Ζεύγη βάσεων Αδενίνη Θυμίνη Γουανίνη Κυτοσίνη ΓΕΝΕΤΙΚΗ Φωσφοδιεστερικός δεσμός 11. ΜΟΡΙΑΚΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ 1
ΜΟΡΙΑΚΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ άμεση πρόσβαση στο γενετικό υλικό εφαρμογές στην υγεία, βελτίωση φυτών και ζώων, προστασία περιβάλλοντος 2
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ Ητεχνική της ηλεκτροφόρησης (πρωτεϊνών νουκλεϊκών οξέων): θέσεις για τα δείγματα ζώνες πηχτή κατάλληλο διάλυμα ηλεκτρόδιο - + κατεύθυνση μετακίνησης συσκευή τροφοδοσίας ενέργειας 3
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ 1. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών: 4
ΕΚΦΡΑΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ πληροφοριακή αλυσίδα DNA: μεταγραφή mrna: μετάφραση (ριβοσώματα) πρωτεϊνη: Val leu Ser His Cys Gln leu Ala 5
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ 1. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών: Βασίζεται στο διαφορετικό μοριακό βάρος και φορτίο κάθε γονίδιο διαφορετική πρωτεϊνη με διαφορετικά αμινοξέα διαφορετικό μέγεθος και φορτίο διαφορετική ηλεκτροφορετική κινητικότητα θέσεις για τα δείγματα ζώνες πηχτή κατάλληλο διάλυμα - + κατεύθυνση μετακίνησης ηλεκτρόδιο 6
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ 1. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών: πχ δρεπανοκυτταρική αναιμία: Η Α, Η S Γενότυπος Η Α Η Α - Η S Η S Η A Η S - + 7
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ 1. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών: Γενετικές διαφορές μεταξύ γενοτύπων (πχ ποικιλιών) (ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών μιας γονιδιακής θέσης) - δείγμα 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 + ΑΑ ΑΑ ΑΑ ΑΑ ΑΑ ΑΑ ΑΑ ΑΑ ΑΑ ΑΑ - δείγμα 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 + ΑΑ Αα αα ΑΑ Αα ΑΑ αα ΑΑ Αα αα 8
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ 2. Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων (ν.ο.):: διαχωρισμός ν.ο. από τον κυτταρικό χυμό (παρουσία οργανικού διαλύτη) διαχωρισμός DNA - RNA (χημικά, ένζυμα, υπερφυγοκέντρηση, αλκαλικό ph) τεμαχισμός ν.ο. με περιοριστικά ένζυμα: 9
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ 2. Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων (ν.ο.):: τεμαχισμός ν.ο. με περιοριστικά ένζυμα: 5 G AATTC 3 5 AG CT 3 5 G GATCC 3 3 CTTAA G 5 3 TC GA 5 3 CCTAG G 5 EcoRI AluI BamHI 5 TCATCG AATTCGAGATGAAGAG CTCTTGCAATTG GATCCGGCCGAA 3 3 AGTAGCTTAA GCTCT ACTT CTC GAGAACGTTAACCTAG GCCGGCTT 5 TCATCG AATTCGAGATGAAGAG CTCTTGCAATTG GATCCGGCCGAA AGTAGCTTAA GCTCT ACTT CTC GAGAACGTTAACCTAG GCCGGCTT 10
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ 2. Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων (ν.ο.):: τεμαχισμός ν.ο. με περιοριστικά ένζυμα: RFLP (Restriction fragment length polymorphism) 11
2. Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων (ν.ο.):: Κατασκευή γενετικού χάρτη (restriction map) 200 50 400 100 bp Πηχτή με πλήρη αποκοπή των DNA - Πηχτή με μερική αποκοπή των DNA 800 700 600 500 400 400 750 650 550 500 450 400 300 200 200 250 200 100 100 100 0 50 + 50 Ζώνη που αντιστοιχεί σε τμήμα DNA με ραδιενεργό ακτινοβολία 12
2. Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων (ν.ο.):: Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) 5 3 DNA στόχος 3 5 5 5 3 3 3 3 5 5 DNA πολυμεράση 5 3 5 3 3 5 3 5 Σε n κύκλους παράγονται 2 n νέα DNA (n=20 1.048.576) 13
2. Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων (ν.ο.):: Προσδιορισμός αλληλουχίας βάσεων DNA primer 5 3 T C G G A T C T G A 3 5 5 A-G-C-C-T-A-G-A-C-T 3 14
2. Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων (ν.ο.):: Προσδιορισμός αλληλουχίας βάσεων DNA primer 5 3 T C G G A T C T G A 3 5 dda ddg ddc ddt 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 5 A-G-C-C-T-A-G-A-C-T 3 15
Σύνθεση γονιδίου in vitro με βάση το mrna Πρόβλεψη mrna: πρωτεϊνη: Ser - Met - Asp - Cys - Gly - Asn mrna: U C U A U A G A C U G C G G U A A U Λήψη mrna με ανοσοκατακρήμνιση πολυσωμάτων 16
Σύνθεση γονιδίου in vitro με βάση το mrna ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ mrna ΑΑΑΑΑΑ υβριδισμός με ολιγοθυμίνη ΤΤΤΤΤΤΤ ΑΑΑΑΑΑ αντίστροφη μεταγραφάση ΤΤΤΤΤΤΤ ΑΑΑΑΑΑ απομάκρυνση του mrna ΤΤΤΤΤΤΤ cdna DNA πολυμεράση ΤΤΤΤΤΤΤ ΑΑΑΑΑΑ 17
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΣΤΑ ΦΥΤΑ H ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝ ΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA DNA R πλασμίδιο βακτήριο 18
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΣΤΑ ΦΥΤΑ H ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝ ΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA G A T A A T T C T A C G TA A G T A A T T C G C πλασμίδιο ανοιχτό πλασμίδιο A A T T C G T T A A T T A A C G T T A A ξένο γονίδιο ανασυνδυασμένο DNA 19
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΣΤΑ ΦΥΤΑ H ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝ ΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA Μεταμόρφωση βακτηρίων: DNA R πλασμίδιο βακτήριο 20
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ Ενσωμάτωση ανθρώπινου γονιδίου ινσουλίνης σε βακτήρια: πάγκρεας mrna ινσουλίνης ανασυνδυασμός cdna ινσουλίνης πλασμιδίου μεταμορφωμένο βακτήριο 21
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΣΤΑ ΦΥΤΑ Τα βακτήρια Agrobacterium: A. tumefaciens Ti πλασμίδιο δημιουργία κάλλου A. rhizogenes Ri πλασμίδιο δημιουργία ριζών 22
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΣΤΑ ΦΥΤΑ Ti πλασμίδιο T-DNA ανασυνδυασμός Τ-DNA πυρήνας «ξένο» γονίδιο Καλλιέργεια μολυσμένων κυττάρων μεταφορά ενός κλώνου νεαρό φυτό 23
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΣΤΑ ΦΥΤΑ Ανθεκτικότητα σε ιούς ομή ιών πρωτεϊνική κάψα πρώιμα γονίδια κεφαλή DNA όψιμα γονίδια ουρά 24
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΣΤΑ ΦΥΤΑ Ανθεκτικότητα σε ιούς φυτικό κύτταρο 25
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΣΤΑ ΦΥΤΑ Ανθεκτικότητα σε ιούς φυτικό κύτταρο 26
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΣΤΑ ΦΥΤΑ Ανθεκτικότητα σε ιούς φυτικό κύτταρο 27
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΣΤΑ ΦΥΤΑ Ανθεκτικότητα σε ιούς φυτικό κύτταρο 28
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΣΤΑ ΦΥΤΑ Ανθεκτικότητα σε ιούς 1. μεταφορά όψιμων γονιδίων για τον ιό της μωσαϊκής του καπνού γονίδια πρωτεϊνικής κάψας στον πυρήνα φυτικό κύτταρο 29
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΣΤΑ ΦΥΤΑ Ανθεκτικότητα σε ιούς 2. μεταφορά πρώιμων γονιδίων σε καπνό, τομάτα και ζαχαρότευτλα RNA RNA γονίδια αναπαραγωγής DNA στον πυρήνα φυτικό κύτταρο 30
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΣΤΑ ΦΥΤΑ Ανθεκτικότητα σε ιούς 2. μεταφορά πρώιμων γονιδίων σε καπνό, τομάτα και ζαχαρότευτλα γονίδια αναπαραγωγής DNA στον πυρήνα φυτικό κύτταρο 31
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΣΤΑ ΦΥΤΑ Ανθεκτικότητα σε βακτήρια μύκητες - ζιζανιοκτόνα 1. μεταφορά γονιδίων που κωδικοποιούν αντιβιοτικές ουσίες 2. τροποποίηση ενζύμου «στόχου» ή αύξηση των γονιδίων του ενζύμου «στόχου» 3. ενίσχυση της αντίδρασης υπερ-ευαισθησίας 32
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΣΤΑ ΦΥΤΑ Ανθεκτικότητα σε έντομα Bacillus thurigiensis εντομοκτόνος πρωτεϊνη (ντομάτα, καπνό, μελιτζάνα) Προστασία από παγετούς Ψεκασμός με μεταλλαγμένα βακτήρια στα οποία έχει αφαιρεθεί το γονίδιο που κωδικοποιεί τη δημιουργία παγοκρυστάλλων Βελτίωση καλλωπιστικών 1. Μεταφορά γονιδίου από καλαμπόκι σε πετούνια πορτοκαλί άνθη 2. Μεταφορά γονιδίου λουσιφεράσης από πυγολαμπίδα σε γκαζόν 33