EIΣAΓΩΓH ΣTHN ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΣΤΗΝ TEXNOΛOΓIA TOY ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA

ΦAPMAKEYTIKH ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΔIAΛEΞEIΣ 1-3 EIΣAΓΩΓH ΣTHN ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΣΤΗΝ TEXNOΛOΓIA TOY ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA

Η ΠΡΟΟΔΟΣ ΤΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΔΩΣΕ ΩΘΗΣΗ ΚΑΙ ΣΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΗΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ H Μοριακή Βιολογία που έχει ως αντικείμενο την ανάλυση της δομής και της έκφρασης του γενετικού υλικού ανέπτυξε μιά σειρά εργαλεία απαραίτητα για την ανάπτυξη και της Φαρμακευτικης Βιοτεχνολογίας, όπως τις δυνατότητες: Nα «κόβουμε» το DNA σε μικρότερα τμήματα Να «αρχειοθετούμε» το DNA στο εργαστήριο Nα αναλύουμε την πρωτοταγή δομή του DNA Nα μετράμε την έκφραση των γονιδίων Nα εκφράζουμε τα γονίδια σε ετερόλογα συστήματα είτε για να μελετήσουμε τη λειτουργικότητά τους ή για να παράγουμε μεγάλες ποσότητες των προϊόντων τους Να ενισχύουμε γενετικό υλικό από απειροελάχιστες ποσότητες

Εισαγωγή DNA σε ευκαρυωτικά κύτταρα αλλάζει τον φαινότυπο τους Εφαρμογή στη Φαρμακευτική Βιοτεχνολογία; Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

Παραγωγή Mεγάλων Ποσοτήτων Πρωτεϊνών µε Kλωνοποίηση Φορείς Έκφρασης

DNA ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΑΠΟΜΟΝΩΘΕΙ ΕΙΤΕ ΑΠΟ ΚΥΤΤΑΡΑ Η ΑΠΟ ΙΣΤΟΥΣ ΠΡΟΚΕΙΜΕΝΟΥ ΠΡΟΣΟΧΗ: ΝΑ ΜΕΛΕΤΗΘΕΙ Το DNA είναι ένα ΤΕΡΑΣΤΙΟ μόριο (ακόμη και το DNA των σχετικά μικρών βακτηριακών γονιδιωμάτων είναι αρκετά μεγάλο) που είναι εξαιρετικά ευαίσθητο στη μηχανική καταπόνηση, δηλαδή μπορεί πολύ εύκολα να «σπάσει» σε μικρότερα θραύσματα κατά τη διάρκεια των εργαστηριακών χειρισμών. ΕΠΟΜΕΝΩΣ ü Το «κόψιμο» του DNA σε μικρότερα θεραύσματα μπορεί να βελτιώσει τη μηχανική του σταθερότητα και να απλοποιήσει το χειρισμό του

ΠΩΣ MΠOPOYME NA «KOΨOYME» TO DNA ΣE MIKPOTEPA ΘPAYΣMATA; ME TH XPHΣH EIΔIKΩN ENZYMΩN YΠAPXOYN ΠPOΫΠOΘEΣEIΣ; NAI, TA ENZYMA AYTA ΘA ΠPEΠEI NA ΔIAΣΠOYN TO DNA ΠANTA ΣTIΣ IΔIEΣ AΛΛHΛOYXIEΣ OI OΠOIEΣ EINAI EK TΩN ΠPOTEPΩN ΓNΩΣTEΣ

ENΔONOYKΛEAΣEΣ ΠEPIOPIΣMOY Oι ενδονουκλεάσες περιορισμού είναι ένζυμα τα οποία αναγνωρίζουν συγκεκριμένες παλινδρομικές αλληλουχίες του DNA και τις διασπούν πάντα στο ίδιο σημείο. Μπορύν να θεωρηθούν σαν «μοριακά ψαλίδια» που κόβουν το DNA Παραδείγματα στις επόμενες διαφάνειες

ΤΙ ΕΙΝΑΙ ΟΙ ENΔONOYKΛEAΣEΣ ΠEPIOPIΣMOY; Οι ενδονουκλεάσες περιορισµού είναι ενδονουκλεάσες οι οποίες αναγνωρίζουν συγκεκριµένες παλινδροµικές αλληλουχίες στο DNA, το οποίο διασπούν πάντα στις ίδιες προκαθορισµένες θεσεις. Θα δείξουμε μερικά παραδείγματα στις επόμενες δύο διαφάνειες

ΤΕΣΣΕΡΙΣ ΔΗΜΟΦΙΛΕΙΣ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΩΝ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ θέση διάσπασης Σακχαροφωσφορικός σκελετός HindIII EcoRI AluI NotI PstI

ΑΠΟ ΠΟΥ ΠΡΟΕΡΧΟΝΤΑΙ ΟΙ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ; Οι ενδονουκλεάσες περιορισµού αποµονώθηκαν αρχικά από βακτήρια. Είναι συστατικά ενός µηχανισµού άµυνας των βακτηρίων ενάντια σε εισβολή ξένου γενετικού υλικού, π.χ. από µόλυνση µε κάποιον βακτηριοφάγο. Γιατί οι ενδονουκλεάσες περιορισµού δεν διασπούν και το DNA του βακτηρίου που τα παράγει;

ΕΞΕΙΔΙΚΕΥΜΕΝΗ ΧΗΜΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΟΥ DNA ΤΟ ΠΡΟΣΤΑΤΕΥΕΙ ΑΠΟ ΠΕΨΗ ΑΠΟ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ Ενδονουκλεάση περιορισμού EcoRI EcoRI μεθυλάση Μη μεθυλιωμένο DNA «κολλώδη» άκρα Διάσπαση του DNA Μη μεθυλιωμένο DNA Μεθυλιωμένο DNA Ενδονουκλεάση περιορισμού EcoRI Η EcoRI δε μπορεί να διασπάσει το μεθυλιωμένο DNA

ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΤΗ ΚΟΠΗ ΤΙ; Πως αναλύεται το DNA µετά την πέψη του µε ενδονουκλεάσες περιορισµού;

HΛEKTPOΦOPHTIKH ANAΛYΣH TΩN ΘPAYΣMATΩN TOY DNA

APXEΣ HΛEKTPOΦOPHTIKHΣ ANAΛYΣHΣ

KΛΩNOΠOIHΣH H «αρχειοθέτηση» του DNA στο εργαστήριο

Φορείς κλωνοποίησης - Tα πλασµίδια

H Διαδικασία της Kλωνοποίησης

Πολλαπλασιασµός των Aντιγράφων ενός Γονιδίου µε Kλωνοποίηση

Aπαραίτητες Iδιότητες ενός Πλασµιδιακού Φορέα Kλωνοποίησης 1. Aλληλουχίες έναρξης αντιγραφής (ORI) 2. Γονίδιο που επιτρέπει εύκολη επιλογή (π.χ.aντίσταση σε αντιβιοτικό) 3. Aλληλουχίες που επιτρέπουν κοπή από αρκετές ενδονουκλεάσες περιορισµού (polylinker) 4. ( Έναν υποκινητή που να επιτρέπει ρυθµιζόµενη έκφραση)

Δηµιουργία µιας Γενωµικής Bιβλιοθήκης

Γενωµικές & cdna Bιβλιοθήκες

Διαδικασία Παρασκευής cdna

Χωρητικότητα κοινών φορέων κλωνοποίησης

Bιβλιοθήκες DNA µπορούν να Kατασκευασθούν και σε Φάγους

Τα βασικά βήµατα της κλωνοποίησης DNA σε πλασµίδιο

Συρραφή ΘραυσµάτωνDNA µε Διαδοχική Kλωνοποίηση

Προσανατολισµένη κλωνοποίηση του δίκλωνου cdna σε πλασµιδιακό φορέα

Διάκριση µπλε-λευκών αποικιών για τον εντοπισµό ανασυνδυασµένων φορέων

ΠΩΣ MΠOPOYME NA TAYTOΠOIHΣOYME AΠOIKIEΣ ΠOY ΠEPIEXOYN ANAΣYNΔYAΣMENOYΣ ΦOPEIΣ KΛΩNOΠOIHΣHΣ AΠO AYTEΣ ΠOY ΠEPIEXOYN «AΔEIOYΣ» ΦOPEIΣ;

Kοσµίδια Τα κοσμίδια είναι πλασμιδιακοί φορείς κλωνοποίησης που περιέχουν μία ή δύο θέσεις cos. (Η θέση cos είναι μία αλληλουχία περίπου 200bp που προέρχεται από τον φάγο λ και η οποία είναι απαραίτητη για το «πακετάρισμα» του DNA σε σωματίδια φάγου). Πως κλωνοποιούμε το DNA σε ένα κοσμίδιο; 1. Χρησιμοποιούμε τη θέση πολλαπλής κλωνοποίησης (polylinker) για να ενθέσουμε θραύσματα DNA που έχουν δημιουργηθεί με πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού. 2. Το DNA πακετάρεται σε φάγους, ακριβώς όπως και το DNA του ίδιου του φάγου. 3. Τα κοσμίδια πολλαπλασιάζονται μέσα στα βακτηριακά κύτταρα όπως και τα πλασμίδια (δηλ. φέρουν γονίδια που προσδίδουν στα κύτταρα αντίσταση σε αντιβιοτικό). 4. Τα κοσμίδια απομονώνονται ακριβώς όπως και τα πλασμίδια. Το πλεονέκτημα τους είναι ότι μπορούν να «πακετάρουν» μέσα στην «κεφαλή» του φάγου μεγαλύτερα σε μέγεθος θραύσματα DNA (40-55 kb of DNA, δηλ. Σε κοσμίδια μεγέθους ~5 kb μπορούμε να εισάγουμε ενθέματα 33-50 kb)).

Kλωνοποίηση σε κοσµίδια - Παράδειγµα Το κοσμίδιο «κόβεται» με την ενδονουκλεάση BglII σε θέση κοντά στη θέση cos. Το γενωμικό DNA«κόβεται» με την ενδονουκλεάση Sau3A (μερική υδρόλυση), που δημιουργεί συμβατά «κολλώδη» άκρα με την BglII. Τα θραύσματα τα κατεργαζόμαστε με αλκαλική φωσφατάση (ΓΙΑΤΙ;) Το DNA δότης συνδέεται με το DNA δέκτη (κοσμίδιο) με την DNA λιγάση δημιουργώντας εν σειρά συνδέσεις. Το DNA καθαρίζεται με βάση το μέγεθος. Το DNA «πακετάρεται» σε φάγους.

Το DNA των κοσµιδίων «πακετάρεται» σε γραµµική µορφή

Κοσµίδια - ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ

YBPIΔIΣMOΣ NOYKΛEΪNIKΩN OΞEΩN

Tαυτοποίηση Aποικιών που Περιέχουν Θετικούς Kλώνους µε Yβριδισµό -1

Tαυτοποίηση Aποικιών που Περιέχουν Θετικούς Kλώνους µε Yβριδισµό - 2

ΠΩΣ MΠOPOYME NA EΠITYXOYME THN ANAΛYΣH/TAYTOΠOIHΣH ΣYΓKEKPIMENΩN ΘPAYΣMATΩN DNA (πριν την κλωνοποίηση ή και µετά);

Στύπωµα κατά Southern: ανάλυση DNA µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα, στύπωµα και υβριδοποίηση - 1

Στύπωµα κατά Southern: ανάλυση DNA µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα, στύπωµα και υβριδοποίηση - 2

ANIXNEYΣH THΣ METAΛΛAΞHΣ ΠOY ΠPOKAΛEI ΔPEΠANOKYTTAPIKH ANAIMIA ΜΕ ΥΒΡΙΔΙΣΜΟ ΝΟΥΚΛΕΪΝΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ

Διαδικασία αλληλούχισης DNA µε τη µέθοδο του Sanger που βασίζεται στη χρήση διδεοξυνουκλεοτιδίων

Διαδικασία αλληλούχισης DNA µε τη µέθοδο του Sanger που βασίζεται στη χρήση διδεοξυνουκλεοτιδίων

TI KANOYME OTAN TO ΔIAΘEΣIMO ΓENETIKO YΛIKO ΔEN EINAI ΔIAΘEΣIMO ΣE ΠOΣOTHTEΣ IKANEΣ ΠPOΣ ANAΛYΣH; ΦTIAXNOYME ΠEPIΣΣOTEPO ΜΕ ΤΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΤΗΣ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR)

PCR Η ενίσχυση του DNA in vitro

Ο κύκλος της τεχνικής PCR

Η εκθετική αύξηση των αντιγράφων του DNA κατά την PCR - 1

Η εκθετική αύξηση των αντιγράφων του DNA κατά την PCR - 2

Η εκθετική αύξηση των αντιγράφων του DNA κατά την PCR - 3

Μοριακή διαγνωστική µε PCR στην ιατροδικαστική

Aνίχνευση HIV µε RT-PCR

Xρήση RT-PCR µε πολλαπλούς εκκινητές στη µοριακή διαγνωστική µιάς ιογενούς κτηνιατρικής νόσου

H PCR στην κλωνοποιηση DNA και RNA

Χρήση της PCR πραγµατικού χρόνου για τη µέτρηση της ποσότητας των µορίων-στόχων που περιέχει ένα δείγµα

Μοριακοί φάροι για την PCR πραγµατικού χρόνου

Παραγωγή Mεγάλων Ποσοτήτων Πρωτεϊνών µε Kλωνοποίηση Φορείς Έκφρασης

Kατευθυνόµενη Mεταλλαξιγένεση

Eισαγωγή Kατευθυνόµενων Tροποποιήσεων στο Γενετικό Yλικό

Kατασκευή Διαγονιδιακών Ποντικών