Ιστοχηµική ανίχνευση υδατανθράκων σε τοµές παραφίνης διαφόρων ιστών

Ιστοχηµική ανίχνευση υδατανθράκων σε τοµές παραφίνης διαφόρων ιστών

94

ΙΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ Υ ΑΤΑΝΘΡΆΚΩΝ ΣΕ ΤΟΜΕΣ ΠΑΡΑΦΙΝΗΣ ΑΠΟ ΙΑΦΟΡΟΥΣ ΙΣΤΟΥΣ Σκοπός της άσκησης : ο µικροσκοπικός εντοπισµός ενώσεων σε ένα ιστό µε τη χρήση εξειδικευµένων χρωστικών και η εξοικείωση µε έννοιες όπως αποπαραφινοποίηση, ενυδάτωση, αφυδάτωση. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι όροι ιστοχηµεία (histochemistry) και κυτταροχηµεία (cytochemistry) αναφέρονται στην µεθοδολογία ανίχνευσης της χηµικής φύσης των συστατικών των ιστών ή κυττάρων. Για τον σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται ειδικές χρωστικές και στην συνέχεια γίνεται η µικροσκοπική παρατήρηση. Με τη χρήση των αυτών των µεθόδων δίνεται η δυνατότητα να πάρει κανείς πληροφορίες όχι µόνο για την χηµική φύση και για την τοπογραφία µιας κυτταρικής ουσίας ή οργανιδίου αλλά ακόµα και πληροφορίες για κυτταρικές λειτουργίες (π.χ. βιωσιµότητα κυττάρων, αλλαγή του ph των λυοσωµάτων κ.α.). Συνδέεται δηλαδή η µορφολογία µε την λειτουργία. Για παράδειγµα, η όξινη φωσφατάση είναι χαρακτηριστικό ένζυµο των λυοσωµάτων και χρησιµοποιείται για την ανίχνευση τους και την παρακολούθηση της τύχης τους στις διάφορες κυτταρικές δραστηριότητες. Εποµένως η αξία τους στη µελέτη της φυσιολογίας των κυττάρων και ιστών κάτω από φυσιολογικές και παθολογικές συνθήκες είναι προφανής. Γι' αυτό χρησιµοποιείται εκτεταµένα σε διάφορα πεδία της Ιατρικής (αιµατολογία, παθολογία, κυτταρογενετική) αλλά και άλλων κλάδων όπως στην Τεχνολογία τροφίµων. Οι γενικές αρχές στις οποίες στηρίζονται οι ιστοχηµικές και κυτταροχηµικές µέθοδοι δίνονται παρακάτω: α) Οι περισσότερες από τις µεθόδους αυτές βασίζονται συνήθως στον σχηµατισµό ενός αδιάλυτου χρωµατιστού ιζήµατος ή συµπλόκου ως τελικό προϊόν της αντίδρασης. β) Οι µέθοδοι θα πρέπει να είναι τέτοιες που να διατηρούν όσο το δυνατόν περισσότερο την δοµή των ιστών και των κυττάρων. Γι αυτό θα πρέπει να αποφεύγεται η χρήση ισχυρών οξέων ή βάσεων. γ) Θα πρέπει να είναι ειδικές για τις χηµικές οµάδες ή ουσίες που θα µελετηθούν. 95

δ) Θα πρέπει να είναι αρκετά ευαίσθητες ώστε να µπορεί να γίνει ανίχνευση ουσιών που υπάρχουν στους ιστούς ή τα κύτταρα σε πολύ µικρές ποσότητες. ε) Θα πρέπει να περιορίζουν όσο το δυνατόν περισσότερο την διάχυση των χηµικών οµάδων ή ουσιών από τις αρχικές τους θέσεις για να γίνεται σωστά ο εντοπισµός τους. Αυτό µπορεί να γίνει εύκολα µε τα αδιάλυτα συστατικά, π.χ. το φωσφορικό ασβέστιο ή µε τα µακροµόρια (πρωτεΐνες ή νουκλεοπρωτεΐνες). Είναι όµως πολύ δύσκολο για τις ευδιάλυτες ουσίες (συνήθως µικρού µοριακού βάρους) που µπορούν να διαχυθούν όπως συµβαίνει µε τα ιόντα, τους ολιγοσακχαρίτες, τα ολιγοπεπτίδια, κ λ π. Οι παραπάνω αρχές όµως εκπληρώνονται µόνο από µερικές αντιδράσεις και αυτό εξηγεί γιατί χρησιµοποιούµε πολύ περισσότερες χηµικές σε σχέση µε ιστοχηµικές µεθόδους και γιατί µερικές φορές µπορεί να γίνουν λάθη στον εντοπισµό διαφόρων ουσιών στα κύτταρα ή τους ιστούς. Με τη βοήθεια των διαφόρων ιστοχηµικών µεθόδων µπορεί να ανιχνευτεί µία µεγάλη ποικιλία χηµικών ουσιών όπως: οργανικές ρίζες (αµινοµάδες, διπλοί δεσµοί άνθρακα κ.α.) που αποτελούν συστατικά βιοπολυµερών ή και µικρότερων µορίων, ανόργανα ιόντα όπως ασβεστίου, σιδήρου, φωσφορικά κ.α. Τα ιόντα αυτά µπορεί να βρίσκονται σαν ανόργανες αποθέσεις, π.χ. στα οστά, ή συνδεδεµένα µε διάφορα οργανικά µόρια. Μερικές φορές έχουν τα ίδια βιολογικό ενδιαφέρον όπως είναι το ασβέστιο που εναποτίθεται κατά τον σχηµατισµό των οστών ή είναι συνέπεια παθολογικής ασβέστωσης των κατεστραµµένων ιστών. Σε άλλες περιπτώσεις χρησιµοποιούνται ως ιστοχηµικοί σηµατοδότες άλλων χηµικών συστατικών. Π.χ. οι αλδεϋδοµάδες συνήθως δεν βρίσκονται σε µεγάλες συγκεντρώσεις στους ιστούς. Μπορούν όµως να παραχθούν από συστατικά των ιστών όπως από DNA και πολυσακχαρίτες µετά από ειδική κατεργασία και ν ανιχνευτούν. Με την ανίχνευση τέτοιων αλδεϋδοµάδων ουσιαστικά ανιχνεύεται ή DNA (µέθοδος Feulgen) ή πολυσακχαρίτες (µέθοδος PAS). ΙΣΤΟΧΗΜΙΚΕΣ-ΚΥΤΤΑΡΟΧΗΜΙΚΕΣ ΧΡΩΣΤΙΚΕΣ Όλες οι ιστοχηµικές-κυτταροχηµικές χρωστικές έχουν στο µόριό τους δύο χαρακτηριστικές οµάδες: α) εκείνες που απορροφούν στο ορατό φως (χρωµοφόρες οµάδες) και β) εκείνες που αντιδρούν και ενώνονται µε τις χηµικές ουσίες των ιστών-κυττάρων (αυξόχρωµες οµάδες). Πολλές αντιδράσεις µεταξύ των χρωστικών και των κυτταρικών συστατικών είναι ηλεκτροστατικής φύσης. δηλαδή ένα θετικά φορτισµένο µόριο κάποιου κυτταρικού οργανιδίου έλκει µία αρνητικά φορτισµένη χρωστική και το αντίθετο. Έτσι οι χρωστικές διακρίνονται σε 96

ανιοντικές (όξινες) και κατιοντικές (βασικές). Τα δε κυτταρικά συστατικά σε οξεόφιλα ή βασεόφιλα ανάλογα αν ενώνονται µε όξινες ή βασικές χρωστικές. Με βασικές χρωστικές µπορούµε να βάψουµε τα νουκλεϊκά οξέα και τους όξινους πολυσακχαρίτες. Με όξινες χρωστικές από τις πρωτεΐνες ειδικά τις ιστόνες, γιατί αποτελούνται σε µεγάλο ποσοστό από βασικά αµινοξέα. Όξινες χρωστικές που χρησιµοποιούνται συχνά στην είναι η εωζίνη, η όξινη φουξίνη κ.ά. Βασικές είναι το µπλε της τολουϊδίνης, η αιµατοξυλίνη και το µπλε του µεθυλενίου. Το πώς θα βάψει µια χρωστική έναν ιστό εξαρτάται από τον τρόπο µονιµοποίησης και έγκλεισης του ιστού και κυρίως από το ph στο οποίο γίνεται η αντίδραση χρώσης. Ο βαθµός διάστασης των οµάδων των κυτταρικών µορίων που ιονίζονται αλλάζει σηµαντικά µε τις αλλαγές του ph. Σε ένα ph λίγο µεγαλύτερο από µία µονάδα πάνω από το pk (το pk µιας ιοντιζόµενης οµάδας ορίζεται σαν το ph στο οποίο η συγκέντρωση των οµάδων που έχουν διασταθεί είναι ίση µε τη συγκέντρωση των οµάδων που δεν έχουν διασταθεί) µία όξινη οµάδα είναι σχεδόν τελείως ιοντισµένη και µία βασική σχεδόν τελείως µη ιονισµένη. Το αντίθετο συµβαίνει σε ένα ph λίγο µικρότερο από µία µονάδα κάτω από το pk. Η συµπεριφορά των πρωτεϊνών κατά τη χρώση εξαρτάται από το σχετικό αριθµό και τύπο των όξινων και βασικών αµινοξέων που έχουν τα πρωτεϊνικά µόρια καθώς και από το καθαρό φορτίο τους. Σε χαµηλές τιµές ph οι πρωτεΐνες έχουν ένα θετικό καθαρό φορτίο (οι όξινες οµάδες τους δεν είναι ιονισµένες και οι βασικές σχεδόν όλες πρωτονιοµένες και συνεπώς θετικά φορτισµένες). Αν το ph αυξηθεί οι όξινες οµάδες αρχίζουν να διϊστανται και προκύπτουν αρνητικά φορτία η αλληλεπίδραση των οποίων µε τα θετικά φορτία των βασικών αµινοξέων ελαττώνει το θετικό καθαρό φορτίο. Σ' ένα ορισµένο ph, το οποίο ποικίλει από πρωτείνη σε πρωτείνη, ο αριθµός των αρνητικών φορτίων εξισορροπείται ακριβώς από τον αριθµό των θετικών φορτίων. Η πρωτείνη τότε δεν έχει ούτε θετικό ούτε αρνητικό καθαρό φορτίο. Το ph αυτό είναι γνωστό σαν ισοηλεκτρικό σηµείο (Ι.Σ.) της πρωτείνης. Το Ι.Σ. είναι ψηλό σε πρωτείνες που έχουν σε µεγάλο ποσοστό βασικά αµινοξέα και χαµηλό σε πρωτείνες µε µεγάλο ποσοστό σε όξινα. Οι περισσότερες φυσικές πρωτείνες είναι όξινες µε Ι.Σ. µεταξύ 4 και 6. Σε ph µεγαλύτερα του ισοηλεκτρικού σηµείου τα βασικά αµινοξέα των πρωτεϊνών αρχίζουνν να αποπρωτονιώνονται και να χάνουν τα θετικά φορτία τους µε συνέπεια οι πρωτείνες να εµφανίζουν αρνητικό το καθαρό τους φορτίο το οποίο και αυξάνει όσο αυξάνει το ph. Π.χ. η φιµπρίνη, µία πρωτείνη του ορού έχει Ι.Σ. περίπου 5,6. Σ' αυτό το ph δε βάφεται καλά ούτε από τις κατιονικές ούτε από τις ανιονικές χρωστικές παρά το γεγονός ότι υπάρχουν στην πρωτείνη και θετικά και αρνητικά φορτία. Η συµπεριφορά αυτή της φιµπρίνης δείχνει ότι το καθαρό φορτίο των πρωτεϊνών είναι σηµαντικός παράγοντας καθορισµού των ηλεκτροστατικών τους ιδιοτήτων που είναι υπεύθυνες για την αντίδραση χρώσης. Όταν το ph ελαττώνεται, το θετικό φορτίο της 97

φιµπρίνης αυξάνει και καταλήγει σε µία αντίστοιχη αύξηση της δεσµευτικής ικανότητας µε την ανιονική χρωστική ενώ ουσιαστικά δε συνδέεται µε την κατιονική χρωστική. Η χηµική συγγένεια της φιµπρίνης µε την κατιονική χρωστική αυξάνει σαφώς σε τιµές ph πάνω από το Ι.Σ. στις οποίες φέρνει αρνητικό καθαρό φορτίο. Με βάση τις παραπάνω πληροφορίες µπορούµε να προβλέψουµε κατά προσέγγιση το ph στο οποίο µπορεί να βαφτεί µία τοµή µε µία βασική ή µε µία όξινη χρωστική. Οι όξινοι πολυσακχαρίτες είναι αρνητικά φορτισµένοι γι' αυτό και χρωµατίζονται µε κατιονικές χρωστικές. Το καθαρό φορτίο που φέρουν τα µόριά τους είναι σχεδόν ανεξάρτητο του ph λόγω του χαµηλού pk των οµάδων τους που µπορούν να ιονιστούν. Φυσικά οι αντιδράσεις χρώσης των όξινων και βασικών χρωστικών δεν είναι ειδικές. Υπάρχουν όµως και χρωστικές µε εξειδικευµένες αντιδράσεις χρώσης όπως η λευκοβασική φουξίνη (αντιδραστήριο Schiff) που βάφει εκλεκτικά τις γειτονικές γλυκολικές οµάδες των υδατανθράκων µετά από µία συγκεκριµένη κατεργασία των παρασκευασµάτων. Οι περισσότερες χρωστικές µπορούν να βάφουν τα κυτταρικά συστατικά µε το ίδιο χρώµα που έχουν κι αυτές (ορθοχρωµατικές). Μερικές όµως έχουν την ικανότητα να βάφουν µε διαφορετικό χρώµα από εκείνο που έχουν οι ίδιες τα διάφορα κυτταρικά συστατικά. Το φαινόµενο αυτό ονοµάζεται µεταχρωµατισµός και οι χρωστικές µεταχρωµατικές. Π.χ. η χρωστική µπλε της τολοϋδίνης έχει την ικανότητα να χρωµατίζει µπλε ορισµένα µακροµόρια (ορθοχρωµατική χρώση) ενώ άλλα τα χρωµατίζει κόκκινα (µεταχρωµατική χρώση). Οι ουσίες που αλλάζουν το χρώµα µιας µεταχρωµατικής χρωστικής είναι συνήθως πολυµερή µε πολυάριθµες όξινες οµάδες που βρίσκονται πολύ κοντά η µία στην άλλη όπως π.χ. οι γλυκοζαµινογλυκάνες. Τα µόρια της χρωστικής που συνδεόνται µε τις οµάδες αυτές τις φέρνουν ακόµα πιο κοντά µε αποτέλεσµα την αλλαγή στην απορρόφηση του φωτός και εποµένως και την αλλαγή του χρώµατος. Παρασκευάσµατα-µάρτυρες Στην ιστοχηµεία-κυτταροχηµεία η χρήση θετικών και αρνητικών µαρτύρων είναι πολύ σηµαντική γιατί κατά την κατεργασία του παρασκευάσµατος µπορεί να προκύψουν αλλοιώσεις µε τελικό αποτέλεσµα να καταλήξει κανείς σε λάθος συµπεράσµατα ως προς την ύπαρξη ή µη ενός συστατικού ή ως προς την τοπογραφία του στο υπό εξέταση παρασκεύασµα. Για παράδειγµα µπορεί να υπάρχει η χηµική ουσία στον ιστό και να έχει απενεργοποιηθεί (π.χ. ένζυµο) ή να έχει εκχυλιστεί (π.χ. ιόντα µολύβδου) κατά την µονιµοποίηση ή έγκλειση του ιστού. Αλλά και αντίθετα να µην υπάρχει η ουσία και να λαµβάνεται θετική αντίδραση σε περιοχές που δεν την περιέχουν λόγω διάχυσης ή λόγω προσρόφησης. 98

Ως θετικοί µάρτυρες χρησιµοποιούνται στην Ιστοχηµεία τοµές που είναι γνωστό ότι είναι πλούσιες στο προς ανίχνευση συστατικό. Για παράδειγµα, για ανίχνευση των θετικών στη χρώση PAS χηµικών ενώσεων, µπορεί να χρησιµοποιηθεί µία τοµή συκωτιού που είναι πολύ πλούσιο σε γλυκογόνο και συνεπώς σε αλδεϋδοµάδες µετά την ειδική οξείδωση µε το υπεριωδικό οξύ (βλ. παρακάτω). Οι αρνητικοί µάρτυρες µπορεί να γίνουν µε διάφορους τρόπους. Για παράδειγµα α) µπλοκάροντας ή αδρανοποιώντας τις οµάδες που αντιδρούν. π.χ. µε ακετυλίωση των 1,2 γλυκολοµάδων των πολυσακχαριτών εµποδίζεται η αντίδραση τους µε το υπεριωδικό. β) χρησιµοποιώντας ένζυµα που αποικοδοµούν τις ουσίες που θέλουµε να ανιχνεύσουµε. π.χ. µε προσθήκη αµυλάσης διασπάται το γλυκογόνο και δεν ανιχνεύεται µε τη µέθοδο PAS. γ) παραλείποντας τις αντιδράσεις που θα δηµιουργήσουν τις προς ανίχνευση ουσίες. π.χ. παραλείποντας κατά την ανίχνευση ενός ενζύµου το υπόστρωµά του κ.ά. Ανίχνευση υδατανθράκων µε τη µέθοδο PAS Γενικά οι υδατάνθρακες που ανιχνεύονται στους ιστούς είναι: πολυσακχαρίτες απλοί που αποτελούνται µόνο από εξόζες και έχουν δοµικό ή αποθηκευτικό ρόλο (π.χ. γλυκογόνο, άµυλο, χιτίνη, κυτταρίνη) και ετεροπολυσακχαρίτες που περιέχουν εξοζαµίνες όπως είναι οι γλυκοζαµινογλυκάνες (GAGs). Οι γλυκοζαµινογλυκάνες (ή βλεννοπολυσακχαρίτες) είτε ελεύθερες είτε ως συστατικό των πρωτεογλυκανών απαντούν κυρίως στην εξωκυτταρική ύλη. Επίσης ανιχνεύοντας στην επιφάνεια της κυτταροπλασµατικής µεµβράνης ολιγοσακχαρίτες που βρίσκονται µε τη µορφή συµπλόκων µε πρωτεΐνες (γλυκοπρωτεΐνες) ή λιπίδια (γλυκολιπίδια). Μία σηµαντική µέθοδος ανίχνευσης των παραπάνω υδατανθράκων είναι η αντίδραση υπεριωδικού οξέος- Schiff (Periodic Acid-Sciff: PAS). Βασίζεται στο ότι οι περισσότεροι υδατάνθρακες περιέχουν 1,2 γλυκολοµάδες (CHOH-CHOH) οι οποίες µετά την οξείδωση µε το υπεριωδικό οξύ σχηµατίζουν διαλδεΰδες (CHO-CHO). Οι αλδεΰδες αυτές στη συνέχεια αντιδρούν µε το αντιδραστήριο Schiff (διάλυµα της χρωστικής φουξίνη σε θειώδες οξύ) και σχηµατίζουν ένα σύµπλοκο φούξια χρώµατος. Κανένας υδατάνθρακας δεν δίνει θετική αντίδραση (φούξια χρώµα) µε το αντιδραστήριο Schiff αν προηγουµένως δεν παραχθούν από αυτόν αλδεϋδοµάδες. Κάθε δοµή που βάφεται µε αυτό το χρώµα θεωρείται PAS-θετική. Να σηµειωθεί ότι µπορεί να βαφούν και κάποια φωσφολιπίδια. εν βάφεται όµως το DNA και το RNA γιατί τα σάκχαρά τους δεν έχουν 1,2 γλυκολοµάδες. Εποµένως, ουσίες που είναι θετικές στο αντιδραστήριο Schiff χωρίς την οξείδωση του υπεριωδικού οξέος δεν είναι απαραίτητα υδατάνθρακες. Γι' αυτό είναι απαραίτητη η χρησιµοποίηση τοµών ελέγχου (µάρτυρες) για να βρούµε ποιές ουσίες είναι θετικές στο αντιδραστήριο Schiff µόνο µετά την ειδική οξείδωση. 99

Επίσης επειδή τα συνηθισµένα µονιµοποιητικά είναι αλδεΰδες θα πρέπει πριν ο ιστός ή τα κύτταρα εκτεθούν στο αντιδραστήριο Schiff να έχουν ξεπλυθεί πολύ καλά ώστε να µην υπάρχουν στις τοµές ίχνη µονιµοποιητικού. Τέλος αφού βγάλουµε την αντικειµενοφόρο από το διάλυµα Schiff καλό είναι πριν την µεταφέρουµε στο νερό να την ξεπλύνουµε µε θειώδες οξύ. Το θειώδες οξύ διώχνει την περίσσεια του αντιδραστηρίου Schiff και εµποδίζει την οξείδωση ξανά σε βασική φουξίνη. Αν µεταφέρουµε την τοµή κατευθείαν στο νερό τότε θα ξανασχηµατιστεί η βασική φουξίνη που µπορεί να βάψει το παρασκεύασµα και να πάρουµε έτσι ψεύτικα θετικά αποτελέσµατα. 100

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΑ Μικροσκόπιο Τοµές εντέρου, στοµαχιού, όρχεων, νεφρών ποντικού οχεία χρώσης Ποτήρια ζέσεως Λαβίδες Καλυπτρίδες Αντικειµενοφόροι DPX ιηθητικό χαρτί ΙΑΛΥΜΑΤΑ Υδατικό διάλυµα υπεριωδικού οξέος 0,5% Αντιδραστήριο Schiff ιάλυµα θειώδους οξέος: 0,9 gr µεταθειώδες κάλιο + 7,5ml 1NCl + 150ml Η 2 Ο ιάλυµα αιµατοξυλίνης Ξυλόλη Απόλυτη αιθανόλη Αιθανόλη 90% Αιθανόλη 70% ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ ιαδικασία χρώσης Για τα δείγµατα και τους µάρτυρες θα ακολουθείται η ίδια διαδικασία. Θα παραλειφθεί µόνο για τους µάρτυρες το βήµα της ειδικής οξείδωσης µε υπεριωδικό οξύ. Αποπαραφινοποίηση Ξυλόλη 5 Ξυλόλη 5 Ενυδάτωση 101

Αιθανόλη 100% 3 Αιθανόλη 90% 3 Αιθανόλη 70% 3 Αποσταγµένο νερό 5 Ειδική οξείδωση (µόνο τα δείγµατα) Υπεριωδικό οξύ 0,5% 5 Αποσταγµένο νερό 5 Χρώση ιάλυµα Schiff 5 ιάλυµα θειώδους οξέος 5 Αποσταγµένο νερό 3x2 Στην περίπτωση που θέλουµε να χρωµατιστούν και οι περιοχές που δεν είναι θετικές στο PAS τεστ διαλέγουµε µια γενική χρωστική µε διαφορετικό χρώµα από το φούξια π.χ. αιµατοξυλίνη που βάφει µπλε. Για το σκοπό αυτό µετά το ξέπλυµα από το θειώδες οξύ βάφουµε τις τοµές µε διάλυµα αιµατοξυλίνης για 1 (1 σταγόνα/τοµή) και στη συνέχεια ξεπλένουµε µε νερό της βρύσης σύµφωνα µε τις οδηγίες του υπεύθυνου της άσκησης. Αφυδάτωση. Αιθανόλη 70% 2 Αιθανόλη 90% 2 Απόλυτη αιθανόλη 2 ιαύγαση. Ξυλόλη για 2 Επικάλυψη διηθητικό χαρτί, στέγνωµα και τοποθέτηση υλικού επικάλυψης (DPX) στις τοµές. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΤΟΜΩΝ ΕΝΤΕΡΟΥ ΚΑΙ ΟΡΧΕΩΝ Λεπτό έντερο Το λεπτό έντερο αποτελείται από 3 µέρη: το δωδεκαδάκτυλο, τη νήστιδα και τον ειλεό. Στα τρία αυτά τµήµατα, παρά τις κάποιες διαφορές, το τοίχωµα έχει την ίδια βασική οργάνωση. Συνίσταται από 4 οµόκεντρους χιτώνες οι οποίοι αρχίζοντας από τον αυλό του εντέρου προς τα έξω, είναι κατά σειρά: ο βλεννογόνος, ο υποβλεννογόνος, ο µυϊκός και ο ορογόνος χιτώνας (εικ. 1) 102

Εικόνα 1. Λεπτό έντερο. εξιά: ιαγραµµατική απεικόνιση επιµήκους τοµής λεπτού εντέρου. 1. Λάχνη 7. Χόριο βλεννογόνου 2. Επιθήλιο βλεννογόνου 8. Μυϊκή στοιβάδα βλεννογόνου 3. Αγγείο 9. Υποβλεννογόνος χιτώνας 4. Καλυκοειδές κύτταρο 10. Μυϊκός χιτώνας 5. Απορροφητικό κύτταρο 11. Ορογόνος χιτώνας 6. Κρύπτη Αριστερά: α) εγκάρσια τοµή λάχνης β) εγκάρσια τοµή κρύπτης 1. Καλυκοειδές κύτταρο 3. Αγγείο 1. Καλυκοειδές κύτταρο 2. Μικρολάχνες 4. Χόριο 2. Εντεροενδοκρινές κύτταρο 3. Κύτταρο Paneth Ο λειτουργικός ρόλος του εντέρου είναι να εκκρίνει διάφορες ορµόνες οι οποίες έχουν σχέση µε την κινητικότητά του και την έκκριση γαστρικών υγρών, να συνεχίζει και σχεδόν να συµπληρώνει την πέψη της τροφής και να απορροφά µέσω του βλεννογόνου τους προκύπτοντες µεταβολίτες οι οποίοι στη συνέχεια περνούν στα αιµοφόρα και λεµφικά αγγεία. Η πεπτική και απορροφητική λειτουργία του εντέρου διευκολύνεται από ειδικούς σχηµατισµούς, τις λάχνες που είναι δακτυλοειδείς προεκβολές του βλεννογόνου και τις πτυχές που είναι σπειροειδείς αναδιπλώσεις του βλεννογόνου και υποβλεννογόνου (σχ. 1). Η απορροφητικότητα µάλιστα του εντέρου αυξάνει ακόµα περισσότερο λόγω των µικρολαχνών των απορροφητικών κυττάρων οι οποίες αυξάνουν κατά πολύ την επιφάνεια των κυττάρων αυτών. Ο βλεννογόνος χιτώνας περιλαµβάνει το επιθήλιο, το χόριο και τη βλεννογόνο µυϊκή στοιβάδα. Το επιθήλιο εισχωρεί σε πολλά σηµεία στο χόριο και σχηµατίζει τις κρύπτες ή αδένες του βλεννογόνου (σχ. 1). Αποτελείται από: α) τα κυλινδρικά απορροφητικά κύτταρα τα 103

οποία στην ελεύθερη επιφάνειά τους φέρουν πολυάριθµες µικρολάχνες που καλύπτονται από τον γλυκοκάλυκα και στον οποίο δεσµεύονται διάφορα ένζυµα. β) τα καλυκοειδή κύτταρα που είναι µονοκύτταροι αδένες διασπαρµένοι ανάµεσα στα απορροφητικά. Παράγουν τη βλέννα η οποία δρα ως κάλυµµα και προστατεύει το επιθήλιο. γ) τους διάφορους τύπους εντεροενδοκρινών κυττάρων τα οποία είναι και αυτά διάσπαρτα στο επιθήλιο και παράγουν και εκκρίνουν τις διάφορες εντεροορµόνες και δ) τα αδιαφοροποίητα κύτταρα, στη βάση των εντερικών κρυπτών, για την αναπλήρωση των κατεστραµµένων επιθηλιακών κυττάρων. Στη βάση των κρυπτών υπάρχουν επίσης τα κύτταρα Paneth που εκκρίνουν το αντιβακτηριακό ένζυµο λυσοζύµη. Το χόριο αποτελείται από ένα χαλαρό συνδετικό ιστό ο οποίος διατρέχεται από λεµφαγγεία και αιµοφόρα αγγεία, απολήξεις νεύρων και λεµφοζίδια (αθροίσµατα λεµφοκυττάρων) τα οποία αθροίζονται σε οµάδες και σχηµατίζουν πλακόµορφες δοµές (πλάκες Peyer) µόνο στον ειλεό. Το χόριο καταλαµβάνει το κέντρο των λαχνών και τον χώρο που παρεµβάλλεται µεταξύ των πολυαρίθµων εντερικών κρυπτών (σχ. 1). Η µυϊκή στοιβάδα του βλεννογόνου αποτελείται από δύο λεπτές στοιβάδες λείων µυϊκών κυττάρων, µια εσωτερική κυκλική και µια εξωτερική επιµήκη. Ο υποβλεννογόνος είναι ένας συνδετικός ιστός πλούσιος σε ελαστικές ίνες που συνδέει το βλεννογόνο µε το µυϊκό χιτώνα. Ο υποβλεννογόνος διατρέχεται επίσης από λεµφικά, αιµοφόρα αγγεία και νευρικές ίνες και στο δωδεκαδάκτυλο µόνο φέρει και αδένες (δωδεκαδακτυλικοί αδένες). Ο µυϊκός χιτώνας αποτελείται από δύο στοιβάδες λείων µυϊκών ινών α) την εξωτερική ή επιµήκη και β) την εσωτερική ή κυκλική στοιβάδα. Ο µυϊκός χιτώνας γίνεται παχύτερος προχωρώντας από το δωδεκαδάκτυλο στον ειλεό. Ο ορογόνος χιτώνας αποτελείται από ένα λεπτό αραιό συνδετικό ιστό στον οποίο επικάθεται εξωτερικά ένα µονόστιβο πλακώδες επιθήλιο. Παχύ έντερο ιακρίνεται σε 3 τµήµατα: το τυφλό, το κόλον και το απευθυσµένο. Κύριος ρόλος του είναι η απορρόφηση ηλεκτρολυτών, υγρών και αερίων. Φιλοξενεί βακτήρια που παράγουν βιταµίνες για την αιµοποίηση και πήξη του αίµατος. Το τοίχωµά του περιλαµβάνει τους 4 χιτώνες που έχει και το τοίχωµα του λεπτού, µε κάποιες διαφοροποιήσεις. Ο βλεννογόνος είναι παχύτερος χωρίς λάχνες και πλάκες Peyer. Το επιθήλιό του αποτελείται από τους ίδιους τύπους κυττάρων όπως το λεπτό µε επικρατούντα τα καλυκοειδή. Οι κρύπτες είναι ευθύγραµµες και επιµηκέστερες από εκείνες του λεπτού εντέρου. 104

Όρχεις Οι όρχεις είναι τα αρσενικά γενετικά όργανα στα οποία επιτελείται η σπερµατογένεση και εκκρίνεται η ανδρική ορµόνη τεστοστερόνη. Κάθε όρχις περιλαµβάνει έναν εξωτερικό ινώδη χιτώνα που αποτελείται από πυκνό συνδετικό ιστό. Κάτω από αυτόν συνεχίζει ένας αραιός συνδετικός ιστός ο διάµεσος ιστός, πλούσιος σε λεµφικά και αιµοφόρα αγγεία και περιλαµβάνει µεταξύ των άλλων τύπων κυττάρων τα διάµεσα κύτταρα ή κύτταρα του Leydig που εκκρίνουν την τεστοστερόνη. Ο ιστός αυτός εισχωρεί ανάµεσα στα σπερµατικά σωληνάρια. Τα σπειροειδή σπερµατικά σωληνάρια ξεκινούν αµέσως κάτω από τον ινώδη χιτώνα (σχ. 2). Το τοίχωµά τους περιλαµβάνει ένα συνδετικό επικάλυµµα, τη βασική µεµβράνη και το πολύστοιβο γενετικό ή βλαστικό επιθήλιο που αποτελείται από σπερµατογόνα κύτταρα σε διάφορα στάδια σπερµατογένεσης (σπερµατογόνια, σπερµατοκύτταρα 1 ης και 2 ης τάξης, σπερµατίδες, σπερµατοζωάρια) και τα κύτταρα Sertoli. Τα κύτταρα Sertoli έχουν πολύ ανώµαλο σχήµα εφάπτονται στη βασική µεµβράνη και περιβάλλουν τα σπερµατογόνα κύτταρα (σχ. 2). Χρησιµεύουν για τη στήριξη και θρέψη των σπερµατογόνων κυττάρων και σπερµατοζωαρίων τα οποία αποτελούν το µεγαλύτερο τµήµα του γενετικού επιθηλίου. 1 3 1 2 4 5 6 7 Εικόνα 2. Φωτογραφία εγκάρσιας τοµής σπερµατικών σωληναρίων 1. Αυλός σωληναρίου 5. Σπερµατογόνα 2. Σπερµατοζωάρια 6. Βασική µεµβράνη 3. Σπερµατίδες 7. ιάµεσα κύτταρα 4. Σπερµατοκύτταρα 105

106