Άσκηση 10: Απομόνωση DNA

Άσκηση 10: Απομόνωση DNA Σύνοψη Σκοπός της άσκησης είναι η κατανόηση των ιδιοτήτων των νουκλεϊκών οξέων και η απομόνωση δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος (DNA) από φυτικά κύτταρα. Ο φοιτητής θα εκπαιδευτεί σε έναν απλό τρόπο εκχύλισης DNA από φράουλες (οι οποίες χάρη στο οκταπλοειδές γονιδίωμα που διαθέτουν επιτρέπουν την εξαγωγή μεγάλης ποσότητας γενετικού υλικού) με τη χρήση υλικών καθημερινής χρήσης. Στο εισαγωγικό μέρος της άσκησης περιγράφεται σύντομα η δομή του DNA και ο τρόπος συσπείρωσής του σε χρωματίνη, και αναλύεται η μεθοδολογία εκτίμησης των συγκεντρώσεων και της καθαρότητας των νουκλεϊκών οξέων σε ένα διάλυμα, και συγκεκριμένα η ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος φασματοφωτομετρικής ανάλυσης (μέτρηση της απορρόφησης στο υπεριώδες φως). Στο πρακτικό μέρος γίνεται λεπτομερής περιγραφή των επιμέρους σταδίων της διαδικασίας εκχύλισης με τη βοήθεια video και animated σχημάτων (λύση κυττάρων-διαλυτοποίηση μεμβρανών, κατακρήμνιση DNA κ.λπ.), καθώς και της διαδικασίας ποσοτικοποίησης του DNA. Προαπαιτούμενη γνώση Από το βιβλίο των Campbell, N. A., & Reece, J. B. (2010), Βιολογία (τόμος Ι), Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, ISBN: 978-960-524-306-7, ο φοιτητής θα πρέπει να ανατρέξει στο Κεφάλαιο 5: Δομή και λειτουργίες των μεγάλων βιομορίων, και στο Κεφάλαιο 16: Η μοριακή βάση της κληρονομικότητας. Από το βιβλίο των Cooper, G. M., & Hausman, R. E. (2011), Το Κύτταρο μία μοριακή προσέγγιση (τόμος Ι), Ακαδημαϊκές εκδόσεις Μπάσδρα και ΣΙΑ Ο.Ε., Αλεξανδρούπολη, ISBN: 978-960-99895-0-3, ο φοιτητής θα πρέπει να ανατρέξει στο Κεφάλαιο 4.1: Κληρονομικότητα, γονίδια και DNΑ, και στο Κεφάλαιο 5.2: Χρωμοσώματα και χρωματίνη. 1. Εισαγωγικό μέρος 1.1. Γενικά Το δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA) αποτελεί το γενετικό υλικό όλων των οργανισμών, με εξαίρεση ορισμένους ιούς που έχουν ως γενετικό υλικό ριβονουκλεϊνικό οξύ (RNA-ιοί). Στο DNA βρίσκονται κωδικοποιημένες όλες οι πληροφορίες που είναι απαραίτητες για τις λειτουργίες του οργανισμού, σε μονάδες πληροφορίας που ονομάζονται γονίδια. Το DNA είναι ο φορέας των γενετικών πληροφοριών του κυττάρου όχι μόνον με την έννοια της μεταβίβασης χαρακτηριστικών, αναλλοίωτων από γενεά σε γενεά, αλλά και της ρύθμισης της φυσιογνωμίας εξειδίκευσης κάθε κυττάρου για την επιτέλεση των ιδιαίτερων λειτουργιών του. Η αποκωδικοποίηση του DNA, η αποσαφήνιση δηλαδή του τρόπου με τον οποίο η δομή του DNA καθορίζει συγκεκριμένες γενετικές επιλογές, επίτρεψε στους επιστήμονες να κατανοήσουν καλύτερα τη γενετική της ζωής και την κληρονόμηση πολλών χαρακτηριστικών και νόσων. Τα τελευταία χρόνια, με τη βοήθεια της βιοτεχνολογίας γίνεται εντατική χρήση του DNA, η οποία οδήγησε σε εντυπωσιακά επιτεύγματα ιδιαίτερα στους τομείς της Ιατρικής και της Γεωπονίας για την αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση του ανθρώπινου πόνου και της πείνας, αντίστοιχα. Οι επιστήμονες χρησιμοποιούν σήμερα το DNA για τη γενετική τροποποίηση οργανισμών με στόχο την παραγωγή νέων φαρμάκων και άλλων προϊόντων (π.χ. παραγωγή ορμονών και διαφόρων ενζύμων), για τη δημιουργία και την αποτελεσματικότερη ανάπτυξη φυτών και ζώων (π.χ. φυτών ανθεκτικών σε αντίξοες περιβαλλοντικές συνθήκες ή/και ανθεκτικών σε ασθένειες και στα έντομα), καθώς και για την προσφορά υπηρεσιών (π.χ. γενετικά τεστ πατρότητας). 1.2. Δομή του DNA Η ανακάλυψη της δομής του DNA πραγματοποιήθηκε το 1953 από τους Τζέιμς Γουάτσον (James D. Watson) και Φράνσις Κρικ (Francis Crick), δύο ερευνητές στο Πανεπιστήμιο του Κέμπριτζ οι οποίοι χρησιμοποιώντας τα έως τότε πειραματικά δεδομένα για το μόριο του DNA πρότειναν ένα "μοντέλο" της δομής του στο χώρο, γνωστό ως "μοντέλο της διπλής έλικας" (Εικ. 10.1). - 129 -

Εικόνα 10.1 Οι Τζέιμς Γουάτσον (αριστερά) και Φράνσις Κρικ (δεξιά) διατύπωσαν το μοντέλο της διπλής έλικας του DNA που αναφέρεται στη δομή του DNA στον χώρο. Σύμφωνα με το μοντέλο αυτό, το μόριο του DNA παρουσιάζεται με τα ακόλουθα τρία βασικά χαρακτηριστικά (Εικ. 10.2): 1. Αποτελείται από δύο πολυνουκλεοτιδικές αλυσίδες σε μορφή δύο αντιπαράλληλα προσανατολισμένων κλώνων που σχηματίζουν διπλή έλικα. 2. Οι αζωτούχες βάσεις κάθε κλώνου είναι κάθετες ως προς τον άξονα του μορίου και προεξέχουν προς το εσωτερικό της συστροφής. 3. Οι δύο αλυσίδες συγκρατούνται μεταξύ τους με ασθενείς δεσμούς υδρογόνου που αναπτύσσονται μεταξύ των αζωτούχων βάσεων και είναι συμπληρωματικές μεταξύ τους, δηλαδή απέναντι από κάθε αδενίνη (Α) βρίσκεται θυμίνη (Τ) και αντίστροφα, ενώ απέναντι από κάθε γουανίνη (G) βρίσκεται κυτοσίνη (C) και αντίστροφα. Από πολλούς, η ανακάλυψη της διπλής έλικας του DNA θεωρείται ως η μεγαλύτερη βιολογική ανακάλυψη του 20ου αιώνα. Για τη συνεισφορά τους στη μελέτη της δομής του DNA, οι Γουάτσον και Κρικ μοιράστηκαν το 1962 το Βραβείο Νόμπελ στη Φυσιολογία-Ιατρική με τον Μόρις Γουίλκινς (Maurice Wilkins), ο οποίος εργάστηκε προς την ίδια κατεύθυνση. Εικόνα 10.2 Ο τρόπος ζευγαρώματος των πολυνουκλεοτιδικών αλυσίδων στο μόριο του DNA. - 130 -

1.3. Χρωματίνη Το συνολικό DNA που υπάρχει στον πυρήνα κάθε ευκαρυωτικού κυττάρου δεν είναι ένα ενιαίο μόριο, αλλά αποτελείται από πολλά γραμμικά μόρια (κάθε γραμμικό μόριο DNA είναι και ένα χρωμόσωμα), ο αριθμός και το μήκος των οποίων είναι χαρακτηριστικά για τα διάφορα είδη των οργανισμών. Τα μόρια του DNA δεν βρίσκονται στον πυρήνα υπό μορφή απλών δίκλωνων μορίων DNA, αλλά το DNA συνδυάζεται επακριβώς με μεγάλη ποσότητα πρωτεϊνών σχηματίζοντας ινίδια χρωματίνης, που χωρούν μέσα στον πυρήνα χάρη σε ένα περίπλοκο και πολυεπίπεδο σύστημα συμπύκνωσης (Εικ. 10.3). Ορισμένες πρωτεΐνες που ονομάζονται ιστόνες (πλούσιες σε βασικά αμινοξέα) ευθύνονται για το πρώτο επίπεδο συσκευασίας του DNA στη χρωματίνη, ενώ και πλήθος άλλων μη-ιστονικών πρωτεϊνών συμμετέχουν στην αναδίπλωση της χρωματίνης. Το συνολικό DNA σε κάθε κύτταρο του ανθρώπου έχει μήκος 2 μέτρα, περίπου, και συσπειρώνεται σε τέτοιο βαθμό ώστε να χωράει στον πυρήνα, ο οποίος έχει διάμετρο δέκα εκατομμυριοστά του μέτρου! Εικόνα 10.3 Το «πακετάρισμα» του DNA σε χρωματίνη και χρωμόσωμα. 1.4. Γονιδίωμα Το γενετικό υλικό του κυττάρου αποτελεί το γονιδίωμά του. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα το γενετικό υλικό κατανέμεται στον πυρήνα, στα μιτοχόνδρια και στους χλωροπλάστες (σε φυτικά κύτταρα), συνήθως όμως ο όρος γονιδίωμα αναφέρεται στο γενετικό υλικό που βρίσκεται στον πυρήνα. Τα κύτταρα στα οποία το γονιδίωμα υπάρχει σε ένα μόνο αντίγραφο (μία σειρά χρωμοσωμάτων), όπως είναι τα προκαρυωτικά κύτταρα και οι γαμέτες των διπλοειδών οργανισμών, ονομάζονται απλοειδή. Τα κύτταρα στα οποία το γονιδίωμα υπάρχει σε δύο αντίγραφα (φέρουν δηλαδή δύο σειρές χρωμοσωμάτων), όπως είναι τα σωματικά κύτταρα των ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών, ονομάζονται διπλοειδή. Στην άσκηση αυτή θα απομονώσετε DNA από φράουλες που φέρουν έως και οκτώ σειρές χρωμοσωμάτων! Αν και η άγρια φράουλα (Fragaria vesca) είναι ένας διπλοειδής οργανισμός, όπως ακριβώς και ο άνθρωπος, η πιο συχνά καλλιεργούμενη σήμερα ποικιλία φράουλας (Fragaria ananassa) είναι ένα φυτό με οκτώ αντίγραφα του γονιδιώματος (οκταπλοειδές γονιδίωμα), χαρακτηριστικό που την καθιστά έναν - 131 -

εξαιρετικό υποψήφιο σε πρωτόκολλα απομόνωσης DNA για εκπαιδευτικούς σκοπούς αφού επιτρέπει την εξαγωγή μεγαλύτερης, συγκριτικά με άλλα υλικά, ποσότητας γενετικού υλικού. Εικόνα 10.4 Η Fragaria ananassa είναι μία φράουλα με οκτώ αντίγραφα του γονιδιώματος. Η εκχύλιση του DNA από διάφορα κύτταρα και ιστούς πραγματοποιείται σήμερα γρήγορα και εύκολα με τη βοήθεια κατάλληλων έτοιμων πακέτων υλικών, η δε διαδικασία γίνεται συχνά αυτοματοποιημένα. Για εκπαιδευτικούς λόγους, στην παρούσα άσκηση θα χρησιμοποιήσετε απλά υλικά καθημερινής χρήσης. Αρχικά, με τη βοήθεια ενός απορρυπαντικού θα σπάσετε τα κύτταρα (λύση των κυττάρων) διαλυτοποιώντας τις μεμβράνες ώστε να απελευθερωθεί το DNA. Στη συνέχεια, θα κατακρημνίσετε το DNA από το διάλυμα με την προσθήκη καθαρού οινοπνεύματος. Τέλος, θα προσδιορίσετε τη συγκέντρωση του DNA που απομονώσατε και θα εκτιμήσετε τον βαθμό καθαρότητάς του. 1.5. Ποσοτικός προσδιορισμός του DNA Στις σύγχρονες τεχνικές μοριακής βιολογίας χρησιμοποιούνται κατά κανόνα μικροποσότητες DNA (της τάξεως των μικρο- ή νανογραμμαρίων), υψηλού βαθμού καθαρότητας (απαλλαγμένο δηλαδή από πρωτεΐνες ή/και άλλες προσμίξεις), και για τον λόγο αυτό απαιτείται ακριβής προσδιορισμός της συγκέντρωσης του DNA σε ένα διάλυμα και εκτίμηση της καθαρότητάς του. Υπάρχουν διάφορες μέθοδοι για την ποσοτικοποίηση των νουκλεϊκών οξέων (DNA, RNA) σε ένα διάλυμα, μία εκ των οποίων είναι και η ευρέως χρησιμοποιούμενη φασματοφωτομετρική ανάλυση. Φασματοφωτομετρική ανάλυση: Τα νουκλεϊκά οξέα έχουν την ιδιότητα να απορροφούν υπεριώδες φως (UV). Η ποσότητα του DNA (ή του RNA) που περιέχεται σε ένα υδατικό διάλυμα μπορεί επομένως να υπολογιστεί με μέτρηση της οπτικής απορρόφησης (Optical Density, OD) σε μήκος κύματος 260 nm (OD 260 ), καθώς τα νουκλεϊκά οξέα έχουν μέγιστο της απορρόφησης τους σ αυτήν την περιοχή της υπεριώδους ακτινοβολίας (Εικ. 10.5). Όσο περισσότερο είναι το φως που απορροφάται από το δείγμα, τόσο υψηλότερη είναι η συγκέντρωση νουκλεϊκού οξέος στο δείγμα. Εικόνα 10.5 Οπτική απορρόφηση (OD) του μονόκλωνου και του δίκλωνου DNA. - 132 -

Γενικά, μία μονάδα απορρόφησης στα 260 nm (OD 260 = 1) αντιστοιχεί σε: 50 μg/ml δίκλωνου DNA, 40 μg/ml μονόκλωνου DNA ή RNA, και σε ~20 μg/ml ολιγονουκλεοτιδίων. Η μέτρηση της OD 260 δεν μπορεί να διακρίνει μεταξύ του DNA και του RNA, ωστόσο, o λόγος της απορρόφησης στα 260 nm προς την απορρόφηση στα 280 nm (OD 260 /OD 280 ) μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης της καθαρότητας του διαλύματος των νουκλεϊκών οξέων που απομονώθηκε. Καθαρά παρασκευάσματα DNA ή RNA έχουν λόγο OD 260 /OD 280 ~1,8 και ~2,0, αντίστοιχα. Τιμές λόγου μικρότερες απ αυτές είναι ενδεικτικές ότι το DNA ή το RNA έχει προσμίξεις από άλλες ουσίες. Οι πρωτεΐνες, για παράδειγμα, απορροφούν και αυτές το υπεριώδες φως με μέγιστο απορρόφησης στα 280 nm και έτσι ένας μειωμένος λόγος OD 260 /OD 280 είναι ένδειξη προσμίξεων από πρωτεΐνες (ή/και φαινολικές ενώσεις). Υψηλές τιμές απορρόφησης στα 230 nm υποδεικνύουν ότι το δείγμα μας έχει προσμίξεις από φαινολικές ενώσεις ή ουρία, ενώ απορρόφηση στα 325 nm υποδηλώνει συνήθως άλλες προσμίξεις ή ότι τα σωληνάκια φωτομέτρησης (κυβέτες) που χρησιμοποιήσαμε δεν ήταν καθαρά. Μήκος κύματος (nm) Οπτική απορρόφηση (OD) OD260/OD280 325 0.30 280 0.28 260 0.56 2.0 28 230 0.01 Συγκέντρωση (μg/ml) Πίνακας 10.1 Τυπικές τιμές οπτικής απορρόφησης ενός πολύ καθαρού διαλύματος DNA. Το DNA (25 μg/ml) έχει διαλυτοποιηθεί σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΕ (Tris/EDTA, ph 7.4). 2. Πρακτικό μέρος 2.1. Κατάλογος εφοδίων 2.1.1. Συσκευές φασματοφωτόμετρο. 2.1.2. Υλικά φράουλες (φρέσκες ή κατεψυγμένες). Εναλλακτικά μπορούν να χρησιμοποιηθούν μπανάνα, ακτινίδιο, κρεμμύδι, πεπόνι κ.ά., πλαστικά σακουλάκια τροφίμων polybag, διαφανή πλαστικά ποτήρια μιας χρήσης (ή γυάλινα ποτήρια ζέσεως), καθαρό νερό (απιονισμένο ή και απλό βρύσης), υγρό απορρυπαντικό πιάτων, μαγειρικό αλάτι, φίλτρα καφετιέρας, κουταλάκια του γλυκού, δοκιμαστικοί σωλήνες, πλαστικοί αναδευτήρες καφέ/ποτών μιας χρήσης (ή γυάλινες εργαστηριακές ράβδοι ή ξύλινα καλαμάκια ή πιπέτες Pasteur), πλαστικά σωληνάρια Eppendorf χωρητικότητας 1,5-2,0 ml για τη φύλαξη του DNA. - 133 -

2.1.3. Διαλύματα διάλυμα εκχύλισης του DNA (παρασκευάζεται από τον φοιτητή), παγωμένη καθαρή αιθανόλη (οινόπνευμα 95%), υδατικό διάλυμα αιθανόλης 70%. 2.2. Πειραματική διαδικασία 2.2.1. Εκχύλιση του DNA Βίντεο 10.1 Πειραματική διαδικασία απομόνωσης DNA από φράουλα. 1. Τοποθετήστε μία φράουλα, από την οποία έχετε αφαιρέσει όλα τα πράσινα φύλα, μέσα σε ένα καθαρό πλαστικό σακουλάκι τροφίμων. Σφραγίστε το σακουλάκι και με τα χέρια σας πολτοποιήστε τη φράουλα ώστε να πάρετε έναν όσο το δυνατόν πιο ομοιογενή πολτό. Αν θέλετε μπορείτε να χρησιμοποιήσετε για την πολτοποίηση έναν πλαστικό σωλήνα ως πλάστη. Κατά το στάδιο αυτό επιτυγχάνετε το μηχανικό σπάσιμο των κυττάρων ώστε να απελευθερωθεί στη συνέχεια το DNA. 2. Σε ένα ποτήρι παρασκευάστε το διάλυμα εκχύλισης του DNA: Ρίξτε ½ φλιτζάνι νερό (~100 ml), 2 κουταλάκια του γλυκού υγρό απορρυπαντικό πιάτων και 1 κουταλάκι του γλυκού μαγειρικό αλάτι. Ανακατέψτε ελαφρά για να διαλυθούν τα υλικά φροντίζοντας να αποφύγετε τον σχηματισμό πολλών φυσαλίδων. 3. Αδειάστε το διάλυμα εκχύλισης στο σακουλάκι με την πολτοποιημένη φράουλα, σφραγίστε προσεκτικά το σακουλάκι και ομογενοποιήστε καλά το περιεχόμενο μαλάζοντας με τα χέρια σας για 1-2 min (φροντίστε και πάλι να περιορίσετε τον σχηματισμό φυσαλίδων). Στο στάδιο αυτό επιτυγχάνετε με χημικό τρόπο τη λύση των μεμβρανών του κυττάρου και τη διαλυτοποίηση του DNA. Προαιρετικά στάδια: Για μεγαλύτερη απόδοση και καλύτερα αποτελέσματα τοποθετήστε το σακουλάκι με το ομογενοποίημα σε υδατόλουτρο που έχει ρυθμιστεί στους 55-60 C για 15 λεπτά. Στη θερμοκρασία αυτή επιταχύνεται η λύση των κυττάρων/μεμβρανών και η διαλυτοποίηση του DNA. Η θερμοκρασία είναι κρίσιμη στο στάδιο αυτό καθώς το DNA αποδιατάσεται σε θερμοκρασίες άνω των 80 C. Προσθέστε στο σακουλάκι φρέσκο χυμό ανανά (όχι κονσέρβας) ή υγρό καθαρισμού φακών επαφής. Τα υγρά αυτά περιέχουν ένζυμα που πέπτουν τις πρωτεΐνες και επομένως βοηθούν στην απομόνωση πιο καθαρού DNA. 4. Τοποθετήστε σε ένα διαφανές ποτήρι ένα φίλτρο του καφέ και φιλτράρετε το ομογενοποίημα συλλέγοντας το διαυγές διάλυμα. Για να υποβοηθήσετε τη διήθηση και να συλλέξετε επαρκές διήθημα συμπιέστε ελαφρά το φίλτρο του καφέ, προσέχοντας ώστε να μην σκιστεί. Αν αυτό συμβεί, επαναλάβετε τη διαδικασία χρησιμοποιώντας ένα καινούργιο φίλτρο. 5. Μεταφέρετε μία ποσότητα από το διήθημα (~5 ml) σε έναν γυάλινο δοκιμαστικό σωλήνα και στη συνέχεια προσθέστε ίση ποσότητα παγωμένης αιθανόλης, αργά και προσεκτικά από τα τοιχώματα του σωλήνα, έτσι ώστε να σχηματίσει ένα στρώμα πάνω από το διάλυμα με το εκχύλισμα της φράουλας. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η αιθανόλη πρέπει να είναι παγωμένη γι' αυτό την τοποθετούμε στην κατάψυξη σε ένα ασφαλές δοχείο αρκετές ώρες πριν από τη διεξαγωγή του πειράματος. 6. Αφήστε τον δοκιμαστικό σωλήνα να ηρεμήσει για μερικά λεπτά, προσέχοντας να μην αναμιχθούν οι δύο φάσεις (υδατική/αλκοολική). Παρατηρήστε πως το DNA αρχίζει να «σχοινιάζει» και συγκεντρώνεται στη φάση της αλκοόλης. - 134 -

7. Με τη βοήθεια ενός πλαστικού αναδευτήρα μιας χρήσης «ψαρέψτε» το DNA στριφογυρίζοντας ήπια τον αναδευτήρα μέσα στην αιθανόλη (Εικ.10.6). 8. Ξεπλύνετε το DNA που συλλέξατε εμβαπτίζοντας τον αναδευτήρα αρκετές φορές σε διάλυμα 70% αιθανόλης. 9. Αφήστε το DNA να στεγνώσει σε θερμοκρασία δωματίου για αρκετά λεπτά (>10 min) και ακολούθως διαλύστε το σε μικρή ποσότητα αποσταγμένου νερού (0,5-1,0 ml) μέσα σε ένα σωληνάριο Eppendorf. Φυλάξετε το DNA στους 4 ο C. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για μεγαλύτερη σταθερότητα, το DNA μπορεί να φυλαχθεί σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα (π.χ. Tris/EDTA, ph 7.4) αντί για νερό. Το DNA χρειάζεται κατά κανόνα αρκετή ώρα για να διαλυθεί (συνήθως γίνεται ολονύκτια επώαση σε θερμοκρασία δωματίου) και αν η ποσότητα που απομονώσατε είναι πολύ μεγάλη μπορεί να χρειαστεί να αυξήσετε τον όγκο του νερού ή του ρυθμιστικού διαλύματος στο οποίο θα το διαλύσετε. Μπορείτε πάλι να φυλάξετε το DNA που απομονώσατε σε ξηρή μορφή. Το DNA, σε αντίθεση με το RNA, είναι αρκετά σταθερό και μπορεί να διατηρηθεί αναλλοίωτο για αιώνες! Εικόνα 10.6 Διαδραστική απεικόνιση «ψαρέματος» του DNA. 2.2.2. Ποσοτικοποίηση του DNA 10. Με τη βοήθεια μιας αυτόματης μικροπιπέτας που θα σας δοθεί τοποθετήστε 1 ml απιονισμένου νερού σε μία καθαρή κυβέτα από χαλαζία. Εισάγετε την κυβέτα στο φασματοφωτόμετρο (θα χρησιμοποιήσετε φασματοφωτόμετρο μιας δέσμης) και αφού διαβάστε την οπτική απορρόφηση στα 325 nm μηδενίστε το όργανο. 11. Απομακρύνετε την κυβέτα ( τυφλό δείγμα) από το φωτόμετρο, αδειάστε το περιεχόμενό της και τοποθετήστε το διάλυμα του DNA που απομονώσατε. Διαβάστε την οπτική απορρόφηση (OD) του διαλύματος ΠΡΟΣΟΧΗ: Αν το διάλυμα του DNA είναι πολύ πυκνό θα χρειαστεί να ετοιμάσετε ένα αραιωμένο δείγμα προτού φωτομετρήσετε. Βεβαιωθείτε ότι έχετε καταγράψει την αραίωση που κάνατε ώστε να υπολογίσετε στη συνέχεια τη συγκέντρωση του DNA στο αρχικό σας διάλυμα. Βεβαιωθείτε επίσης ότι θα κάνετε την αραίωση στο ίδιο μέσο (νερό ή ρυθμιστικό διάλυμα) που χρησιμοποιήσατε ως τυφλό. 12. Επαναλάβετε τη διαδικασία μετρώντας την OD του δείγματος στα 280, 260 και 230 nm. 13. Υπολογίστε τη συγκέντρωση του DNA λαμβάνοντας υπόψη ότι OD 260 = 1 αντιστοιχεί σε 50 μg/ml δίκλωνου DNA. 14. Χρησιμοποιήστε τον λόγο OD 260 /OD 280 για να εκτιμήσετε την καθαρότητα του DNA που απομονώσατε από τη φράουλα. - 135 -

Μήκος κύματος (nm) Οπτική απορρόφηση (OD) OD260/OD280 Συγκέντρωση (μg/ml) 325 280 260 230 2.3. Ερωτήσεις Παρατηρήσεις 1. Σε τι νομίζετε ότι συνεισφέρει το υγρό απορρυπαντικό στη διαδικασία απελευθέρωσης των νουκλεϊκών οξέων και γιατί χρησιμοποιούμε αλάτι (NaCl) στο διάλυμα εκχύλισης; 2. Γιατί το DNA είναι ορατό μετά την προσθήκη της αιθανόλης; Συνιστώμενη βιβλιογραφία 1. Campbell, N. A., & Reece, J. B. (2010). Βιολογία. Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο Κρήτης. ISBN: 978-960-524-305-0, 2. Cooper, G. M., & Hausman, R. E. (2011). Το Κύτταρο μία μοριακή προσέγγιση (τόμος Ι). Ακαδημαϊκές εκδόσεις Μπάσδρα και ΣΙΑ Ο.Ε., Αλεξανδρούπολη. ISBN: 978-960-99895-0-3. 3. Short protocols in molecular biology, 3 rd edition (1995). Edited by Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., & Struhl K. John Wiley & Sons, New York. ISBN 0-471- 13781-2. - 136 -