Κεφάλαιο 5. Απομόνωση DNA. 5.1 Θεωρητικό μέρος. Δ.Παλαιολόγου, Ε. Κατσαρέλη και Γ. Παπανικολάου Εισαγωγή

Κεφάλαιο 5 Απομόνωση DNA Δ.Παλαιολόγου, Ε. Κατσαρέλη και Γ. Παπανικολάου Περίληψη Στο DNA βρίσκονται κωδικοποιημένες όλες οι πληροφορίες που καθορίζουν την ανάπτυξη του κάθε οργανισμού. Η μελέτη του μας δίνει πληροφορίες για κληρονομούμενα χαρακτηριστικά και περιέχει τον κώδικα που καθορίζει τη σύνθεση των πρωτεϊνών. Το DNA μπορεί να απομονωθεί από οποιοδήποτε εμπύρηνο κύτταρο. Τα βήματα για την απομόνωσή του περιλαμβάνουν λύση των κυτταρικών μεμβρανών, αποικοδόμηση των πρωτεϊνών, διαχωρισμό του DNA από τα υπόλοιπα κυτταρικά συστατικά, καθαρισμό και αποθήκευση του DNA σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα. Το DNA αποτελεί άριστη πρώτη ύλη για πειράματα μοριακής βιολογίας γιατί απομονώνεται εύκολα από πολλές πηγές, είναι εξαιρετικά σταθερό και διατηρείται για μεγάλο χρονικό διάστημα σε συνθήκες απλής κατάψυξης. Στην παρούσα άσκηση θα απομονώσουμε DNA από κύτταρα του στοματικού βλεννογόνου με τη βοήθεια απλών αντιδραστηρίων και θα το χρησιμοποιήσουμε στις εργαστηριακές ασκήσεις που ακολουθούν. Προαπαιτούμενη γνώση Βασικές γνώσεις καλής εργαστηριακής πρακτικής, όπως αναφέρονται στο κεφάλαιο «Οδηγίες εργασίας στο εκπαιδευτικό εργαστήριο». 5.1 Θεωρητικό μέρος 5.1.1 Εισαγωγή Το δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (Deoxyribonucleic Αcid, DNA) περιέχει τις γενετικές πληροφορίες που καθορίζουν τη βιολογική ανάπτυξη όλων των κυτταρικών μορφών ζωής και των περισσοτέρων ιών. Εξαίρεση αποτελούν ιοί που έχουν ως γενετικό υλικό ένα μόριο ριβονουκλεϊνικού οξέος (Ribonucleic Αcid, RNA). Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς το περισσότερο DNA βρίσκεται στον πυρήνα, ενώ μικρή ποσότητα βρίσκεται σε οργανίδια όπως τα μιτοχόνδρια και οι χλωροπλάστες. Τα μόρια DNA ενός ευκαρυωτικού κυττάρου έχουν μήκος περισσότερο από 2 m, επομένως για να χωρέσουν στον πυρήνα πρέπει να συμπυκνωθούν. Αυτό επιτυγχάνεται με σύνδεση του DNA με μια ομάδα βασικών, θετικά φορτισμένων πρωτεϊνών, τις ιστόνες, καθώς και με μια ετερογενή ομάδα πρωτεϊνών (μη ιστόνες). Τα μόρια του DNA περιελίσσονται γύρω από ιστόνες και σχηματίζουν τα νουκλεοσώματα, που αποτελούν τη δομική μονάδα της χρωματίνης. Οι ιστόνες χωρίζονται σε πέντε μεγάλες οικογένειες, τις H1/H5, H2A, H2B, H3 και H4. Κάθε νουκλεόσωμα αποτελείται από ένα κεντρικό τμήμα ιστονών (δύο αντίγραφα από κάθε ιστόνη τύπου 103

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4 σχηματίζουν ένα κεντρικό οκταμερές) που περιβάλλεται από 145-147 ζεύγη βάσεων DNA. Τα νουκλεοσώματα συνδέονται μεταξύ τους με ιστόνες τύπου Η1 ή Η5 ενωμένες με μόρια DNA μέχρι και 80 ζευγών βάσεων και σχηματίζουν δομές που μοιάζουν με χάντρες κομπολογιού. Τα νουκλεοσώματα στη συνέχεια περιελίσσονται, δημιουργώντας νημάτια διαμέτρου 30 nm, τα οποία σχηματίζουν τη δομή της χρωματίνης (εικόνα 5.1). Εικόνα 5.1 Η δομή του νουκλεοσώματος. Το νουκλεόσωμα αποτελείται από μόρια DNA περιελιγμένα γύρω από ιστόνες. Η σύνδεση του DNA με ιστόνες και η περιέλιξή του στη δομή της χρωματίνης, εκτός από τη συμπύκνωσή του, στοχεύει στην προστασία του και τον ακριβή έλεγχο της αντιγραφής και της γονιδιακής έκφρασης [1]. 5.1.2 Πηγές απομόνωσης DNA Το DNA είναι απαραίτητη πρώτη ύλη για τα περισσότερα πειράματα μοριακής βιολογίας. Η απομόνωσή του σε «καθαρή» μορφή αποτελεί προϋπόθεση για την επιτυχία όλων των περαιτέρω εφαρμογών. Η επιλογή της κατάλληλης τεχνικής απομόνωσης DΝΑ καθορίζεται από πολλές παραμέτρους, όπως το αρχικό υλικό (π.χ. κύτταρα, ιστός, αίμα), το είδος (π.χ. χρωμοσωμικό, πλασμιδιακό, μιτοχονδριακό, ιικό κ.λπ.) και την ποιότητα του DΝΑ που επιθυμούμε να απομονώσουμε. Στους ανθρώπους, η πιο συνηθισμένη πηγή DNA είναι τα λευκά αιμοσφαίρια του αίματος, από τα οποία απομονώνεται εύκολα γενετικό υλικό υψηλής ποιότητας και συγκέντρωσης. Εναλλακτικά, DNA μπορεί να απομονωθεί εύκολα από τα κύτταρα της στοματικής κοιλότητας (επίχρισμα παρειάς), με πλεονέκτημα την αποφυγή της παρεμβατικής διαδικασίας της αιμοληψίας. Με την πρόοδο της τεχνολογίας και των μεθόδων απομόνωσης, DNA μπορεί πρακτικά να απομονωθεί από οποιοδήποτε υλικό περιέχει εμπύρηνα κύτταρα, όπως κύτταρα από βιοψία τροφοβλάστης, μουσειακά εκθέματα, ρίζες τριχών, δόντια, οστά, βιοψίες ιστού σε κύβους παραφίνης κ.ά. 5.1.3 Βασικά στάδια της απομόνωσης DNA Απομόνωση DNA με χρήση απλών χημικών αντιδραστηρίων Υπάρχουν πολλές μέθοδοι για την απομόνωση DNA, οι οποίες παρουσιάζουν διαφορές μεταξύ τους ανάλογα με το αρχικό υλικό που θα χρησιμοποιηθεί και το αν η διαδικασία θα πραγματοποιηθεί με απλά χημικά αντιδραστήρια, με εμπορικά διαθέσιμα κιτ ή με χρήση αυτοματοποιημένων συστημάτων απομόνωσης γενετικού υλικού. Όλες όμως οι μέθοδοι απομόνωσης πυρηνικού DNA ακολουθούν τα παρακάτω κοινά στάδια: 104

Απομόνωση DNA 1. Λύση των κυτταρικών μεμβρανών και της μεμβράνης του πυρήνα για να ελευθερωθεί το DNA στο διάλυμα. Η λύση των κυτταρικών μεμβρανών επιτυγχάνεται με χρήση διαλυμμάτων που περιέχουν απορρυπαντικά, το πιο κοινό εκ των οποίων είναι το δωδεκυλοθειικό νάτριο (Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)). Το SDS απομακρύνει επίσης τις ιστόνες από τα μόρια του DNA. Το SDS είναι αμφιφατικό μόριο που αποτελείται από μια υδρόφοβη ουρά και μια υδρόφιλη κεφαλή. Δρα ως αποδιατακτικός παράγοντας, διαταράσσοντας τους δεσμούς μεταξύ των πρωτεϊνών. Η κυτταρική μεμβράνη αποτελείται από μια διπλοστιβάδα φωσφολιπιδίων και πρωτεΐνες. Τα φωσφολιπίδια έχουν τις πολικές κεφαλές προς την εξωτερική υδατική φάση και τις υδρόφοβες λιπαρές αλυσίδες προς το εσωτερικό της διπλοστιβάδας. Το SDS διασπά τη συνοχή των φωσφολιπιδίων και δημιουργεί σύμπλοκα με τις μεμβρανικές πρωτεΐνες καθιστώντας τες υδατοδιαλυτές (εικόνα 5.2). Το SDS δεσμεύει επίσης και τις μη μεμβρανικές υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες (εικόνα 5.2). Οι δεσμευμένες με SDS πρωτεΐνες χάνουν την τριτοταγή δομή τους και επομένως τη λειτουργικότητά τους [2]. Εικόνα 5.2 Ο τρόπος δράσης του SDS. 2. Αποικοδόμηση κυτταρικών πρωτεϊνών με επίδραση πρωτεολυτικών ενζύμων Το ένζυμο που χρησιμοποιείται συχνότερα είναι η πρωτεϊνάση Κ. Η πρωτεϊνάση Κ δρα έναντι ευρέος φάσματος ενδογενών πρωτεϊνών του κυττάρου και πήρε το ονομά της από την ιδιότητά της να διασπά την κερατίνη. Είναι μια πρωτεάση σερίνης, που αναγνωρίζει και διασπά τον πεπτιδικό δεσμό δίπλα στην καρβοξυλομάδα των αλειφατικών και αρωματικών αμινοξέων. Η 105

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ βέλτιστη θερμοκρασία δράσης της ποικίλει από 50 C έως 70 C. Μετά την προσθήκη της στο διάλυμα, η πρωτεϊνάση K απενεργοποιεί αμέσως τις ενδογενείς νουκλεάσες (DNAσες) του κυττάρου, που μπορεί να κατακερματίσουν το DNA κατά τη διαδικασία απομόνωσης. Ένα πλεονέκτημα της πρωτεϊνάσης Κ είναι ότι παραμένει δραστική ακόμη και παρουσία SDS και χηλικών παραγόντων όπως το Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). 3. Διαχωρισμός του DNA από τις πρωτεΐνες Ανάλογα με το πρωτόκολλο που χρησιμοποιείται, ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται με την προσθήκη διαλυμάτων αλάτων υψηλής ιοντικής ισχύος και απόλυτης (100%) αιθανόλης, με οργανική εκχύλιση με διάλυμα φαινόλης - χλωροφορμίου, με πρόσδεση σε μεμβράνη ιοντοανταλλαγής ή σε μαγνητικά σφαιρίδια. Στη συνέχεια θα αναφερθούμε στη μέθοδο που βασίζεται στην προσθήκη διαλυμάτων υψηλής ιοντικής ισχύος, την οποία και θα εφαρμόσουμε στο εργαστήριο. Οι υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων διασπούν τους δεσμούς του DNA με τα μόρια του νερού και το κάνουν λιγότερο υδρόφιλο άρα και υδατοδιαλυτό. Η προσθήκη της αιθανόλης παρουσία αλάτων προκαλεί δομικές αλλαγές στο μόριο του DNA, με αποτέλεσμα να κατακρημνίζεται εκτός διαλύματος και όταν η ποσότητά του είναι μεγάλη να γίνεται ορατό σαν μια λευκή κλωστή. Μετά από φυγοκέντρηση το DNA βρίσκεται ως ίζημα στον πυθμένα του σωληναρίου και το υπερκείμενο απομακρύνεται. 4. Καθαρισμός του DNA από υπολείμματα αλάτων με διάλυμα παγωμένης αιθανόλης 70% 5. Ανασύσταση του DNA σε διάλυμα TE Το διάλυμα Tris-EDTA (TE) είναι ένα ελαφρά αλκαλικό ρυθμιστικό διάλυμα (ph 8-9), που περιέχει EDTA. Το EDTA προστατεύει το DNA, δεσμεύοντας δισθενή ιόντα, όπως Mg 2+ ή Ca 2+, που είναι απαραίτητα για τη δράση ενζύμων όπως οι νουκλεάσες (που διασπούν το DNA) και οι πρωτεάσες. 5.1.4 Απομόνωση DNA με εμπορικά διαθέσιμα συστήματα αντιδραστηρίων Τα εμπορικά διαθέσιμα συστήματα αντιδραστηρίων (κιτ) έχουν απλοποιήσει κατά πολύ την απομόνωση γενετικού υλικού. Με τον χρόνο η χρήση τους γίνεται ολοένα και πιο συχνή. Η απομόνωση βασίζεται στην επιλεκτική και παροδική πρόσδεση των μορίων DNA σε μια μεμβράνη με γέλη πυριτίου που βρίσκεται στο εσωτερικό κατάλληλης στήλης. Σε συνθήκες υψηλής αλατότητας τα αρνητικά φορτισμένα μόρια DNA έχουν μεγάλη συγγένεια προς τα θετικά φορτισμένα μόρια του πυριτίου της μεμβράνης. Η δέσμευση αυτή αναστρέφεται παρουσία ελαφρά αλκαλικού διαλύματος χαμηλής ιοντικής ισχύος και το DNA εκλούεται από τη μεμβράνη (εικόνα 5.3). Υπάρχουν διαφορετικά κιτ ανάλογα με την πηγή από την οποία επιθυμούμε να απομονώσουμε DNA (όπως αίμα και άλλα βιολογικά υγρά, επίχρισμα μυελού των οστών, ιστοί, κύτταρα από καλλιέργειες, τρίχες, επίχρισμα παρειών, φυτά, βακτήρια κ.ά.) και ανάλογα με την ποσότητα του DNA που πρόκειται να απομονωθεί (mini, midi, maxi). Τα βασικά πλεονεκτήματά της χρήσης κιτ για απομόνωση DNA είναι: ευκολία χειρισμού και αναλυτικές οδηγίες εκτέλεσης της διαδικασίας, ταυτόχρονος χειρισμός πολλών δειγμάτων, 106

Απομόνωση DNA Εικόνα 5.3 Στη μεμβράνη πυριτίου μιας στήλης δεσμεύονται μόρια νερού (Α) και μόρια DNA παρουσία διαλύματος υψηλής αλατότητας (B). Εικόνα: «Qiagen Mini Spin Column» από Squidonius (talk), με άδεια Public Domain. Πηγή: Wikimedia Commons. ταχύτητα, αποφυγή χρήσης επικίνδυνων χημικών (φαινόλη - χλωροφόρμιο), υψηλή ποιότητα απομονωμένου DNA, επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων. Τα στάδια που ακολουθούνται για την απομόνωση DNA είναι: 1. Λύση των κυττάρων του δείγματος παρουσία ενός διαλύματος χαοτροπικών αλάτων και πρωτεϊνάσης Κ. Στη συνέχεια προστίθεται αιθανόλη για διαμόρφωση κατάλληλων συνθηκών για την πρόσδεση του DNA στη μεμβράνη (εικόνα 5.4 Α). 2. Τα δείγματα φορτώνονται στη στήλη και κατά τη φυγοκέντρηση τα μόρια DNA προσροφώνται στη μεμβράνη, ενώ οι αποδιαταγμένες πρωτεΐνες, τα πολυσακχαρίδια και τα υπόλοιπα κυτταρικά συστατικά τη διαπερνούν και συλλέγονται σε κατάλληλο σωληνάριο (εικόνα 5.4 Β). 3. Το DNA παραμένει προσδεδεμένο στη μεμβράνη, ενώ γίνεται περαιτέρω απομάκρυνση αλάτων και τμημάτων πρωτεϊνών με δύο διαδοχικές πλύσεις με κατάλληλα διαλύματα με αιθανόλη (εικόνα 5.4 Γ και Δ). 4. Η μεμβράνη στεγνώνεται με φυγοκέντρηση (εικόνα 5.4 Ε). 5. Το καθαρό DNA εκλούεται από τη μεμβράνη με ελαφρά αλκαλικό διάλυμα χαμηλής αλατότητας (εικόνα 5.4 Ζ). Τα διαλύματα λύσης: Το διάλυμα λύσης που περιέχεται στα περισσότερα κιτ απομόνωσης περιέχει υψηλή συγκέντρωση χαοτροπικών αλάτων, όπως υδροχλωρική γουανιδίνη (Guanidine hydrochloride), θειοκυανιούχος γουανιδίνη (Guanidine thiocyanate), ουρία, και υπερχλωρικό λίθιο. Τα άλατα αυτά καταστρέφουν τους δεσμούς υδογόνου, τις δυνάμεις Van der Waals και τις υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις. Επίσης μειώνεται η διαλυτότητα του DNA στο νερό και οι πρωτεΐνες αποσταθεροποιούνται. Τα διαλύματα λύσης περιέχουν επίσης απορρυπαντικά για τη λύση των μεμβρανών και την αποδιάταξη των πρωτεϊνών. Σχεδόν πάντα προστίθεται η πρωτεϊνάση Κ, η οποία εξακολουθεί να διατηρεί την ενεργότητά της σε τέτοια αποδιατακτικά διαλύματα. 107

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Εικόνα 5.4 Στάδια απομόνωσης γενομικού DNA με στήλες που φέρουν μεμβράνη πυριτίου. 5.1.5 Αυτοματοποιημένα συστήματα απομόνωσης DNA Τα τελευταία χρόνια αναπτύχθηκαν πλήρως αυτοματοποιημένα ρομποτικά συστήματα απομόνωσης νουκλεϊκών οξέων με βάση την τεχνολογία των μαγνητικών σφαιριδίων. Το σύστημα εκτελεί αυτόματα όλα τα απαραίτητα βήματα, από την προετοιμασία του δείγματος μέχρι την έκλουση του καθαρού γενετικού υλικού (DNA ή RNA). Τα πλεονεκτήματα ενός τέτοιου συστήματος είναι η εκμηδένιση του κινδύνου επιμόλυνσης από δείγμα σε δείγμα, ο σύντομος χρόνος απομόνωσης (τυπικά 30-45 λεπτά για 6 έως 16 δείγματα) και η ελάχιστη ενασχόληση του χειριστή. Στα μειονεκτήματα συγκαταλέγεται το γεγονός ότι προς το παρόν δεν έχουν αναπτυχθεί κιτ για απομόνωση γενετικού υλικού από πιο «δύσκολες πηγές» (όπως δόντια, τρίχες, βιοψία σε κύβο παραφίνης κ.ά.) και το αρκετά υψηλό κόστος των αντιδραστηρίων και του μηχανήματος. Υπάρχουν διαφόρων ειδών μαγνητικά σφαιρίδια, που έχουν πυρήνα σιδήρου και φέρουν στην επιφάνειά τους κατάλληλη επικάλυψη για τη δέσμευση των επιθυμητών μορίων. Τα μαγνητικά σφαιρίδια μπορούν να έχουν στην επιφάνειά τους ένα δευτερογενές αντίσωμα που δεσμεύει ένα πρωτοταγές αντίσωμα επιλογής, επικάλυψη στρεπταβιδίνης για δέσμευση βιοτυνιλιωμένων προϊόντων, ουρά πολυ-τ για απομόνωση mrna ή επικάλυψη πυριτίου στην περίπτωση της δέσμευσης νουκλεϊκών οξέων. Τα μαγνητικά σφαιρίδια που χρησιμοποιούνται για την απομόνωση DNA έχουν συνήθως επικάλυψη διοξειδίου του πυριτίου, που επιτρέπει την ισχυρή πρόσδεση μορίων DNA υπό συνθήκες χαμηλού ph και υψηλής συγκέντρωσης αλάτων. Τα βήματα της απομόνωσης με χρήση αυτόματου συστήματος διαφέρουν ανά μηχάνημα, αλλά τυπικά περιλαμβάνουν: 1. Τοποθέτηση του δείγματος σε κατάλληλο σωληνάριο στην τράπεζα εργασίας μέσα στο μηχάνημα. 2. Ανάδευση του φυσιγγίου με τα προδιανεμημένα αντιδραστήρια και τοποθέτησή του στην κατάλληλη εσοχή. Κάθε σωληνάριο του φυσιγγίου περιέχει ένα διαφορετικό αντιδραστήριο, όπως μαγνητικά σωματίδια, διάλυμα λύσης, διάλυμα πλύσης ή διάλυμα έκλουσης (εικόνα 5.5.) 3. Επιλογή του επιθυμητού προγράμματος απομόνωσης ανάλογα με τον τύπο του δείγματος. 108

Απομόνωση DNA 4. Παραλαβή των σωληναρίων με το καθαρό DNA σε σύντομο χρονικό διάστημα. Εικόνα 5.5 Κασέτα με προδιανεμημένα αντιδραστήρια. Η κασέτα περιέχει όλα τα απαραίτητα αντιδραστήρια για τη διαδικασία απομόνωσης του DNA και χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με αυτόματα συστήματα απομόνωσης νουκλεϊκών οξέων. Η διαδικασία απομόνωσης αποτελείται από λύση του δείγματος παρουσία χαοτροπικών αλάτων και απορρυπαντικού, εφαρμογή μαγνητικού πεδίου και δέσμευση των μορίων DNA σε μαγνητικά σωματίδια διοξειδίου του πυριτίου, απομάκρυνση των μη δεσμευμένων κυτταρικών στοιχείων, διαδοχικές πλύσεις για απομάκρυνση των αλάτων και άλλων αναστολέων και τέλος έκλουση του καθαρού DNA σε ελαφρά αλκαλικό διάλυμα χαμηλής αλατότητας (εικόνα 5.6). Εικόνα 5.6 Στάδια απομόνωσης γενομικού DNA με τη χρήση μαγνητικών σφαιριδίων. Αρχικά πραγματοποιείται λύση του δείγματος παρουσία κατάλληλου διαλύματος και πρωτεϊνάσης Κ, προστίθενται τα μαγνητικά σφαιρίδια και εφαρμόζεται μαγνητικό πεδίο. Τα μόρια DNA προσροφώνται σε μαγνητικά σωματίδια διοξειδίου του πυριτίου και τα μη δεσμευμένα κυτταρικά στοιχεία απομακρύνονται. Ακολουθούν διαδοχικές πλύσεις για απομάκρυνση των αλάτων και άλλων αναστολέων και, τέλος, έκλουση του καθαρού DNA σε ελαφρά αλκαλικό διάλυμα χαμηλής αλατότητας. 109

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ 5.2 Πρακτικό μέρος 5.2.1 Aπομόνωση DNA από επιθηλιακά κύτταρα παρειάς Το πρωτόκολλο απομόνωσης που περιγράφεται στη συνέχεια αποτελεί προσαρμογή πρωτοκόλλου χαμηλού κόστους για εκπαιδευτική χρήση που αναπτύχθηκε από τους R. P. Hearn και K. E. Arblaster [3]. Κατά την εκτέλεση του πρωτοκόλλου χρησιμοποιείται ισοτονικό αναψυκτικό του εμπορίου, που έχει ευχάριστη γεύση και είναι ασφαλές. Ένα πλεονέκτημα που προκύπτει από τη χρήση του αναψυκτικού είναι ότι περιέχει χρωστική που καθιστά το ίζημα ορατό και διευκολύνει τη διάκριση της υδατικής φάσης του διαλύματος κατά τα στάδια της απομόνωσης. Η χρήση του αναψυκτικού δεν φαίνεται να επηρεάζει σημαντικά την καθαρότητα του DNA και τη δυνατότητα διεξαγωγής περαιτέρω αντιδράσεων, όπως αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και πέψη με περιοριστική ενδονουκλεάση. Απαραίτητα υλικά Για την εκτέλεση της άσκησης θα χρειαστούμε: 10 ml ισοτονικού αναψυκτικού (POWERADE ION4) Πλαστικό ποτήρι 1 πλαστική ράβδο (εναλλακτικά οδοντογλυφίδα με πλατύ άκρο) 3 σωληνάρια πολυπροπυλενίου 1,5 ml (τύπου Eppendorf) 1 ακρυλικό δοκιμαστικό σωλήνα 5 ml 1 γυάλινη πιπέττα pasteur 3 πλαστικές πιπέττες pasteur Tips για μικροπιπέττες των 20 και 200 μl 1 ml διαλύματος λύσης (TE, ph 8 +1% SDS) 20 μl διαλύματος πρωτεϊνάσης Κ (Proteinase K, 20 mg/ml) 100 μl NaCl 2,5 M 1 ml 100% αιθανόλης και 500 μl 70% αιθανόλης Διάλυμα ανασύστασης TE (10 mm Tris-HCl ph 8.0, EDTA 1 mm) Επιτραπέζια φυγόκεντρο για μικροσωληνάρια Θερμαντική πλάκα στους 56 C Συσκευή ανάδευσης (Vortex) 110

Απομόνωση DNA Πειραματική διαδικασία Βήμα 1ο: Συλλογή κυττάρων 1. Γεμίζουμε το πλαστικό ποτήρι με 10 ml ισοτονικό αναψυκτικό (μέχρι την πρώτη χαραγή) (εικόνα 5.7 α). 2. Ξύνουμε το βλεννογόνο των παρειών με την πλαστική ράβδο για 1 min αποφεύγοντας την κατάποση. Εναλλακτικά ξύνουμε χρησιμοποιώντας το πεπλατυσμένο άκρο μιας οδοντογλυφίδας (εικόνα 5.7 β, γ). Προσοχή! Η ποσότητα DNA που θα παραλάβουμε στο τέλος της πειραματικής διαδικασίας εξαρτάται σε σημαντικό βαθμό από την επιμέλεια με την οποία θα υλοποιήσουμε αυτό το βήμα! 3. Βάζουμε το αναψυκτικό στη στοματική κοιλότητα και το κρατάμε κάνοντας κινήσεις ξεπλύματος για 60 δευτερόλεπτα προκειμένου να αυξηθεί η ποσότητα των κυττάρων που θα συλλέξουμε. Εικόνα 5.7 Διαδικασία συλλογής κυττάρων για απομόνωση DNA: (α) προσθήκη 10 ml ισοτονικού αναψυκτικού σε πλαστικό ποτήρι, (β) πλαστική ράβδος, (γ) ξύσιμο επιθηλίου παρειών με την βοήθεια πλαστικής ράβδου. 4. Φτύνουμε το αναψυκτικό στο ποτήρι. Σημειώνουμε τον αριθμό μητρώου μας στα σωληνάρια πολυπροπυλενίου 1,5 ml που έχουμε μπροστά μας. 5. Ανακατεύουμε το διάλυμα με μια πιπέττα pasteur (στο πρώτο ανακάτεμα είναι καλύτερα να χρησιμοποιήσουμε τη ράβδο με την οποία ξύσαμε τις παρειές, γιατί στην επιφάνειά της έχει προσκολλημένα επιπλέον κύτταρα). Λαμβάνουμε 1,5 ml διαλύματος και το τοποθετούμε στο σωληνάριο πολυπροπυλενίου. 6. Φυγοκεντρούμε στις 10.000 rpm για 30 δευτερόλεπτα (εικόνα 5.8 α, β). 7. Απορρίπτουμε απαλά το υπερκείμενο υγρό, αφήνοντας μια μικρή ποσότητα, που περιέχει το ίζημα. Προσοχή! Να μην απορρίψουμε και το ίζημα που περιέχει τα κύτταρα! 8. Επαναλαμβάνουμε τα βήματα 5-7 προσθέτοντας στο ίδιο σωληνάριο κυτταρικό διάλυμα για δεύτερη φορά, ώστε να αυξήσουμε τον αριθμό των κυττάρων που συλλέγουμε. Βήμα 2ο: Λύση των κυττάρων 1. Μετά την απόρριψη του υπερκείμενου για δεύτερη φορά, προσθέτουμε στο ίζημα 1 ml διαλύματος λύσης (TE pη8 + 1% SDS) (εικόνα 5.8 γ). 2. Κάνουμε ανασύσταση του ιζήματος με ανάδευση στο vortex για περίπου 30 δευτερόλεπτα (εικόνα 5.8 δ). 111

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Εικόνα 5.8 Προσθήκη διαλύματος λύσης: (α) φυγοκέντρηση δείγματος, (β) μετά την φυγοκέντρηση το ίζημα με τα κύτταρα συκεντρώνεται στο κάτω μέρος του σωληναρίου, (γ) προσθήκη διαλύματος λύσης, (δ) το δείγμα μετά την προσθήκη διαλύματος λύσης και την ανάδευση στο vortex. Βήμα 3ο: Πέψη πρωτεϊνών 1. Προσθέτουμε 20 μl διαλύματος πρωτεϊνάσης Κ (εικόνα 5.9 α, β). 2. Μεταφέρουμε το σωληνάριο στην πλάκα θέρμανσης και επωάζουμε στους 56 C για 10 λεπτά (εικόνα 5.9 γ). Εικόνα 5.9 Επώαση δείγματος με πρωτεϊνάση Κ: (α) αναρρόφηση διαλύματος πρωτεϊνάσης Κ, (β) προσθήκη πρωτεϊνάσης Κ στο δείγμα, (γ) τοποθέτηση του δείγματος σε θερμαντική πλάκα προθερμασμένη στους 56 C. Βήμα 4ο: Κατακρήμνιση DNA με προσθήκη διαλύματος υψηλής αλατότητας 1. Προσθέτουμε 100 μl NaCl 2,5 Μ (εικόνα 5.10 α, β). 2. Αναμιγνύουμε απαλά με αναστροφή του σωληναρίου πέντε φορές (εικόνα 5.10 γ). 3. Μεταφέρουμε το διάλυμα σε ακρυλικό δοκιμαστικό σωλήνα των 5 ml. 4. Με μια πιπέττα pasteur λαμβάνουμε περίπου ίσο όγκο (1 ml) παγωμένης απόλυτης αιθανόλης (100% αιθανόλη), την οποία προσθέτουμε στον δοκιμαστικό σωλήνα. Κρατάμε τον σωλήνα σε γωνία 45 και προσθέτουμε την αιθανόλη αργά, με την άκρη της πιπέττας να εφάπτεται στα τοιχώματά του σωληναρίου. Με τον τρόπο αυτό σχηματίζουμε μια ξεχωριστή στιβάδα πάνω από την υδατική φάση (εικόνα 5.10 δ). 112

Απομόνωση DNA 5. Αφήνουμε το σωληνάριο για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Σε αυτό το στάδιο το DNA θα αρχίσει να εμφανίζεται με τη μορφή κουβαριασμένης κλωστής στη φάση της αιθανόλης (εικόνα 5.10 ε). Εικόνα 5.10 Κατακρήμνιση πρωτεϊνών και DNA: (α) αναρρόφηση και (β) προσθήκη διαλύματος NaCl 2,5 M στο δείγμα, (γ) απαλή ανάμιξη του σωληναρίου, (δ) προσθήκη παγωμένης απόλυτης αιθανόλης, (ε) το DNA εμφανίζεται στη φάση της αιθανόλης σαν κουβαριασμένη κλωστή. Βήμα 5ο: Συλλογή και καθαρισμός του DNA 1. Ανάβουμε έναν λύχνο, με τη βοήθεια του οποίου λυγίζουμε την άκρη μιας γυάλινης ράβδου ώστε να πάρει τη μορφή γάντζου (μικρών διαστάσεων, ώστε να χωράει στον πυθμένα ενός σωληναρίου πολυπροπυλενίου). 2. Με τη βοήθεια της γυάλινης ράβδου «ψαρεύουμε» το DNA τυλίγοντάς το με ελαφρές περιστροφικές κινήσεις (εικόνα 5.11 α). 3. Βυθίζουμε την άκρη της ράβδου σε σωληνάριο πολυπροπυλενίου 1,5 ml που περιέχει 500 μl 70% αιθανόλης για να απομακρυνθούν τα υπολείμματα αλάτων (εικόνα 5.11 β). Εικόνα 5.11 Παραλαβή και καθαρισμός DNA: (α) ανάκτηση του DNA από την αλκοολική φάση με την βοήθεια γυάλινης ράβδου, (β) καθαρισμός DNA σε διάλυμμα 70% αιθανόλης. 4. Αφήνουμε τη γυάλινη ράβδο στον αέρα για 5 λεπτά για να εξατμιστεί η αιθανόλη. Είναι σημαντικό το DNA να στεγνώσει τελείως, γιατί ακόμη και ελάχιστη ποσότητα αιθανόλης μπορεί να αναστείλει τις ενζυμικές αντιδράσεις που θα ακολουθήσουν, όπως την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. 113

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Βήμα 6ο: Αποθήκευση του DNA 1. Τοποθετούμε την άκρη της ράβδου σε νέο σωληνάριο πολυπροπυλενίου και προσθέτουμε 50-100 μl διαλύματος TE. 2. Ανακατεύουμε ώστε να διαλυθεί το DNA στο TE. 3. Φυλάμε το απομονωμένο DNA στους -20 C. 5.3 Ερωτήσεις - εργασίες 1. Τι είναι η πρωτεϊνάση Κ; Ποιος είναι ο ρόλος της στην απομόνωση του DNA; Απάντηση: Η πρωτεϊνάση Κ είναι ένα πρωτεολυτικό ένζυμο που αναγνωρίζει και διασπά τον πεπτιδικό δεσμό δίπλα στην καρβοξυλομάδα των αλειφατικών και αρωματικών αμινοξέων. Με τον τρόπο αυτό αποικοδομούνται οι κυτταρικές πρωτεΐνες, μεταξύ των οποίων και οι ιστόνες, και διευκολύνεται η απομόνωση καθαρού DNA. H πρωτεϊνάση Κ είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για την απομόνωση DNA στο εργαστήριο γιατί μετά την προσθήκη της στο διάλυμα απενεργοποιεί αμέσως τις ενδογενείς νουκλεάσες (DNAσες) του κυττάρου που μπορεί να κατακερματίσουν το DNA. Επίσης διατηρεί τη δραστικότητά της ακόμη και παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων, όπως το SDS, καθώς και χηλικών παραγόντων, όπως το EDTA. Το SDS και το EDTA υπάρχουν στα περισσότερα διαλύματα λύσης των κυττάρων. 2. Το απομονωμένο DNA μπορεί να αποθηκευτεί και σε διάλυμα αποσταγμένου νερού. Γιατί όμως είναι προτιμότερη η φύλαξή του σε διάλυμα που περιέχει EDTA; Απάντηση: Το EDTA είναι ένας χηλικός παράγοντας που δεσμεύει δισθενή ιόντα, όπως Mg 2+ και Ca 2+. Προσθήκη EDTA στο διάλυμα έκλουσης προστατεύει το DNA γιατί δεσμεύει τα δισθενή ιόντα, που είναι απαραίτητα για τη δράση των νουκλεασών που διασπούν το DNA. 3. Απομόνωση DNA από κύτταρα του βλεννογόνου του στόματος μπορεί να πραγματοποιηθεί και με υλικά που υπάρχουν σε μια οικιακή κουζίνα. Ένα τέτοιο πρωτόκολλο περιλαμβάνει τη χρήση απορρυπαντικού πιάτων, χυμού από ανανά, μαγειρικού αλατιού και παγωμένης αλκοόλης. Μπορείτε να αντιστοιχίσετε καθένα από τα παραπάνω υλικά με τα αντίστοιχα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήσατε στην εργαστηριακή άσκηση και να εξηγήσετε τη δράση τους; Απάντηση: Το απορρυπαντικό πιάτων χρησιμεύει για τη λύση των κυτταρικών μεμβρανών και των μεμβρανών του πυρήνα για την απελευθέρωση του DNA στο διάλυμα. Στο εργαστήριο χρησιμοποιήσαμε διάλυμα λύσης που περιέχει SDS. Ο χυμός του ανανά περιέχει το ένζυμο βρωμελαΐνη, μια πρωτεάση που φυσιολογικά αποικοδομεί τις πρωτεΐνες στα επιμέρους αμινοξέα. Στην εργαστηριακή άσκηση χρησιμοποιήθηκε η πρωτεϊνάση Κ για την αποικοδόμηση των πρωτεϊνών και την αδρανοποίηση των νουκλεασών. Το μαγειρικό αλάτι προστίθεται στο διάλυμα λύσης για να οδηγήσει στη συσσωμάτωση των μορίων του DNA και παρουσία αλκοόλης στην κατακρήμνισή του εκτός διαλύματος. Το μόριο DNA είναι τώρα ορατό σαν λευκή κλωστή. Αντίστοιχα, στο εργαστήριο χρησιμοποιήσαμε NaCl και παγωμένη απόλυτη αιθανόλη (100% EtOH). 114

Απομόνωση DNA 5.4 Βιβλιογραφία [1] K. Luger, Nucleosomes: structure and function, in els, Chichester: John Wiley & Sons Ltd, 2001. doi: 10.1038/npg.els.0001155. [2] A. K. Bhuyan, On the mechanism of sds-induced protein denaturation, Biopolymers, vol. 93, no. 2, pp. 186 199, 2010. doi: 10.1002/bip.21318. [3] R. P. Hearn and K. E. Arblaster, DNA extraction techniques for use in education, Biochem Mol Biol Educ, vol. 38, no. 3, pp. 161 166, May 2010. doi: 10.1002/bmb.20351. Χρήσιμες ηλεκτρονικές διευθύνσεις Απομόνωση DNA με υλικά κουζίνας http://www.funsci.com/fun3_en/dna/dnaen.htm BitesizeBio: Πύλη στην οποία αναρτώνται χρήσιμες πρακτικές συμβουλές από επιστήμονες με μακρόχρονη εργαστηριακή εμπειρία. http://bitesizebio.com/ Σχετικά με τον τρόπο λειτουργίας των εμπορικών κιτ απομόνωσης γενετικού υλικού http: //bitesizebio.com/13516/how-dna-extraction-rna-miniprep-kits-work/ Επεξήγηση της μεθόδου κατακρήμνισης DNA με προσθήκη αιθανόλης http://bitesizebio.com/253/the-basics-how-ethanol-precipitation-ofdna-and-rna-works/ Οδηγίες για απομόνωση DNA από αίμα με χρήση κιτ http://www.mn-net.com/portals/8/attachments/redakteure_bio/protocols/ Genomic%20DNA/UM_gDNABlood.pdf Βίντεο για τον τρόπο δράσης των μαγνητικών σφαιριδίων https://www.youtube.com/watch?v=q886j2cx1ga Βίντεο με πληροφορίες για τη δομή του DNA https://www.youtube.com/watch?v=q6pp-c4udka&index=1&list= PLE_-e70KAjl7D8-0dvZpK31fvizIjx5zm 115