ΟΧΗΜΑΤΑ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗΣ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΓΙΑ ΤΗ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ

Πανεπιστήµιο Πατρών, Σχολή Επιστηµών Υγείας, Τµήµα Ιατρικής, Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας Μεταπτυχιακό Πρόγραµµα Εφαρµογές Στις Βασικές Ιατρκές Επιστήµες ΟΧΗΜΑΤΑ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗΣ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΓΙΑ ΤΗ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΩΝ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΩΝ Σταύρος Πολυβίου Ιατρός Επιβλέπουσα Καθηγήτρια Αγλαΐα Αθανασιάδου Πάτρα, Νοέµ βριος 2005

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ i ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ iv ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ v 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 1.1 Γονιδιακή Θεραπεία Βασικές αρχές 1 1.2 Ο γενετικός τόπος των β-σφαιρινικών γονιδίων 2 1.3 Αιµοσφαιρινοπάθειες - Η β-θαλασσαιµία και η δρεπανοκυτταρική αναιµία 7 1.4 Αιµοσφαιρινοπάθειες και γονιδιακή θεραπεία 10 1.5 Κατηγοριοποίηση οχηµάτων γονιδιακής µεταφοράς 15 1.5.1 Ιϊκά οχήµατα γονιδιακής µεταφοράς 15 1.5.2 Μη ιϊκά οχήµατα γονιδιακής µεταφοράς 18 1.6 Το όχηµα hβ-s/mar(a) 25 i

2 ΣΚΟΠΟΣ 28 3 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 29 3.1 Μέθοδοι 29 3.1.1 ιατήρηση κυτταρικής καλλιέργειας MEL 29 3.1.2 Αποµόνωση γονιδιωµατικού DNA από ευκαρυωτικά κύτταρα 3.1.3 Επαγωγή ερυθροειδικής διαφοροποίησης διαµολυσµένης ευκαρυωτικής κυτταρικής σειράς 29 30 3.1.4 Αποµόνωση ολικού RNA από ευκαρυωτικά κύτταρα 31 3.1.5 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (Polymerase Chain Reaction-PCR) 3.1.6 Αλυσιδωτή αντίδραση αντίστροφης µεταγραφάσηςπολυµεράσης (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction RT-PCR) 31 33 3.1.7 Ηλεκτροφόρηση 34 3.1.8 Φασµατοφωτοµετρία (φασµατοσκοπία µοριακής απορρόφησης) 35 3.1.9 Αποστείρωση 35 3.2 Υλικά 36 3.2.1 Το πλασµίδιο hβ-s/mar(a) 36 3.2.2 Κυτταρική σειρά και καλλιεργητικές συνθήκες 37 3.2.3 Σωληνάρια ελεύθερα ριβονουκλεάσης 38 ii

3.2.4 Συσκευή ηλεκτροφόρησης ελεύθερη ριβονουκλεάσης 38 3.2.5 ιαλύµατα 38 3.2.6 Υλικά της PCR 42 3.2.7 Υλικά της RT-PCR 44 4 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 47 4.1 ιατήρηση του πλασµιδίου hβ-s/mar(a) εντός διαµολυσµένης καλλιέργειας ερυθρολευχαιµικής κυτταρικής σειράς ποντικού (MEL) για περίοδο τριών µηνών 4.2 ιατήρηση της έκφρασης της β-σφαιρίνης του πλασµιδίου hβ- S/MAR(A) εντός της διαµολυσµένης καλλιέργειας για περίοδο τριών µηνών 4.3 ιατήρηση υψηλών επιπέδων έκφρασης της β-σφαιρίνης του πλασµιδίου hβ-s/mar(a) εντός της διαµολυσµένης καλλιέργειας για περίοδο τριών µηνών 47 49 51 5 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 55 6 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 57 iii

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστηµίου Πατρών. Ευχαριστώ θερµά την Επιβλέπουσα Καθηγήτριά µου, κ. Αγλαΐα Αθανασιάδου για τη βοήθειά της και τη συµπαράστασή της καθ όλη τη διάρκεια της παραµονής µου στο Εργαστήριο. Ευχαριστώ τα µέλη της Τριµελούς Εξεταστικής Επιτροπής, κ. Ι.Ζαρκάδη και. ραΐνα, για τις εύστοχες παρατηρήσεις τους. Ευχαριστώ την Αργυρώ Σγουρού για τη σηµαντική βοήθειά της για την πραγµατοποίηση της παρούσας εργασίας. Τέλος, ευχαριστώ όλα τα µέλη του Εργαστηρίου Γενικής Βιολογίας, γιατί, όποτε χρειάστηκα τη βοήθειά τους, ήταν έκει. iv

ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ βλ. σ.α.λ. bp cdna ddh20 DNAse EBNA-1 egfp HIV-1 HSV GFP Kb LCR MuLV RNAse S/MAR βλέπε στροφές ανά λεπτό base pairs (ζεύγη βάσεων) complementary DNA (συµπληρωµατικό DNA) δις απεσταγµένο νερό deoxyribonuclease (δεοξυριβονουκλεάση) Epstein-Barr Virus Nuclear Antigen-1 enhanced Green Fluorescent Protein Human Immunodefficiency Virus-1 Herpes Simplex Virus Green Fluorescent Protein kilobases (κιλοβάσεις) Locus Control Region (περιοχή ελέγχου του γονιδιακού τόπου) Murine Leukemia Virus ribonuclease (ριβονουκλεάση) Scaffold/Matrix Attachment Region SV40 Simian Virus 40 v

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Γονιδιακή θεραπεία Βασικές αρχές Η έλλειψη επαρκών κλασικών θεραπευτικών µεθόδων ή η ύπαρξη µόνο συµπτωµατικής θεραπείας για αρκετές ασθένειες, οδήγησε από πολλά χρόνια στην ιδέα της θεραπευτικής παρέµβασης σε επίπεδο γενετικού υλικού. Η επίτευξη της µεταφοράς γενετικού υλικού εντός αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων ποντικού στις αρχές της δεκαετίας του 1980 1 έθεσε τις βάσεις για αισιόδοξη πειραµατική προσέγγιση της γονιδιακής θεραπείας και ιδιαίτερα όσον αφορά τις διαταραχές του αιµοποιητικού συστήµατος. Η γονιδιακή θεραπεία αναφέρεται στη θεραπευτική προσέγγιση ασθενειών µέσω εισαγωγής εξωγενούς γενετικού υλικού στα κύτταρα του ασθενούς. Η µεταφορά του γενετικού υλικού γονιδιακή µεταφορά αναφέρεται σε σωµατικά κύτταρα υποδοχής, δεδοµένου ότι η µεταφορά σε γενετικά κύτταρα θα είχε απρόβλεπτες συνέπειες και θα ήγειρε τεράστια ηθικά διλήµµατα. Η γονιδιακή µεταφορά πραγµατοποιείται είτε µε αφαίρεση των κυττάρων υποδοχής από τον οργανισµό, µεταφορά του γενετικού υλικού σε αυτά και επανατοποθέτησή τους εντός του οργανισµού (ex vivo γονιδιακή µεταφορά), είτε µε µεταφορά του γενετικού υλικού σε κύτταρα ενώ βρίσκονται εντός του οργανισµού (in vivo γονιδιακή µεταφορά) (Εικόνα 1.1). Για τη γονιδιακή µεταφορά συνήθως χρησιµοποιούνται οχήµατα. Τα οχήµατα αποτελούνται από γενετικό υλικό που διευκολύνει µε τις ιδιότητές του την είσοδο και την έκφραση του υπό µεταφορά γενετικού υλικού. Ένα όχηµα είναι τόσο πιο επιτυχηµένο όσο περισσότερο µπορεί, υπό τις κατάλληλες συνθήκες, να εξασφαλίσει είσοδο σε µεγάλο ποσοστό κυττάρων και έκφραση για το επιθυµητό χρονικό διάστηµα συνήθως όσο το δυνατό περισσότερο, σπανιότερα παροδικά. 1

Εικόνα 1.1: Μέθοδοι γονιδιακής µεταφοράς. Στην εικόνα φαίνονται µέθοδοι in vivo γονιδιακής µεταφοράς µε µη ιϊκά συστήµατα (βλ. Ενότητα 1.5). Εάν γίνει εφικτή, ένα πλήθος ασθενειών θα µπορούσε να προσεγγιστεί µε τη γονιδιακή θεραπεία, όπως ο καρκίνος, η κυστική ίνωση, τα καρδιαγγειακά νοσήµατα, νοσήµατα του αιµοποιητικού συστήµατος, λοιµώδη νοσήµατα. 2 Η παρούσα εργασία εστιάζει στην ανάπτυξη οχηµάτων για τη γονιδιακή θεραπευτική προσέγγιση των αιµοσφαιρινοπαθειών και ιδίως της β-θαλασσαιµίας και της δρεπανοκυτταρικής αναιµίας. 1.2 Ο γενετικός τόπος των β-σφαιρινικών γονιδίων Ο γενετικός τόπος των β-σφαιρινικών γονιδίων του ανθρώπου βρίσκεται στο χρωµόσωµα 11, στη θέση 11p15.5, και σε µια έκταση 100 Kb περιλαµβάνει τα β 2

σφαιρινικά γονίδια και τα cis-δρώντα στοιχεία που καθορίζουν την έκφραση αυτών ανάλογα µε το αναπτυξιακό στάδιο 3,4 (Εικόνα 1.2). Υπάρχουν πέντε β-σφαιρινικά γονίδια στον άνθρωπο, τα οποία είναι διατεταγµένα από 5 προς 3 µε την ίδια σειρά µε την οποία εκφράζονται κατά την ανάπτυξη 5 : Το γονίδιο ε εκφράζεται τις 10 πρώτες εβδοµάδες της κύησης. Τα δύο γονίδια γ εκφράζονται κατά την εµβρυϊκή περίοδο ανάπτυξης Τα γονίδια δ και β εκφράζονται κατά την ενήλικο ζωή. Εικόνα 1.2: Ο γενετικός τόπος των β-σφαιρινικών γονιδίων. Φαίνεται η θέση των γονιδίων ε, γ (δύο ειδών, G γ και A γ), δ και β, καθώς και του ψευδογονιδίου β (ψβ). Τα HS1-7 εντποπίζονται -6, -11, -15, -18, -22, -28 και -35 Kb ως προς το γονίδιο ε. Όσον αφορά το γονίδιο της β-σφαιρίνης, ρυθµίζεται από εγγύς και άπω ρυθµιστικά στοιχεία. Το κύριο εγγύς ρυθµιστικό στοιχείο είναι ο υποκινητής της β-σφαιρίνης και η δράση του συµπληρώνεται από δύο ενισχυτές, έναν εντός του δευτέρου ιντρονίου και έναν 800 περίπου βάσεις καθοδικά του β-σφαιρινικού γονιδίου. 6-10 Το σηµαντικότερο άπω ρυθµιστικό στοιχείο του β-γονιδίου είναι η περιοχή ελέγχου του γονιδιακού τόπου (Locus Control Region LCR), που εντοπίζεται σε µια περιοχή 6-22 Kb ανοδικά του ε-γονιδίου. 11 Τις πρώτες ενδείξεις για τη λειτουργική σηµασία της περιοχής LCR παρείχαν περιπτώσεις θαλασσαιµικών ασθενών, οι οποίοι έφεραν ελλείψεις σε σηµαντική απόσταση ανοδικά του γονιδίου της β-σφαιρίνης και όχι εντός ή πλησίον του γονιδίου. Σε µια τέτοια περίπτωση θαλασσαιµικού ασθενούς, την ισπανική έλλειψη, όπως αναφέρεται, παρατηρήθηκε έλλειψη µιας περιοχής 35 Kb 3

ανοδικά του ε-γονιδίου, γεγονός που οδήγησε στην υπόθεση ότι αυτή η περιοχή περιείχε cis-δρώντα στοιχεία απαραίτητα για τη φυσιολογική έκφραση του γονιδίου της β-σφαιρίνης. 12 Τα πρώτα βήµατα για τη διερεύνηση αυτής της περιοχής και τη µετέπειτα ανακάλυψη της LCR πραγµατοποιήθηκαν µέσω µελέτης της ευαισθησίας στη DNΑse I του γενετικού τόπου των β-σφαιρινικών γονιδίων. 13-16 Η µεγαλύτερη ευαισθησία µιας χρωµατινικής περιοχής στη DNAse I θεωρείται ότι υποδηλώνει περισσότερο «ανοικτή» δοµή της χρωµατίνης. 17 Η ανοικτή δοµή ευνοεί την πρόσδεση µεταγραφικών παραγόντων και τη δηµιουργία λειτουργικής µεταγραφικής µηχανής, συνεπάγεται, δηλαδή, µεταγραφική ενεργότητα. 18 Ολόκληρος ο γενετικός τόπος των β-σφαιρινικών γονιδίων παρουσιάζει στα ερυθροκύτταρα γενική ευαισθησία στη DNAse I, ευαισθησία µία τάξη µεγέθους µεγαλύτερη από την ευαισθησία στη DNAse I που παρουσιάζει η κοινή χρωµατίνη. Οι περιοχές που παρουσιάζουν ευαισθησία στην DNAse I δύο τάξεις µεγέθους µεγαλύτερη από την κοινή χρωµατίνη ονοµάζονται υπερευαίσθητες στη DNAse I περιοχές (Hypersensitive Sites HS) και στο γενετικό τόπο των β-σφαιρινικών γονιδίων ανιχνεύονται επτά τέτοιες περιοχές ανοδικά των γονιδίων (HS1-7) και µία καθοδικά (3 HS1). Η LCR περιλαµβάνει 5 υπερευαίσθητες στην κατάτµηση µε DNAse I περιοχές, οι οποίες µε ανοδική κατεύθυνση συµβολίζονται 5 HS1 ως 5 HS5 11,17 (Εικόνα 1.2). Από αυτές, µόνο οι 5 HS1-4 και η 3 HS1 είναι ερυθροειδικές. 11 Στη συνέχεια παρατηρήθηκε ότι κατά την ερυθροειδική επαγωγή ερυθρολευχαιµικής κυτταρικής σειράς ποντικού πρώτα σχηµατίζονταν αυτές οι θέσεις υπερευαισθησίας στη DNAse I και επακολουθούσε η ενεργοποίηση των σφαιρινικών γονιδίων. Αυτό το πειραµατικό δεδοµένο οδήγησε στην υπόθεση ότι η περιοχή αυτή, που περιέχει αυτές τις υπερευαίσθητες στη DNAse I θέσεις είναι υπεύθυνη για την ενεργοποίηση του γενετικού τόπου και της αποδόθηκε ο όρος «περιοχή ελέγχου του γονιδιακού τόπου» (Locus Control Region LCR). 19 Μέχρι εκείνη την περίοδο τα αποτελέσµατα όσον αφορά την έκφραση του διαγονιδίου της β-σφαιρίνης σε διαγονιδιακά ποντίκια ήταν απογοητευτικά. Το διαγονίδιο της β-σφαιρίνης εκφραζόταν κατά τα πειράµατα σε µικρό ποσοστό των διαγονιδιακών ποντικών και σε αυτά σε ποσοστό µικρότερο του 1%. 20-22 Η χρήση της νέας περιοχής µε τις υπερευαίσθητες στη DNAse I θέσεις είχε σαν αποτέλεσµα την έκφραση του διαγονιδίου της β-σφαιρίνης σε όλα τα 4

διαγονιδιακά ποντίκια που χρησιµοποιήθηκαν και µάλιστα σε επίπεδα αντίστοιχα αυτών των ενδογενών β-γονιδίων του ποντικού. 23 Το δεδοµένο αυτό επιβεβαίωσε την ύπαρξη ρόλου της περιοχής LCR στην έκφραση του β-γονιδίου, ενίσχυσε τον πειραµατικό προσανατολισµό προς τη διερεύνηση του ακριβούς φυσιολογικού ρόλου και του τρόπου δράσης της LCR και σηµατοδότησε την έναρξη της χρήσης της σε συνδυασµό µε το διαγονίδιο της β-σφαιρίνης σε πειραµατικό επίπεδο. Η µελέτη της περιοχής ελέγχου του γονιδιακού τόπου των β-σφαιρινικών γονιδίων (LCR) που ακολούθησε τα επόµενα χρόνια έχει να παρουσιάσει δεδοµένα σχετικά µε τη δραστικότητα των επιµέρους στοιχείων της περιοχής καθώς και της LCR ως σύνολο. Κάθε HS περιοχή ξεχωριστά έχει ειδική δραστικότητα. Η 5 HS5 έχει δραστικότητα µονωτή. 23,24 Οι 5 HS2-4 έχουν δραστικότητα ενισχυτών, 11,25 ενώ οι 5 HS2 και 5 HS3 είναι απαραίτητες για την ενεργοποίηση των β-σφαιρινικών γονιδίων. 25,26 Στην 5 HS1 δεν έχει αποδοθεί ακόµα κάποια ειδική δραστικότητα. Καθεµιά από αυτές τις περιοχές έχει µια αναπόσπαστη (core) αλληλουχία µήκους 200-300 περίπου βάσεων, η οποία βρίθει προτύπων αλληλουχιών πρόσδεσης για γενικούς και ερυθροειδικούς µεταγραφικούς παράγοντες, µε κυρίαρχα τα πρότυπα για τους µεταγραφικούς παράγοντες NF-E2 και GATA-1. 17 Η LCR παρουσιάζει και δραστικότητα, η οποία φαίνεται ότι εξαρτάται από τη συνολική δοµή και την ακεραιότητα της περιοχής αυτής και την αλληλεπίδραση των στοιχείων της. 27,28 Είναι σαφές ότι έχει ισχυρή δραστικότητα ενισχυτή. Η απουσία της, όπως προαναφέρθηκε, µειώνει την έκφραση τουλάχιστο εκατό φορές σε διαγονιδιακά ποντίκια. Η σηµαντική ενισχυτική δραστικότητα της LCR έχει παρατηρηθεί και στην ενδογενή της θέση µε πειράµατα πρόκλησης ελλείψεων στα χρωµοσώµατα κυτταρικών σειρών ανθρώπου ή ποντικού, οι οποίες επίσης µειώνουν σηµαντικά την έκφραση των σφαιρινικών γονιδίων. 29-31 Η ενισχυτική δραστικότητα της LCR είναι ιστοειδική και συγκεκριµένα ερυθροειδική. 32 Η ερυθροειδικότητα, πάντως, της έκφρασης των σφαιρινικών γονιδίων φαίνεται ότι αποτελεί ένα συνδυασµό της ερυθροειδικής βασικής έκφρασης που επάγουν οι υποκινητές και της ερυθροειδικής ενίσχυσης από την LCR. 7-11 5

Η LCR θεωρείται ότι επάγει ανοικτή δοµή χρωµατίνης. Πρώτη ένδειξη προς αυτή την κατεύθυνση αποτέλεσε η κλειστή δοµή χρωµατίνης, που παρατηρήθηκε σε θαλασσαιµικούς ασθενείς µε έλλειψη της LCR και ακέραιο β-γονίδιο, και συγκεκριµένα στην ισπανική µορφή β-θαλασσαιµίας. 12 Η θεωρία αυτή ενισχύεται από την παρατήρηση ότι η LCR έχει τη χαρακτηριστική ιδιότητα να επάγει την έκφραση ενός in cis συνδεδεµένου διαγονιδίου ανεξάρτητα από τη θέση του διαγονιδίου αλλά µε τρόπο που εξαρτάται από τον αριθµό των αντιγράφων του. 33 Η συσχετισµένη µε τον αριθµό αντιγράφων έκφραση θεωρείται ενδεικτική ανοικτής δοµής χρωµατίνης. 11 Σήµερα, µάλιστα, η ικανότητα ενός τµήµατος DNA να επάγει συσχετισµένη µε τον αριθµό αντιγράφων έκφραση ενός διαγονιδίου χρησιµοποιείται για τον προσδιορισµό της περιοχής ως περιοχής ελέγχου του γονιδιακού τόπου (LCR) παρά ως µεταγραφικού ενισχυτή. 11 Αυτό το κριτήριο έχει υιοθετηθεί για τον προσδιορισµό των LCR περιοχών και το σηµαντικότερο διακριτικό τους στοιχείο από τους ενισχυτές θεωρείται η ικανότητά τους να επάγουν ανοικτή δοµή στη χρωµατίνη και να αποτρέπουν την ετεροχρωµατινοποίηση σε έκτοπες θέσεις (επαγωγή έκφρασης διαγονιδίου ανεξάρτητα από τη θέση ενσωµάτωσης). 11 LCRs έχουν περιγραφεί σε ένα ευρύ φάσµα ευκαρυωτικών οργανισµών. 11 Ο τρόπος αλληλεπίδρασης της LCR µε τα β-σφαιρινικά γονίδια δεν έχει διευκρινισθεί. Τα πειραµατικά δεδοµένα έχουν αναδείξει την παρουσία θέσεων πρόσδεσης γενικών και ερυθροειδικών µεταγραφικών παραγόντων καθώς και τη σύνδεση µε την RNA πολυµεράση ΙΙ. Έχουν προταθεί τέσσερα µοντέλα δράσης (Εικόνα 1.3) : α) Μοντέλο βρόχου (looping model): Μεταγραφικοί παράγοντες προσδένονται στην LCR και στον υποκινητή του γονιδίου, τους φέρνουν κοντά παρακάµπτοντας το ενδιάµεσο τµήµα DNA µε σχηµατισµό βρόχου και η LCR αλληλεπιδρά άµεσα µε τον υποκινητή και σχηµατίζει εκεί µια ενεργή µεταγραφική µονάδα. 34-37 6

β) Μοντέλο εντοπισµού (tracking model): Μεταγραφικοί παράγοντες προσδένονται στην LCR και σαρώνουν το DNA, µέχρι να εντοπίσουν άλλους µεταγραφικούς παράγοντες προσδεδεµένους στον κατάλληλο υποκινητή, επάγοντας τη γονιδιακή έκφραση. 38,39 γ) Μοντέλο υποβοηθούµενου εντοπισµού (facilitated tracking model): Η σάρωση υποβοηθείται από επαφή LCR και υποκινητή µε σχηµατισµό βρόχου. 39 δ) Μοντέλο σύνδεσης (linking model): ιαδοχική πρόσδεση µεταγραφικών παραγόντων κατά µήκος του DNA διευθύνει τις αλλαγές στη διαµόρφωση της χρωµατίνης και καθορίζει τη µεταγραφική περιοχή. 40 Εικόνα 1.3: Μοντέλα δράσης της LCR. Γαλάζιο ορθογώνιο: σφαιρινικό γονίδιο, Πράσινο ορθογώνιο: υποκινητής σφαιρινικού γονιδίου, Έγχρωµοι κύκλοι και ελλείψεις: µεταγραφικοί παράγοντες, Μπλε τετράγωνα: 5 HS5 και 3 HS1, Κόκκινα τετράγωνα: 5 HS1-4, Κυµατιστά βέλη: µετάγραφα. Α: Μοντέλο βρόχου Β: Μοντέλο εντοπισµού Γ: Μοντέλο υποβοηθούµενου εντοπισµµού : Μοντέλο σύνδεσης 1.3 Αιµοσφαιρινοπάθειες - Η β-θαλασσαιµία και η δρεπανοκυτταρική αναιµία Οι αιµοσφαιρινοπάθειες περιλαµβάνουν διαταραχές που επηρεάζουν τη δοµή, τη λειτουργικότητα ή / και την παραγωγή της αιµοσφαιρίνης. Οι δύο σηµαντικότερες ασθένειες αυτής της οµάδας είναι η β-θαλασσαιµία και η δρεπανοκυτταρική αναιµία. Η επιστηµονική επιθυµία για επαρκή γνώση του ελέγχου της έκφρασης των σφαιρινικών γονιδίων, προκειµένου να επιτευχθεί ακριβής διάγνωση και θεραπευτική 7

παρέµβαση σε αυτές κυρίως τις ασθένειες, καθώς και το µικρό µέγεθος των σφαιρινικών γονιδίων, είχαν ως αποτέλεσµα τα σφαιρινικά γονίδια να είναι από τα πρώτα που κλωνοποιήθηκαν και προσδιορίστηκε η αλληλουχία τους. Στη συνέχεια η φαινοµενική αιτιολογική απλότητά των ασθενειών αυτών και η θεωρητική δυνατότητα θεραπείας µε την απλή µεταφορά ενός µόνο γονιδίου τις έκανε να θεωρηθούν άριστο µοντέλο για την έναρξη προσπαθειών γονιδιακής θεραπείας. 3,41 Τελικά, όµως, η εξαιρετικά περίπλοκη ρύθµιση των γονιδίων στα διάφορα στάδια της ανάπτυξης, η οποία αναδείχθηκε στη πορεία, µε δύο µεταστροφές του τύπου της παραγόµενης αιµοσφαιρίνης (από πρώιµη εµβρυϊκή σε εµβρυϊκή και στη συνέχεια σε ενηλίκου), 5,17 είχε ως αποτέλεσµα να µην είναι τόσο απλή, όσο πιθανώς αναµενόταν αρχικά, η γονιδιακή θεραπεία των αιµοσφαιρινοπαθειών. Η β-θαλασσαιµία οφείλεται στη µειωµένη (β + ) ή µηδενική (β 0 ) παραγωγή β- σφαιρινικών αλυσίδων, εξαιτίας µετάλλαξης, που επηρεάζει οποιοδήποτε στάδιο της έκφρασης της β-σφαιρίνης: µεταγραφή, µετα-µεταγραφική επεξεργασία, µετάφραση, µετα-µεταφραστικό µεταβολισµό της β-σφαιρίνης. 2 Η ετεροζυγωτία δεν έχει ουσιαστικά κλινικές συνέπειες. Η οµοζυγωτία οδηγεί σε ποικίλλουσας κλινικής βαρύτητας νόσο, αντικατοπτρίζοντας τη µεγάλη γενετική ετερογένεια (Εικόνα 1.4). Οι µειωµένες β-αλυσίδες οδηγούν σε µειωµένη παραγωγή αιµοσφαιρίνης, ενώ η περίσσεια των α-αλυσίδων καθιζάνει εντός των κυττάρων και τα οδηγεί σε πρώιµη καταστροφή. Αποτέλεσµα είναι η αναποτελεσµατική ερυθροποίηση στην περίπτωση Εικόνα 1.4: Η γενετική ετερογένεια της β-θαλασσαιµίας. 1. Μεταλλάξεις που επηρεάζουν την έναρξη της µεταγραφής 2. Μεταλλάξεις που επηρεάζουν τη συναρµογή (splicing) του RNA 3. Μεταλλάξεις χωρίς νόηµα 4. Μεταλλάξεις στην 5 UTR, στην 3 UTR και ειδικά στη θέση πολυαδενυλίωσης 8

των ερυθροβλαστών 42-44 και η περιφερική αιµόλυση στο σπλήνα όσων ερυθροκυττάρων εξέρχονται τελικά στην κυκλοφορία. 2 Η αναιµία, που προκύπτει έχει ως επακόλουθο την ερυθροειδική υπερπλασία και την εξωµυελική αιµοποίηση, αλλά η αναποτελεσµατική ερυθροποίηση παραµένει. Η βαριά µορφή επιφέρει το θάνατο εντός του πρώτου έτους από τη γέννηση, εάν δεν υπάρξει οποιαδήποτε θεραπευτική αντιµετώπιση. 45 Η αντιµετώπιση περιλαµβάνει µεταγγίσεις αίµατος µε στόχο την αντιµετώπιση της αναιµίας και την καταστολή της µαζικής ερυθροποίησης και της αυξηµένης απορρόφησης σιδήρου από το γαστρεντερικό σύστηµα. Οι µεταγγίσεις, όµως, προκαλούν συσσώρευση σιδήρου, θανατηφόρα, εάν δεν ανασταλεί. Η αντιµετώπιση της συσσώρευσης σιδήρου αποτελεί θεµέλιο λίθο στη θεραπευτική προσέγγιση της β-θαλασσαιµίας. 46 Η παρατήρηση ότι ασθενείς µε συνδυασµό δρεπανοκυτταρικής αναιµίας ή θαλασσαιµίας µε την καλοήθη κληρονοµική παραµονή εµβρυϊκής αιµοσφαιρίνης HbF εµφανίζουν αντιρρόπηση των συµπτωµάτων της αναιµίας οδήγησε στην αναζήτηση φαρµάκων, που να επάγουν αύξηση της εµβρυϊκής γ-σφαιρίνης.. Κυτταροτοξικά φάρµακα, όπως η υδροξυουρία, έχουν χρησιµοποιηθεί για την αύξηση της γ-σφαιρίνης προς υποκατάσταση σε κάποιο βαθµό της απούσας β αλλά χωρίς κλινικό όφελος. Η µόνη πλήρης θεραπεία σήµερα παραµένει η αλλογενής µεταµόσχευση µυελού των οστών. 47-50 Στη δρεπανοκυτταρική αναιµία µια µετάλλαξη στο έκτο αµινοξύ της β-σφαιρίνης οδηγεί στην παραγωγή παθολογικής β S σφαιρίνης αντί της φυσιολογικής β Α. 51 Η παθολογική αιµοσφαιρίνη HbS προκαλεί πρώιµη καταστροφή των ερυθροκυττάρων, ερυθροειδική υπερπλασία και ισχαιµικά επεισόδια, µε αποτέλεσµα επώδυνες κρίσεις, έµφρακτα σε διάφορα όργανα, ίσως και αιφνίδιο θάνατο. 2 Η θεραπευτική αντιµετώπιση είναι συµπτωµατική. Η υδροξυουρία επάγει µια ανιχνεύσιµη αύξηση της γ-σφαιρίνης, µε συνέπεια µείωση της ερυθροποίησης και µικρό κλινικό όφελος, 52-54 είναι, όµως, κυτταροτοξικό φάρµακο, όπως και τα υπόλοιπα που έχουν δοκιµαστεί για αυτό το σκοπό. Η µόνη θεραπεία παραµένει και εδώ η αλλογενής µεταµόσχευση µυελού των οστών. 50-58 Η αλλογενής µεταµόσχευση µυελού των οστών είναι δυνητικά θεραπευτική, αλλά δεν είναι ούτε απλή ούτε απόλυτα ασφαλής διαδικασία. Ο σηµαντικότερος περιοριστικός παράγοντας είναι η ανάγκη ανεύρεσης ιστοσυµβατού δότη, προκειµένου να ελαχιστοποιηθούν οι κίνδυνοι της απόρριψης του µοσχεύµατος αλλά και της 9

αντίδρασης του µοσχεύµατος κατά του ξενιστή. 50-58 Σε πρώιµα στάδια της νόσου, πριν την εµφάνιση βλάβης τελικών οργάνων, τα θεραπευτικά ποσοστά κυµαίνονται στο 80-90%. Η θνητότητα της επέµβασης πέφτει κάτω από το 10% µόνο σε πολύ εξειδικευµένα κέντρα. 2 Η αλλογενής µεταµόσχευση µυελού, όταν υπάρχει αυτή η επιλογή, παραµένει µια σηµαντική και δύσκολη απόφαση. 1.4 Αιµοσφαιρινοπάθειες και γονιδιακή θεραπεία Η γονιδιακή θεραπεία της β-θαλασσαιµίας και της δρεπανοκυτταρικής αναιµίας προσεγγίζεται γενικά µε δύο στρατηγικές: α) Προσπάθεια αύξησης των αλυσίδων της εµβρυϊκής γ-σφαιρίνης, όπως προαναφέρθηκε, µε στόχο την αντιρρόπηση της ποσοτικής ή ποιοτικής ανεπάρκειας των β-σφαιρινών. β) Προσπάθεια αύξησης των αλυσίδων της β-σφαιρίνης. Για καθεµιά από τις δυο κατευθύνσεις έχουν αναπτυχθεί και αντίστοιχες µεθοδολογίες: α) Η αύξηση των αλυσίδων της γ-σφαιρίνης επιδιώκεται µε: Κυτταροτοξικά φάρµακα, όπως η υδροξυουρία Μεταφορά του φυσιολογικού γ-γονιδίου υπό τον έλεγχο της LCR, µε στόχο η έκφρασή του διαγονιδίου να αναπληρώνει για την απουσία έκφρασης του ενδογενούς β-γονιδίου. 59 10

β) Η αύξηση των αλυσίδων της β-σφαιρίνης επιδιώκεται µε: Μεταφορά του φυσιολογικού β-γονιδίου, µε στόχο η έκφρασή του διαγονιδίου να αναπληρώνει για την απουσία έκφρασης του ενδογενούς β- γονιδίου. Παρέµβαση στην ελαττωµατική συναρµογή (splicing) του mrna µε τη χρήση αντινοηµατικών (antisense) ολιγονουκλεοτιδίων, όταν η µοριακή βάση της θαλασσαιµίας είναι σηµειακή µετάλλαξη που δηµιουργεί νέα θέση για συναρµογή, οδηγώντας σε ελαττωµατική συναρµογή (περίπου 15% των περιπτώσεων β-θαλασσαιµίας 60 ). Τα αντινοηµατικά ολιγονουκλεοτίδια καλύπτουν τη νέα θέση και η συναρµογή χρησιµοποιεί µόνο τις σωστές θέσεις. Φυσικά, πρόκειται για µια διαδικασία, που θα είχε εφαρµογή µόνο στις συγκεκριµένες µεταλλάξεις και θα απαιτούνταν επαναλαµβανόµενη χορήγηση καθ όλη τη διάρκεια της ζωής του ασθενούς. 61 Πρόσφατα, βέβαια, πραγµατοποιήθηκε ανάλογη προσπάθεια και µε όχηµα γονιδιακής µεταφοράς, που θα αντιµετώπιζε αυτό τον περιορισµό. 62 Γονιδιωµατική επιδιόρθωση, παρέµβαση, δηλαδή, στην αλληλουχία του µεταλλαγµένου ενδογενούς γονιδίου. Πρόκειται για µια πρόσφατη προσέγγιση και επιδιώκεται κυρίως µέσω εισαγωγής της φυσιολογικής αλληλουχίας στο κύτταρο-στόχο, αφαίρεσης της µεταλλαγµένης µε κατάλληλη ενδονουκλεάση και αντικατάστασή της µε τη φυσιολογική µέσω οµόλογου ανασυνδυασµού, χάρη στις οµόλογες περιοχές που διαθέτουν εκατέρωθέν τους οι δύο αλληλουχίες. 63 Σήµερα, µάλιστα, αναπτύσσονται τεχνικές δηµιουργίας ενδονουκλεασών µε δοµές «δακτύλων ψευδαργύρου», που θα τους εξασφαλίζουν την ικανότητα απόλυτα ειδικής αναγνώρισης της περιοχής που φέρει τη µετάλλαξη, οι οποίες θα διευκολύνουν την αφαίρεση της περιοχής και την αντικατάστασή της µε τη φυσιολογική αλληλουχία. 64 11

Η πρώτη (µεταφορά του φυσιολογικού β-γονιδίου) είναι και η πειραµατική κατεύθυνση που ακολουθεί η πλειονότητα του επιστηµονικού κόσµου που ασχολείται ερευνητικά µε το θέµα. Στόχο των πειραµάτων γονιδιακής µεταφοράς µε στόχο τη γονιδιακή θεραπεία των αιµοσφαιρινοπαθειών αποτελούν τα αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα. Τα αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα έχουν εξ ορισµού την ικανότητα να αναγεννήσουν ολόκληρο το αιµοποιητικό σύστηµα, όταν χορηγηθούν σε δέκτες µε πλήρη µυελοκαταστολή. Τα πολυδύναµα αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα έχουν την ικανότητα αυτοαναπαραγωγής in vivo, ενώ ταυτόχρονα µπορούν να δώσουν και απογόνους που θα ακολουθήσουν µια σταδιακή διαφοροποίηση, οδηγώντας τελικά σε ώριµα κύτταρα πολλών κυτταρικών σειρών µε διαφορετικές λειτουργίες 65,66 (Εικόνα 1.5). Συνεπώς, η ex vivo σταθερή γονιδιακή µεταφορά σε αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα µε επακόλουθη αυτόλογη µεταµόσχευση θα µπορούσε να οδηγήσει σε µακράς διαρκείας, πιθανόν διά βίου, διατήρηση των γενετικά τροποποιηµένων αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων στο δέκτη, παρέχοντας µια πιθανή θεραπεία για µια σειρά διαταραχών του αιµοποιητικού συστήµατος, 65,66 όπως κληρονοµικές ανοσοανεπάρκειες, αιµοσφαιρινοπάθειες, αιµορροφιλίες και πολλές άλλες. 67-69 Η γενετική τροποποίηση αυτόλογων αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων αποτελεί µια ελκυστική προσέγγιση, δεδοµένου ότι είναι δυνητικά θεραπευτική και θα εξάλειπτε την ανάγκη ανεύρεσης συµβατού δότη και τους κινδύνους απόρριψης του µοσχεύµατος και αντίδρασης του µοσχεύµατος κατά του ξενιστή. Η επιτυχηµένη γονιδιακή µεταφορά σε αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα προϋποθέτει 4 : α) αποτελεσµατική µεταφορά του γονιδίου (της µεταγραφικής µονάδας) εντός των κυττάρων. β) σταθερή έκφραση του διαγονιδίου. Αυτή προϋποθέτει τόσο τη διατήρηση του οχήµατος για µακρά χρονική διάρκεια, όσο και τη διατήρηση υψηλού επιπέδου έκφρασης του διαγονιδίου. Η διατήρηση σταθερής έκφρασης του διαγονιδίου για σηµαντικό χρονικό διάστηµα είναι απαραίτητη για τη γονιδιακή µεταφορά σε αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα, αφού πρόκειται για κύτταρα µε υψηλό δυναµικό πολλαπλασιασµού και διαφοροποίησης και οι περισσότερες εφαρµογές απαιτούν 12

Εικόνα 1.4: Τα αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα και το δυναµικό τους. έκφραση του διαγονιδίου µετά από σειρά διαιρέσεων, στα ώριµα πια κύτταρα. Κατά συνέπεια, το ιδανικό όχηµα µεταφοράς θα διατηρούνταν στον πυρήνα πολλαπλασιαζόµενων κυττάρων σε µακράς διάρκειας καλλιέργειας και θα εξασφάλιζε έκφραση του διαγονιδίου για ολόκληρη τη ζωή του κυττάρων και των απογόνων του. Επιπλέον, θα εξασφάλιζε και την τρίτη προϋπόθεση, όπως αναφέρεται στο σηµείο (γ). γ) απουσία παρέµβασης στη φυσιολογική κυτταρική λειτουργία, την κλωνογόνο ικανότητα και το αναπαραγωγικό δυναµικό των αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων και γενικά ασφάλεια και απουσία παθογονικότητας. Στην περίπτωση της γονιδιακής µεταφοράς της β-σφαιρίνης, οι αυστηρές µεταγραφικές της απαιτήσεις θέτουν και επιπλέον προϋποθέσεις 4 : δ) έκφραση ιστοειδική (ερυθροειδική) και ειδική ως προς το στάδιο διαφοροποίησης ε) ικανοποιητικά υψηλό και ελεγχόµενο επίπεδο έκφρασης. 13

Όταν πραγµατοποιούνται πειράµατα µε αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα, χρησιµοποιείται ο υποπληθυσµός των αιµοποιητικών κυττάρων που φέρει το επιφανειακό αντιγόνο CD34+. Ο υποπληθυσµός αυτός θεωρείται εµπλουτισµένος σε αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα. 70 Το κλασικό πειραµατικό µοντέλο για τα πειράµατα γονιδιακής µεταφοράς για τη θεραπεία των αιµοσφαιρινοπαθειών είναι ο ποντικός. Ο ενήλικας ποντικός φέρει δύο ενδογενή β-γονίδια, το β major (β maj ) και το β minor (β min ). 3 Για την προτυποποίηση των επιπέδων έκφρασης του ανθρώπινου β-διαγονιδίου µετά τη γονιδιακή µεταφορά σε αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα ποντικού και την αυτόλογη µεταµόσχευσή τους χρησιµοποιούνται τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου β maj. Θεωρείται ότι προκειµένου να επιτευχθεί θεραπευτικό όφελος, θα πρέπει τα επίπεδα έκφρασης του διαγονιδίου να φθάνουν το 10-20% της έκφρασης του ενδογενούς σφαιρινικού γονιδίου β maj στην πλειονότητα των ερυθροβλαστών. 71 Η πορεία των πειραµάτων γονιδιακής θεραπείας των αιµοσφαιρινοπαθειών περιλαµβάνει: α) Μεταφορά του συστήµατος όχηµα-διαγονίδιο σε καθιερωµένες καλλιέργειες κυττάρων αιµοποιητικών σειρών ποντικού (όπως η ερυθρολευχαιµική κυτταρική σειρά MEL 72 ) και ανθρώπου (όπως η χρόνια µυελοειδική λευχαιµική κυτταρική σειρά Κ562 73 ), καθώς και µη αιµοποιητικών σειρών (όπως η ανθρώπινη καρκινική κυτταρική σειρά HeLa και η καρκινική κυτταρική σειρά CHO Chinese Hamster Ovary). Σε αυτό το στάδιο εκτιµώνται διάφορες παράµετροι του συστήµατος στις αιµοποιητικές σειρές, όπως η επάρκεια της διαµόλυνσης, η διατήρηση του διαγονιδίου και η έκφραση του διαγονιδίου, και λαµβάνονται οι πρώτες ενδείξεις για τα πιθανά αντίστοιχα αποτελέσµατα σε αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα. Παράλληλα, παρατηρείται η ιστοειδικότητα της συµπεριφοράς του µε τη χρήση των µη αιµοποιητικών σειρών. β) Μεταφορά του συστήµατος όχηµα-διαγονίδιο σε αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα ποντικού και ανθρώπου και καλλιέργεια βραχείας διάρκειας. Εκτιµώνται οι παράµετροι του συστήµατος στα κύτταρα που µας ενδιαφέρουν για την 14

πραγµατοποίηση στα επόµενα στάδια προκλινικών µελετών στο ζωικό µοντέλο του ποντικού και κλινικών µελετών στον άνθρωπο. γ) Αυτόλογη µεταµόσχευση διαµολυσµένων µε το σύστηµα όχηµα-διαγονίδιο αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων σε θαλασσαιµικό ποντικό. Αυτό είναι και το στάδιο, µέχρι το οποίο έχει φθάσει η έρευνα στο πεδίο των αιµοσφαιρινοπαθειών. δ) Αυτόλογη µεταµόσχευση διαµολυσµένων µε το σύστηµα όχηµα-διαγονίδιο αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων σε θαλασσαιµικό άνθρωπο. Η σχετική έρευνα δεν έχει φθάσει ακόµα στην πραγµατοποίηση κλινικής µελέτης. 1.5 Κατηγοριοποίηση οχηµάτων γονιδιακής µεταφοράς Οι πρώτες επιτυχηµένες απόπειρες γονιδιακής µεταφοράς πραγµατοποιήθηκαν σε κύτταρα ποντικού µε τη χρήση ιϊκών οχηµάτων, που δηµιουργήθηκαν από το γενετικό υλικό ιών. 1,74,75 Τα µη ιϊκά οχήµατα επακολούθησαν. 1.5.1 Ιϊκά οχήµατα γονιδιακής µεταφοράς Οχήµατα που έχουν προκύψει από διάφορους ιούς έχουν δοκιµαστεί για την πιθανή γονιδιακή µεταφορά σε αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα 4 : ογκορετροϊοί ποντικού (κυρίως ο MuLV), αδενοϊοί, AAV (Adeno-Associated Viruses), ο ιός του απλού έρπητα, lenti-ιοί (όπως ο HIV-1) και άλλοι. Τα κυριότερα οχήµατα που έχουν χρησιµοποιηθεί προέρχονται από ρετροϊούς και είναι τα ογκορετροϊικά και τα lentiιϊκά. Τα οχήµατα αυτά στοχεύουν στην ενσωµάτωση τους στο χρωµοσωµικό γενετικό υλικό του κυττάρου υποδοχής, οδηγώντας, έτσι, σε σταθερή γονιδιακή µεταφορά. Τα πρώτα ενθαρρυντικά αποτελέσµατα για τη µεταφορά του β-γονιδίου σε αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα (ποντικού) µε τη χρήση ογκορετροϊικού οχήµατος προέκυψαν στα τέλη της δεκαετίας του 1980. 74,75 Όµως, αν και επιτεύχθηκε γονιδιακή µεταφορά και ιστοειδική έκφραση, τα επίπεδα έκφρασης ήταν και πολύ 15

χαµηλά και ποικίλα, ανάλογα µε τη θέση ενσωµάτωσης, ενώ η σταθερότητα δεν αποδείχθηκε. Στη συνέχεια έγινε προσπάθεια ενσωµάτωσης σε ιϊκό όχηµα (από τον ιό MuLV) στοιχείων της LCR, 76 προκειµένου να επιτευχθεί η υψηλού επιπέδου, µακράς διάρκειας, ανεξάρτητη της θέσης ενσωµάτωσης και ερυθροειδική έκφραση που είχε βρεθεί ότι επάγει. Η ενσωµάτωση αναπόσπαστων αλληλουχιών των HS2-4 αύξησε σηµαντικά τα επίπεδα έκφρασης του διαγονιδίου της β-σφαιρίνης, αλλά απέτυχε να αντιµετωπίσει τη µεταβλητότητα της έκφρασης ανάλογα µε τη θέση ενσωµάτωσης. Τότε έγινε αντιληπτό ότι οι ελάχιστες αυτές κεντρικές αλληλουχίες δεν µπορούσαν να υποκαταστήσουν την LCR, παρά δρούσαν σαν κοινός ερυθροειδικός ενισχυτής. Προσπάθειες ενσωµάτωσης σε ογκορετροϊικά οχήµατα µεγαλύτερων τµηµάτων από το LCR προσέκρουσαν στην αδυναµία των οχηµάτων να φέρουν µεγάλη ποσότητα γενετικού υλικού µε σταθερό τρόπο, ενώ προέκυπτε και ανασυνδυασµός του οχήµατος, εξαιτίας ανασυνδυασµού του ρετροϊικού RNA σε θέσεις των µεγαλύτερων αλληλουχιών της LCR. 77,78 Εξάλλου, ένας εξίσου σηµαντικός περιοριστικός παράγοντας για τα ογκορετροϊικά οχήµατα είναι η αδυναµία τους να διαµολύνουν µη διαιρούµενα κύτταρα, µια και το RNA τους πρέπει να περιµένει τη διάλυση της πυρηνικής µεµβράνης κατά τη µίτωση, προκειµένου να εισέλθει στον πυρήνα. 79 εδοµένου ότι τα περισσότερα αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα βρίσκονται σε φάση ηρεµίας, θα πρέπει να επαχθούν προς διαίρεση µε κατάλληλες ουσίες, όπως οι κυτταροκίνες, κάτι όµως που έχει ως αποτέλεσµα τη διαφοροποίησή τους και την µείωση του µακροπρόθεσµου αυτοαναπαραγωγικού δυναµικού τους. 79-84 Το ενδιαφέρον για τα lenti-ιϊκά οχήµατα εγέρθηκε µε την παρατήρηση ότι ο lenti-ιός HIV-1 µπορούσε να διαµολύνει µη διαιρούµενα κύτταρα, αφού το σύµπλεγµα προενσωµάτωσής του µπορεί να µεταπηδήσει στον πυρήνα µέσα από την ακέραιη πυρηνική µεµβράνη και να ενσωµατώνεται απουσία κυτταρικής διαίρεσης. 85,86 Σύντοµα, όµως, έγινε αντιληπτό, ότι το σηµαντικότερο πλεονέκτηµα των lenti-ιϊκών οχηµάτων ήταν η ικανότητά τους να φέρουν πλήρες RNA, χωρίς αυτό να υπόκειται σε ανασυνδυασµούς. Ο HIV-1 εκφράζει µηχανισµούς, οι οποίοι καταστέλλουν την επεξεργασία του RNA και επιτρέπει την πυρηνοκυτταροπλασµατική µεταφορά µεγάλου µήκους και ακατάτµητου από συναρµογή RNA. 87 Αν και η χρήση τµηµάτων των HS2-4 µήκους µερικών εκατοντάδων βάσεων δεν είχε αποτέλεσµα ούτε µε τα lenti-ιϊκά οχήµατα, 88 ο συνδυασµός του διαγονιδίου της β-σφαιρίνης µε µεγάλα τµήµατα του LCR οδήγησε για πρώτη φορά σε υψηλής απόδοσης µεταφορά του β- 16

γονιδίου µε lenti-ιϊκό όχηµα σε ποντίκια µε νόσο αντίστοιχη της ενδιάµεσης β- θαλασσαιµίας του ανθρώπου και έκφρασή του σε θεραπευτικά επίπεδα. 88 Ακόµη πιο αποτελεσµατική διαµόλυνση, µικρότερη µεταβλητότητα της έκφρασης λόγω της θέσης ενσωµάτωσης και πλήρης ίαση θαλασσαιµικών ποντικών επιτεύχθηκε σε µεταγενέστερο πείραµα. 89 Αυτά τα αποτελέσµατα δηµιούργησαν ελπίδες ότι η πρώτη κλινική µελέτη είναι κοντά. Υπάρχουν, όµως, αρκετά σηµαντικά ζητήµατα, που αφορούν κυρίως την ασφάλεια των ιϊκών οχηµάτων, τα οποία καθιστούν απρόβλεπτο το µέλλον τους 4 : α) Παθογονικότητα: Παρά το γεγονός ότι οι νεότερες γενιές οχηµάτων έχουν µειώσει σηµαντικά την πιθανότητα να δηµιουργηθεί ένας αυτοαναπαραγόµενος ιός, 90,91 η πιθανότητα αυτή δεν παύει να αποτελεί µια ανησυχία. β) Ανοσοογονικότητα: Οι ιϊκές πρωτεΐνες µπορούν να προκαλέσουν ανοσολογικές αντιδράσεις, οι οποίες όχι µόνο περιορίζουν τη δυνατότητα επαναλαµβανόµενης χορήγησης του οχήµατος, αλλά καθιστούν πιθανή και µια συστηµατική φλεγµονώδη αντίδραση, που όπως έχει παρατηρηθεί, µπορεί να οδηγήσει και στο θάνατο. 92,93 γ) Μετάλλαξιγένεση µε την ενσωµάτωση: Η ενσωµάτωση του οχήµατος µπορεί να οδηγήσει σε κυτταρική εξαλλαγή µέσω µεταγραφικής ενίσχυσης κυτταρικού πρωτογκογονιδίου από ιϊκούς ενισχυτές, καταστολή ογκοκατασταλτικών γονιδίων που βρίσκονται γύρω από τη θέση ενσωµάτωσης ή µε παρεµβολή στην αλληλουχία κάποιου γονιδίου. 94-96 Ο αρχικά θεωρητικός κίνδυνος έχει αποδειχθεί πια αρκετά ρεαλιστικός, τόσο σε ποντίκια, όσο και σε ανθρώπους, οι οποίοι συµµετείχαν στην πρώτη κλινική µελέτη για τη γονιδιακή θεραπεία της φυλοσύνδετης στο Χ βαριάς µικτής ανοσοανεπάρκειας. 94,96-98 Τουλάχιστο δύο στους δέκα ασθενείς έχουν ήδη αναπτύξει οξεία Τ-λεµφοβλαστική λευχαιµία. Ο κίνδυνος αυτός, µάλιστα, δεν είχε αναδειχθεί από τις προκλινικές µελέτες σε ζωικά µοντέλα. δ) Ανεξέλεγκτη έκφραση αποσιώπηση του διαγονιδίου: Τα ρετροϊικά οχήµατα φαίνεται ότι ενσωµατώνονται στο γονιδίωµα του ξενιστή σε µεγάλο βαθµό µε τυχαίο τρόπο, ώστε κάθε διαφορετική θέση ενσωµάτωσης να έχει τη δική της ιδιαίτερη επίδραση στη µεταγραφή του διαγονιδίου, µε αποτέλεσµα να µην υπάρχει σταθερότητα στην έκφρασή του. Επιπλέον, µε την πάροδο του χρόνου προκύπτει 17

αποσιώπηση του διαγονιδίου, κυρίως µέσω απενεργοποίησης του υποκινητή, διαµεσολαβούµενης από επιγενετικούς µηχανισµούς, όπως CpG µεθυλίωση και αποακετυλίωση των ιστονών. 99-101 Η αποσιώπηση πιθανόν να σχετίζεται µε την επιλεκτική αναγνώριση και απενεργοποίηση συγκεκριµένων αλληλουχιών 102-104 ή µε την ετεροχρωµατινική ή ευχρωµατινική κατάσταση της εκάστοτε θέσης ενσωµάτωσης. 105-107 ε) Ανάγκη ενεργού κυτταρικού κύκλου: Το πρόβληµα αυτό, όπως προαναφέρθηκε, αφορά κυρίως τους ογκορετροϊούς, αλλά και η διαµόλυνση µε lenti-ιούς είναι επίσης λιγότερο αποτελεσµατική για το µη διαιρούµενο κλάσµα των κυττάρων σχετικά µε το διαιρούµενο. στ) Περιορισµοί στο µέγεθος του ενθέτου: Αν και αυτό ποικίλλει ανάλογα µε το είδος του ιϊκού οχήµατος, οι ρετροϊοι έχουν, γενικά, περιορισµένες δυνατότητες. ζ) Πρακτικά προβλήµατα: Η παραγωγή των ιϊκών οχηµάτων σε µεγάλη κλίµακα είναι και τεχνικά και οικονοµικά απαιτητική. Το κόστος αυξάνεται ιδιαίτερα και εξαιτίας της απαίτησης αυστηρών δοκιµασιών για την εκτίµηση της ασφάλειάς τους. 1.5.2 Μη ιϊκά οχήµατα γονιδιακής µεταφοράς Τα προβλήµατα των ιϊκών οχηµάτων έχουν καταστήσει τα µη ιϊκά οχήµατα εξαιρετικά επίκαιρα. Τα µη ιϊκά συστήµατα µεταφοράς (ο όρος σύστηµα αναφέρεται στο συνδυασµό του νουκλεϊκού οξέος συνήθως ένα πλασµίδιο µε µια µέθοδο µεταφοράς) µεταφέρουν γενετικό υλικό µέσα στα κύτταρα, χωρίς να χρησιµοποιούν µολυσµατικά ανασυνδυασµένα ιϊκά σωµατίδια. 108 Σε σχέση µε τα ιϊκά είναι λιγότερο ανοσογόνα, αφού δε φέρουν ή φέρουν ελάχιστες πρωτεΐνες, λιγότερο τοξικά, περισσότερο αποδοτικά ανάλογα µε το κόστος και ευκολότερα στην παραγωγή σε µεγάλη κλίµακα και στον ποιοτικό έλεγχο. Επίσης, δεδοµένου ότι δε φέρουν ειδικότητα ως προς το κύτταρο-ξενιστή, µπορούν να διαµολύνουν ένα µεγάλο εύρος ιστών και οργάνων. Τα τελευταία χρόνια έχουν χρησιµοποιηθεί µη ιϊκά συστήµατα µε στόχο διάφορα είδη κυττάρων και σε διάφορες εφαρµογές. 109,110 18

Παρ όλ αυτά, η χρήση µη ιϊκών συστηµάτων για αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα έχει υπάρξει µέχρι σήµερα περιορισµένη, κυρίως εξαιτίας δύο παραµέτρων: α) Τα µη ιϊκά οχήµατα, κυρίως τα πλασµίδια, αποτελούνται από ένα µόριο νουκλεϊκού οξέους χωρίς συνδεόµενες πρωτεΐνες («γυµνό DNA») και είναι πολύ ανεπαρκή για µεταφορά γενετικού υλικού σε κύτταρα. Έτσι, πρέπει να συνδυάζονται µε µια µέθοδο γονιδιακής µεταφοράς, που να καθιστά εφικτή την είσοδο στα κύτταρα. Παρ όλ αυτά, τα αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα είναι γνωστά για την εξαιρετική δυσκολία διαµόλυνσής τους. 111 β) Τα πλασµίδια χάνονται γρήγορα από ταχέως πολλαπλασιαζόµενα κύτταρα, διότι δεν έχουν µιτωτική σταθερότητα. Τα συγκριτικά πλεονεκτήµατα των µη ιϊκών οχηµάτων και οι πρόσφατες εξελίξεις στη σχετική έρευνα τα έχουν καταστήσει ανταγωνιστικά ως προς τα ιϊκά οχήµατα στην προσπάθεια γονιδιακής µεταφοράς σε αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα. Έχουν χρησιµοποιηθεί διάφορες µέθοδοι µεταφοράς ενός µη ιϊκού οχήµατος εντός των κυττάρων. Έχουν χρησιµοποιηθεί συνθετικά µακροµόρια, όπως τα κατιονικά λιπίδια και τα πολυµερή, 112-114 αλλά η αποτελεσµατικότητά τους στα αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα δεν είναι ενθαρρυντική. 115-117 Η εµπειρία από τη σχετικά νέα τεχνική της µεταφοράς µε τη χρήση στερεών σωµατιδίων, κατά την οποία το DNA προσδένεται σε σωµατίδια χρυσού, τα οποία βοµβαρδίζουν το κύτταρο, είναι µικρή. 118,119 Η πιο αποτελεσµατική µέθοδος για τη µεταφορά πλασµιδικού DNA σε αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα φαίνεται να είναι σήµερα η ηλεκτροδιάτρηση, 120 δηλαδή η εφαρµογή ηλεκτρικού πεδίου, η οποία πιστεύεται ότι καθιστά παροδικά διαπερατές τις µεµβράνες του κυττάρου µέσω αντιστρεπτού σχηµατισµού πόρων. 121-128 Το DNA κατευθύνεται από ηλεκτροφορητικές και ηλεκτρωσµωτικές δυνάµεις µέσα από τις αποσταθεροποιηµένες µεµβράνες. 129-131 Επιπλέον, η ηλεκτροδιάτρηση δεν περιλαµβάνει µόλυνση µε άλλα βιοµόρια ή πιθανές ανοσολογικές αντιδράσεις, ενώ είναι µια απλή, οικονοµική, ταχεία και επαναλήψιµη µέθοδος. Τα µη ιϊκά οχήµατα που έχουν χρησιµοποιηθεί για τη µεταφορά ενός διαγονιδίου σε κύτταρα µπορούν να καταταχθούν στις παρακάτω κατηγορίες: 19

α) Κοινά πλασµίδια: Τα οχήµατα αυτά δεν αυτοαναπαράγονται µέσα σε κύτταρα θηλαστικών και χάνονται µε τη διαίρεση του κυττάρου, 132 εκτός αν ενσωµατωθούν στο χρωµοσωµικό γενετικό υλικό του κυττάρου, κάτι που συµβαίνει µε µια πιθανότητα 10-3 10-5. 133-136 Επιπλέον, µεταφέρονται σε πολύ µικρό βαθµό στον πυρήνα και παραµένουν κυρίως στο κυτταρόπλασµα και αποικοδοµούνται από νουκλεάσες. β) Επισωµατικά αυτοαναπαραγόµενα οχήµατα (Replicating Episomal Vectors REVs): Προκειµένου να αντιµετωπιστούν αυτά τα προβλήµατα των κοινών πλασµιδιακών οχηµάτων, τροποποιήθηκαν τα οχήµατα DNA, ώστε να αυτοαναπαράγονται αυτόνοµα στα ανθρώπινα κύτταρα και χωρίς να ενσωµατώνονται στο χρωµοσωµικό γενετικό υλικό. 137-139 Αυτό επιτεύχθηκε για πρώτη φορά µε τα οχήµατα βασισµένα σε επισωµατικά αυτοαναπαραγόµενους ιούς. Τα οχήµατα αυτά συµπεριλαµβάνουν µια αντιγραφική µονάδα (replicon) κάποιου ιού πρωτευόντων, ο οποίος φυσιολογικά αναπαράγεται εξωχρωµοσωµικά εντός των κυττάρων κατά τη διάρκεια της λανθάνουσας φάσης της µόλυνσης. Τέτοιοι ιοί, που έχουν χρησιµοποιηθεί, είναι ο ανθρώπινος ιός Epstein-Barr (EBV) 140 και οι ιοί θηλαστικών SV40 (Simian Virus 40) 141 και BKV. 142,143 Η αντιγραφική µονάδα περιλαµβάνει δύο στοιχεία, µία αφετηρία της αντιγραφής και ένα πρώιµο γονίδιο, η παραγόµενη πρωτεΐνη του οποίου λειτουργεί ως trans- ενεργοποιητής της αντιγραφής. 144 Με αυτό τον τρόπο επιτυγχάνεται και υψηλή έκφραση του διαγονιδίου, εξαιτίας του πολλαπλασιασµού του οχήµατος, και σε κάποιο βαθµό διατήρηση της έκφρασης, χάρη στην κάθετη µεταβίβαση του επισώµατος κατά την κυτταρική διαίρεση. 144 Από τα οχήµατα αυτής της κατηγορίας, αυτά που έχουν βασιστεί στον ιό EBV είναι τα πιο ευρέως µελετηµένα. Μάλιστα, έχει κατασκευαστεί κοσµιδιακό όχηµα βασισµένο στον ιό EBV, που έφερε ολόκληρο το LCR και το γονίδιο της β- σφαιρίνης, το οποίο απουσία πίεσης επιλογής διατηρήθηκε σε επισωµατική κατάσταση στην ανθρώπινη λευχαιµική κυτταρική σειρά Κ562 για τουλάχιστο 60 γενιές. 145 Το όχηµα αυτό (cos203β) διατήρησε κατά τη διάρκεια των 60 γενεών και απουσία πίεσης επιλογής περίπου σταθερά επίπεδα έκφρασης του διαγονιδίου της β- σφαιρίνης, τα οποία, µάλιστα, αν αναπαράγονταν in vivo, θα αντιστοιχούσαν σε 20

θεραπευτικά επίπεδα έκφρασης. Το cos203β, βέβαια, απέτυχε να διατηρηθεί εντός της ερυθρολευχαιµικής κυτταρικής σειράς MEL. 145 Τα επισωµατικά αυτοαναπαραγόµενα οχήµατα, εµφανίζοντας πιθανότητα ενσωµάτωσης µικρότερη ακόµα και από την αναµενόµενη συχνότητα αυτόµατης µεταλλαξιγένεσης, 145 εξαλείφουν τον κίνδυνο µεταβλητότητας της έκφρασης ανάλογα µε τη θέση ενσωµάτωσης 146 και τα υπόλοιπα προβλήµατα, που αντιµετωπίζουν τα ιϊκά οχήµατα εξαιτίας της ενσωµάτωσης. Επιπλέον, έχουν τη δυνατότητα να φέρουν µεγάλα τµήµατα DNA, µε αποτέλεσµα να µπορούν να συµπεριληφθούν ιντρόνια και cis- ρυθµιστικές περιοχές, που απαιτούνται για την αυστηρή ρύθµιση της έκφρασης. 147,148 Εξάλλου, προσφέρουν αποδοτικότερη διαµόλυνση 108,149,150 πλασµίδια. 108 και υψηλότερα επίπεδα έκφρασης σε σχέση µε τα κοινά Σηµαντικά προβλήµατα, όµως, στην ανάπτυξη αυτών των οχηµάτων δηµιουργεί το γεγονός ότι εκφράζουν ιϊκές πρωτεΐνες, τα προϊόντα των πρώιµων ιϊκών γονιδίων, που λειτουργούν ως trans- ενεργοποιητές της αντιγραφής. Οι πρωτεΐνες αυτές θέτουν ζητήµατα ανοσολογικών αντιδράσεων και, κυρίως, εξαλλαγής του κυττάρου-ξενιστή. Έτσι, η πρωτεΐνη EBNA-1 στην περίπτωση του EBV είναι απαραίτητη για τη διατήρηση των βασισµένων στον EBV οχηµάτων σε επισωµατική κατάσταση, 151-155 ευθύνεται, όµως, για την πρόκληση καρκινικής εξαλλαγής. 156-159 Το ίδιο ισχύει και για τα µεγάλα Τ-αντιγόνα των ιών SV40 144 και BKV. 160-163 Προβληµατισµό για τα βασισµένα στον EBV οχήµατα, που είναι και αυτά που κυρίως έχουν µελετηθεί, προκαλεί και το γεγονός ότι συχνά χάνονται από τα κύτταρα απουσία επιλογής. 149,153,164-166 Τα οχήµατα αυτά, πρέπει να σηµειωθεί, ότι αρχικά θεωρούνταν ότι δε µπορούν να αυτοαναπαράγονται παρά µόνο σε κύτταρα πρωτευόντων, κάτι που θα απέκλειε την πιθανότητα πραγµατοποίησης προκλινικών µελετών σε µοντέλα τρωκτικών. 140,167 Παρ όλ αυτά, έχει επιτευχθεί πια η µεταφορά ενός ολόκληρου τµήµατος 185 Kb του ανθρώπινου γενετικού τόπου της β-σφαιρίνης σε κυτταρική σειρά ποντικού (ινοβλάστες) και η έκφραση µακράς διάρκειας του διαγονιδίου της β- σφαιρίνης µε και χωρίς πίεση επιλογής. 168 γ) Επισωµατικά οχήµατα βασισµένα σε χρωµοσωµικά στοιχεία: Η ανάγκη δηµιουργίας συστηµάτων απαλλαγµένων από γονίδια που να εκφράζουν ιϊκές 21

πρωτεΐνες οδήγησε στην κατασκευή οχηµάτων που φέρουν στοιχεία από ανθρώπινα χρωµοσώµατα. Τα τελευταία χρόνια έχουν γίνει αρκετές προσπάθειες κατασκευής τεχνητών χρωµοσωµάτων θηλαστικών, οχηµάτων που να προσοµοιάζουν στα φυσικά χρωµοσώµατα, για τη γονιδιακή µεταφορά σε κύτταρα ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισµών. 137-139,169-175 Στα σηµαντικά πλεονεκτήµατα των ανθρώπινων τεχνητών χρωµοσωµάτων περιλαµβάνονται το γεγονός ότι περιέχουν αποκλειστικά ανθρώπινα γενετικά στοιχεία, ότι έχουν δυνατότητα συµπερίληψης τεράστιας ποσότητας DNA και ότι είναι µιτωτικά σταθερά απουσία επιλογής. Από τότε που κατασκευάστηκε το πρώτο τεχνητό χρωµόσωµα, 176 έχουν χρησιµοποιηθεί αρκετά τεχνητά χρωµοσώµατα ως συστήµατα γονιδιακής µεταφοράς. 177-180 Πρόσφατα, µάλιστα επιτεύχθηκε η µεταφορά ενός τεχνητού χρωµοσώµατος θηλαστικού σε CD34+ κύτταρα µε απόδοση 2,5-4,0% 181 (ο πληθυσµός των CD34+ κυττάρων θεωρείται αυξηµένης περιεκτικότητας σε προγονικά αιµοποιητικά κύτταρα). Τα προβλήµατα που εµφανίζουν τα τεχνητά χρωµοσώµατα εκπορεύονται από δυσκολίες στην κατασκευή τους, το χειρισµό τους και τη µεταφορά τους στα κύτταρα-στόχους εξαιτίας του τεράστιου µεγέθους τους της τάξης µερικών µεγαβάσεων, ενώ πρόβληµα δηµιουργεί και η τάση τους να ανασυνδυάζονται. Πρόσφατα δηµιουργήθηκε ένα µικρό κυκλικό όχηµα βασισµένο σε ανθρώπινα χρωµοσωµικά στοιχεία που αντιγράφεται και παραµένει σε επισωµατική κατάσταση σε ευκαρυωτικά κύτταρα χωρίς να χρειάζεται ιϊκούς trans-δρώντες παράγοντες για την αντιγραφή του. Το όχηµα αυτό, το pepi-1 (Εικόνα 1.6) κατασκευάστηκε 182 από ένα όχηµα βασισµένο στον ιό SV40, που περιείχε την αφετηρία της αντιγραφής του SV40, µε αντικατάσταση του γονιδίου του µεγάλου Τ-αντιγόνου του SV40 µε το S/MAR (Scaffold/Matrix Attachment Region) στοιχείο από την 5 περιοχή του γονιδίου της ανθρώπινης ιντερφερόνης β. 183 Το pepi-1 περιλαµβάνει, 182,184 εκτός από το S/MAR, µια αφετηρία της αντιγραφής για προκαρυωτικά κύτταρα (puc ori) και µια για ευκαρυωτικά κύτταρα (SV40 ori), το γονίδιο αντίστασης στην καναµυκίνη (Kan/Neo) για την επιλογή των διαµολυσµένων κυττάρων, που ολοκληρώνεται µε τη θέση πολυαδενυλίωσης της θυµιδινικής κινάσης του ιού HSV (HSV TK polya), και, ως γονίδιο αναφοράς, το 22

γονίδιο για τη GFP (Green Fluorescent Protein) µε τον ισχυρό υποκινητή του κυτταροµεγαλοϊού pcmv. Η GFP είναι µια πρωτεΐνη της µέδουσας Aequoria victoria και εµφανίζει φαινόµενο αυτοφθορισµού, εκπέµποντας έντονο πράσινο φως, όταν προσπέσει πάνω της κυανό ή υπεριώδες φως. 185 Εικόνα 1.6: Το πλασµίδιο pepi-1. Τα S/MAR στοιχεία είναι περιοχές από τριακόσιες ως µερικές χιλιάδες βάσεις του γονιδιώµατος των ευκαρυωτικών 186,187 οργανισµών πλούσιες σε αδενίνη και θυµίνη 188,189 µε τις οποίες προσδένεται η χρωµατίνη στον πυρηνικό πρωτεϊνικό σκελετό, τη θεµέλια ουσία, 190,191 και οι οποίες θεωρείται ότι είναι υπεύθυνες για το σχηµατισµό των βρόχων της ίνας των 30nm. 192 Ο φυσιολογικός τους ρόλος φαίνεται ότι περιλαµβάνει την προσκόληση του DNA στο γονιδίωµα, µεταγραφική ενίσχυση χωρίς την ανάγκη παρουσίας ενισχυτών 194-197 (αλλά δρουν και πολλαπλασιαστικά µε αυτούς 198 ) και πιθανώς να φέρουν και ρόλο µονωτή, ορίζοντας τα όρια αυτόνοµα ρυθµιζόµενων χρωµατινικών περιοχών. 199-203 Η µοναδικότητα του οχήµατος pepi-1 έγκειται στην ικανότητά του να λειτουργεί ως σταθερό επίσωµα απουσία του µεγάλου Τ-αντιγόνου του SV40. 182 Αυτή την ικανότητα θεωρείται ότι την προσδίδει το S/MAR. Το pepi-1 έχει παρατηρηθεί να διατηρείται σταθερά και σε επισωµατική κατάσταση σε διάφορες κυτταρικές σειρές ανθρώπου και τρωκτικών 182,204-206 σε χαµηλό αριθµό αντιγράφων ανά κύτταρο, για τουλάχιστο 100 γενιές απουσία επιλογής και µάλιστα ότι µπορεί να 23

αυτοαναπαράγεται σε κύτταρα θηλαστικών µία φορά ανά κυτταρικό κύκλο. 205 Θεωρείται ότι το S/MAR στρατολογεί κυτταρικούς παράγοντες, που εµπλέκονται στη µιτωτική σταθερότητα όσο και στην επισωµατική κατάσταση του pepi-1. Το πλασµίδιο pepi-1 συνδέεται µε την πυρηνική θεµέλια ουσία και τα µιτωτικά χρωµοσώµατα, όπως έχει παρατηρηθεί in vivo, 207 και αυτό είναι πιθανό να διαµεσολαβείται από το S/MAR. Ένδειξη προς αυτή την κατεύθυνση αποτελεί το γεγονός ότι ο παράγοντας SAF-A (Scaffold Attachment Factor-A), 208 µια βασική πρωτεΐνη της θεµέλιας ουσίας, 209 που συνδέεται φυσιολογικά µε τα χρωµοσώµατα και τη χρωµατίνη 210 και µάλιστα στα S/MAR στοιχεία, 208 συνδέεται µε το S/MAR του pepi-1. 208 ηλαδή φαίνεται ότι το pepi-1 συνδέεται µε τα χρωµοσώµατα µέσω του SAF-A και µε αυτό τον τρόπο, αφού αντιγραφεί, πραγµατοποιεί κατά τη µίτωση διαχωρισµό ανάλογο των χρωµοσωµάτων και παράλληλα µε αυτά. 208 Ταυτόχρονα, το S/MAR είναι πιθανό να στρατολογεί πυρηνικά στοιχεία που υποκαθιστούν άλλες δράσεις του µεγάλου Τ-αντιγόνου, µε κυριότερη την αποσταθεροποίηση της διπλής έλικας του DNA, που οδηγεί στη δηµιουργία ενός ανοικτού συµπλέγµατος στην αφετηρία της αντιγραφής απαραίτητου για τη συγκρότηση της αντιγραφικής µηχανής. 208 Σηµαντική ένδειξη για τη σηµασία του S/MAR παρέχει και η παρατήρηση ότι, όταν αφαιρεθεί το S/MAR, το όχηµα ενσωµατώνεται µε τυχαίο τρόπο στο γονιδίωµα. 182,207,211 Το pepi-1 µε ήπια τροποποίηση (egfp enhanced GFP αντί της GFP) οδήγησε πρόσφατα σε διαµόλυνση της ανθρώπινης αιµοποιητικής σειράς Κ562, µε αποτέλεσµα µακράς διάρκειας διατήρησή του ως σταθερού επισώµατος και µακράς διάρκειας έκφραση του διαγονιδίου, τόσο παρουσία όσο και απουσία πίεσης επιλογής. Επίσης απέδωσε και την πρώτη γονιδιακή µεταφορά σε αιµοποιητικά προγονικά κύτταρα µε επισωµατικό όχηµα βασισµένο σε στοιχείο S/MAR. 204 Αξίζει να σηµειωθεί ότι η αποδοτικότητα της διαµόλυνσης µε ηλεκτροδιάτρηση δεν επηρεάστηκε από τη φάση του κυτταρικού κύκλου, µε αποτέλεσµα να µη χρειάζεται να επαχθούν τα αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα προς διαίρεση, η οποία αναπόφευκτα οδηγεί και στη διαφοροποίησή τους και την µείωση του µακροπρόθεσµου αυτοαναπαραγωγικού δυναµικού τους. 79-84 24

1.6 Το όχηµα hβ-s/mar(a) Τα παραπάνω στοιχεία διαµορφώνουν ένα ικανό υπόβαθρο για τη δοκιµασία του σκελετού του οχήµατος pepi-1 σε πειράµατα για τη δηµιουργία κατάλληλου οχήµατος για τη γονιδιακή µεταφορά της β-σφαιρίνης. Για τη δηµιουργία του κατάλληλου οχήµατος, λήφθηκαν υπόψη τα εξής δεδοµένα, ενταγµένα στο πλαίσιο των προαναφερόµενων δεδοµένων: α) Το pepi-1 έχει τη δυνατότητα γονιδιακής µεταφοράς σε αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα, αν και δεν επιτυγχάνεται η συγκράτηση του οχήµατος, ενώ µετά από γονιδιακή µεταφορά µε το pepi-1 σε κυτταρική σειρά MEL το διαγονίδιο αποσιωπάται. 204 β) Όπως συµβαίνει και στα ενσωµατωνόµενα διαγονίδια, έτσι και στα επισωµατικά αυτοαναπαραγόµενα οχήµατα η έκφραση του διαγονιδίου της β-σφαιρίνης υπόκειται σε αποσιώπηση, η οποία αποτρέπεται, όταν συµπεριληφθεί στο όχηµα το LCR. 145 γ) Ο µικρότερος σε µήκος συνδυασµός στοιχείων του LCR, που έχει βρεθεί µέχρι σήµερα ότι έχει πλήρη τη βιολογική λειτουργικότητα του LCR, είναι το µlcr (microlcr). 212,213 Τα στοιχεία του µlcr φαίνονται στην Εικόνα 1.7. δ) Ο συνδυασµός του β-σφαιρινικού γονιδίου µε ολόκληρο το LCR έχει µεταφερθεί και διατηρηθεί για µακρό χρονικό διάστηµα σε ανθρώπινη αιµοποιητική σειρά (Κ562) µε επισωµατικό αυτοαναπαραγόµενο όχηµα (cos203β). 145 Το όχηµα αυτό διατήρησε περίπου σταθερά επίπεδα έκφρασης του διαγονιδίου της β-σφαιρίνης, τα οποία, µάλιστα, αν αναπαράγονταν in vivo, θα αντιστοιχούσαν σε θεραπευτικά επίπεδα έκφρασης. Παρ όλ αυτά, το βασισµένο σε στοιχεία του ιού EBV όχηµα cos203β, απέτυχε να διατηρηθεί εντός της ερυθρολευχαιµικής κυτταρικής σειράς MEL. 145 Σε αυτό το πλαίσιο τέθηκε το εξής επιστηµονικό ερώτηµα: Έχει τη δυνατότητα το pepi-1 να µεταφέρει το γονίδιο της β-σφαιρίνης σε αιµοποιητική σειρά, να διατηρηθεί για µεγάλο χρονικό διάστηµα (µήνες ή 25

έτη) και σε επισωµατική κατάσταση και να διατηρήσει ικανοποιητικό επίπεδο έκφρασης; Προκειµένου να προσεγγιστεί αυτό το ερώτηµα αντικαταστάθηκε η µεταγραφική µονάδα pcmv - GFP από το γονίδιο της β-σφαιρίνης συνοδευόµενο από το µlcr (microlcr) και το νέο όχηµα hβ-s/mar(a), που προέκυψε, χρησιµοποιήθηκε για διαµόλυνση µε ηλεκτροδιάτρηση της ερυθρολευχαιµικής κυτταρικής σειράς ποντικού MEL. Τα κύτταρα της σειράς MEL διαιρούνται κάθε 12 ώρες και διατηρήθηκαν δύο καλλιέργειες, µία παρουσία επιλογής και µία απουσία επιλογής. Ο προσανατολισµός µε τον οποίο έχει τοποθετηθεί το S/MAR στοιχείο µέσα στο όχηµα επιλέχθηκε σύµφωνα µε την παρατήρηση ότι η παρουσία µιας ενεργού µεταγραφικής µονάδας ανοδικά του S/MAR είναι απαραίτητη για τη διατήρηση του επισώµατος. 214,215 26