ΕΠΟΧΙΚΕΣ ΜΕΤΑΒΟΛΕΣ ΤΗΣ ΑΕΡΟΒΙΑΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΣΤΗΝ ΚΑΡΔΙΑ ΚΑΙ ΣΤΟ ΗΠΑΡ ΤΗΣ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ, Sparus aurata -722-9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ Φειδάντσης Κ., Αντωνοπούλου Ε., Μιχαηλίδης Β. Τομέας Ζωολογίας, Τμήμα Βιολογίας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, michaeli@bio.auth.gr Περίληψη Η θερμοκρασία επηρεάζει την αερόβια ικανότητα και το ρυθμό σύνθεσης της βιολογικής ενέργειας (ΑΤΡ) των θαλάσσιων οργανισμών. Η αύξηση της θερμοκρασίας ενεργοποιεί τον αναερόβιο μεταβολισμό στους διάφορους ιστούς. Στα πλαίσια των κλιματικών αλλαγών οι εποχικές αυξήσεις της θερμοκρασίας πιθανότατα επηρεάζουν την αερόβια ικανότητα των θαλάσσιων οργανισμών, με αποτέλεσμα τις αρνητικές επιδράσεις σε διάφορες φυσιολογικές διαδικασίες όπως είναι η αύξηση, η ανάπτυξη και η αναπαραγωγή. Σκοπός της εργασίας ήταν να προσδιοριστεί το εποχικό πρότυπο μεταβολής της δραστικότητας ενζύμων-δεικτών της αερόβιας ικανότητας ιστών όπως της καρδιάς και ήπατος στην τσιπούρα, Sparus aurata. Ο προσδιορισμός της δραστικότητας κάποιων ενζυμών του κυτταρικού μεταβολισμού, όπως η κιτρική συνθετάση (CS), η αφυδρογονάση του γαλακτικού οξέος (L-LDH) και η αφυδρογονάση του β-υδροξυάκυλο-coa (HOAD), συμβάλλει στην κατανόηση του μεταβολικού πρότυπου της σύνθεσης ΑΤΡ στα κύτταρα. Λέξεις κλειδιά: θερμοκρασία, L-LDH, CS, HOAD, τελεόστεοι. SEASONAL CHANGES IN THE AEROBIC CAPACITY OF THE HEART AND LIVER OF THE GILTHEAD SEA BREAM, Sparus aurata Feidantsis Κ., Antonopoulou Ε., Michaelidis Β. Department of Zoology, School of Biology, Aristotle University of Thessaloniki, michaeli@bio.auth.gr Abstract Temperature affects the aerobic capacity and the synthesis rate of biological energy and demand in marine animals. An increase in temperature activates the aerobic metabolism in various tissues. In the context of global warming, seasonal variations in temperature, may affect the aerobic capacity of marine animals, resulting in negative effects in certain physiological processes, including increase, growth and reproduction. The aim of this project was to examine the seasonal pattern of the activity of enzymes-indicators of the aerobic capacity in tissues such as the heart and liver in the species Sparus aurata (gilthead sea bream). Τhe determination of certain enzymes activity with key role in cellular metabolism, such as citrate sunthetase (CS), L-Lactate dehydrogonase (L-LDH) and b-hydroxyacyl-coa dehydrogonase (HOAD), plays a significant part in the understanding of the metabolic pattern of ATP synthesis in cells. Keywords: temperature, L-LDH, CS, HOAD, teleosts. 1. Εισαγωγή Συγκριτικές μελέτες σε θαλάσσιους ποικιλόθερμους οργανισμούς έδειξαν ότι αύξηση της θερμοκρασίας του νερού αναστέλλει τις αερόβιες διαδικασίες οξείδωσης των βιολογικών καυσίμων (υδατάνθρακες, λίπη) και ενεργοποιεί την αναερόβια οξείδωση αυτών. Η μετατροπή του μεταβολικού πρότυπου πιστεύεται ότι οφείλεται στη μειωμένη ικανότητα πρόσληψης και μεταφοράς του οξυγόνου στους ιστούς του θαλάσσιων οργανισμών (Anestis et al., 2007, 2008; Pörtner 2001; Pörtner 2002; Pörtner et al., 2004). Τα ανώτερα θερμικά όρια που προκαλούν τη μετατροπή αυτή διαφέρουν σημαντικά από είδος σε είδος. Στα πλαίσια των κλιματικών αλλαγών και στην επικείμενη σταδιακή αύξηση της μέσης θερμοκρασίας της γης και των θαλασσών κρίνεται σκόπιμη η μελέτη των θερμικών ορίων ανοχής των θαλάσσιων ειδών και ιδιαίτερα αυτών που έχουν σημαντική εμπορική και οικονομική αξία. H κατανόηση των μεταβολικών πρότυπων και η επίδραση της θερμοκρασίας σε αυτά, βασίζεται κυρίως στη μελέτη διαφόρων ενζύμων-δεικτών της αερόβιας ικανότητας. Κάποια
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ από τα ένζυμα αυτά είναι η κιτρική συνθετάση (CS) που συμμετέχει στον κύκλο του Krebs, η αφυδρογονάση του γαλακτικού οξέος (L-LDH) που συμμετέχει στη γλυκόλυση και η αφυδρογονάση του β-υδροξυάκυλο-coa (HOAD) που συμμετέχει στη β-οξείδωση των λιπαρών οξέων. Σκοπός της συγκεκριμένης εργασίας είναι να προσδιοριστεί το εποχικό πρότυπο μεταβολής της δραστικότητας των παραπάνω ενζύμων στην καρδιά και στο ήπαρ, ατόμων τσιπούρας (Sparus aurata) κατά τη διάρκεια ενός έτους και να εξεταστεί εάν οι αλλαγές αυτές σχετίζονται με τις μεταβολές τις θερμοκρασίας του θαλασσινού νερού. Α. Β. Εικ. 1: Α. Τοποθεσία της ιχθυοκαλλιέργειας και Β. Τοποθέτηση των ιχθυοκλωβών στη μονάδα. 2. Μεθοδολογία Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε μονάδα ιχθυοκαλλιέργειας στο Καραγάτσι Σιθωνίας Χαλκιδικής (Εικ. 1Α). Συγκεκριμένα, στα τέλη Νοεμβρίου 2007, ψάρια (περίπου 300 άτομα) τοποθετήθηκαν σε ιχθυοκλωβούς διαστάσεων: 2μ (ύψος) x 2μ (μήκος) x 2μ (πλάτος). Οι κλωβοί τοποθετήθηκαν επιφανειακά (0-2μ.) και σε βάθος 10-12μ. (Εικ. 1Β). Οι δειγματοληψίες πραγματοποιούνταν σε μηνιαία βάση με έναρξη το Φεβρουάριο του 2008. Συγκεκριμένα άτομα απομακρύνονταν από τους κλωβούς και αφού αναισθητοποιούνταν (MS 222, 1/10.000), στη συνέχεια γινόταν μέτρηση του ολικού βάρους και του μεσουραίου μήκους των ψαριών. Ακολούθως γινόταν λήψη των ιστών και άμεση ψύξη τους σε υγρό άζωτο. Στα δείγματα αυτά μετά από ομογενοποίηση γινόταν ο προσδιορισμός της δραστικότητας (μmoles/min.g.wet.wt) και της ειδικής δραστικότητας (μmoles/min.mg protein) των ενζύμων L-LDH, HOAD και CS. Η μέτρηση των δραστικοτήτων έγινε σύμφωνα με τους Passonneau & Lowry (1993), φασματοφωτομετρικά στα 340nm για τα πρώτα δύο ένζυμα και στα 412nm για τη CS. Για τον προσδιορισμό της ολικής πρωτεΐνης στα δείγματα χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος Bradford, Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA). Κατά τη διάρκεια των δειγματοληψιών γινόταν και μέτρηση των φυσικοχημικών παραμέτρων του νερού (Πίν. 2). 3. Αποτελέσματα Τα αποτελέσματα έδειξαν μία σημαντική εποχική μεταβολή στις δραστικότητες των ενζύμων στους δύο ιστούς που εξετάσθηκαν. Στους ιστούς που μελετήθηκαν από άτομα που τοποθετήθηκαν στην επιφάνεια της θάλασσας, παρατηρήθηκε μείωση στη δραστικότητα της L-LDH (Εικ. 2). Στην καρδιά παρατηρήθηκε μείωση των τιμών της HOAD (Εικ. 3), ενώ η τιμή της CS (Εικ. 4) παρέμεινε σταθερή. Αντίθετα, για τα άτομα που έχουν τοποθετηθεί στο βάθος των 10 μέτρων, στην καρδιά και στο ήπαρ, παρατηρήθηκε μείωση της δραστικότητας της L-LDH (Εικ. 2). Επίσης στην καρδιά παρατηρήθηκε μείωση των τιμών της CS (Εικ. 4) ενώ η HOAD (Εικ. 3) παρέμεινε σταθερή. Στο ήπαρ παρατηρήθηκε μείωση της δραστικότητας των CS (Εικ. 4) και HOAD (Εικ. 3). Όσον αφορά -723-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ Εικ. 2: Ενζυμική και ειδική ενζυμική δραστικότητα της L-LDH στην καρδιά και στο ήπαρ. Εικ. 3: Ενζυμική και ειδική ενζυμική δραστικότητα της HOAD στην καρδιά και στο ήπαρ. Εικ. 4: Ενζυμική και ειδική ενζυμική δραστικότητα της CS στην καρδιά και στο ήπαρ. -724-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ τα μορφοσωματικά χαρακτηριστικά των ψαριών, όπως είναι το βάρος και το μήκος (Πίν. 1), δεν παρατηρήθηκε καμιά στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των ψαριών που ήταν τοποθετημένα επιφανειακά και αυτών που βρίσκονταν στο βάθος των 10 μέτρων κατά τη διάρκεια του πειράματος. Πίνακας 1: Μετρήσεις του βάρους και του μεσουραίου μήκους των ψαριών. Βάρος (gr) Μεσουραίο μήκος (cm) 0-2μ. 10-12μ. 0-2μ. 10-12μ. Φεβ. 318,4±57,2 286,8±36,7 24,9±1,4 24,4±0,9 Μαρ. 296,8±43,1 277,8±41,5 25,1±1,2 24,2±1,1 Απρ. 270,6±26,8 253,8±31,1 24,3±0,8 24,2±0,9 Μάι. 283,6±29,1 296,1±21,3 24,8±1,2 24,9±0,9 Ιούν. 273,1±21,4 265,3±18,1 25,2±1,2 24,6±1,3 Ιούλ. 293,7±14,1 278,1±15,4 26,2±1,1 25,5±1,1 Αύγ. 294,5±18,2 278,9±20 25,3±0,6 25,2±1,2 Πίνακας 2: Mετρήσεις των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών του νερού στην τοποθεσία της πειραματικής διαδικασίας. Οξυγόνο (mg/l) Θερμοκρασία ( o C) Αλατότητα (g/l) 0-2μ. 10-12μ. 0-2μ. 10-12μ. 0-2μ. 10-12μ. Φεβ. 8,95 8,08 14,53 14,7 34,86 34,8 Μαρ. 6,49 7,40 11,77 11,9 33,70 33,83 Απρ. 9,46 9,16 14,6 13,2 34,03 34,3 Μάι. 7,46 7,42 17,0 15,8 33,03 33,3 Ιούν. 7,96 8,47 24,83 22,2 31,47 31,53 Ιούλ. 6,45 6,07 28,37 27,6 31,07 31,6 Αύγ. 6,40 6,05 28,8 28,1 31,22 31,78 4. Συμπεράσματα Από τα παραπάνω αποτελέσματα προκύπτει ότι η σημαντικότερη μεταβολή στη ενζυμική δραστικότητα μεταξύ των δύο βαθών, αφορά αυτήν της HOAD στην καρδιά. Υψηλότερες τιμές δραστικότητας του συγκεκριμένου ενζύμου μετρήθηκαν την άνοιξη στα άτομα που είχαν τοποθετηθεί επιφανειακά, δηλαδή, στα άτομα που επιδέχονται τις μεγαλύτερες θερμοκρασιακές αλλαγές. Σε αντίθεση, στην καρδιά των ατόμων που τοποθετήθηκαν σε βάθος 10μ. μετρήθηκαν ιδιαίτερα χαμηλές τιμές δραστικότητας κατά την περίοδο του χειμώνα και της άνοιξης όταν η θερμοκρασία του νερού στο συγκεκριμένο βάθος δεν μεταβάλλεται σημαντικά. Αντίθετα, η δραστικότητα της HOAD στα συγκεκριμένα άτομα αυξάνει κατά τη διάρκεια των καλοκαιρινών μηνών, όπου η θερμοκρασία του νερού αυξάνεται σε σχέση με αυτή της άνοιξης. Όταν οι θερμοκρασίες συγκλίνανε κατά τη διάρκεια των καλοκαιρινών μηνών στα 2 βάθη, τότε δεν παρατηρήθηκε καμιά διαφορά στην ενζυμική δραστικότητα της HOAD μεταξύ των ατόμων των διαφορετικών βαθών. Αντίθετα με την καρδιά, η δραστικότητα της HOAD φαίνεται να ακολουθεί παρόμοιο πρότυπο μεταβολής στο ήπαρ ατόμων ανεξαρτήτου βάθους. Για την ενζυμική δραστικότητα της L-LDH και CS, παρατηρήθηκε στους εξεταζόμενους ιστούς παρόμοιο πρότυπο διαφοροποίησης κατά τη διάρκεια του έτους, με χαμηλότερες τιμές με την είσοδο του καλοκαιριού και την ταυτόχρονη αύξηση της θερμοκρασίας του νερού, και στα δύο βάθη. Έτσι φαίνεται ότι η μηνιαία αλλαγή της θερμοκρασίας του νερού που παρατηρείται στην επιφάνεια, πιθανότατα επηρεάζει την οξείδωση των λιπαρών οξέων στην καρδιά της τσιπούρα με αποτέλεσμα να επηρεάζεται γενικότερα το εποχικό μεταβολικό πρότυπο. Για μια πιο εμπεριστατωμένη διερεύνηση του εποχικού μεταβολικού προτύπου στην τσιπούρα και της -725-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ επίδρασης της θερμοκρασίας σε αυτό, είναι απαραίτητη η μελέτη και ορισμένων άλλων βιοχημικών δεικτών, καθώς και ορισμένων μοριακών δεικτών. 5. Ευχαριστίες Ευχαριστούμε ιδιαίτερα τον κύριο Ιωάννη Χορόζογλου για την παραχώρηση των απαραίτητων εγκαταστάσεων στη μονάδα ιχθυοκαλλιέργειας στο Καραγάτσι Χαλκιδικής. Ευχαριστούμε θερμά όλους τους προπτυχιακούς και μεταπτυχιακούς φοιτητές του Εργαστηρίου Φυσιολογίας, χωρίς την πολύτιμη βοήθεια των οποίων καμία από τις δειγματοληψίες δεω θα ήταν δυνατή. 6. Βιβλιογραφικές Αναφορές Anestis, A., Lazou, A., Pörtner, H.O. & Michaelidis B., 2007. Behavioral, metabolic and molecular stress responses of marine bivalve Mytillus galloprovincialis during long-term acclimation at increasing ambient temperature. Am. J. Physiology 293: R911-R921. Anestis, A., Pörtner, H.O., Lazou, A. & Michaelidis, B., 2008. Metabolic and molecular stress responses of sublittoral bearded horse mussel Modiolus barbatus to warming sea water: implications for vertical zonation. J. Exp. Biol. 211: 2889-2898. Passonneau, J. V. & Lowry, O. H., 1993. Enzymatic analysis: a practical guide. The Humana Press Inc. pp. 120-128, 206-212. Pörtner, H. O., 2001. Climate change and temperature dependent biogeography: oxygen limitation of thermal tolerance in animals, Naturwissenschaften. 88: 137-146. Pörtner, H. O., 2002. Climate variations and the physiological basis of temperature dependent biogeography: systemic to molecular hierarchy of thermal tolerance in animals. Comp. Biochem. Physiol. Part A. 132: 739-761. Pörtner, H. O., Marc, F. C. & Book, C., 2004. Oxygen limited thermal tolerance in fish? Answers obtained by nuclear magnetic resonance techniques. Respiratory Physiology and Neurobiology. 141: 243-260. -726-