Ανασυνδυασμένο DNA Γονίδια και Γονιδιώματα Μία Συνοπτική Παρουσίαση James D. Watson Amy A. Caudy Richard M. Myers Jan A. Witkowski
Κεφάλαιο 6 Τα σύγχρονα εργαλεία στην τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 2
ΕΙΚΟΝΑ 6.1: Προσθήκη νέων αλληλουχιών στο 5 άκρο των προϊόντων της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). -Προσθήκη κατάλληλων θέσεων περιορισμού (προσοχή: δεν θα πρέπει να υπάρχει στην αλληλουχία του προϊόντος!) -Προσθήκη αλληλουχίας επίτοπου (7-10 αμινοξέα) που θα αναγνωρίζεται από γνωστό αντίσωμα. Χρήσιμο για τον εντοπισμό ή την απομόνωση της πρωτεΐνης Κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση Ανασυνδυασμένο DNA 3
ΕΙΚΟΝΑ 6.2: Τυχαία μεταλλαξιγένεση ενός συγκεκριμένου γονιδίου και επιλογή των μεταλλαγμένων μορφών του. Από τη στιγμή που έχουμε έναν GFP επίτοπο μπορούμε να δημιουργήσουμε τυχαίες μεταλλαγές με συνθήκες που τις ευνοούν: 1. Πολυμεράση που δεν κάνει διορθωτικό έλεγχο 2. Χαμηλή συγκέντρωση μιας DNA βάσης 3. MηCl2 αντί για MgCL2 Μόνο κατά προσέγγιση των κύριων λειτουργικών περιοχών ενός γονιδίου. Δεν μπορείς να γνωρίζεις τον τρόπο λειτουργίας των μηχανισμών σε μοριακό επίπεδο. 4
ΕΙΚΟΝΑ 6.3: Κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση μέσω ολιγονουκλεοτιδίου. Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 5
ΕΙΚΟΝΑ 6.3: Κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση μέσω ολιγονουκλεοτιδίου. Θέλουμε να απομακρύνουμε τα πατρικά πλασμίδια (δεν φέρουν τη μεταλλαγή) και τα ετερόδιπλα (μόνο ένας κλώνος φέρει τη μεταλλαγή): Μεθυλίωση Dam: η αδενοσίνη μεθυλιώνεται στην πατρική αλληλουχία GATC. Το DNA που συντίθεται in vitro όχι. DpnI: κόβει μόνο μεθυλιωμένο DNA.
Αν κάποιος έχει ήδη καρκίνο και καταστείλουμε τη δράση του ογκογονιδίου, τότε ο καρκίνος θεραπεύεται ή είναι πολύ αργά; Θα χρειαστούμε τις γνώσεις μας για το: Lac Operon + Διαγονιδιακή τεχνολογία ποντικών + Ογκογονίδια
ΕΙΚΟΝΑ 3.1: Η ρύθμιση του οπερονίου lac. CAP: catabolite gene Activator Protein (όταν τα επίπεδα camp μειώνονται ραγδαία παρουσία γλυκόζης (καταβολική καταστολή) + Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 8
ΕΙΚΟΝΑ 3.1: Η ρύθμιση του οπερονίου lac. 1. Αντί LacZ να βάλουμε ένα άλλο γονίδιο! 2. Να αλλάξουμε τον υποκινητή 3. Να μεταφέρουμε τον Ο σε άλλο γονίδιο CAP: catabolite gene Activator Protein (όταν τα επίπεδα camp μειώνονται ραγδαία παρουσία γλυκόζης (καταβολική καταστολή) + Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 9
ΕΙΚΟΝΑ 6.4: Το σύστημα Tet-off χρησιμοποιήθηκε για να διαπιστωθεί αν η συνεχής έκφραση του myc είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της ανάπτυξης ενός όγκου. Το γονίδιο tta συνδυάζει: Υποκινητής της βαριάς αλυσίδας των αντισωμάτων TetR: προσδένεται στο DNA AD: προέρχεται από τον ερπητοιό Vp16 και ενεργοποιεί τη μεταγραφή. Προσδένεται στο χειριστή TetO απουσία τετρακυκλίνης
ΕΙΚΟΝΑ 6.4: Το σύστημα Tet-off χρησιμοποιήθηκε για να διαπιστωθεί αν η συνεχής έκφραση του myc είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της ανάπτυξης ενός όγκου. -Απουσία τετρακυκλίνης τα ζώα πέθαιναν από όγκους του λεμφοποιητικού συστήματος. -Αν όμως ενώ είχαν αναπτύξει όγκους- γινόταν χορήγηση τετρακυκλίνης, οι όγκοι υποχωρούσαν. Αρα η ανάπτυξη των όγκων χρειάζεται τη συνεχή ενεργοποίηση του ογκογονιδίου myc.
ΕΙΚΟΝΑ 6.5: Παραγωγή μονοκλωνικού αντισώματος (mab). Η σύντηξη των κυττάρων διευκολύνεται παρουσία πολυαιθυλενικής γλυκόλης. Τα υβριδικά κύτταρα που εκφράζουν Hprt επιλέγονται και αναπτύσσονται σε μέσο που περιέχει υποξανθίνη, αμινοπτερίνη, θυμιδίνη. Τα κύτταρα του μυελώματος δεν συνθέτουν Hprt. Τα λεμφοκύτταρα της σπλήνας δεν μεγαλώνουν για πάντα. Κάθε υβρίδιο παράγει ένα συγκεκριμένο Ab που αναγνωρίζει ένα συγκεκριμένο αντιγόνο Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 12
ΕΙΚΟΝΑ 6.5: Παραγωγή μονοκλωνικού αντισώματος (mab). Όσα δείγματα είναι θετικά καλλιεργούνται περεταίρω. Τα υβριδώματα μπορούν αν καλλιεργούνται για πάντα αφού είναι δυνητικά αθάνατα. Σήμερα η ιδέα είναι τα Abs να χρησιμοποιηθούν για ειδική στόχευση καρκινικών κυττάρων και τη δημιουργία-παράδοση ενός magic bullet που θα καταστρέφει μόνο τα καρκινικά που εκφράζουν ένα συγκεκριμένο αντιγόνο. Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 13
magic bullet Σήμερα η ιδέα είναι τα Abs να χρησιμοποιηθούν για ειδική στόχευση καρκινικών κυττάρων και τη δημιουργία-παράδοση ενός magic bullet (χημειοθεραπευτικού) που θα συνδέεται με το αντίσωμα και καταστρέφει μόνο τα καρκινικά που εκφράζουν ένα συγκεκριμένο αντιγόνο. Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 14
Μεταφορά γονιδίου από ένα φορέα σε ένα άλλο: ΤΑ κλωνοποίηση Απλός φορέας Φορέας έκφρασης
ΕΙΚΟΝΑ 6.6: Στην κλωνοποίηση TA, η λιγάση αντικαθίσταται από μια τοποϊσομεράση. Κόβει το φωσφοδ. δεσμό στην αλληλουχία 5-CCCTT-3 Η τοποισομεράση Ι κόβει το φωσφοδ. δεσμό του φορέα στην αλληλουχία 5-CCCTT-3 και παραμένει συνδεδεμένη στα άκρα του. Όταν προστεθεί το προϊόν της PCR ενώνει τα άκρα του φορέα με εκείνα του PCR προϊόντος. -Οι τοποισομεράσες είναι μια κατηγορία ρεκομπινασών και ρυθμίζουν την υπερελίκωση του DNA. -Καταλύουν την ανταλλαγή τμημάτων Ομόλογων DNA τμημάτων. -Δεν χρειάζονται περιοριστικά ένζυμα! -Οι εκκινητές δεν ενσωματώνονται γιατί δεν έχουν P
Μεταφορά γονιδίου από ένα φορέα σε ένα άλλο: με ανασυνδυασμό στα βακτήρια Δότης: -φέρει το pir-116 πρωτεΐνη Π επιτρέπει την επιλεκτική αντιγραφή πλασμιδίων που φέρουν oriγ -φέρει το πλασμίδιο F (fertility) που περιέχει το οπερόνιο tra πρωτεΐνες που επιτρέπουν μεσω σύζευξης τη μεταφορά πλασμιδίων που διαθέτουν orit (από το ίδιο το tra πλασμίδιο έχει αφαιρεθεί το orit για να μην είναι δυνατή η μεταφορά του). -Φέρει το πλασμίδιο δότη που έχει orit ώστε να είναι δυνατή η μεταφορά του στο στέλεχος δέκτη μέσω σύζευξης. Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 17
Μεταφορά γονιδίου από ένα φορέα σε ένα άλλο: με ανασυνδυασμό Δέκτης: -φέρει το ένζυμο περιορισμούi-scei που αναγνωρίζει μια σπάνια θέση περιορισμού 18bp και βρίσκεται υπό τον έλεγχο του επαγώγιμου υποκινητή της αραβινόζης. -φέρει ένα πλασμίδιο που περιέχει ορισμένα γονίδια του φάγου λ που επάγουν τη διαδικασία του ανασυνδυασμού υπό τον έλεγχο του επαγώγιμου υποκινητή της λακτόζης. -Φέρει το πλασμίδιο δέκτη που έχει ένα αρνητικό δείκτη επιλογής, το phes (είναι τοξικό για την E. Coli όταν μεγαλώνει παρουσία ενός ανάλογου φαινυλαλανίνης και του γονιδίου ανθεκτικότητας της αμπικιλίνης Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 18
Μεταφορά γονιδίου από ένα φορέα σε ένα άλλο: με ανασυνδυασμό -Στα δύο πλασμίδια βρίσκονται 2 περιοχές ομολογίας. Στο δότη έχουμε το τμήμα που πρόκειται να μεταφερθεί. Στο δέκτη το γονίδιο phes που πρόκειται να αντικατασταθεί. -Με σύζευξη, το πλασμίδιο δότης μεταφέρεται στο βακτήριο δέκτη. Το πλασμίδιο του δότη δεν μπορεί να αντιγραφεί γιατί το βακτήριο δέκτης δεν έχει το pir-116. Προστίθεται αραβινόζη και έτσι εκφράζεται το I-SceI το οποίο κόβει εκατέρωθεν των ομολογιών Α και Β και στα 2 πλασμίδια. Οι περιοχές ομολογίας παραμένουν. -Προσθέτουμε IPTG, ενεργοποιείται ο υποκινητής lac και εκφράζονται οι πρωτεΐνες του φάγου λ για τον ανασυνδυασμό. -Επιλέγονται τα βακτήρια που είναι ανθεκτικά στην Amp και τη Phe Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 19
Εικόνα 6.8. Μεταφορά γονιδίων: -με ηλεκτροδιάτρηση. -με χλωριούχο ασβέστιο Η έννοια της μόνιμης και παροδικής ενσωμάτωσης του εξωγενούς DNA στο γονιδίωμα. Μόνιμη διαμόλυνση: Διαδοχικοί κύκλοι ανακαλλιέργειας παρουσία του δείκτη επιλογής. Ανασυνδυασμένο DNA 20
ΕΙΚΟΝΑ 6.9: Διαμόλυνση με χρήση λιποσωμάτων. Το DNA είναι αρνητικά φορτισμένο. Τα λιπίδια φέρουν στις κεφαλές τους θετικά φορτισμένες κατιονικές ομάδες. Τα μόρια των λιπιδίων σχηματίζουν αυθόρμητα διπλοστοιβάδες γύρω από τα μόρια DNA δημιουργώντας λιποσώματα. Τα λιποσώματα προστίθενται στα κύτταρα. Η επιφάνεια των περισσότερων ζωικών κυττάρων είναι αρνητικά φορτισμένη και τα θετικά φορτισμένα λιποσώματα προσκολλώνται πάνω τους. Τα κύτταρα προσλαμβάνουν τα σύμπλοκα λιπιδίων-dna και κάποια καταλήγουν στο πυρήνα. Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 21
ΕΙΚΟΝΑ 6.10: Αναγέννηση φυτών από πρωτοπλάστες. Η μεταφορά εξωγενούς DNA στα φυτά είναι δύσκολη λόγω του κυτταρικού τοιχώματος και της κυτταρίνης. Οι πρωτοπλάστες προσλαμβάνουν εύκολα DNA με διαμόλυνση ή ηλεκτροδιάτρηση. Πιο σπουδαίο: αναγεννούν ένα πλήρες φυτό. Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 22
ΕΙΚΟΝΑ 6.10: Αναγέννηση φυτών από πρωτοπλάστες. Όμως η αναγέννηση ολόκληρη φυτού από πρωτοπλάστες στα δημητριακά είναι εξαιρετικά δύσκολη. Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 23
ΕΙΚΟΝΑ 6.11: Άμεση μεταφορά DNA σε φυτικά κύτταρα με βομβαρδισμό μικροσφαιριδίων. Το DNA επικάθεται σε μικροσφαιρίδια βολφραμίου ή χρυσού ~1μm και τοποθετούνται στην άκρη ενός πλαστικού βλήματος.. Η κάννη του πιστολιού και ο θάλαμος βρίσκονται σε κενό και τα φυτικά κύτταρα αντέχουν στο κενό για Περίπου 2 λεπτά. Μετά το βομβαρδισμό τα κύτταρα τοποθετούνται σε καλλιέργεια και από αυτά αναγεννούνται πλήρη φυτά. Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 24
Ορισμένοι κυτταρικοί τύποι δεν επιδέχονται την εισαγωγή DNA με τη χρήση κάποιας από τις τεχνικές που προαναφέραμε. Έτσι πολλοί ερευνητές στράφηκαν στους ιούς. Το γονίδιο-στόχος ενσωματώνεται στο γονιδίωμα ενός φάγου και μεταφέρεται μέσα στο κύτταρο μετά τη μόλυνση με το φάγο. Σημειώσεις: Η χρήση ιών όπως ο SV40 είναι περιορισμένη αφού μόνο μικρά τμήματα DNA μπορούν να ενσωματωθούν (όταν το μέγεθος του DNA αυξηθεί πολύ δεν είναι δυνατόν να πακεταριστεί πλέον σε ιικά σωμάτια). Οι λυτικοί ιοί δεν είναι χρήσιμοι για μόνιμη εισαγωγή του DNA γιατί σκοτώνουν το κύτταρο. Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 25
ΕΙΚΟΝΑ 6.12: Χρήση ενός ρετροϊικού φορέα για τη σταθερή και μακροπρόθεσμη έκφραση ενός εξωγενούς γονιδίου. Φορείς έκφρασης των gag, pol και env εισάγονται σε κυτταρικές σειρές με σταθερή διαμόλυνση. Το γονίδιο που μας ενδιαφέρει είναι κλωνοποιημένο σε ένα ρετροιικό φορέα που τους έχουν αφαιρεθεί τα γονίδια συσκευασίας. Τα κύτταρα τώρα εκφράζουν τις πρωτεΐνες συσκευασίας. Το RNA που παράγεται από τον ρετροιό συσκευάζεται σε ιικά σωμάτια. Οι ιοί που απελευθερώνονται περιέχουν το γονίδιο που μας ενδιαφέρει.
ΕΙΚΟΝΑ 6.12: Χρήση ενός ρετροϊικού φορέα για τη σταθερή και μακροπρόθεσμη έκφραση ενός εξωγενούς γονιδίου. Με τους νέους ιούς μπορούμε τώρα να μολύνουμε άλλα κύτταρα. Οι ανασυνδυασμένοι ιοί δεν εκφράζουν gag, pol και env και τα κύτταρα που μολύνουν δεν παράγουν νέους ιούς αλλά ενσωματώνουν το γονίδιο που μας ενδιαφέρει στο γονιδίωμα του κυττάρου.
ΕΙΚΟΝΑ 17.17 Tο πλασμίδιο Ti και η παρεμβολή RNA Οι όγκοι επάγονται από το πλασμίδιο Ti του βακτηρίου. Μέρος του DNA του Ti (το Τ-DNA ή μετασχηματιστικό DNA) ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του φυτικού κυττάρου. T-DNA: -περιβάλλεται από 2 επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες 25bp που εμπλέκονται στην εκτομή του T DNA -ακολουθεί η μεταφορά του T-DNA από το βακτήριο στο πυρήνα και η ένθεση του στο πυρηνικό DNA -τα γονίδια της εκτομής, μεταφοράς και ένθεσης βρίσκονται σε άλλη περιοχή του πλασμιδίου (virulence)
ΕΙΚΟΝΑ 6.13: Μεταφορά γονιδίων σε φυτικά κύτταρα με τη χρήση ενός δυαδικού συστήματος. Χρησιμοποιούμε 2 πλασμίδια: Δυαδικός φορέας: -Διατηρεί τις 2 επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες 25bp που εμπλέκονται στην εκτομή του T DNA. -φέρει θετικό δείκτη επιλογής NPTII ώστε τα κύτταρα να είναι ανθεκτικά στη καναμυκίνη -δε φέρει το γονίδιο που επάγει την αυξητική ορμόνη και επάγει τους όγκους στο φυτό. Βοηθητικός φορέας: -έχει αφαιρεθεί το Τ DNA -έχει όμως τα γονίδια vir που είναι υπεύθυνα για την εκτομή, μεταφορά και ένθεση του T DNA.
ΕΙΚΟΝΑ 6.13: Μεταφορά γονιδίων σε φυτικά κύτταρα με τη χρήση ενός δυαδικού συστήματος. Κλωνοποιούμε το 5 cdna του γονιδίου της Πολυγαλακτουρονάσης που προάγει την ωρίμανση της ντομάτας με τέτοια φορά ώστε να συντίθεται το αντισημαίνον RNA. και επάγουμε τη σίγαση του γονιδίου.
ΕΙΚΟΝΑ 6.14: Κατασκευή διαγονιδιακών ποντικών με μικροένεση. Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 31
Παραγωγή εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων (κυττάρων ES) από βλαστοκύστες ποντικού.
In vivo σήμανση πρωτεϊνών με στόχο το φθορισμό: Knockin ζώα
In vivo βιοτινυλίωση πρωτεϊνών: In vivo biotinylation tagging of transcription factors Σε κυτταρικές σειρές: Biotin-TF MS ChIP-on-chip
BirA Tg Biotin-tagged TF1 Χ Biotin-tagged TF2
Το σύστημα CRISPR-CAS9 Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 37
Το σύστημα CRISPR-CAS9 Όταν τα βακτήρια μολύνονται από κάποιο ιό, κάποια πρωτεινικά σύμπλοκα «μνήμης» του CRISPR Cas ανοσοποιητικού συστήματος επιλέγουν αλληλουχίες του ιού (protospacers) και τις ενσωματώνουν σαν αλληλουχίες στο δικό τους χρωμόσωμα. Αυτές οι αλληλουχίες ενσωματώνονται σε μια σειρά επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών που λέγονται «clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs)». Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 38
Το σύστημα CRISPR-CAS9 Την επόμενη φορά που τα βακτήρια θα μολυνθούν με το ίδιο ιικό DNA, τα μετάγραφα των spacers καθοδηγούν μια ενδονουκλεάση στο ιικό DNA που το κόβει. Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 39
Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 40
Το σύστημα CRISPR-CAS9 στη γονιδιακή θεραπεία Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 41
CRISPR-CAS9 και επιδιόρθωση γενετικών βλαβών Knockout Knockin Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 42