ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 6 ΕΛΕΓΧΟΣ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑΣ ΟΙΝΩΝ Ιωάννης Ρούσσης Οκτώβριος 2016 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ Σταθερότητα οίνων Η σταθερότητα των οίνων αφορά την κατάσταση των οίνων κατά τη διατήρησή του. Γενικά, οίνοι που έχουν κατεργαστεί σωστά (σταθεροποιηθεί) δεν θα παρουσιάσουν φυσικοχημική, μικροβιακή ή οργανοληπτική αλλαγή και κατά συνέπεια αλλοίωση. Πάντως, δεν καθορίζεται η διάρκεια ζωής των οίνων, και επίσης η σταθερότητα των οίνων εξαρτάται από τις συνθήκες διατήρησης. Για τη σταθερότητα των οίνων έχουν αναπτυχθεί και χρησιμοποιούνται δοκιμές σταθερότητας των οίνων, που αναφέρονται σε κανονικές συνθήκες διατήρησης. Οι δοκιμές σταθερότητας γίνονται πριν την εμφιάλωση των οίνων. Επίσης, η οργανοληπτική δοκιμασία συνεισφέρει στην αποτίμηση της σταθερότητας. Στους οίνους υπάρχουν υδρόφιλα και υδρόφοβα κολλοειδή. Τα θετικά φορτισμένα με τα αρνητικά φορτισμένα κροκιδώνονται. Παράδειγμα σιδηροκυανιούχος σίδηρος (-) και ζελατίνη (+). Όσον αφορά στα προστατευτικά κολλοειδή, το υδρόφιλο τυλίγει υδρόφοβο του ίδιου φορτίου. Η σταθερότητα των κολλοειδών εξαρτάται από την προσρόφηση ιόντων και διαλύτη. Τα κολλοειδή είναι προσροφητικά και έχουν την ικανότητα να συμπαρασύρουν διάφορα συστατικά. Με ζωικό άνθρακα απομακρύνονται ταννίνες, χρωστικές, πρωτείνες. Με μπεντονίτη απομακρύνονται πρωτείνες. Στους οίνους συμβαίνει καταβύθιση μη μεταλλικών και μεταλλικών ενώσεων. Επίσης, υπάρχουν μικροβιακά θολώματα.
Καταβύθιση μη μεταλλικών ενώσεων 1. Χρωστικές -- ανθοκυάνες + πρωτείνες. Οι χρωστικές απομακρύνονται με αλβουμίνη και οι πρωτείνες με μπεντονίτη. 2. Προιόντα οξείδωσης πολυφαινόλες κινόνες πολυμερισμός 3. Πρωτεΐνες στα ερυθρά κρασιά καταβύθιση πρωτεινών με ταννίνες. Απομάκρυνση με καταβύθιση πρωτεινών με μπεντονίτη. 4. Τρυγικά άλατα: όξινο τρυγικό κάλι, τρυγικό ασβέστιο. 5. Άλλα άλατα: βλενικό αβέστιο (φαιά σήψη). Οξαλικό ασβέστιο. Καταβύθιση μεταλλικών ενώσεων Τα θολώματα σιδήρου συμβαίνουν σε υψηλές συγκεντρώσεις σιδήρου, όπως > 12 mg/l Το θόλωμα χαλκού συμβαίνει σε συγκεντρώσεις χαλκού όπως > 0,5 mg/l Θολώματα σιδήρου Fe II Fe III Fe (OH)3 Fe III + Φωσφορικά Φωσφορικός σίδηρος (κολλοειδές -) που με ιόντα ασβεστίου, καλίου, πρωτείνες (+) Λευκό θόλωμα. Fe III + ταννίνες - σύμπλοκο σιδήρου-ταννινών (κολλοειδές -) που με ιόντα ασβεστίου, καλίου, πρωτείνες (+) Κυανού θόλωμα. Θόλωμα χαλκού --θειούχος χαλκός σε κολλοειδή μορφή --μεταλλικός χαλκός σε κολλοειδή μορφή πιθανόν θειούχος χαλκός/χαλκός+πρωτείνη/πρωτείνη+ταννίνη
Θολώματα οίνων. Ερυθροί οίνοι Θόλωμα σιδήρου Ίζημα τρυγικών αλάτων Ίζημα χρωστικών ουσιών Λευκοί οίνοι Θόλωμα σιδήρου Θόλωμα χαλκού Πρωτεϊνικό θόλωμα Ίζημα τρυγικών αλάτων Θόλωμα οξείδωσης Θόλωμα από Ζυμομύκητες Θόλωμα από Βακτήρια Θόλωμα οξείδωσης Θόλωμα από Ζυμομύκητες Θόλωμα από Βακτήρια σπάνια Δοκιμές σταθερότητας Έχουν αναπτυχθεί δοκιμές για τη σταθερότητα των πρωτεϊνών, την οξειδωτική σταθερότητα τη σταθερότητα των μετάλλων, τη σταθερότητα των τρυγικών, τη σταθερότητα του χρώματος, τη μικροβιακή σταθερότητα. Πρωτεϊνικό θόλωμα α) Μια φιάλη με τον υπό δοκιμή οίνο τοποθετείται στους 80 o C για 30 min και κατόπιν ψύχεται. Αν δεν θολώσει και παραμείνει διαυγής μετά από 24 h είναι σταθερός. β) Προσθήκη ταννίνης 0.5 g/l. Το σύμπλοκο ταννίνη-πρωτεϊνη σχηματίζει θόλωμα. Ίζημα τρυγικών Ψύξη του οίνου στους -4 o C για μια εβδομάδα. Αν δεν εμφανιστεί κρυσταλλικό ίζημα ο οίνος είναι σταθερός. Ίζημα χρωστικών
Παραμονή του οίνου στους 0-4 o C για 12-24 h μπορεί να δημιουργήσει θόλωμα το οποίο εξαφανίζεται όταν ο οίνος επανέλθει στη θερμοκρασία περιβάλλοντος Θόλωμα σιδήρου α) Ο οίνος τοποθετείται σε άχρωμη φιάλη μέχρι τη μέση και διοχετεύεται οξυγόνο (από οβίδα ή πεπιεσμένος αέρας). Ανακινείται για 30 sec, πωματίζεται και παραμένει σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για 48 h. Αν υπάρχει πλεόνασμα σιδήρου θα θολώσει. Αν διατηρείται διαυγής μετά από μια εβδομάδα, είναι σταθερός. β) Ο οίνος παραμένει στους 0 o C για μια εβδομάδα. Θόλωμα χαλκού α) Λευκή φιάλη, γεμάτη με τον υπό δοκιμή οίνο, πωματίζεται και τοποθετείται οριζόντια σε διάχυτο ηλιακό φως για 7 ημέρες ή σε υπεριώδες για 24 h. β) Μια φιάλη οίνου, γεμάτη και πωματισμένη, τοποθετείται στους 30 o C για 3-4 εβδομάδες. Αν υπάρχει περίσσεια χαλκού θα εμφανιστεί θόλωμα. Θόλωμα οξείδωσης Ο οίνος τοποθετείται σε ποτήρι κι εκτίθεται στον αέρα για 12 h. Αν δεν θολώσει σημαίνει ότι δεν υπάρχει κίνδυνος για θόλωμα οξείδωσης μετά την εμφιάλωση. Μικροβιακό θόλωμα Μια φιάλη οίνου γεμάτη και κλεισμένη με βαμβάκι τοποθετείται στους 25 o C για 8 ημέρες. Αν δεν σχηματιστεί θόλωμα ο οίνος είναι ασφαλής για ανάπτυξη ζυμών. Αν εμφανιστεί θόλωμα μετά τις 8 ημέρες ίσως αναπτυχθούν βακτήρια.
Αζωτούχα συστατικά Πρωτεΐνες Ο οίνος περιέχει άζωτο με μορφή διαφόρων αζωτούχων ενώσεων σε συγκεντρώσεις 0,5 έως 4 g/l. Οι αζωτούχες ενώσεις διακρίνονται στις ανόργανες και τις οργανικές. Οι ανόργανες περιέχονται στον οίνο ως αμμωνιακά και αποτέλούν το 5 % του συνολικού αζώτου. Το υπόλοιπο 95 % αποτελούν οι οργανικές ενώσεις, κυρίως πρωτεΐνες, πολυπεπτίδια., αμινοξέα και αμίδια. Οι πρωτεΐνες (Μ-Β. > 10.000) μπορεί να φτάνουν το 10 % του συνολικού αζώτου, και είναι υπεύθυνες για το πρωτεϊνικό θόλωμα. Τα πολυπεπτίδια (Μ.Β.. < 10.000) συνιστούν το 60-80 % του συνολικού αζώτου. Τα αμινοξέα αποτελούν το 30-40 % του συνολικού αζώτου των οίνων. Στα κόκκινα κρασιά οι πρωτεΐνες ενώνονται με τις ταννίνες και καταβυθίζονται. Αντίθετα στα λευκά κρασιά παραμένουν και μπορούν να δώσουν θόλωμα πρωτεϊνών στο εμφιαλωμένο κρασί Το ανόργανο άζωτο (ΝΗ4 + ) χρησιμοποιείται από τους ζυμομύκητες, και έτσι μειώνεται κατά την ζύμωση. Αντίθετα, τα βακτήρια χρησιμοποιούν το άζωτο των αμινοξέων. Τα κόκκινα κρασιά περιέχουν, λόγω εκχύλισης των στερεών συστατικών, μεγαλύτερα ποσά αζωτούχων ενώσεων, 0,8-4 g/l, από τα λευκά κρασιά, 0,5-1,25 g/l. Μέθοδοι προσδιορισμού πρωτεινών και αμινοξέων Το ολικό άζωτο μπορεί να προσδιοριστεί με τη μέθοδο Kjeldahl. Επίσης, οι πρωτεΐνες προσδιορίζονται με τη μέθοδο, Bradford, και α-αμινοξέα με αντίδραση με νινυδρίνη. Μέταλλα Τα μέταλλα που κυρίως δημιουργούν προβλήματα αστάθειας είναι ο σίδηρος και ο χαλκός. Περίσσεια σιδήρου ή χαλκού στον οίνο μπορεί να προκαλέσει δημιουργία θολωμάτων ή ιζημάτων. Εάν τα επίπεδα του σιδήρου και του χαλκού είναι μεγαλύτερα από 5 mg/l και 0,2 mg/l αντίστοιχα, μπορεί να οδηγήσουν σε σχηματισμό θολωμάτων ή ιζημάτων. Επίσης, η περιεκτικότητα σε άλλα συστατικά επηρεάζει την πιθανότητα εμφάνισης του προβλήματος. Στον οίνο ο σίδηρος βρίσκεται κυρίως ως δισθενής. Η αναλογία δισθενούς/τρισθενούς σιδήρου εξαρτάται από την οξειδωτική κατάσταση του οίνου. Ο
τρισθενής σίδηρος συνδέεται με φωσφορικά. Από τα μέταλλα το κάλιο και το ασβέστιο σχετίζονται κυρίως με την τρυγική σταθερότητα του οίνου. Οξείδωση οίνου Η οξείδωση του γλεύκους είναι ενζυμικό φαινόμενο (ενζυμική καστάνωση). Η οξείδωση του οίνου είναι μία πορεία που λαμβάνει χώρα με δράση ελεύθερων ριζών. Έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια αρώματος την ανάπτυξη οξειδωμένου χρώματος, όπως και την ανάπτυξη οξειδωμένου αρώματος. Σύμφωνα με την πρόσφατη γνώση η οξείδωση στον οίνο λαμβάνει χώρα με ρίζες υδροξυλίου. Στο ph του οίνου ο Fe(II) ανάγει το οξυγόνο προς υπεροξείδιο του υδρογόνου, το οποίο παρουσία Fe(II) μετασχηματίζεται σε ρίζες υδροξυλίου (αντίδραση Fenton) Fe +2 + H 2 O 2 Fe +3 +OH. + OH - Οι ρίζες υδροξυλίου είναι πολύ δραστικές και μη επιλεκτικές, και μπορούν να οξειδώσουν σχεδόν όλα τα συστατικά των οίνων. Με την οξείδωση των φαινολικών συστατικών από τις ρίζες υδροξυλίου ξεκινάει μια αλληλουχία αντιδράσεων. Οι κινόνες που σχηματίζονται είναι ασταθείς και αντιδρούν περαιτέρω με το σχηματισμό πολυμερών και δημιουργία καστανού χρώματος. Τα αντιοξειδωτικά που προστίθενται στον οίνο μπορεί να αναστέλλουν το φαινόμενο της οξείδωσης-καστάνωσης των οίνων. Ο θειώδης ανυδρίτης δεσμεύει το υπεροξείδιο του υδρογόνου. Το ασκορβικό οξύ οξειδώνεται προς δευδροασκορβικό οξύ δεσμεύοντας οξυγόνο. Παράλληλα προκύπτει υπεροξείδιο του υδρογόνου. Έτσι, είναι απαραίτητο να χρησιμοποιείται μαζί με θειώδη ανυδρίτη, ο οποίος δεσμεύει το υπεροξείδιο του υδρογόνου που προκύπτει.
ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ Πρωτείνες και πρωτεινική σταθερότητα Προσδιορισμός πρωτεϊνών Ο προσδιορισμός των πρωτεϊνών και των πολυπεπτιδίων μπορεί να γίνει με την μέθοδο Bradford. Η μέθοδος στηρίζεται στο ότι το μέγιστο απορρόφησης όξινου διαλύματος της χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G-250 μετατοπίζεται από τα 465 nm στα 595 nm με σύνδεσή της με διαλυμένες πρωτεΐνες. Η χρωστική συνδέεται κυρίως με βασικά και αρωματικά αμινοξέα ιδιαιτέρα την αργινίνη. Σε 2,5 ml αραιωμένου (1 όγκος εμπορικής χρωστικής με 4 όγκους απεσταγμένου νερού) προστίθεται κατάλληλος όγκος οίνου και γίνεται ανάδευση. Μετά από παραμονή σε θερμοκρασία δωματίου για 5 minutes μετράται η απορρόφηση στα 595 nm. Η συγκέντρωση υπολογίζεται με τη χρήση πρότυπης καμπύλης με αλβουμίνη. Τυπική πρότυπη C (mg/l) = 103 χ ΔΑ. Πρωτεινική σταθερότητα Για την εκτίμηση της σταθερότητας των πρωτεϊνών στον οίνο υπάρχουν διάφορες δοκιμές. Όλες αφορούν τη μετουσίωση των πρωτεϊνών, με θέρμανση, προσθήκη οξέος ή αλκοόλης. Δοκιμή με θέρμανση Ο οίνος σε υδατόλουτρο στους 80 C για 30 min. Η εμφάνιση του τυχόν θολώματος εκδηλώνεται μετά την ψύξη του οίνου. Εάν ο οίνος εξακολουθεί να παραμένει διαυγής και μετά από 24 h προκύπτει ότι δεν υπάρχει κίνδυνος πρωτεϊνικού θολώματος. Δοκιμή με οξύ Σε 10 ml του υπό δοκιμή οίνου προστίθενται 2 σταγόνες αντιδραστηρίου οξέος. Εάν το δείγμα άμεσα παραμείνει διαυγές τότε δεν υπάρχει κίνδυνος πρωτεϊνικού θολώματος.
Σταθερότητα τρυγικών αλάτων Δοκιμή αγωγιμότητας Σε ποτήρι ζέσεως φέονται 200 ml οίνου, και διατηρείται στους 0 o C. Μετράται η αγωγιμότητα και η θερμοκρασία του οίνου. Προστίθενται υπό ανάδευση 0,8 gr θρυμματισμένου όξινου τρυγικού καλίου, και μετράται η αγωγιμότητα και η θερμοκρασία. Στη συνέχεια ανά λεπτό μετράται η αγωγιμότητα μέχρι να σταθεροποιηθεί η τιμή. Σημειώνεται ο χρόνος και η τιμή της αγωγιμότητας. Η μείωση της αγωγιμότητας σε συνάρτηση με το χρόνο δηλώνει αστάθεια. Γενικά, το εύρος των αποδεκτών μεταβολών είναι από 2 σε 4 %. Οίνοι με μεγαλύτερες μεταβολές στην αγωγιμότητα θεωρούνται ασταθείς. Πάντως, χρησιμοποιούνται τα δεδομένα που καταγράφονται για τους διάφορους οίνους. Μέταλλα Προσδιορισμός σιδήρου Ο σίδηρος στον οίνο προσδιορίζεται με διάφορες φωτομετρικές μεθόδους, και με ατομική απορρόφηση. Συχνά χρησιμοποιείται η αντίδραση του τρισθενούς σιδήρου με θειοκυανιούχα με σχηματισμό του έγχρωμου συμπλόκου Fe (CNS) 6-3 Μετράται η απορρόφηση στα 490 nm. Με οξείδωση του δισθενούς σιδήρου σε τρισθενή με υπεροξείδιο του υδρογόνου προσδιορίζεται ο συνολικός σίδηρος. Σε δύο δοκιμαστικούς σωλήνες φέρονται από 10 ml οίνου. Σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα προστίθενται 2 ml 3 N υδροχλωρικού οξέος και 1 ml διαλύματος 20 % θειοκυανιούχου καλίου. Ακολούθως, στον ένα σωλήνα προστίθενται 5 σταγόνες 30 % υπεροξειδίου του υδρογόνου και στον άλλο 5 σταγόνες απ. νερού. Γίνεται ανάμιξη και εκχύλιση με 10 ml μίγματος 2:1 οξικού αμυλεστέρα-μεθανόλης. Γίνεται διαχωρισμός, αφυδάτωση του εκχυλίσματος με άνυδρο θειικό νάτριο και διήθηση. Μετράται η απορρόφηση στα 490 nm. Από την απορρόφηση παρουσία υπεροξειδίου του υδρογόνου προκύπτει ο συνολικός ανόργανος σίδηρος, και από την απορρόφηση απουσία υπεροξειδίου του υδρογόνου προκύπτει ο τρισθενής σίδηρος.
Κατασκευάζεται πρότυπη καμπύλη με μεταλλικό σίδηρο. Ένα gr σιδήρου διαλύεται σε λίγα ml θερμού πυκνού υδροχλωρικού οξέος και ακολουθεί αραίωση στο 1 L με απ. νερό. Από το διάλυμα αυτό παρασκευάζονται διαλύματα σιδήρου συγκεντρώσεων 1, 2, 5 και 10 mg/l. Σε δοκιμαστικούς σωλήνες προστίθενται 10 ml πρότυπου διαλύματος σιδήρου. Ακολουθεί προσθήκη 2 ml 3 N υδροχλωρικού οξέος, 1 ml διαλύματος 20 % θειοκυανιούχου καλίου και 5 σταγόνες 30 % υπεροξειδίου του υδρογόνου. Η εκχύλιση του συμπλόκου που σχηματίζεται γίνεται με με 10 ml μίγματος 2:1 οξικού αμυλεστέραμεθανόλης. Μετράται η απορρόφηση στα 490 nm. Προσδιορισμός χαλκού Ο χαλκός στον οίνο προσδιορίζεται με φωτομετρικές μεθόδους, και με ατομική απορρόφηση. Συχνά χρησιμοποιείται η αντίδραση του δισθενούς χαλκού με διαιθυλο διθειο καρβαμιδικά με σχηματισμό του έγχρωμου συμπλόκου Μετράται η απορρόφηση στα 435 nm. Σε δοκιμαστικό σωλήνα φέρονται 10 ml οίνου. Ακολουθεί προσθήκη 1 ml αντιδραστηρίου υδροχλωρικού οξέος-κιτρικού οξέος, γίνεται ανάμιξη, και προστίθενται 2 ml 5 N υδροξειδίου του αμμωνίου, και γίνεται ξανά ανάμιξη. Στη συνέχεια, προστίθεται 1 ml διαλύματος 1 % διαιθυλο διθειο καρβαμιδικού νατρίου, και γίνεται καλή ανακίνηση. Μετά από 1 min προστίθενται 10 ml οξικού αμυλεστέρα και 5 ml απόλυτης μεθανόλης. Γίνεται ανάμιξη για 30 sec και ακολουθεί παραμονή για διαχωρισμό των φάσεων. Λαμβάνεται η οργανική φάση, και αφυδατώνεται με προσθήκη άνυδρου θειικού νατρίου, και ακολουθεί διήθηση. Μετράται η απορρόφηση στα 435 nm.
Κατασκευάζεται πρότυπη καμπύλη με μεταλλικό χαλκό. Διαλύονται 0,5 gr χαλκού σε αραιό νιτρικό οξύ και ακολουθεί συμπλήρωση με απ. νερό στο 1 L. Από αυτό το διάλυμα παρασκευάζονται διαλύματα χαλκού με τη βοήθεια αλκοόλης 95 %. Στη συνέχεια, γίνεται η ίδια διαδικασία που αναφέρεται παραπάνω για τον οίνο, δηλαδή χρησιμοποιούνται 10 ml πρότυπου διαλύματος στη θέση του οίνου. Οξειδωτική σταθερότητα Η αποτίμηση της οξειδωτικής σταθερότητας λευκών οίνων θα γίνει με χρήση υπεροξειδίου του υδρογόνου στους 60 ο C. Η % αύξηση της απορρόφησης στα 420 nm αποτελεί μέτρο της οξείδωσης. Επίσης, θα χρησιμοποιηθούν θειώδης ανυδρίτης, ασκορβικό οξύ και μίγμα τους ως αναστολείς της οξείδωσης. Η ταχεία οξείδωση του οίνου πραγματοποιείται με προσθήκη υπεροξειδίου του υδρογόνου και θέρμανση. Σε 5 ml οίνου προστίθενται 25 μl διαλύματος 3 % υπεροξειδίου του υδρογόνου και ακολουθεί διατήρηση στους 60 ο C για μία ώρα (και για μεγαλύτερο χρόνο). Μετά από μία ώρα (και περισσότερο) μετράται η απορρόφηση στα 420 nm, που είναι δείκτης της οξείδωσης-καστάνωσης. Η επίδραση των αντιοξειδωτικών αποτιμάται θα αποτιμάται με προσθήκη τους στον οίνο, πριν την προσθήκη υπεροξείδιου του υδρογόνου και τη θέρμανση. Ο θειώδης ανυδρίτης χρησιμοποιείται σε διάφορες συγκεντρώσεις, όπως 50, 100 mg/l, και μεγαλύτερες. Επίσης ασκορβικό οξύ σε διάφορες συγκεντρώσεις, όπως 50 και 100 mg/l, και μεγαλύτερες. Επιπλέον, θα χρησιμοποιηθούν αντίστοιχα μίγματα θειώδη ανυδρίτη και ασκορβικού οξέος. Γίνεται σύγκριση των διαφόρων δειγμάτων με και χωρίς την προσθήκη αντιοξειδωτικών. Επίσης, γίνεται σύγκριση γίνεται με μάρτυρα χωρίς προσθήκη και χωρίς θέρμανση.