CINtec PLUS Kit ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ

ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ CINtec PLUS Kit Το CINtec PLUS Kit είναι μια ανοσοκυτταροχημική δοκιμασία για την ταυτόχρονη ποιοτική ανίχνευση των πρωτεϊνών p16 INK4a και Ki-67 σε τραχηλικά κυτταρολογικά παρασκευάσματα. Προορίζεται για χρήση ως βοήθημα στην ταυτοποίηση γυναικών με τραχηλικές ενδοεπιθηλιακές βλάβες υψηλού βαθμού σε πληθυσμό προσυμπτωματικού ελέγχου, καθώς και σε υποομάδες ασθενών με κυτταρολογικό αποτέλεσμα στην εξέταση Παπανικολάου ASC-US (μη διαγνωστική ατυπία πλακωδών κυττάρων) ή LSIL (χαμηλού βαθμού πλακώδης ενδοεπιθηλιακή αλλοίωση), ή σε ασθενείς με θετικά αποτελέσματα στην εξέταση για HPV υψηλής επικινδυνότητας. Roche mtm laboratories AG Sandhofer Straße 116 D-68305 Mannheim Germany www.cintec.info 9531 50 2 8 C

Πίνακας περιεχομένων I Όνομα προϊόντος... 2 II. Προοριζόμενη χρήση... 2 III. Περίληψη και επεξήγηση της συσκευής... 2 Υπόβαθρο... 2 Κλινική σημασία... 3 Αρχές της διαδικασίας... 6 IV. Αντιδραστήρια... 6 Υλικά που παρέχονται... 6 Αποθήκευση... 9 Υλικά και αντιδραστήρια που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται... 9 Εξοπλισμός που απαιτείται... 10 V. Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις... 10 Προειδοποίηση... 10 Προσοχή... 11 VI. Διαδικασίες... 11 Παρασκευάσματα κυτταρολογικών δειγμάτων... 11 Επεξεργασία δειγμάτων με θερμικά επαγόμενη ανάκτηση επιτόπου πριν τη χρώση... 13 Διαδικασία χρώσης αντικειμενοφόρων... 13 1. Παρασκευή αντιδραστηρίου... 14 1.1 Epitope Retrieval Solution... 14 1.2 Wash Buffer... 14 1.3 Substrate-Chromogen Solutions (DAB και Fast Red)... 14 1.4 Αντίχρωση... 15 1.5 Επικαλυπτικό μέσο... 15 2. Διαδικασία χρώσης... 15 2.1 Επανυδάτωση δειγμάτων... 16 2.2 Ανάκτηση επιτόπου... 17 2.3 Πρωτόκολλα χρώσης... 18 2.3.1 Πρωτόκολλο χρώσης για όργανα Autostainer (Dako, LabVision)... 18 2.3.2 Πρωτόκολλο χρώσης για το Shandon Coverplate System... 20 2.4 Αντίχρωση με Hematoxylin... 22 2.5 Επικάλυψη... 22 VII. Ποιοτικός έλεγχος... 23 Θετικός μάρτυρας... 23 Αρνητικός μάρτυρας... 23 Επιβεβαίωση δοκιμασίας... 24 VIII. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων... 24 IX. Περιορισμοί... 25 X. Χαρακτηριστικά απόδοσης... 26 XI. Αντιμετώπιση προβλημάτων... 33 XII. Σύμβολα... 38 XIII. Κατασκευαστής... 38 XIV. Κατάσταση αναθεώρησης... 38 XV. Νομική κοινοποίηση... 38 Παράρτημα 1: Βιβλιογραφία... 39 Παράρτημα 2: Πίνακες... 41 REF 9531 1 / 49 2009-9531-001EL Rev 2.2

I. Όνομα προϊόντος CINtec PLUS Kit II. Προοριζόμενη χρήση Για in vitro διαγνωστική χρήση. Το CINtec PLUS Kit είναι μια ανοσοκυτταροχημική δοκιμασία για την ταυτόχρονη ποιοτική ανίχνευση των πρωτεϊνών p16 INK4a και Ki-67 σε τραχηλικά κυτταρολογικά παρασκευάσματα. Προορίζεται για χρήση ως βοήθημα στην ταυτοποίηση γυναικών με τραχηλικές ενδοεπιθηλιακές βλάβες υψηλού βαθμού σε πληθυσμό προσυμπτωματικού ελέγχου, καθώς και σε υποομάδες ασθενών με κυτταρολογικό αποτέλεσμα στην εξέταση Παπανικολάου ASC-US (μη διαγνωστική ατυπία πλακωδών κυττάρων) ή LSIL (χαμηλού βαθμού πλακώδης ενδοεπιθηλιακή αλλοίωση), ή σε ασθενείς με θετικά αποτελέσματα στην εξέταση για HPV υψηλής επικινδυνότητας. Το κιτ προορίζεται για χρήση σε ιατρικά εργαστήρια κυτταρολογίας. Η ερμηνεία των αποτελεσμάτων της εξέτασης μπορεί να γίνει μόνο από πιστοποιημένο επαγγελματία σε συνδυασμό με το κλινικό ιστορικό της ασθενούς καθώς και πρόσθετες διαγνωστικές εξετάσεις που έχουν διεξαχθεί. III. Περίληψη και επεξήγηση της συσκευής Υπόβαθρο Σε ευκαρυωτικά κύτταρα, ο έλεγχος της εξέλιξης του κύκλου κυτταρικής διαίρεσης πραγματοποιείται από ένα περίπλοκο μοτίβο ελεγχόμενης έκφρασης και μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων (π.χ., φωσφορυλίωση) των ρυθμιστικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου. Η πρωτεΐνη p16 INK4a παίζει μείζονα ρόλο στο μηχανισμό αυτό της ρύθμισης του ευκαρυωτικού κυτταρικού κύκλου. Αποτελεί μέρος του ελέγχου της μετάβασης μεταξύ των φάσεων G1-S που διαμεσολαβείται από την πρωτεΐνη του ρετινοβλαστώματος (prb), και δίνει έναυσμα στη διακοπή του κυτταρικού κύκλου κατά τη διάρκεια των διαδικασιών κυτταρικής διαφοροποίησης. Έτσι, η p16 INK4a λειτουργεί αντιπολλαπλασιαστικά όταν εκφράζεται κατά την κανονική εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Σε τερματικά διαφοροποιημένα επιθηλιακά κύτταρα, η έκφραση της p16 INK4a υπορρυθμίζεται σε επίπεδα που δεν ανιχνεύονται συνήθως μέσω ανοσοκυτταροχημείας [ανασκόπηση σε 31;35] Το Ki-67 είναι μια πρωτεΐνη που συνδέεται με τον πολλαπλασιασμό και μπορεί να ανιχνευτεί αποκλειστικά στον πυρήνα των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων. Λεπτομερείς αναλύσεις του κυτταρικού κύκλου αποκάλυψαν ότι το αντιγόνο Ki-67 παρουσιάζεται σε ανιχνεύσιμα επίπεδα σε όλες τις φάσεις όπως και κατά τη μίτωση, ενώ ηρεμούντα κύτταρα στη φάση G 0 δεν εκφράζουν το αντιγόνο [ανασκόπηση σε 3;26]. Επειδή κύτταρα με υπερέκφραση της p16 INK4a μπορούν να πολλαπλασιαστούν ενεργά μόνο μετά από βλάβη του μηχανισμού ελέγχου του κυτταρικού κύκλου τους, η έκφραση του πολλαπλασιαστικού δείκτη Ki-67 και η έκφραση της p16 INK4a στο ίδιο κύτταρο θα πρέπει να αλληλοαποκλείονται υπό συνθήκες κανονικής φυσιολογίας. Έτσι, η συνακόλουθη έκφραση των Ki-67 και p16 INK4a σε συγκεκριμένα κύτταρα μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης για την απορρύθμιση του ελέγχου του κυτταρικού κύκλου στα αντίστοιχα κύτταρα. REF 9531 2 / 49 2009-9531-001EL Rev 2.2

Σε τραχηλική νεοπλασία, έχει διαπιστωθεί ότι η p16 INK4a υπερεκφράζεται έντονα ως αποτέλεσμα της λειτουργικής αδρανοποίησης της prb που διαμεσολαβείται μέσω της ογκοπρωτεΐνης E7 από τους τύπους του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων υψηλής επικινδυνότητας (HR-HPV) [13;22]. Καθώς η E7 είναι απαραίτητη για την παγίωση και διατήρηση ενός κακοήθους φαινότυπου σε προκαρκινικές και καρκινικές βλάβες που σχετίζονται με τον HPV, η υπερέκφραση της p16 INK4a συνδέεται απευθείας με την ογκογόνο δράση των διαφόρων τύπων HR-HPV και έτσι έχει προταθεί ως βοηθητικός δείκτης για τις λοιμώξεις μετασχηματισμού του HPV [ανασκόπηση σε 6;31;35]. Πολλές μελέτες ανέλυσαν και απέδειξαν την κλινική χρησιμότητα της ανοσοχρώσης της p16 INK4a στην τραχηλική ιστολογία [2;6;7;11-14;17;18;20-22;32] και κυτταρολογία [4-6;8-10;13;15;17;19;20;25;29;30;33;34;37]. Σε πολλές μελέτες διαπιστώθηκε ότι η συνδυαστική ερμηνεία αντικειμενοφόρων κεχρωσμένων για την p16 INK4a με χρήση του CINtec Histology Kit (Roche mtm laboratories AG) αυξάνει σημαντικά την αξιοπιστία μεταξύ παρατηρητών καθώς και τη διαγνωστική ακρίβεια για την ανίχνευση της CIN2 καθώς και των αλλοιώσεων υψηλότερου βαθμού [2;11;14]. Επιπλέον, αλλοιώσεις CIN1 με θετικότητα για την p16 INK4a μπορεί να παρουσιάζουν μεγαλύτερες πιθανότητες εξέλιξης σε αλλοιώσεις υψηλού βαθμού σε σύγκριση με εκείνες τις αλλοιώσεις CIN1 που ελέγχονται αρνητικές για την p16 INK4a [7;18]. Σε τραχηλική κυτταρολογία, έχει διαπιστωθεί ότι η ανοσοχρώση για την p16 INK4a αποτελεί πολύτιμο εργαλείο για την αποτελεσματική ταξινόμηση των περιπτώσεων κυτταρολογικής εξέτασης Παπανικολάου που κατηγοριοποιούνται ως περιπτώσεις μη διαγνωστικής ατυπίας πλακωδών κυττάρων(asc-us) ή ως χαμηλού βαθμού πλακώδεις ενδοεπιθηλιακές αλλοιώσεις (LSIL), με επίπεδα ευαισθησίας για την ανίχνευση των υποκείμενων αλλοιώσεων CIN2 καθώς και των υψηλότερου βαθμού αλλοιώσεων που είναι παρόμοιες με εκείνες της εξέτασης για HPV, αλλά παρέχει σημαντικά υψηλότερη ειδικότητα [5;9;10;15;19;25;29;30;33;34;37]. Επιπροσθέτως, η κυτταρολογία p16 INK4a έχει προταθεί ως πολύτιμος συμπληρωματικός δείκτης για την ταξινόμηση γυναικών με θετική εξέταση για HR-HPV κατά τον προσυμπτωματικό έλεγχο για καρκίνο του τραχήλου [4]. Έχει διαπιστωθεί ότι σχεδόν όλες οι τραχηλικές ενδοεπιθηλιακές αλλοιώσεις υψηλού βαθμού (δηλ. CIN2 ή 3 και υψηλότερου βαθμού) υπερεκφράζουν την p16 INK4a [2;6;11;13;17;20;32]. Καθώς μεγάλη αναλογία των επιθηλιακών κυττάρων στις αλλοιώσεις CIN επιδεικνύουν επίσης πολλαπλασιαστική δράση, η ανίχνευση τραχηλικών επιθηλιακών κυττάρων που εκφράζουν ταυτόχρονα p16 INK4a και Ki-67 μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης κατάστασης μετασχηματισμένου κυττάρου. Συνεπώς, μια προσέγγιση βασισμένη στην αξιολόγηση των τραχηλικών κυτταρολογικών δειγμάτων αναφορικά με την παρουσία μεμονωμένων τραχηλικών επιθηλιακών κυττάρων που παρουσιάζουν θετικό αποτέλεσμα διπλής χρώσης για p16 INK4a και Ki-67 μπορεί να προσφέρει υψηλά επίπεδα και ευαισθησίας και ειδικότητας για την παρουσία προκαρκινικής και καρκινικής νόσου. Κλινική σημασία Έχει διαπιστωθεί ότι η ερμηνεία αντικειμενοφόρων τραχηλικών κυτταρολογικών παρασκευασμάτων που έχουν υποβληθεί σε ανοσοχρώση για την ταυτόχρονη ανίχνευση της έκφρασης της ρυθμιστικής του κυτταρικού κύκλου πρωτεΐνης p16 INK4a και του πολλαπλασιαστικού δείκτη Ki-67 ταυτοποιεί γυναίκες με τραχηλική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία υψηλού βαθμού (HGCIN) με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα όταν χρησιμοποιείται REF 9531 3 / 49 2009-9531-001EL Rev 2.2

σε πληθυσμό προσυμπτωματικού ελέγχου ως συμπλήρωμα στη συνήθη κυτταρολογική εξέταση Παπανικολάου, στην υποομάδα ασθενών με κυτταρολογικό αποτέλεσμα στην εξέταση Παπανικολάου ASC-US ή LSIL, ή στην υποομάδα ασθενών με αρνητικό κυτταρολογικό αποτέλεσμα στην εξέταση Παπανικολάου, αλλά θετικά αποτελέσματα στην εξέταση HPV. Η αποτελεσματική ταυτοποίηση γυναικών που παρουσιάζουν HGCIN κατά τη διάρκεια των συνήθων εξετάσεων σε πληθυσμό προσυμπτωματικού ελέγχου για τον καρκίνο του τραχήλου αποτελεί μείζονα πρόκληση για τη δημόσια υγεία. Εξαιτίας του χαμηλού επιπολασμού των προκαρκινικών αλλοιώσεων υψηλού βαθμού (συνήθως λιγότερο του 1% των γυναικών σε ασυμπτωματικό πληθυσμό προσυμπτωματικού ελέγχου), έχει μεγάλη σημασία η διαθεσιμότητα εξετάσεων και διαδικασιών ελέγχου τόσο υψηλής ευαισθησίας όσο και υψηλής ειδικότητας που ταυτοποιούν γυναίκες με παγιωμένη HGCIN [24]. Τις τελευταίες δεκαετίες έχει διαπιστωθεί ότι οι κυτταρολογικές εξετάσεις Παπανικολάου για μορφολογικές ανωμαλίες επιτυγχάνουν τη μείωση της νοσηρότητας και θνησιμότητας που σχετίζονται με τον καρκίνο του τραχήλου στις χώρες εκείνες που έχουν καθιερώσει πρωτόκολλα προσυμπτωματικού ελέγχου για τον καρκίνο του τραχήλου. Ωστόσο, παρά τη γενική επιτυχία τους, παρουσιάζεται μη ικανοποιητική χαμηλή ευαισθησία μίας μόνο κυτταρολογικής εξέτασης Παπανικολάου (που συνήθως κυμαίνεται στο 50-70% [16]), και η οποία απαιτεί σύντομα διαστήματα μεταξύ προσυμπτωματικών ελέγχων ώστε να αντισταθμίζεται η σχετικά χαμηλή ευαισθησία ενός μόνο αποτελέσματος κυτταρολογικής εξέτασης. Ταυτόχρονα, έχει διαπιστωθεί ότι η ειδικότητα των κυτταρολογικών εξετάσεων Παπανικολάου είναι σχετικά υψηλή, αν και μπορεί να παρουσιάζει σημαντικές διακυμάνσεις με βάση τα χαρακτηριστικά του συγκεκριμένου πληθυσμού προσυμπτωματικού ελέγχου, μεταξύ των οποίων η ηλικία, ο επιπολασμός του HPV, οι διαφορές της μεθοδολογίας των εξετάσεων Παπανικολάου (συμβατικά επιχρίσματα έναντι επιχρισμάτων υγρής κυτταρολογίας), οι τεχνολογίες που χρησιμοποιούνται (δηλ. μη αυτόματη ερμηνεία έναντι κυτταρολογίας/ απεικόνισης υποβοηθούμενης με υπολογιστή), και εξαρτάται από την εμπειρία των μεμονωμένων ειδικών ανάγνωσης των αντικειμενοφόρων. Οι εξετάσεις HPV έχουν προταθεί ως μια πιθανή προσέγγιση για τη βελτίωση του τρέχοντος προσυμπτωματικού ελέγχου βάσει της κυτταρολογίας Παπανικολάου για τον καρκίνο του τραχήλου και τις πρόδρομες αυτού αλλοιώσεις [24]. Αν και έχει διαπιστωθεί ότι οι εξετάσεις για HPV παρέχουν υψηλή ευαισθησία για την ταυτοποίηση γυναικών με HGCIN, ο υψηλός επιπολασμός των κυρίως παροδικών λοιμώξεων με τύπους HPV υψηλής επικινδυνότητας έχει ως αποτέλεσμα συνολικώς χαμηλά επίπεδα ειδικότητας. Καθώς ο επιπολασμός του HPV κυμαίνεται σύμφωνα με την ηλικία, οι εξετάσεις για τον HPV έχουν προταθεί μόνο ως πιθανός συνδυασμός για ταυτόχρονη διεξαγωγή με τις κυτταρολογικές εξετάσεις Παπανικολάου σε γυναίκες ηλικίας 30 ετών και περισσότερο. [1] REF 9531 4 / 49 2009-9531-001EL Rev 2.2

Εκτός του καθορισμού της βέλτιστης προσέγγισης για την εφαρμογή αποτελεσματικών τεχνολογιών και αλγορίθμων πρωτοπαθούς προσυμπτωματικού ελέγχου, υπάρχουν και άλλοι τομείς ενδιαφέροντος στον προσυμπτωματικό έλεγχο για τον καρκίνο του τραχήλου, όπου υπάρχει δυνατότητα βελτίωσης των υφιστάμενων τεχνολογιών με στόχο τη βελτιστοποίηση της ακρίβειας ταυτοποίησης του HGCIN, ή όπου δεν υπάρχει κανένα διαθέσιμο εργαλείο επί του παρόντος. Η ταξινόμηση των ασαφών (ASC-US, μη διαγνωστική ατυπία πλακωδών κυττάρων) ή ηπίως μη φυσιολογικών (LSIL, χαμηλού βαθμού πλακώδης ενδοεπιθηλιακή αλλοίωση) κυτταρολογικών αποτελεσμάτων των εξετάσεων Παπανικολάου ανήκουν σε αυτήν την κατηγορία, όπως και η διαχείριση γυναικών ηλικίας 30 ετών και άνω με αποτελέσματα προσυμπτωματικού ελέγχου από μεθόδους ταυτόχρονης εξέτασης Παπανικολάου/HPV με κατηγοριοποίηση ως αρνητικά για ενδοεπιθηλιακές αλλοιώσεις ή κακοήθεια (NILM) στην εξέταση Παπανικολάου, αλλά θετικά στην εξέταση HPV υψηλής επικινδυνότητας. Για την ταξινόμηση των κυτταρολογικών ανωμαλιών ASC-US, αποδείχτηκε ότι μια στρατηγική ταξινόμησης που ενσωματώνει την ανίχνευση του HPV εντός του πληθυσμού ASC-US παρουσιάζει ευαισθησία για την ανίχνευση υποκείμενου HGCIN. Ωστόσο, η ειδικότητα σαφώς απέχει της βελτιστοποίησης και διαπιστώνεται ότι εξαρτάται από την ηλικία [27;36]. Επιπλέον, καθώς έχει διαπιστωθεί ότι η συντριπτική πλειοψηφία των περιπτώσεων LSIL είναι θετικές για τύπους HPV υψηλής επικινδυνότητας [23], η ταυτόχρονη ταξινόμηση των κυτταρολογικών αποτελεσμάτων LSIL της εξέτασης Παπανικολάου με τον HPV θα ήταν εξαιρετικά αναποτελεσματική. Επειδή οι υπηρεσίες κολποσκόπησης είναι περιορισμένες και το κόστος των υπηρεσιών αυτών όπως και της επακόλουθης αγωγής των αλλοιώσεων χαμηλού βαθμού είναι σημαντικά υψηλό, διατηρείται το ενδιαφέρον για τη διαθεσιμότητα μιας εξέτασης ταξινόμησης για γυναίκες με ASC-US και LSIL που αν διαθέτει βελτιωμένα χαρακτηριστικά απόδοσης, ιδίως αναφορικά με το παρεχόμενο επίπεδο ειδικότητας. Η εισαγωγή μιας εξέτασης βιοδείκτη με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα ικανής να ταυτοποιεί ασθενείς με παγιωμένη τραχηλική νόσο υψηλού βαθμού θα ήταν επωφελής για τη διαχείριση γυναικών με ασαφείς και χαμηλού βαθμού κυτταρολογικές ανωμαλίες. Μια τέτοιου είδους εξέταση θα είχε τη δυνατότητα 1) να κατηγοριοποιήσει καλύτερα ασθενείς με κυτταρολογικά αποτελέσματα ASC-US σε εξετάσεις Παπανικολάου, και 2) να είναι σε θέση να δημιουργήσει την ευκαιρία αποτελεσματικής ταξινόμησης των κυτταρολογικών αποτελεσμάτων LSIL σε εξετάσεις Παπανικολάου. Όπως συμβαίνει και με την κατάσταση ταξινόμησης των κυτταρολογικών αποτελεσμάτων LSIL σε εξετάσεις Παπανικολάου, επί του παρόντος δεν υπάρχουν διαθέσιμα εργαλεία για την περαιτέρω ταξινόμηση των αποτελεσμάτων προσυμπτωματικού ελέγχου που ήταν αρνητικά στην κυτταρολογία Παπανικολάου αλλά ελέγχθηκαν ως θετικά για HPV υψηλής επικινδυνότητας. Για περίπου 5-7% των αποτελεσμάτων ταυτόχρονης εξέτασης Παπανικολάου/HPV, αυτό αντιστοιχεί σε μια αυξανόμενη ομάδα περιπτώσεων που θα απαιτούσαν πλήρη επαναληπτικό έλεγχο με κολποσκόπηση έτσι ώστε να εκμεταλλευτούν τη δυνατότητα υψηλότερου ποσοστού ανίχνευσης της εξέτασης HPV σε σχέση με την κυτταρολογική εξέταση Παπανικολάου. Ωστόσο, καθώς το ποσοστό της υποκείμενης νόσου υψηλού βαθμού εντός αυτής της ομάδας των αποτελεσμάτων εξέτασης προσυμπτωματικού ελέγχου μπορεί να αναμένεται ακόμα να είναι σχετικά χαμηλό, η διαθεσιμότητα ενός αποτελεσματικού εργαλείου ταξινόμησης θα ήταν εξαιρετικά επιθυμητή με στόχο την αποτελεσματική διαχείριση γυναικών με θετικά αποτελέσματα εξέτασης για HPV που δεν αντιστοιχούν σε μη φυσιολογικά κυτταρολογικά αποτελέσματα εξέτασης Παπανικολάου. REF 9531 5 / 49 2009-9531-001EL Rev 2.2

Αρχές της διαδικασίας Το CINtec PLUS Kit περιέχει ένα σύνολο αντιδραστηρίων για την ανοσοκυτταροχημική ανίχνευση των αντιγόνων p16 INK4a και Ki-67. Το κιτ έχει σχεδιαστεί για την εκτέλεση μιας διαδικασίας ανοσοκυτταροχημικής χρώσης δύο βημάτων για κυτταρολογικά δείγματα που προέρχονται από τον τράχηλο της μήτρας. Για την ανίχνευση των αντιγόνων, χρησιμοποιούνται πρωτοταγές μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, κλώνος E6H4, που στρέφεται έναντι της ανθρώπινης πρωτεΐνης p16 INK4a, και ένα πρωτοταγές μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού, κλώνος 274-11 AC3, που στρέφεται έναντι της ανθρώπινης πρωτεΐνης Ki-67. Χρησιμοποιούνται έτοιμα για χρήση αντιδραστήρια οπτικοποίησης που περιλαμβάνουν (i) ένα πολυμερές αντιδραστήριο συζευγμένο με υπεροξειδάση του χρένου και θραύσματα αντισώματος Fab αίγας έναντι ποντικού, και (ii) ένα πολυμερές αντιδραστήριο συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση και θραύσματα αντισώματος Fab αίγας έναντι κουνελιού. Τα αντιδραστήρια οπτικοποίησης έχουν υποβληθεί σε απορρόφηση στερεής φάσης για εξάλειψη της διασταυρούμενης αντιδραστικότητας με ανθρώπινες ανοσοσφαιρίνες. Οι αντιδράσεις χρωμογόνου βασίζονται στη μετατροπή ενός χρωμογόνου DAB, που διαμεσολαβείται από την υπεροξειδάση του χρένου, και στη μετατροπή του χρωμογόνου Fast Red, που διαμεσολαβείται από την αλκαλική φωσφατάση, σε ορατά προϊόντα αντίδρασης στις αντίστοιχες θέσεις αντιγόνων. Μετά την αντίχρωση, πρέπει να εφαρμοστεί ένα πρωτόκολλο επικάλυψης δύο βημάτων: σε ένα πρώτο βήμα, πρέπει να χρησιμοποιηθεί υδατική επικάλυψη των δειγμάτων με χρήση ενός υδατικού επικαλυπτικού μέσου που παρέχεται με το κιτ. Στη συνέχεια, οι αντικειμενοφόρες μπορούν να καλυφθούν με καλυπτρίδα με χρήση, π.χ., ενός μόνιμου επικαλυπτικού μέσου. Τα αποτελέσματα μπορούν να αξιολογηθούν με εξέταση σε κοινό μικροσκόπιο. IV. Αντιδραστήρια Υλικά που παρέχονται Τα υλικά που παρατίθενται παρακάτω συμπεριλαμβάνονται σε κάθε κιτ και επαρκούν για την εκτέλεση 50 εξετάσεων. Ο αριθμός των εξετάσεων βασίζεται στη χρήση 200 µl αντιδραστηρίων ανά αντικειμενοφόρο. REF 9531 6 / 49 2009-9531-001EL Rev 2.2

1 Peroxidase Blocking Reagent Peroxidase Blocking Reagent 11,5 ml, έτοιμο για χρήση Υπεροξείδιο του υδρογόνου 3%, που περιέχει 15 mmol/l νατραζίδιο (NaN 3 ). Το Φύλλο Δεδομένων Ασφαλείας Υλικού είναι διαθέσιμο εάν ζητηθεί. 2 Primary Antibodies Solution Primary Antibodies Solution 11,5 ml, έτοιμο για χρήση Monoclonal mouse anti-human p16 INK4a antibody, Clone E6H4, και monoclonal rabbit anti-human Ki-67 antibody Clone 274-11 AC3, που παρέχεται σε 50 mm ρυθμιστικό διάλυμα Tris ph 7,2, που περιέχει 15 mmol/l νατραζίδιο (NaN 3 ) και σταθεροποιητική πρωτεΐνη. 3 Visualization Reagent HRP Visualization Reagent HRP 11,5 ml, έτοιμο για χρήση Πολυμερές αντιδραστήριο συζευγμένο με υπεροξειδάση του χρένου και θραύσματα αντισώματος Fab αίγας έναντι ποντικού κεκαθαρμένα με χρωματογραφία συγγένειας, που παρέχονται σε σταθεροποιητικό διάλυμα που περιέχει συντηρητικά και σταθεροποιητική πρωτεΐνη. Περιέχει 5-βρωμο-5-νιτρο-1,3-διοξάνιο που μπορεί να προκαλέσει αλλεργική αντίδραση. Το Φύλλο Δεδομένων Ασφαλείας Υλικού είναι διαθέσιμο εάν ζητηθεί. 4 Visualization Reagent AP Visualization Reagent AP 11,5 ml, έτοιμο για χρήση Πολυμερές αντιδραστήριο συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση και θραύσματα αντισώματος Fab αίγας έναντι κουνελιού κεκαθαρμένα με χρωματογραφία συγγένειας, που παρέχονται σε σταθεροποιητικό διάλυμα που περιέχει συντηρητικά και σταθεροποιητική πρωτεΐνη. Περιέχει 5-βρωμο-5-νιτρο-1,3-διοξάνιο που μπορεί να προκαλέσει αλλεργική αντίδραση. Το Φύλλο Δεδομένων Ασφαλείας Υλικού είναι διαθέσιμο εάν ζητηθεί. REF 9531 7 / 49 2009-9531-001EL Rev 2.2

5 DAB Buffered Substrate DAB Buffered Substrate 16,0 ml Ρυθμιστικό διάλυμα υποστρώματος, ph 7,5, που περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου < 0,1%, σταθεροποιητές, ενισχυτικά και έναν αντιμικροβιακό παράγοντα. 6 DAB Chromogen DAB Chromogen 0,85 ml, χρωμογόνο διάλυμα 3,3 -διαμινοβενζιδίνης. Το DAB είναι επιβλαβές. Ανατρέξτε στις παρακάτω Φράσεις κινδύνου και ασφάλειας: R40 Περιορισμένα στοιχεία καρκινογόνου επίδρασης. R43 Μπορεί να προκαλέσει ευαισθητοποίηση μέσω της επαφής με το δέρμα. R68 Πιθανός κίνδυνος μη αναστρέψιμων επιδράσεων. S35 Το υλικό αυτό και ο περιέκτης του πρέπει να απορρίπτονται με ασφαλή τρόπο. S36/37 Φοράτε κατάλληλο προστατευτικό ρουχισμό και γάντια. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αν και η διαμινοβενζιδίνη σχετίζεται δομικά με τη βενζιδίνη, δεν υπάρχουν στοιχεία για την καρκινογόνο επίδραση της διαμινοβενζιδίνης. Συμβουλευτείτε τους τοπικούς ή κρατικούς κανονισμούς σχετικά με την απόρριψη. Το Φύλλο Δεδομένων Ασφαλείας Υλικού είναι διαθέσιμο εάν ζητηθεί. 7 Naphthol Phosphate Substrate Naphthol Phosphate Substrate 25,0 ml Ρυθμιστικό διάλυμα υποστρώματος, ph 9,2, που περιέχει φωσφορικό υπόστρωμα ναφθόλης AS-TR, σταθεροποιητές, ενισχυτικά και έναν αντιμικροβιακό παράγοντα. 8 Fast Red Chromogen Fast Red Chromogen 1,33 ml, χρωμογόνο διάλυμα Fast Red. 9 Epitope Retrieval Solution 10 x Epitope Retrieval Solution 10 x 500 ml, 100 mm Tris, 10 mm EDTA, ph 9,0, που περιέχει 15 mmol/l νατραζίδιο (NaN 3 ). REF 9531 8 / 49 2009-9531-001EL Rev 2.2

10 CINtec PLUS Mount CINtec PLUS Mount 18,0 ml, μόνιμο επικαλυπτικό μέσο υδατικής βάσης για τη μόνιμη διατήρηση των παρασκευασμάτων αντικειμενοφόρων κεχρωσμένων με συστήματα οπτικοποίησης με βάση την υπεροξειδάση και την αλκαλική φωσφατάση. Περιέχει 7,7 mmol/l νατραζίδιο (NaN 3 ) Αποθήκευση Αποθηκεύεται στους 2 8 C. Μη χρησιμοποιείτε το προϊόν μετά την ημερομηνία λήξης. Δεν έχουν συγκεντρωθεί δεδομένα αναφορικά με την αποθήκευση των αντιδραστηρίων υπό οποιεσδήποτε συνθήκες διαφορετικές των όσων αναφέρονται παραπάνω. Μετά το άνοιγμα, τα συστατικά του κιτ είναι σταθερά επί 6 μήνες εάν φυλάσσονται στους 2 8 C. Τα διαλύματα πρέπει να απορρίπτονται εάν εμφανίζουν θολερότητα. Το φιαλίδιο CINtec PLUS Mount (Φιαλίδιο 10) πρέπει να αφαιρείται από τη συσκευασία του κιτ αφού ανοιχτεί για πρώτη φορά το κιτ και μπορεί να φυλαχθεί περαιτέρω σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (2 30 C). Το Diluted Wash Buffer και το αραιωμένο Epitope Retrieval Solution είναι σταθερά επί 1 μήνα εάν φυλάσσονται στους 2 8 C. Τα διαλύματα δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται εάν εμφανίζουν θολερότητα. Υλικά και αντιδραστήρια που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Το Wash Buffer που προορίζεται για χρήση με το CINtec PLUS Kit διατίθεται με αριθμό καταλόγου 8550 από την Roche mtm laboratories AG αλλά δεν περιλαμβάνεται στο κιτ. Για στοιχεία παραγγελίας, ανατρέξτε στον ιστότοπο www.cintec.info. Αιματοξυλίνη χωρίς αλκοόλη για αντίχρωση Αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό Αιθανόλη, 99% Επικαλυπτικό μέσο με βάση την ξυλόλη για επικάλυψη με καλυπτρίδα γυάλινων αντικειμενοφόρων Αντικειμενοφόρες: SuperFrost PLUS, ThinPrep Microscopy Slides; BD SurePath PreCoat αντικειμενοφόρες πλάκες Ξυλόλη Γυάλινες καλυπτρίδες ή καλυπτρίδες μεμβράνης Μάρτυρες διαδικασίας, π.χ. αντικειμενοφόρες ThinPrep που παράγονται από το φιαλίδιο εναπομείναντος δείγματος: Θετικός μάρτυρας: ThinPrep αντικειμενοφόρος από ένα ή περισσότερα (αποθεματικά) δείγματα με το κυτταρολογικό αποτέλεσμα της εξέτασης Παπανικολάου επιβεβαιωμένο ως υψηλού βαθμού πλακώδης ενδοεπιθηλιακή αλλοίωση (HSIL) REF 9531 9 / 49 2009-9531-001EL Rev 2.2

Αρνητικός μάρτυρας: αντικειμενοφόρος ThinPrep από ένα ή περισσότερα (αποθεματικά) δείγματα με το κυτταρολογικό αποτέλεσμα της εξέτασης Παπανικολάου επιβεβαιωμένο ως αρνητικό για ενδοεπιθηλιακή αλλοίωση ή κακοήθεια (NILM). Εξοπλισμός που απαιτείται Κοινό μικροσκόπιο (αντικειμενική μεγέθυνση 10-40x) Θερμοανθεκτικά δοχεία χρώσης (πλαστικά) Κύλινδροι μέτρησης Φιάλη πίδακα (για γέμισμα με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης) Χρονόμετρο (ικανό να μετρήσει διαστήματα των 30-60 λεπτών) Υδατόλουτρο με καπάκι (ικανό διατήρησης θερμοκρασίας Epitope Retrieval Solution στους 95 99 C) Θερμόμετρο V. Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις Προειδοποίηση 1. Προσοχή! Ορισμένα από τα αντιδραστήρια που περιλαμβάνονται σε αυτό το κιτ περιέχουν επικίνδυνα χημικά. Κατά το χειρισμό των συστατικών του κιτ αυτού, τηρείτε τις προφυλάξεις ασφαλείας που σχετίζονται με το χειρισμό επικίνδυνων εργαστηριακών αντιδραστηρίων. 2. Τα συστατικά 1, 2, 9 και 10 του προϊόντος αυτού περιέχουν νατραζίδιο (NaN 3 ), που είναι εξαιρετικά τοξικό στην καθαρή μορφή του. Στις συγκεντρώσεις του προϊόντος, αν και δεν ταξινομείται ως επικίνδυνο, το νατραζίδιο ενδέχεται να αντιδράσει με μολύβδινες και χάλκινες σωληνώσεις σχηματίζοντας εξόχως εκρηκτικά μεταλλικά αζίδια. Κατά την απόρριψη, εκπλύνετε με μεγάλες ποσότητες νερού για να αποφευχθεί η συσσώρευση μεταλλικών αζιδίων στις σωληνώσεις. 3. Τα συστατικά 2, 3 και 4 περιέχουν υλικά ζωικής προέλευσης. Τηρείτε τις ορθές διαδικασίες χειρισμού όπως ισχύει για οποιοδήποτε προϊόν προέρχεται από βιολογικές πηγές. 4. Το Φύλλο Δεδομένων Ασφαλείας Υλικού για το κιτ είναι διαθέσιμο εάν ζητηθεί. 5. Κατά το χειρισμό και απόρριψη κυτταρολογικών δειγμάτων, μεταξύ των οποίων όλα τα δείγματα πριν και μετά τη μονιμοποίηση, καθώς και όλων των υλικών που εκτίθενται σε αυτά, τηρείτε τις προφυλάξεις ασφαλείας που σχετίζονται με το χειρισμό δυνητικά μολυσματικών υλικών καθώς και τις ισχύουσες απαιτήσεις απόρριψης αποβλήτων. 6. Κατά την αναρρόφηση αντιδραστηρίων με πιπέτα, μη χρησιμοποιείτε ποτέ το στόμα. Αποφύγετε την επαφή του δέρματος και των βλεννογόνων με αντιδραστήρια και δείγματα. Σε περίπτωση που αντιδραστήρια ή δείγματα έρθουν σε επαφή με δέρμα ή βλεννογόνους, πλύνετε με άφθονη ποσότητα νερού. 7. Τα αντιδραστήρια οπτικοποίησης, DAB Chromogen και Fast Red Chromogen, ενδέχεται να επηρεαστούν αρνητικά εάν εκτεθούν σε υπερβολικά επίπεδα φωτός. Μην αποθηκεύετε τα συστατικά του κιτ και μην εκτελείτε χρώση υπό ισχυρό φως, όπως σε απευθείας ηλιακό φως. REF 9531 10 / 49 2009-9531-001EL Rev 2.2

8. Φοράτε κατάλληλο ατομικό προστατευτικό εξοπλισμό για να αποφύγετε την επαφή με τα μάτια και το δέρμα κατά το χειρισμό οποιουδήποτε από τα συστατικά που περιλαμβάνονται ή προορίζονται για χρήση σε συνδυασμό με το CINtec PLUS Kit. Ανατρέξτε στο Δελτίο Δεδομένων Ασφάλειας Υλικού για περισσότερες πληροφορίες. Προσοχή 1. Για in vitro διαγνωστική χρήση. 2. Μόνο για επαγγελματική χρήση. 3. Ελαχιστοποιήστε την μικροβιακή επιμόλυνση των αντιδραστηρίων έτσι ώστε να αποφύγετε μη ειδική χρώση. 4. Η εφαρμογή χρόνων, θερμοκρασιών ή μεθόδων επώασης διαφορετικών από τα προβλεπόμενα ενδέχεται να δώσει εσφαλμένα αποτελέσματα. 5. Μην χρησιμοποιείτε το κιτ εάν η συσκευασία ή οποιοδήποτε εκ των συστατικών του έχει υποστεί ζημιά. Εάν τυχόν η συσκευασία έχει αλλοιωθεί ή τα συστατικά έχουν υποστεί ζημιά, ενημερώστε τον κατασκευαστή χωρίς καθυστέρηση. 6. Η απόρριψη όλων των αποβλήτων υλικών πρέπει να είναι σύμφωνη με τις τοπικές κατευθυντήριες γραμμές και κανονισμούς. 7. Όλα τα αντιδραστήρια έχουν παρασκευαστεί ειδικά για χρήση με την εξέταση αυτή. Για να εκτελεστεί η εξέταση κατά τα καθοριζόμενα, δεν πρέπει να γίνονται υποκαταστάσεις. 8. Αν παρατηρηθεί μη αναμενόμενη χρώση η οποία δεν μπορεί να εξηγηθεί από τις διακυμάνσεις των εργαστηριακών διαδικασιών και υπάρχει υποψία προβλήματος με το CINtec PLUS Kit, ανατρέξτε αμέσως στον ιστότοπο www.cintec.info για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με την τεχνική υποστήριξη. 9. Δυσλειτουργία του προϊόντος που οφείλεται σε προβλήματα χειρισμού ή σε αστάθεια δεν έχει ως αποτέλεσμα προφανή σημάδια. Συνεπώς, ως μέτρο ποιοτικού ελέγχου, πρέπει να εκτελείται ανάλυση των θετικών και αρνητικών μαρτύρων ταυτόχρονα με τα δείγματα των ασθενών. VI. Διαδικασίες Παρασκευάσματα κυτταρολογικών δειγμάτων Ο χειρισμός των κυτταρολογικών δειγμάτων πρέπει να είναι επαρκής έτσι ώστε να διατηρούνται τα δείγματα για τις ανοσοκυτταροχημικές διαδικασίες. Όλα τα δείγματα πρέπει να υποβάλλονται σε πρότυπες μεθόδους κυτταρικής επεξεργασίας. Κατάλληλες για χρήση είναι αντικειμενοφόρες ThinPrep (Hologic Inc.) που παρασκευάζονται σε ThinPrep 2000 Processor (Hologic Inc.) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, αντικειμενοφόρες BD SurePath (BD Diagnostics Tripath) που παρασκευάζονται σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, καθώς και αντικειμενοφόρες που παρασκευάζονται μη αυτόματα (συμβατικά επιχρίσματα). REF 9531 11 / 49 2009-9531-001EL Rev 2.2

Σημειώσεις: 1. ThinPrep παρασκεύασμα δείγματος: Σημειώστε ότι δεν συνιστάται η χρήση ThinPrep 3000 Processor, διότι η διαδικασία μονιμοποίησης με ψεκασμό που παρέχει το όργανο ενδέχεται να οδηγήσει σε σημαντική απώλεια κυττάρων. 2. BD SurePath παρασκεύασμα δείγματος: Επειδή έχει περιστασιακά αναφερθεί ότι η αποθήκευση εναπομείναντος κυτταρικού υλικού μετά τη διαδικασία εμπλουτισμού σε νερό ενδέχεται να έχει αρνητικό αντίκτυπο στην ένταση του ανοσοκυτταροχημικού σήματος, συνιστούμε θερμά να τηρούνται οι οδηγίες που παρατίθενται παρακάτω κατά την παρασκευή αντικειμενοφόρων για εξέταση CINtec PLUS ώστε να αποφεύγεται οποιοσδήποτε κίνδυνος απώλειας σήματος: a. Παρασκευή αντικειμενοφόρου απευθείας μετά την επεξεργασία της αντικειμενοφόρου της εξέτασης Παπανικολάου i. Μια δεύτερη αντικειμενοφόρος για κάθε περίπτωση μπορεί να παρασκευαστεί αμέσως αφού ολοκληρωθεί η χρώση Παπανικολάου της αντίστοιχης αντικειμενοφόρου SurePath. ii. Τοποθετήστε μια δεύτερη ομάδα αντικειμενοφόρων επισημασμένων με ετικέτα σε στατό αντικειμενοφόρων. iii. Στο PrepStain χρησιμοποιώντας το GYN, έκδοση 1.1 ή 1.2, Παρασκευή αντικειμενοφόρων, επιλέξτε το πρόγραμμα "Transfer only" (Μόνο μεταφορά). b. Παρασκευή αντικειμενοφόρου από το εμπλουτισμένο κυτταρικό σφαιρίδιο μετά από μετέπειτα παρασκευή της αντικειμενοφόρου Παπανικολάου i. Αφαιρέστε τα στατό σωληναρίων από το PrepStain System και προσθέστε περίπου 2 ml SurePath Preservative Fluid σε κάθε σωληνάριο. ii. Τοποθετήστε πώμα σε κάθε σωληνάριο και φυλάξτε σε θερμοκρασία δωματίου επί 4 εβδομάδες ή σε ψυγείο (2 8 C) για έως 6 μήνες. iii. Αν μια αντικειμενοφόρος για CINtec PLUS πρόκειται να παρασκευαστεί επί αποθηκευμένου δείγματος, αφήστε το δείγμα να ηρεμήσει σε θερμοκρασία δωματίου επί 1 ώρα. Ξεκινήστε με το δεύτερο βήμα φυγοκέντρησης της διαδικασίας εμπλουτισμού GYN και συνεχίστε την υπόλοιπη διαδικασία Prep. c. Παρασκευή αντικειμενοφόρου από εναπομείναν υλικό δείγματος που παραμένει στο αρχικό φιαλίδιο δείγματος (περίπου 2 ml) i. Προσθέστε 8 ml SurePath Preservative Fluid στο εναπομείναν δείγμα στο φιαλίδιο SurePath (περίπου 2 ml). ii. Η επεξεργασία του αραιωμένου δείγματος πρέπει να γίνει στο PrepMate χρησιμοποιώντας την πρότυπη τεχνική και στο PrepStain χρησιμοποιώντας το GYN, έκδοση 1.1 ή 1.2, Παρασκευή αντικειμενοφόρων, πρόγραμμα "Transfer only" (Μόνο μεταφορά). REF 9531 12 / 49 2009-9531-001EL Rev 2.2

Αμέσως μετά την παρασκευή, οι αντικειμενοφόρες ThinPrep ή BD SurePath πρέπει να μονιμοποιηθούν σε αιθανόλη 99% για 10 λεπτά έως 1 ώρα και να στεγνώσουν στον αέρα για 20 λεπτά έως 16 ώρες (ολονύχτια). Το κυτταρολογικό παρασκεύασμα ThinPrep ή BD SurePath δεν πρέπει να μονιμοποιηθεί με κυτταρολογικό αντιδραστήριο μονιμοποίησης με ψεκασμό που περιέχει πολυαιθυλενογλυκόλη (π.χ. Merckofix, Merck). Τα συμβατικά επιχρίσματα πρέπει να μονιμοποιούνται με κυτταρολογικό αντιδραστήριο μονιμοποίησης με ψεκασμό που περιέχει πολυαιθυλενογλυκόλη (π.χ. Merckofix, Merck) αμέσως μετά τη συλλογή του δείγματος. Πριν την έναρξη της ανοσοχρωστικής διαδικασίας, όλα τα δείγματα πρέπει να επανυδατώνονται σύμφωνα με ειδικά πρωτόκολλα που περιγράφονται στην ενότητα 2.1. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Απαιτείται αιθανόλη με ελάχιστες προσμείξεις για τη μονιμοποίηση των κυτταρολογικών αντικειμενοφόρων ThinPrep υγρής βάσης ώστε να αποφευχθεί η χρώση υποβάθρου. Κατά την παρασκευή των αντικειμενοφόρων ThinPrep που προορίζονται για χρήση σε ανοσοχρώση, ανανεώνετε το λουτρό αιθανόλης μετά τη μονιμοποίηση κάθε 25 αντικειμενοφόρων ThinPrep. Επεξεργασία δειγμάτων με θερμικά επαγόμενη ανάκτηση επιτόπου πριν τη χρώση Η θερμικά επαγόμενη ανάκτηση επιτόπου (HIER) με χρήση του Epitope Retrieval Solution που περιλαμβάνεται στο κιτ είναι απαραίτητη για βέλτιστη απόδοση της ανάλυσης. Η απόκλιση από την περιγραφόμενη διαδικασία ενδέχεται να επηρεάσει τα αποτελέσματα! Για τη θερμικά επαγόμενη ανάκτηση επιτόπου, το κυτταρολογικό δείγμα πρέπει να θερμανθεί με εμβάπτιση στο Epitope Retrieval Solution σε βαθμονομημένο υδατόλουτρο ικανό να διατηρεί το Epitope Retrieval Solution σε θερμοκρασία 95 99 C. Εργαστήρια που βρίσκονται σε μεγαλύτερο υψόμετρο θα πρέπει να προσδιορίζουν την καλύτερη μέθοδο διατήρησης της απαιτούμενης θερμοκρασίας του υδατόλουτρου. Ο κατασκευαστής δεν συνιστά καμία απόκλιση από τη διαδικασία που περιγράφεται εδώ. Μετά από τη θερμικά επαγόμενη ανάκτηση επιτόπου, το κυτταρολογικό δείγμα πρέπει να διατηρηθεί σε θερμοκρασία δωματίου επί 20 λεπτά ή περισσότερο μέχρι η θερμοκρασία να πέσει στους 50 C ή λιγότερο πριν από την περαιτέρω επεξεργασία. Στη συνέχεια, πρέπει να εκτελεστεί η χρώση του κυτταρολογικού δείγματος χωρίς καθυστέρηση. Διαδικασία χρώσης αντικειμενοφόρων Το κιτ περιέχει ποσότητα αντιδραστηρίων που επαρκεί για την εκτέλεση 50 εξετάσεων. Ο αριθμός των εξετάσεων βασίζεται στη χρήση 200 µl αντιδραστηρίων ανά αντικειμενοφόρο. Συνιστώνται 200 µl ανά αντικειμενοφόρο για την επεξεργασία κυτταρολογικών παρασκευασμάτων ThinPrep ή BD SurePath σε όργανα Dako ή LabVision Autostainer (δύο ζώνες απόθεσης ανά αντικειμενοφόρο με 100 µl καθεμία) ή με χρήση του Shandon Coverplate System (Thermo Fisher Scientific Inc.). Συνιστώνται επίσης 200 µl ανά αντικειμενοφόρο για την επεξεργασία συμβατικών επιχρισμάτων με χρήση του Shandon Coverplate System. Ωστόσο, για τη διασφάλιση πλήρους κάλυψης των συμβατικών επιχρισμάτων σε όργανα Dako ή REF 9531 13 / 49 2009-9531-001EL Rev 2.2

LabVision Autostainer, συνιστάται η χρήση 300 µl ανά αντικειμενοφόρο (100 µl για κάθε μία από τις τρεις διαθέσιμες ζώνες απόθεσης). 1. Παρασκευή αντιδραστηρίου Συνιστάται η παρασκευή των παρακάτω αντιδραστηρίων, εκτός του διαλύματος εργασίας Fast Red, πριν την έναρξη της διαδικασίας χρώσης. Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να ισορροπούν σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C) πριν την ανοσοχρώση. 1.1 Epitope Retrieval Solution Παρασκευάστε την επαρκή ποσότητα Epitope Retrieval Solution για τη διαδικασία χρώσης που προγραμματίζεται με αραίωση μιας ποσότητας του Φιαλιδίου 9 (Epitope Retrieval Solution 10 x) σε αναλογία 1:10 με χρήση αποσταγμένου ή απιονισμένου νερού. Μετά την αραίωση, το Epitope Retrieval Solution μπορεί να αποθηκευτεί στους 2 8 C για έως ένα μήνα. Το αραιωμένο διάλυμα πρέπει να απορρίπτεται εάν παρουσιάσει θολερότητα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Χρήση νερού με αυξημένα επίπεδα ιόντων για αραίωση του διαλύματος ανάκτησης επιτόπου μπορεί να μειώσει σημαντικά την απόδοση χρώσης της εξέτασης. Βεβαιωθείτε ότι το νερό που χρησιμοποιείται είναι σωστά αποσταγμένο ή απιονισμένο (δηλ. βεβαιωθείτε ότι έχει σημειωθεί η στήλη ανταλλαγής ιόντων για την παραγωγή του απιονισμένου νερού από το τμήμα συντήρησης ρουτίνας). Μην χρησιμοποιείτε νερό βρύσης! 1.2 Wash Buffer Χρησιμοποιήστε Wash Buffer (10 x), αριθμός καταλόγου 8550, που παρέχεται από την Roche mtm laboratories AG σε συνδυασμό με το CINtec PLUS Kit. Για στοιχεία παραγγελίας, ανατρέξτε στον ιστότοπο www.cintec.info. Παρασκευάστε μια ποσότητα Wash Buffer επαρκή για τα βήματα πλύσης της διαδικασίας χρώσης που προγραμματίζεται με αραίωση μιας ποσότητας του Wash Buffer (10 x) σε αναλογία 1:10 με χρήση αποσταγμένου ή απιονισμένου νερού. Μετά την αραίωση, το Wash Buffer μπορεί να αποθηκευτεί στους 2 8 C για έως ένα μήνα. Το αραιωμένο διάλυμα πρέπει να απορρίπτεται εάν παρουσιάσει θολερότητα. 1.3 Substrate-Chromogen Solutions (DAB και Fast Red) Βεβαιωθείτε ότι τόσο τα χρωμογόνα όσο και τα υποστρώματα έχουν ισορροπήσει σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C). Η προσθήκη περίσσειας χρωμογόνου στο υπόστρωμα έχει ως αποτέλεσμα την επιδείνωση του θετικού σήματος. A) Παρασκευή του διαλύματος εργασίας DAB πριν τον κύκλο χρώσης Το διάλυμα εργασίας DAB είναι σταθερό επί 8 ώρες μετά την παρασκευή. Παρασκευάστε το διάλυμα εργασίας DAB ως εξής: i) Μεταφέρετε 1 ml του DAB Substrate Solution (Φιαλίδιο 5) σε καθαρό σωληνάριο αντίδρασης ii) iii) Προσθέστε μία σταγόνα (25 30 µl) του DAB Chromogen (Φιαλίδιο 6) και αναμίξτε ήπια αναστρέφοντας το σωληνάριο (μην κάνετε περιδίνηση) REF 9531 14 / 49 2009-9531-001EL Rev 2.2

Κατά τη χρήση Autostainer, μεταφέρετε το διάλυμα εργασίας DAB σε φιαλίδιο αντιδραστηρίου Autostainer πριν την έναρξη του κύκλου χρώσης και φορτώστε το στην κατάλληλη θέση στατό του Autostainer. B) Παρασκευή του διαλύματος εργασίας Fast Red αμέσως πριν τη χρήση Παρασκευάστε το διάλυμα εργασίας Fast Red αμέσως πριν τη χρήση, ειδάλλως ενδέχεται να προκληθεί μειωμένη ένταση χρώσης και επομένως απώλεια ευαισθησίας. Μην περιδινήσετε το διάλυμα εργασίας Fast Red διότι μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό ιζημάτων. Παρασκευάστε το διάλυμα εργασίας Fast Red ως εξής: i) Μεταφέρετε 1 ml του Naphthol Phosphate Substrate Solution (Φιαλίδιο 7) σε καθαρό σωληνάριο αντίδρασης ii) Προσθέστε μία σταγόνα (40 45 µl) του Fast Red Chromogen (Φιαλίδιο 8) και αναμίξτε ήπια αναστρέφοντας το σωληνάριο (μην κάνετε περιδίνηση) iii) Κατά τη χρήση Autostainer, παρασκευάστε το διάλυμα εργασίας Fast Red όταν σας ζητηθεί από το λογισμικό του Autostainer. Στη συνέχεια, μεταφέρετε το διάλυμα εργασίας σε φιαλίδιο αντιδραστηρίου Autostainer και φορτώστε το στην κατάλληλη θέση στατό του Autostainer. Αποφύγετε την καθυστέρηση του βήματος "substrate batch" (παρτίδα υποστρώματος) στη διάρκεια του κύκλου του Autostainer για να ελαχιστοποιηθεί ο κίνδυνος τεχνουργημάτων ξήρανσης. 1.4 Αντίχρωση Οι αντιδράσεις χρώσης DAB και Fast Red έχουν ως αποτέλεσμα χρωματισμένο τελικό προϊόν, μη υδατοδιαλυτό (DAB: καφέ, Fast Red: κόκκινο). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Πρέπει να χρησιμοποιηθεί αιματοξυλίνη χωρίς αλκοόλη για την αντίχρωση, διότι η χρήση αλκοόλης ενδέχεται να επηρεάσει αρνητικά την ένταση του σήματος που προκαλείται από το Fast Red, ή να το εξαλείψει εντελώς. Αν χρησιμοποιηθεί, τηρήστε τις οδηγίες που παρέχονται από τον προμηθευτή της αιματοξυλίνης για την εκτέλεση της αντίχρωσης. 1.5 Επικαλυπτικό μέσο Για την επικάλυψη δειγμάτων αντικειμενοφόρων μετά τη χρώση, χρειάζεται μια διαδικασία επικάλυψης δύο βημάτων όπως περιγράφεται παρακάτω. Καταρχάς, εφαρμόζεται μη αυτόματα σε λεπτό στρώμα το CINtec PLUS Mount (Φιαλίδιο 10), ένα μόνιμο επικαλυπτικό μέσο υδατικής βάσης, και αφήνεται να στεγνώσει ("εφαρμογή υγρής καλυπτρίδας"). Σε ένα δεύτερο βήμα, εφαρμόζεται μια γυάλινη καλυπτρίδα στην στεγνή επιφάνεια του υδατικού επικαλυπτικού μέσου χρησιμοποιώντας επικαλυπτικό μέσο με βάση την ξυλόλη. Αφήστε το CINtec PLUS Mount να ισορροπήσει σε θερμοκρασία δωματίου πριν τη χρήση και φυλάξτε σε θερμοκρασία δωματίου για περαιτέρω χρήση. 2. Διαδικασία χρώσης Το CINtec PLUS Kit έχει επικυρωθεί για χρήση στα όργανα Autostainer (π.χ., το LabVision Autostainer 480 ή το Dako Autostainer PLUS) σύμφωνα με το πρότυπο που περιγράφεται παρακάτω (βλ. ενότητα 2.3.1), όπως και για το Shandon Coverplate System (βλ. ενότητα 2.3.2). Πριν τη χρώση, τα δείγματα και τα αντιδραστήρια πρέπει να παρασκευάζονται όπως περιγράφεται στις ενότητες 1.1-1.3 και 2.1. REF 9531 15 / 49 2009-9531-001EL Rev 2.2

Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να ισορροπούν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (20 25 C) πριν την εκτέλεση της ανοσοχρωστικής διαδικασίας. Παρομοίως, όλα τα βήματα πρέπει να εκτελούνται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Μην αφήνετε τα δείγματα να στεγνώσουν κατά τη διάρκεια της διαδικασίας χρώσης. Τα ξηρά δείγματα ενδέχεται να εμφανίσουν αυξημένη μη ειδική χρώση. Αν χρησιμοποιούνται παρατεταμένοι χρόνοι επώασης, τοποθετήστε τα δείγματα σε υγρό περιβάλλον. 2.1 Επανυδάτωση δειγμάτων Για όλα τα κυτταρολογικά δείγματα είναι απαραίτητο ένα βήμα επανυδάτωσης πριν τη χρώση. Το βήμα αυτό πρέπει να εκτελείται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (20-25 C). A) Αντικειμενοφόρες κυτταρολογίας υδατικής βάσης ThinPrep & συμβατικά επιχρίσματα Τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρες σε αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό και επωάστε για 10 (±3) λεπτά. Ξεκινήστε τη διαδικασία χρώσης όπως περιγράφεται στην ενότητα 2.2, Βήμα 1: Ανάκτηση επιτόπου. B) Αντικειμενοφόρες κυτταρολογίας BD SurePath Οι αντικειμενοφόρες κυτταρολογίας BD SurePath με μονιμοποίηση αλκοόλης πρέπει να υποβάλλονται σε ειδική διαδικασία επανυδάτωσης ώστε να καθίστανται οι ειδικά επικαλυμμένες γυάλινες αντικειμενοφόρες συμβατές με υγρό μέσο καλυπτρίδας. Βεβαιωθείτε ότι οι αντικειμενοφόρες έχουν στεγνώσει εντελώς στον αέρα. Τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρες σε φρέσκο λουτρό ξυλόλης 100% (χρησιμοποιήστε δοχεία ανθεκτικά στην ξυλόλη). Βυθίστε τις αντικειμενοφόρες μια-δυο φορές και επωάστε επί 2 λεπτά. Μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρες σε φρέσκο λουτρό αιθανόλης 99% και επωάστε επί 2 λεπτά. Μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρες σε φρέσκο λουτρό αιθανόλης 70% και επωάστε επί 2 λεπτά. Μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρες σε αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό και και επωάστε επί 2 λεπτά. Σημείωση: Αντικαθιστάτε τα λουτρά που χρησιμοποιούνται για την επανυδάτωση μετά την επεξεργασία 50 αντικειμενοφόρων ή μια φορά την εβδομάδα εάν γίνεται επεξεργασία μικρότερου αριθμού αντικειμενοφόρων. REF 9531 16 / 49 2009-9531-001EL Rev 2.2

2.2 Ανάκτηση επιτόπου A) Αντικειμενοφόρες κυτταρολογίας υδατικής βάσης ThinPrep & συμβατικά επιχρίσματα: Γεμίστε θερμοανθεκτικά δοχεία χρώσης (πλαστικά) με το αραιωμένο Epitope Retrieval Solution (βλ. Διαδικασία, ενότητα 1.1). Τοποθετήστε δοχεία χρώσης που περιέχουν Epitope Retrieval Solution σε υδατόλουτρο και θερμάνετε το υδατόλουτρο και το Epitope Retrieval Solution στους 95 99 C. Η θερμοκρασία πρέπει να μετρηθεί εντός των δοχείων χρώσης. Είναι σημαντικό να ρυθμίσετε τη στάθμη του νερού στο υδατόλουτρο έτσι ώστε να βεβαιωθείτε ότι τα δοχεία είναι βυθισμένα στο νερό σε επίπεδο 80%. Για να σταθεροποιήσετε τη θερμοκρασία και να αποφύγετε την εξάτμιση, καλύψτε τα δοχεία με καπάκια. Όταν επιτευχθεί η θερμοκρασία των 95 99 C, βυθίστε τις επανυδατωμένες αντικειμενοφόρες κυτταρολογίας στο προθερμασμένο Epitope Retrieval Solution στα δοχεία χρώσης. Το βήμα αυτό συνήθως μειώνει τη θερμοκρασία στα δοχεία σε λιγότερο από 90 C. Αφήστε τον ιχνηθέτη θερμοκρασίας μέσα στα δοχεία και κλείστε το καπάκι όσο το δυνατόν καλύτερα. Αυξήστε και πάλι τη θερμοκρασία του υδατόλουτρου και του Epitope Retrieval Solution μέσα στα δοχεία στους 95 99 C. Ελέγξτε τη θερμοκρασία του Epitope Retrieval Solution στα δοχεία. Επωάστε επί 10 (±1) λεπτά και στους 95 99 C. Ξεκινήστε την αντίστροφη μέτρηση μόνο αφού έχει επαληθευτεί ότι η θερμοκρασία του Epitope Retrieval Solution στα δοχεία έχει φθάσει θερμοκρασία 95 99 C. Βγάλτε όλο το δοχείο με τις αντικειμενοφόρες από το υδατόλουτρο. Βγάλτε το καπάκι από τα δοχεία χρώσης και αφήστε τις αντικειμενοφόρες να κρυώσουν στο Epitope Retrieval Solution επί 20 (±1) λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος μέχρι να φθάσει τους 50 C ή λιγότερο. Μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρες σε δοχείο χρώσης γεμισμένο με Wash Buffer (βλ. Διαδικασία, ενότητα 1.2) και επωάστε επί 5 (±1) λεπτά πριν τη φόρτωση των αντικειμενοφόρων στο προγραμματισμένο όργανο Autostainer. Κατά τη χρήση του Shandon Coverplate System, συναρμολογήστε τις αντικειμενοφόρες με τα καλύμματα σύμφωνα με το Πρωτόκολλο REF 2010-953-009EN (διατίθεται από την Roche mtm laboratories AG). B) Αντικειμενοφόρες κυτταρολογίας BD SurePath Γεμίστε θερμοανθεκτικά δοχεία χρώσης (πλαστικά) με το αραιωμένο Epitope Retrieval Solution (βλ. Διαδικασία, ενότητα 1.1). Σημειώστε ότι όταν χρησιμοποιείτε δοχεία που δεν είναι κατασκευασμένα από θερμοανθεκτικό πλαστικό, αλλά από π.χ. μέταλλο ή θερμοανθεκτικό γυαλί, ο χρόνος της ανάκτησης επιτόπου πρέπει να τροποποιηθεί ανάλογα με την περίπτωση. Βυθίστε τις αντικειμενοφόρες στο κρύο Epitope Retrieval Solution. Κλείστε το καπάκι του δοχείου χρώσης. REF 9531 17 / 49 2009-9531-001EL Rev 2.2

Τοποθετήστε το δοχείο χρώσης σε κρύο υδατόλουτρο και αυξήστε τη θερμοκρασία του υδατόλουτρου και του Epitope Retrieval Solution στους 95 99 C και επωάστε επί 15 λεπτά μόλις επιτευχθεί η θερμοκρασία αυτή. Σημειώστε ότι ο χρόνος για τη θέρμανση του διαλύματος στους 95 99 C δεν πρέπει να είναι μεγαλύτερος από 40 λεπτά κατά μέγιστο. Βγάλτε όλο το δοχείο με τις αντικειμενοφόρες από το υδατόλουτρο. Βγάλτε το καπάκι από τα δοχεία χρώσης και αφήστε τις αντικειμενοφόρες να κρυώσουν στο Epitope Retrieval Solution επί 20 (±1) λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος μέχρι να φθάσει τους 50 C ή λιγότερο. Μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρες σε δοχείο χρώσης γεμισμένο με Wash Buffer (βλ. Διαδικασία, ενότητα 1.2) και επωάστε επί 5 (±1) λεπτά πριν τη φόρτωση των αντικειμενοφόρων στο προγραμματισμένο όργανο Autostainer. Κατά τη χρήση του Shandon Coverplate System, συναρμολογήστε τις αντικειμενοφόρες με τα καλύμματα σύμφωνα με το Πρωτόκολλο REF 2010-953-009EN (διατίθεται από την Roche mtm laboratories AG). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το Epitope Retrieval Solution είναι σχεδιασμένο για χρήση μόνο μίας εφαρμογής. Μην το επαναχρησιμοποιείτε. 2.3 Πρωτόκολλα χρώσης 2.3.1 Πρωτόκολλο χρώσης για όργανα Autostainer (Dako, LabVision) Πριν την πρώτη εφαρμογή του CINtec PLUS Kit σε όργανο Autostainer, πρέπει να διαμορφωθεί νέο πρότυπο και χρειάζεται να προστεθούν τα αντιδραστήρια του CINtec PLUS Kit στη λίστα αντιδραστηρίων ("Reagent List") του Autostainer. Ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο χρήσης του συγκεκριμένου οργάνου Autostainer. Συνιστάται η χρήση 200 µl ανά αντικειμενοφόρο για την επεξεργασία κυτταρολογικών παρασκευασμάτων ThinPrep ή BD SurePath. Για συμβατικά επιχρίσματα σε όργανα Dako ή LabVision Autostainer, ενδέχεται να απαιτείται η χρήση 300 µl αντιδραστηρίων ανά αντικειμενοφόρο. REF 9531 18 / 49 2009-9531-001EL Rev 2.2

Ακολουθεί μια σκιαγράφηση του κύκλου προγράμματος: Βήμα ThinPrep κυτταρολογικά Κυτταρολογικά προγράμματος παρασκευάσματα & συμβατικά επιχρίσματα παρασκευάσματα BD Surepath 1 ξέπλυμα* ξέπλυμα* 2 Peroxidase-Blocking Reagent 5 λεπτά 3 ξέπλυμα* ξέπλυμα* 4 Primary Antibodies Solution 30 λεπτά 5 ξέπλυμα* ξέπλυμα* 6 Visualization Reagent HRP 15 λεπτά 7 ξέπλυμα* ξέπλυμα* 8 ξέπλυμα* ξέπλυμα* Peroxidase-Blocking Reagent 5 λεπτά Primary Antibodies Solution 30 λεπτά Visualization Reagent HRP 15 λεπτά 9 ξέπλυμα* ξέπλυμα* 10 Visualization Reagent AP Visualization Reagent AP 15 λεπτά 15 λεπτά 11 ξέπλυμα* ξέπλυμα* 12 ξέπλυμα* ξέπλυμα* 13 ξέπλυμα* ξέπλυμα* 14 αλλαγή αλλαγή 15 Βήμα "Substrate" (υπόστρωμα): DAB 10 λεπτά Βήμα "Substrate" (υπόστρωμα): DAB 10 λεπτά 16 ξέπλυμα με αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό ξέπλυμα με αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό 17 ξέπλυμα* ξέπλυμα* 18 Βήμα "Substrate-batch" (υπόστρωμα-παρτίδα): Fast Red 15 λεπτά Βήμα "Substrate-batch" (υπόστρωμα-παρτίδα): Fast Red 15 λεπτά 19 ξέπλυμα* ξέπλυμα* 20 --- Για LabVision Autostainer: Βήμα "Substrate-batch" (υπόστρωμα-παρτίδα): Fast Red 15 λεπτά Για Dako Autostainer: Βήμα "Substrate" (υπόστρωμα): Fast Red 15 λεπτά 21 ---- ξέπλυμα* 22 ξέπλυμα με αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό 23 αλλαγή αλλαγή ξέπλυμα με αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό *χρησιμοποιήστε Wash Buffer για τα αντίστοιχα βήματα ξεπλύματος. REF 9531 19 / 49 2009-9531-001EL Rev 2.2

ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αν το όργανο Autostainer που χρησιμοποιείται για τη διαδικασία χρώσης ξεπλένει τις αντικειμενοφόρες με ρυθμιστικό διάλυμα, οι αντικειμενοφόρες πρέπει να ξεπλυθούν με αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό αφού βγουν από το Autostainer. Μετά από την εκτέλεση του προγράμματος, συνεχίστε ως εξής: Μεταφέρετε τα αντιδραστήρια από τις φιάλες του κιτ στα φιαλίδια αντιδραστηρίων Autostainer. Χρησιμοποιήστε το διάγραμμα που δημιουργεί το Autostainer για τους χρόνους προγράμματος και τους όγκους αντιδραστηρίων. Τοποθετήστε τα φιαλίδια αντιδραστηρίων Autostainer στο στατό αντιδραστηρίων Autostainer σύμφωνα με το "Reagent Layout Map" (Διάγραμμα διάταξης αντιδραστηρίων). Φορτώστε τις αντικειμενοφόρες στο Autostainer σύμφωνα με το "Slide Layout Map" (Διάγραμμα διάταξης αντικειμενοφόρων) και ξεπλύνετε τις αντικειμενοφόρες με το Wash Buffer για να αποτρέψετε το στέγνωμα του δείγματος. 2.3.2 Πρωτόκολλο χρώσης για το Shandon Coverplate System Συναρμολογήστε τις αντικειμενοφόρες μία - μία με καλύμματα σύμφωνα με το Πρωτόκολλο REF 2010-953-009EN (διατίθεται από την Roche mtm laboratories AG) και τοποθετήστε τις σε όρθια θέση στο στατό αντικειμενοφόρων. Ελέγξτε τη σωστή συναρμολόγηση του Shandon Coverplate System γεμίζοντας τη δεξαμενή αντιδραστηρίου με αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό (2 ml) και επωάστε επί 5 λεπτά ώστε να αφήσετε το νερό να τρέξει εντελώς μέσα από το κενό. Το συναρμολογημένο σύστημα αντικειμενοφόρου-καλύμματος είναι υδατοστεγές όταν το νερό τρέχει αργά διαμέσου του κενού ανάμεσα στην αντικειμενοφόρο και το κάλυμμα. 1. Εξισορρόπηση: Γεμίστε τη δεξαμενή αντιδραστηρίου με Wash Buffer (2 ml) και επωάστε επί 5 λεπτά ώστε να αφήσετε το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης να τρέξει εντελώς μέσα από το κενό. Επαναλάβετε το βήμα αυτό μία φορά. 2. Εφαρμόστε 200 µl Peroxidase Blocking Reagent. Επωάστε επί 5 λεπτά. 3. Γεμίστε τη δεξαμενή αντιδραστηρίου με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (2 ml) και επωάστε επί 5 λεπτά ώστε να αφήσετε το Wash Buffer να τρέξει εντελώς μέσα από το κενό. 4. Εφαρμόστε 200 µl Primary Antibodies Solution (p16 INK4a /Ki-67. Επωάστε επί 30 λεπτά. 5. Γεμίστε τη δεξαμενή αντιδραστηρίου με Wash Buffer (2 ml) και επωάστε επί 5 λεπτά ώστε να αφήσετε το Wash Buffer να τρέξει εντελώς μέσα από το κενό. 6. Εφαρμόστε 200 µl Visualization Reagent HRP. Επωάστε επί 15 λεπτά. REF 9531 20 / 49 2009-9531-001EL Rev 2.2

7. Γεμίστε τη δεξαμενή αντιδραστηρίου με Wash Buffer (2 ml) και επωάστε επί 5 λεπτά ώστε να αφήσετε το Wash Buffer να τρέξει εντελώς μέσα από το κενό. Επαναλάβετε το βήμα αυτό δύο φορές. 8. Εφαρμόστε 200 µl Visualization Reagent AP. Επωάστε επί 15 λεπτά. 9. Γεμίστε τη δεξαμενή αντιδραστηρίου με Wash Buffer (2 ml) και επωάστε επί 5 λεπτά ώστε να αφήσετε το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης να τρέξει εντελώς μέσα από το κενό. 10. Επαναλάβετε το βήμα αυτό δύο φορές. 10. Εφαρμόστε 200 μl διαλύματος εργασίας υποστρώματος-χρωμογόνου DAB που έχει παρασκευαστεί σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται στην ενότητα 1.3 παραπάνω. Επωάστε επί 10 λεπτά. 11. Γεμίστε τη δεξαμενή αντιδραστηρίου με αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό (2 ml) και επωάστε επί 5 λεπτά ώστε να αφήσετε το νερό να τρέξει εντελώς μέσα από το κενό. 12. Γεμίστε τη δεξαμενή αντιδραστηρίου με Wash Buffer (2 ml) και επωάστε επί 5 λεπτά ώστε να αφήσετε το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης να τρέξει εντελώς μέσα από το κενό. 13. Εφαρμόστε 200 μl διαλύματος εργασίας υποστρώματος-χρωμογόνου Fast Red που έχει παρασκευαστεί σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται στην ενότητα 1.3 παραπάνω. Επωάστε επί 15 λεπτά. Σημείωση: Για παρασκευάσματα αντικειμενοφόρων BD SurePath, το βήμα αυτό πρέπει να επαναληφθεί μία φορά. 14. Γεμίστε τη δεξαμενή αντιδραστηρίου με αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό (2 ml) και επωάστε επί 5 λεπτά ώστε να αφήσετε το νερό να τρέξει εντελώς μέσα από το κενό. Επαναλάβετε το βήμα αυτό μία φορά. Για ανάκτηση των αντικειμενοφόρων, τραβήξτε απαλά όλο το συναρμολόγημα αντικειμενοφόρου/καλύμματος και βγάλτε το από το στατό αντικειμενοφόρων χρησιμοποιώντας τον αντίχειρα και τον δείκτη σας στο πίσω μέρος και κατόπιν ανασηκώστε απαλά την αντικειμενοφόρο και αποχωρίστε την από το κάλυμμα. Η διαδικασία αυτή διεξάγεται ιδανικά με τα στοιχεία βυθισμένα σε νερό. Τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρες σε αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό και συνεχίστε περαιτέρω με την αντίχρωση. REF 9531 21 / 49 2009-9531-001EL Rev 2.2