική μετατροπή που επάγεται από τον TGF-β στα HaCaT κερατινοκύτταρα. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν πειράματα αποσιώπησης της Net1Α και της Net1 με τη χρήση ειδικών sirna τα οποία στοχεύουν επιλεκτικά κάθε μία ισομορφή και μελετήθηκε η επίπτωση της αποσιώπησης των ισομορφών της Net1 στις διακυτταρικές συνδέσεις που μεσολαβούνται από την E-Cadherin και τη ΖΟ-1, στην έκφραση των μεσεγχυματικών δεικτών N-cadherin, fibronectin, PAI-1 και Slug, καθώς και στον κυτταροσκελετό της ακτίνης. Παρατηρήθηκε, ότι η αποσιώπηση και μόνο της Net1A απορύθμισε τις διακυτταρικές συνδέσεις που μεσολαβούνται από την E-cadherin και τη ΖΟ-1 και οδήγησε στην έκφραση των μεσεγχυματικών δεικτών N-cadherin, fibronectin, PAI-1 και του καταστολέα της E-cadherin, Slug, ενώ ενίσχυσε το μεσεγχυματικό φαινότυπο μετά από επίδραση με TGF-β, υποδηλώνοντας ότι η μείωση των επιπέδων της Net1A μετά από μακρόχρονη επίδραση με TGF-β παίζει ρόλο στην επιθηλιομεσεγχυματική μετατροπή (EMT). Επιπλέον, η αποσιώπηση της Net1A είχε σαν αποτέλεσμα τα κύτταρα να αποκτήσουν μια πιο επίπεδη διαμόρφωση και να χάσουν την περιπλασματική (cortical) χρώση της ακτίνης που είναι χαρακτηριστική των πολωμένων

6 επιθηλιακών κυττάρων, ενώ παρουσία TGF-β τα κύτταρα απέκτησαν πιο έντονη ινοβλαστοειδή μορφολογία. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε περαιτέρω ο μηχανισμός μείωσης των επιπέδων της Net1Α που μεσολαβείται από τον TGF-β με βάση πρόσφατα δεδομένα από τη βιβλιογραφία, όπου τα επίπεδα της RhoA κατά την επιθηλιομεσεγχυματική μετατροπή που μεσολαβείται από τον TGF-β σε επιθηλιακά κύτταρα μαστού μειώνονται μέσω της αποικοδόμησης από το πρωτεόσωμα και μέσω στόχευσης από το microrna, mir-155. Θελήσαμε να μελετήσουμε την πιθανή στόχευση της Net1A από κάποιο mirna, δεδομένου, ότι η Net1A (και η Net1) σχετίζεται άμεσα με τη RhoA ως ενεργοποιητής της και επιπλέον μειώνονται τα επίπεδα της κατά την επιθηλιομεσεγχυματική μετατροπή που προκαλείται από τον TGF-β. Χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα TargetScan, πραγματοποιήσαμε in silico ανάλυση της 3 UTR του mrna της Net1, η οποία στοχεύεται από τα mirna και είναι κοινή και για τις δύο ισομορφές και βρέθηκαν 6 πιθανά mirna. Από αυτά επιλέξαμε να μελετήσουμε τα mir-24, mir-155 και mir-200b, με κριτήριο την προηγούμενη συσχέτιση τους στη βιβλιογραφία με τον TGF-β ή την επιθηλιομεσεγχυματική μετατροπή. Αποτελεί ενδιαφέρον, ότι στα υποψήφια mirna βρέθηκε και αυτό που στοχεύει στη RhoA, το mir-155. Αρχικά, με πειράματα υπερέκφρασης των pre-mirnas βρέθηκε ότι το mir-24 και σε μικρότερο βαθμό το mir-155 προκαλεί τη μεγαλύτερη μείωση των mrna και πρωτεϊνικών επιπέδων της Net1A (και της Net1). H στόχευση της 3 UTR της Net1/Net1A κυρίως από το mir-24 αλλά και από το mir-155 δείχθηκε ότι είναι άμεση με πειράματα προσδιορισμού της ενεργότητας λουσιφεράσης με χρήση πλασμιδίου που φέρει την 3 UTR του mrna της Net1/Net1A σε σύζευξη με το γονίδιο της λουσιφεράσης. Ακολούθως μελετήθηκε η ρύθμιση του mir-24 και του mir-155 από τον TGF-β και βρέθηκε ότι τα επίπεδα τόσο του mir-24 όσο και του mir-155 αυξάνονται μετά από επίδραση με TGF-β για ώρες. Επίσης σε πειράματα υπερέκφρασης των Smad2 και Smad3 με χρήση αδενοϊών, δείχθηκε ότι σε αυτή την αύξηση των επιπέδων σημαντικό ρόλο παίζει κυρίως η Smad3 και λιγότερο η Smad2. Ο ρόλος του mir-24 σε σχέση με το μηχανισμό του πρωτεοσώματος στη ρύθμιση των επιπέδων της Net1A διερευνήθηκε περαιτέρω, για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν πειράματα συνδυασμού του αναστολέα του πρωτεοσώματος με τον αναστολέα του mir-24 (ASO mir-24) και μελετήθηκε η επίδραση τους στα πρωτεϊνικά επίπεδα της Net1A. Από τα πειράματα αυτά βρέθηκε ότι η αναστολή του mir-24 μέσω του ASO mir-24 οδήγησε σε μία μικρή αύξηση των επιπέδων της Net1A (μετά από 24 ώρες επίδρασης με TGF-β), ενώ η συνεισφορά του πρωτεοσώματος στην ανάκτηση των επιπέδων της Net1A ήταν πολύ σημαντικότερη, γεγονός που σημαίνει ότι το mir-24 ενδεχομένως να στοχεύει ένα μικρό κλάσμα της Net1A σε επίπεδο μετάφρασης, ενώ ο μηχανισμός του πρωτεοσώματος στοχεύει για αποικοδόμηση ένα μεγαλύτερο κλάσμα της Net1A, το οποίο έχει ήδη μεταφρασθεί. Επίσης, διερευνήθηκε ο ρόλος του mir-24 στην επιθηλιομεσεγχυματική μετατροπή και βρέθηκε ότι η υπερέκφραση του mir-24 από μόνη της απορύθμισε τις διακυτταρικές συνδέσεις που μεσολαβούνται από την E-cadherin και τη ΕΟ-1 και οδήγησε στην έκφραση των μεσεγχυματικών δεικτών N-cadherin, fibronectin, PAI-1 και του καταστολέα της E-cadherin, Slug, ενώ ενίσχυσε το μεσεγχυματικό φαινότυπο κατά πολύ μετά από επίδραση με TGF-β. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν, ότι το mir-24 παίζει ρόλο στην ΕΜΤ που επάγεται από τον TGF-β στα HaCaT κερατινοκύτταρα. Τέλος, η παραπάνω μελέτη επεκτάθηκε και σε καρκινικά κύτταρα και βρέθηκε ότι τα επίπεδα του mir-24, αλλά και του mir-155, αυξάνονται μετά από επίδραση με TGF-β για ώρες σε διάφορες καρκινικές σειρές (T47D, MDAMB231, MCF7, DU145). Παράλληλα τα επίπεδα mrna της Net1 ισομορφής μειώνονται σημαντικά μετά από ώρες επίδρασης με TGF-β σε όλες τις καρκινικές σειρές που μελετήθηκαν, ενώ τα

7 επίπεδα mrna της Net1A βρέθηκαν να αυξάνονται μετά από 3 ώρες επίδρασης με TGF-β σε δύο καρκινικές σειρές μαστού (MDAMB231 και T47D). Επίσης, δείχθηκε ότι το mir-24 παίζει σημαντικό ρόλο στη διεισδυτικότητα καρκινικών κυττάρων μαστού (MCF- 7, BT474, SKBR3, T47D) που επάγεται από τον TGF-β μέσω στόχευσης της Net1A. Ενδιαφέρον αποτελεί ότι μετά από ανάλυση με qrt-pcr των επιπέδων mrna της Net1A και του mir-24 σε ζεύγη δειγμάτων ασθενών με πρωτογενή και μεταστατικό καρκίνο μαστού βρέθηκαν χαμηλά επίπεδα mrna της Net1A και υψηλά επίπεδα του mir-24 στα μεταστατικά δείγματα σε σχέση με τους πρωτογενείς όγκους. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ένα σημαντικό ρόλο για το mir-24 και τη Net1A στον καρκίνο του μαστού και αναμένεται να δειχθεί στο μέλλον με μεγαλύτερη σαφήνεια ο ρόλος τους στην επιθηλιομεσεγχυματική μετατροπή, την καρκινογένεση και τη μετάσταση.