Ρόλος του πυρηνικού υποδοχέα HNF-4α στην έκφραση γονιδίων του ήπατος

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Ρόλος του πυρηνικού υποδοχέα HNF-4α στην έκφραση γονιδίων του ήπατος ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΕΛΕΝΗ ΑΓΓΕΛΙΔΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2005

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 ΠΥΡΗΝΙΚΟΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ 1 1.1.1 Κατάταξη των πυρηνικών υποδοχέων 1 1.1.2 Δομή των πυρηνικών υποδοχέων 3 1.1.3 Το μοντέλο της ποντικοπαγίδας 6 1.1.4 Μηχανισμός δράσης των πυρηνικών υποδοχέων 9 1.2 Ο ΠΥΡΗΝΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΤΩΝ ΗΠΑΤΟΚΥΤΤΑΡΩΝ HNF-4 10 1.2.1 Δομή του HNF-4 11 1.2.2 Πρόσδεση του HNF-4α στο DNA 13 1.2.3 HNF-4 ακετυλίωση και φωσφορυλίωση 14 1.2.4 HNF-4α: Ισομορφές και ιστολογική κατανομή 14 1.2.5 Ο ρόλος του HNF-4α στην ανάπτυξη 17 1.2.6 Κρυσταλλική δομή του HNF-4 18 1.2.7 Γονίδια-στόχοι του HNF-4α 21 1.3 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ 23 1.3.1 Τροποποίηση της χρωματίνης 26 1.3.1.1 ATP-εξαρτώμενα σύμπλοκα αναδιάταξης της χρωματίνης 27 1.3.1.2 Ακετυλoτρανσφεράσες των ιστονών (HATs) 28 1.3.1.3 Αναδιοργάνωση της χρωματίνης και HAT σύμπλοκα 29 1.4 ΣΥΝΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΕΣ ΤΩΝ ΠΥΡΗΝΙΚΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ 30 1.4.1 Η οικογένεια SRC 31 1.4.1.1 To LXXLL μοτίβο 34 1.4.2 PGC-1 36 1.4.3 Συνενεργοποιητές και HNF-4α 37 1.5 ΑΠΟΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΕΣ 39 1.5.1 Απολιποπρωτεΐνες και HNF-4 40 1.5.2 ΑpοCIII 41 Σκοπός της εργασίας 42 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ 44 2.1.1 Εισαγωγή σημειακών μεταλλάξεων με PCR 44 ii

2.1.2 Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 50 2.1.3 Καθαρισμός των προϊόντων της PCR με φαινόλη/χλωροφόρμιο 51 2.1.4 Πέψεις των προϊόντων της PCR με ένζυμα περιορισμού 51 2.1.5 Αποφωσφορυλίωση των προϊόντων της PCR 52 2.1.6 Καθαρισμός των προϊόντων της PCR με τη χρήση του QIAquick kit (Qiagen) 53 2.1.7 Ανασυνδυασμός των προϊόντων της PCR στον πλασμιδιακό φορέα (ligation) 54 2.2 ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 55 2.2.1 Παρασκευή «ικανών» για μετασχηματισμό βακτηριακών κυττάρων (competent cells) 55 2.2.2 Μετασχηματισμός βακτηριακών κυττάρων (transformation) 56 2.3 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΟΥ DNA ΑΠΟ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ (plasmid preparation) 57 2.3.1 Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μεγάλης κλίμακας (Qiagen Maxi Prep System) 57 2.3.2 Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μικρής κλίμακας (microscreening) 58 2.3.3 Προσδιορισμός της συγκέντρωσης του DNA 59 2.4 ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 59 2.4.1 Κυτταρικές σειρές 59 2.4.2 Παροδική επιμόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων 60 2.5 ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ 61 2.5.1 Προετοιμασία ολικών κυτταρικών εκχυλισμάτων 61 2.5.2 Προετοιμασία πυρηνικών εκχυλισμάτων 62 2.6 ΕΛΕΓΧΟΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ 63 2.6.1 Αντίδραση β-γαλακτοσιδάσης (β-gal assay) 63 2.6.2 CAT assay 63 2.7 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ SDS-ΠΗΚΤΩΜΑ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ 64 2.8 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ (blotting) 66 2.9 ΑΝΟΣΟΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ (immunoblotting) 67 2.10 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΗ ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΤΗΣ ΚΙΝΗΤΙΚΟΤΗΤΑΣ (Electrophoretic Mobility Shift Assay-EMSA) 68 2.10.1 Υβριδισμός των ολιγονουκλεοτιδίων για το σχηματισμό δίκλωνου iii

DNA (annealing of probe) 68 2.10.2 Σήμανση του δίκλωνου ολιγονουκλεοτιδίου με ραδιενεργό φώσφορο (γ- 32 P-ATP) 69 2.10.3 Αντιδράσεις αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών-dna 70 2.11 ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΕΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ (GST-pull downs) 71 2.11.1 Επαγωγή έκφρασης της GST υβριδικής πρωτεΐνης (GST fusion protein) και δέσμευσή της σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-αγαρόζης 71 2.11.2 Αντιδράσεις αλληλεπίδρασης μεταξύ των πρωτεϊνών 73 2.12 ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ (co-immunoprecipitation) 74 2.12.1 Προετοιμασία δειγμάτων 74 2.12.2 Αντιδράσεις ανοσοκατακρήμνισης 75 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ HNF-4α ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΣΗΜΕΙΑΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΣΤΗΝ ΚΟΙΛΟΤΗΤΑ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΤΟΥ ΣΥΝΔΕΤΗ (ΕΛΙΚΕΣ 3, 4 ΚΑΙ 5) ΤΗΣ LBD ΠΕΡΙΟΧΗΣ 76 3.1.1 Εισαγωγή της LBD περιοχής του HNF-4α με τις σημειακές μεταλλάξεις στις έλικες 3, 4 και 5 στο GAL-4 DBD και μελέτη της μεταγραφικής ενεργότητας των υβριδικών μορίων (pcmxgal-lbd HNF-4α) 76 3.1.2 Εισαγωγή της LBD περιοχής με τις σημειακές μεταλλάξεις στις έλικες 3 και 5 σε ολόκληρο το μόριο του HNF-4α και μελέτη της μεταγραφικής ενεργότητας των μορίων (pcdna3.1-lbd HNF-4α) 85 3.1.2.1 Επίδραση των σημειακών μεταλλάξεων στις έλικες 3 και 5 της LBD περιοχής στην ικανότητα του HNF-4α για πρόσδεση στο DNA και διμερισμό 87 3.2 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΣΥΝΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΩΝ ΣΤΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑ ΤΟΥ HNF-4α ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΣΗΜΕΙΑΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΣΤΗΝ ΚΟΙΛΟΤΗΤΑ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΤΟΥ ΣΥΝΔΕΤΗ (ΕΛΙΚΕΣ 3, 4 ΚΑΙ 5) 92 3.2.1 Επίδραση των συνενεργοποιητών στη μεταγραφική ενεργότητα των χιμαιρικών μορίων pcmxgal-lbd HNF-4α 94 3.2.2 Επίδραση των συνενεργοποιητών στη μεταγραφική ενεργότητα iv

των μορίων pcdna3.1-lbd HNF-4α 96 3.3 ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΕΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΤΟΥ HNF-4α ΜΕ ΤΟ ΣΥΝΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΗ PGC-1 99 3.4 ΜΕΛΕΤΗ ΣΗΜΕΙΑΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΣΤΟΥΣ 2 ΠΥΡΗΝΕΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΗΣ AF-2 ΠΕΡΙΟΧΗΣ: D ΚΑΙ AF-2 AD ΠΕΡΙΟΧΕΣ 100 3.4.1 Επίδραση των σημειακών μεταλλάξεων της D και AF-2AD περιοχής στην ικανότητα του HNF-4α για πρόσδεση στο DNA και διμερισμό 102 3.4.2 Επίδραση των σημειακών μεταλλάξεων της D και AF-2AD περιοχής στη μεταγραφική ενεργότητα του HNF-4α 104 3.5 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΣΗΜΕΙΑΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΣΤΗΝ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ ΔΙΜΕΡΙΣΜΟΥ (ΕΛΙΚΕΣ 7, 9 ΚΑΙ 10) ΤΗΣ LBD ΠΕΡΙΟΧΗΣ ΤΟΥ HNF-4α ΓΙΑ ΠΡΟΣΔΕΣΗ ΣΤΟ DNA ΚΑΙ ΔΙΜΕΡΙΣΜΟ 111 3.5.1 Επίδραση διαφόρων σημειακών μεταλλάξεων στις έλικες 7, 9 και 10 της LBD περιοχής του HNF-4α στην ικανότητα πρόσδεσης και διμερισμού του μορίου 113 3.5.2 Επίδραση διαφόρων σημειακών μεταλλάξεων στις έλικες 7, 9 και 10 της LBD περιοχής του HNF-4α στην ικανότητα διμερισμού του μορίου in vivo 117 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 121 4.1 ΜΕΛΕΤΗ ΣΗΜΕΙΑΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΣΤΗΝ ΚΟΙΛΟΤΗΤΑ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΤΟΥ ΣΥΝΔΕΤΗ (ΕΛΙΚΕΣ 3, 4 ΚΑΙ 5) ΤΗΣ LBD ΠΕΡΙΟΧΗΣ 123 4.2 ΜΕΛΕΤΗ ΣΗΜΕΙΑΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΣΤΗΝ ΚΟΙΛΟΤΗΤΑ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΤΟΥ ΣΥΝΔΕΤΗ (ΕΛΙΚΕΣ 3, 4 ΚΑΙ 5) ΤΗΣ LBD ΠΕΡΙΟΧΗΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΣΥΝΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΩΝ 132 4.3 ΜΕΛΕΤΗ ΣΗΜΕΙΑΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΣΤΟΥΣ 2 ΠΥΡΗΝΕΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΗΣ AF-2 ΠΕΡΙΟΧΗΣ: D ΚΑΙ AF-2AD ΠΕΡΙΟΧΗ 138 4.4 ΜΕΛΕΤΗ ΣΗΜΕΙΑΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΣΤΗΝ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ ΔΙΜΕΡΙΣΜΟΥ (ΕΛΙΚΕΣ 7, 9 ΚΑΙ 10) ΤΗΣ LBD ΠΕΡΙΟΧΗΣ 142 5. ΠΕΡΙΛΗΨΗ 147 6. ABSTRACT 149 7. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 151 v

ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΕΙΚΟΝΩΝ ΚΑΙ ΠΙΝΑΚΩΝ Εικόνα 1 2 Εικόνα 2 3 Εικόνα 3 7 Εικόνα 4 10 Εικόνα 5 16 Εικόνα 6 20 Εικόνα 7 21 Εικόνα 8 25 Εικόνα 9 27 Εικόνα 10 32 Εικόνα 11 33 Εικόνα 12 35 Εικόνα 13 37 Εικόνα 14 42 Εικόνα 15 45 Εικόνα 16 77 Εικόνα 17 80 Εικόνα 18 81 Εικόνα 19 82 Εικόνα 20 83 Εικόνα 21 84 Εικόνα 22 86 Εικόνα 23 88 Εικόνα 24 90 Εικόνα 25 91 Εικόνα 26 93 Εικόνα 27 95 Εικόνα 28 97 Εικόνα 29 98 Εικόνα 30 101 Εικόνα 31 103 Εικόνα 32 105 Εικόνα 33 106 vi

Εικόνα 34 107 Εικόνα 35 109 Εικόνα 36 110 Εικόνα 37 112 Εικόνα 38 114 Εικόνα 39 115 Εικόνα 40 116 Εικόνα 41 118 Εικόνα 42 120 Εικόνα 43 127 Εικόνα 44 128 Εικόνα 45 131 Πίνακας 1 47 Πίνακας 2 48 Πίνακας 3 49 vii

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την καθηγήτριά μου Μαργαρίτα Χατζοπούλου- Κλαδάρα για την ευκαιρία που μου έδωσε να δουλέψω και να μάθω στο εργαστήριό της, καθώς και για τη συμπαράσταση και καθοδήγηση όλα αυτά τα χρόνια. Ευχαριστώ πολύ τα μέλη της Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής, τους Αναπληρωτές καθηγητές Μηνά Γιάγκου και Δημήτρη Καρδάση για τη βοήθειά τους και την επικοδομητική συνεργασία όλα αυτά τα χρόνια. Ευχαριστώ επίσης τους καθηγητές Ζαχαρία Σκούρα, Μηνά Αρσενάκη, Αντιγόνη Λάζου καθώς και τους Επίκουρους καθηγητές Θάνο Παπαδόπουλο, Αφροδίτη Σιβροπούλου και Αθηνά Φουντούλη για τη χρήση οργάνων και συσκευών. Θα ήθελα ακόμη να ευχαριστήσω όλα τα άτομα που γνώρισα στο εργαστήριο για τη βοήθεια και την ευχάριστη συμβίωση στον εργαστηριακό χώρο. Ιδιαίτερα θέλω να ευχαριστήσω την συνεργάτιδά μου, Νάγια Ιορδανίδου, με την οποία μοιράστηκα τις ανησυχίες μου και τους προβληματισμούς μου όλα αυτά τα χρόνια καθώς και άπειρες ώρες δουλειάς. Ευχαριστώ επίσης τον υποψήφιο διδάκτορα, Τάσο Αλατζά, που είχαμε μια άψογη συνεργασία και συμβιώσαμε στον ίδιο εργαστηριακό χώρο όλα αυτά τα χρόνια. Σας ευχαριστώ όλους πολύ. Πάνω απ όλους, είμαι ευγνώμων και θέλω να ευχαριστήσω μέσα απο την καρδιά μου την οικογένειά μου που είναι πάντα δίπλα μου και με στηρίζει τις πιο δύσκολες στιγμές βοηθώντας με να συνεχίζω να προσπαθώ και να πιστεύω στον εαυτό μου. Τους ευχαριστώ που είναι κοντά μου κάθε στιγμή. Αφιερώνω τη διατριβή αυτή στη μητέρα μου και την αδελφή μου. Θεσσαλονίκη, Μάϊος 2005 viii

ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ AF-1/2: Activation Function 1/2 ApoCIII: Apolipoprotein CIII CAT: Chloramphenicol Acetyl Transferase CBP: CREB Binding Protein COUP-TFI/II: Chicken Ovalbumin Upstream Promoter-Transcription Factor I/II CTE: Carboxy Terminal Extention DBD: DNA Binding Domain DR: Direct Repeat DRIP: vitamin D Receptor Interacting Protein ER: Estrogen Receptor GR: Glucocorticoid Receptor GRIP-1: Glucocorticoid Receptor Interacting Protein-1 HAT: Histone Acetyltransferase HDAC: Histone Deacetylase HDL: High Density Lipoprotein HLH: Helix-Loop-Helix HNF-4: Hepatocyte Nuclear Factor 4 HRE: Hormone Response Element LBD: Ligand Binding Domain LBP: Ligand Binding Pocket LDL: Low Density Lipoprotein LXR: Liver X Receptor MODY: Maturity Onset Diabetes of the Young NGFI-B: Nerve Growth Factor Induced gene OTC: Ornithine Transcarbamylase PEPCK: Phosphoenolpyruvate Carboxykinase PGC-1: PPAR gamma Coactivator PPAR: Peroxisome Proliferator-Activated Receptor RAR: Retinoid Acid Receptor RID: Receptor Interacting Domain RXR: Retinoid X Receptor SF1: Steroidogenic Factor 1 ix

SHP: Short Heterodimer Partner SMRT: Silencing Mediator of Retinoid and Thyroid Hormone Receptor SRC: Steroid Receptor Coactivator SWI/SNF: Switch/Sucrose non-fermentable TAT: Tyrosine Amino Transferase TBP: TATA Binding Protein TF: Transcription Factor TR: Thyroid Receptor TRAP: Thyroid Receptor Associated Protein β-gal: β-galactosidase x

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 ΠΥΡΗΝΙΚΟΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ Η υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων περιλαμβάνει περισσότερες απο 150 διαφορετικές πρωτεΐνες, που λειτουργούν ως μεταγραφικοί παράγοντες διαδραματίζοντας σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση διαφόρων βιολογικών λειτουργιών όπως η ανάπτυξη, η διαφοροποίηση, η αναπαραγωγή, ο μεταβολισμός και η ομοιόσταση (Beato et al., 1995, Kastner et al., 1995, Chambon 1996, Aranda and Pascual, 2001, Giguere, 1999). Η μεταγραφική ενεργότητα των περισσότερων πυρηνικών υποδοχέων εξαρτάται απο την πρόσδεση ενός μικρού, λιπόφιλου μορίου, ενός συνδέτη δηλαδή, με αποτέλεσμα να ρυθμίζεται η έκφραση των γονιδίωνστόχων (Steinmetz et al., 2001). Η πρόσδεση του συνδέτη είναι καθοριστική γιατί έχει ως αποτέλεσμα να στρατολογούνται άλλες πρωτεΐνες, όπως είναι οι συνενεργοποιητές, που οδηγούν στην ενεργοποίηση της μεταγραφής των γονιδίων. (McKenna and O Malley, 2002, Torchia et al., 1998, Dilworth and Chambon, 2001). Υπάρχουν όμως και κάποιοι πυρηνικοί υποδοχείς η ενεργότητα των οποίων δεν εξαρτάται απο την παρουσία ενός συνδέτη, αλλά η λειτουργία τους ρυθμίζεται μεταμεταφραστικά, μέσω φωσφορυλίωσης ή ακετυλίωσης ή τέλος μέσω πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων με άλλους πυρηνικούς υποδοχείς (Mangelsdorf and Evans, 1995a, Hermanson et al., 2002). Παράλληλα, στην κατηγορία των πυρηνικών υποδοχέων ανήκουν και οι λεγόμενοι «ορφανοί» υποδοχείς για τους οποίους δεν έχει βρεθεί ακόμη συνδέτης (Chawla et al., 2001). Σε αυτήν την κατηγορία ανήκει και ο HNF-4. 1.1.1 Κατάταξη των πυρηνικών υποδοχέων Οι πυρηνικοί υποδοχείς μπορούν να ομαδοποιηθούν με βάση τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό τους και τη δυνατότητά τους να διμερίζονται και να προσδένονται στο DNA (Jiang et al., 1995, Εικ.1). Στην πρώτη ομάδα ανήκουν οι υποδοχείς, οι οποίοι βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα απουσία συνδέτη, ενώ παρουσία του συνδέτη απελευθερώνονται απο τις πρωτεΐνες θερμικού πλήγματος (heat shock proteins) εισέρχονται στον πυρήνα και προσδένονται ως ομοδιμερή σε παλίνδρομες ακολουθίες του DNA. Στην ομάδα αυτή περιλαμβάνονται οι υποδοχείς των στεροειδών ορμονών, οπώς είναι τα ανδρογόνα, τα οιστρογόνα, η προγεστερόνη και τα γλυκοκορτικοειδή. 1

Στη δεύτερη ομάδα ανήκουν οι υποδοχείς, οι οποίοι βρίσκονται στον πυρήνα ακόμη και απουσία συνδέτη, ενώ παρουσία του συνδέτη προσδένονται στο DNA είτε ως ομοδιμερή, είτε ως ετεροδιμερή, είτε ως μονομερή αναγνωρίζοντας παλίνδρομες ή ευθείες επαναλήψεις. Τα περισσότερα ετεροδιμερή σχηματίζονται με τον ρετινοειδικό υποδοχέα Χ (Retinoid X receptor, RXR) χωρίς αυτό να αποκλείει την ύπαρξη εναλλακτικών ετεροδιμερικών αλληλεπιδράσεων. Στην ομάδα αυτή ανήκουν υποδοχείς των ρετινοειδών, της θυρεοειδούς ορμόνης, της βιταμίνης D και της εκδυσόνης. Στην τρίτη ομάδα ανήκουν οι υποδοχείς, οι οποίοι προσδένονται στο DNA ως μονομερή και περιλαμβάνει τους υποδοχείς NGFI-B (nerve growth factor induced gene) και SF1 (steroidogenic factor-1). Τέλος στην τέταρτη ομάδα ανήκουν οι υποδοχείς, οι οποίοι προσδένονται στο DNA αποκλειστικά ως ομοδιμερή αναγνωρίζοντας ευθείες επαναλήψεις. Σε αυτήν την κατηγορία εντάσσονται οι υποδοχείς HNF-4α, HNF-4β και HNF-4γ. Εικ.1. Η υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων. Απεικόνιση των τεσσάρων ομάδων των πυρηνικών υποδοχέων με βάση τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό τους, την ικανότητα να διμερίζονται και να προσδένονται στο DNA. Οι υποπεριοχές του DNA που προσδένονται οι υποδοχείς μπορεί να είναι ευθείες, παλίνδρομες ή ανεστραμμένες επαναλήψεις που διαχωρίζονται απο 1 εως 5 νουκλεοτίδια (Jiang et al., 1995). Fig.1. Nuclear receptor subfamilies. Receptors are grouped according to subcellular localization, dimerization potential and DNA-binding specificity. Binding sites are depicted by orientation as direct, palindromes or inverted repeats spaced by 1 to 5 nucleotides. 2

1.1.2 Δομή των πυρηνικών υποδοχέων Οι πυρηνικοί υποδοχείς αποτελούνται απο έξι λειτουργικά διακριτές περιοχές (Εικ.2): μία μεταβλητή αμινοτελική περιοχή (Α/Β περιοχή), μία διατηρημένη περιοχή πρόσδεσης στο DNA (C περιοχή), μία συνδετική περιοχή (D περιοχή), μία καλά διατηρημένη περιοχή που αποτελεί και την περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη (E περιοχή) και μία καρβοξυτελική περιοχή (περιοχή F). Εικ.2. Σχηματική απεικόνιση της δομικής και λειτουργικής οργάνωσης των πυρηνικών υποδοχέων. Η περιοχή Α/Β περιέχει την AF-1 περιοχή μεταγραφικής ενεργοποίησης, η C περιοχή είναι υπεύθυνη για την πρόσδεση του υποδοχέα στο DNA, η D αποτελεί το σύνδεσμο ανάμεσα στις περιοχές C και E, η E είναι η περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη και περικλείει την περιοχή μεταγραφικής ενεργοποίησης AF-2. Στο καρβοξυτελικό άκρο της AF-2 εντοπίζεται η καλά διατηρημένη περιοχή AF-2AD (Aranda and Pascual, 2001). Fig.2. Schematic representation of structural and functional organisation of nuclear receptors. The A/B region contains the AF-1 transactivation domain. The C region is responsible for the recognition of specific DNA sequences. The D region connects the DBD to E region that contains the ligand binding domain (LBD) and the transactivation domain AF-2. Within the COOH-terminal portion of the AF-2 is present a conserved region termed AF-2AD. Πιο αναλυτικά, σε σχέση με τις άλλες περιοχές η Α/Β περιοχή παρουσιάζει τη μεγαλύτερη ποικιλία τόσο ως προς το μήκος όσο και ως προς την πρωτοταγή ακολουθία. Οι ισομορφές υποδοχέων που προκύπτουν απο ένα γονίδιο είτε με εναλλακτική συρραφή, είτε χρησιμοποιώντας εναλλακτικούς υποκινητές παρουσιάζουν ποικιλομορφία σε αυτήν την περιοχή (Chambon, 1996). Χαρακτηριστικό της Α/Β ειναι η παρουσία μιας αυτόνομης περιοχής μεταγραφικής ενεργοποίησης AF-1 (Activation Function 1), η οποία είναι υπεύθυνη για την ενεργοποίηση του υποδοχέα απουσία συνδέτη και στην οποία μπορούν και προσδένονται συνενεργοποιητές της μεταγραφής (McKenna and O Malley, 2002). 3

Επιπλέον, η ενεργότητα της περιοχής αυτής φαίνεται να εξαρτάται τόσο απο τον υποκινητή όσο και απο τον κυτταρικό τύπο προτείνοντας ότι πιθανόν συμβάλλει στην εξειδίκευση της δράσης μεταξύ των ισομορφών των υποδοχέων αλληλεπιδρώντας με κυτταροειδικούς συμπαράγοντες (Tora et al., 1988, Berry et al., 1990). Απο την άλλη μεριά, η περιοχή αυτή αποτελεί στόχο για φωσφορυλίωση μέσα απο διαφορετικά μονοπάτια σηματοδότησης και αυτή η τροποποίηση μπορεί να επηρεάζει σημαντικά τη μεταγραφική ενεργότητα είτε επειδή επηρεάζει την πρόσδεση του συνδέτη στον υποδοχέα είτε τη συγγένεια της πρόσδεσης του υποδοχέα στο DNA (Shao and Lazar, 1999) καθώς επίσης και την πρόσδεση των συνενεργοποιητών (Tremblay et al.,1999). Η C περιοχή (DNA-binding domain, DBD) είναι η πιο καλά διατηρημένη περιοχή μεταξύ των πυρηνικών υποδοχέων. Αποτελείται απο δύο δακτύλιους ψευδαργύρου που εκτείνονται κατά 60-70 αμινοξέα και μία καρβοξυτελική επέκταση (Carboxy Terminal Extention, CTE). Σε κάθε δακτύλιο ψευδαργύρου 4 μόρια κυστεΐνης συνδέονται τετραεδρικά με ένα ιόν ψευδαργύρου ενώ οι εννέα συνολικά, εξελικτικά διατηρημένες, κυστεΐνες που περιέχονται στην DBD περιοχή απαιτούνται για ισχυρή πρόσδεση στο DNA. Στον πρώτο δακτύλιο ψευδαργύρου εντοπίζεται το «κουτί P» που είναι απαραίτητο για την αναγνώριση των κατάλληλων μοτίβων στο DNA, ενώ το «κουτί D» που εντοπίζεται στο δεύτερο δακτύλιο ψευδαργύρου είναι απαραίτητο για το σχηματισμό ομοδιμερών. Η CTE περιοχή περιλαμβάνει τα «κουτιά Α και Τ» (Α,Τ boxes). Το «κουτί Α» έρχεται σε επαφή με τη μικρή αύλακα του DNA, ενώ το «κουτί Τ» είναι σημαντικό για την πρόσδεση των διμερών στο DNA (Mangelsdorf and Evans, 1995a). Οι δακτύλιοι ψευδαργύρου είναι αυτοί που φέρουν την ικανότητα να αναγνωρίζουν ειδικές ακολουθίες στο DNA (Hormone Response Elements, HRE, Evans, 1988). Ένα στοιχείο ορμονικής απόκρισης (HRE) αποτελείται απο 6 ζεύγη βάσεων. Δύο ομόφωνα μοτίβα έχουν αναγνωριστεί: η αλληλουχία AGAACA αναγνωρίζεται κυρίως απο τους στεροειδικούς υποδοχείς ενώ η αλληλουχία AGG/TTCA αποτελεί μοτίβο αναγνώρισης για τους υπόλοιπους υποδοχείς (Glass, 1994). Οι πυρηνικοί υποδοχείς προσδένονται στα HRE είτε ως μονομερή είτε ως διμερή και ρυθμίζουν τη μεταγραφή. Κάποιοι μονομερείς υποδοχείς μπορούν να συνδεθούν σε ένα μόνο εξαμερές μοτίβο αν και οι περισσότεροι υποδοχείς προσδένονται ως ομοδιμερή ή ετεροδιμερή στα HRE που αποτελούνται απο δύο εξαμερή μοτίβα. Στα διμερή HREs οι υποπεριοχές μπορεί να είναι ευθείες, 4

παλίνδρομες ή ανεστραμμένες επαναλήψεις. Οι στεροειδικοί υποδοχείς αναγνωρίζουν αποκλειστικά παλίνδρομα στοιχεία, τα οποία διαχωρίζονται απο τρία νουκλεοτίδια, ενώ οι μη στεροειδικοί υποδοχείς μπορούν και προσδένονται σε HRE με διαφορετικές στεροδιατάξεις, κυρίως όμως σε ευθείες επαναλήψεις (Direct Repeats, DR) που διαχωρίζονται από ένα ως πέντε νουκλεοτίδια (DR1-5) (Mangelsdorf and Evans, 1995a). Επιπλέον, μελέτες που έχουν γίνει σε ένα μεγάλο αριθμό πυρηνικών υποδοχέων έδειξαν πως πέρα απο τον προσανατολισμό των μοτίβων υπάρχουν και κάποια άλλα στοιχεία που χαρακτηρίζουν τα HRE, όπως είναι οι μικρές διαφορές στην αλληλουχία των υπομονάδων, η απόσταση μεταξύ των υπομονάδων, καθώς και η αλληλουχία των γειτονικών αμινοξέων των υπομονάδων που είναι σημαντικά καθoρίζοντας την ικανότητα πρόσδεσης του υποδοχέα στο DNA καθώς και την ορμονική απόκριση (Mader et al., 1993). Τέλος, τα κουτιά Α και Τ εξαιτίας της εκτεταμένης επαφής με το DNA που προσφέρουν, επεκτείνουν ουσιαστικά την επιφάνειες επαφής του DBD πέρα απο το HRE με αποτέλεσμα ο υποδοχέας να πραγματοποιεί περισσότερες επαφές με το DNA, γεγονός που συμβάλει στην εξειδίκευση και στην καλύτερη πρόσδεση στο DNA, ειδικά στην περίπτωση των υποδοχέων που προσδένονται ως μονομερή (Giguere, 1999). Η D περιοχή είναι μια μη διατηρημένη εξελικτικά περιοχή μεταξύ των διαφόρων υποδοχέων και χρησιμεύει ως σύνδεσμος αναμεσα στο DBD και στην περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη (Ligand Binding Domain, LBD). Είναι μια ευέλικτη περιοχή που επιτρέπει την DBD περιοχή να περιστρέφεται κατά 180º με αποτέλεσμα μερικοί υποδοχείς να έχουν τη δυνατότητα να προσδεθούν ως διμερή σε HRE που αποτελούνται τόσο απο ευθείες όσο και απο ανεστραμμένες επαναλήψεις του μοτίβου AGGTCA (Glass, 1994 ). Η περιοχή αυτή σε μερικές περιπτώσεις περιέχει τα σήματα για τον πυρηνικό εντοπισμό του υποδοχέα καθώς και επιφάνειες αλληλεπίδρασης με συγκαταστολείς (Chen and Evans, 1995 ) και συνενεργοποιητές (Tcherepanova et al., 2000). Η Ε περιοχή (LBD περιοχή) έχει πολλές λειτουργίες, έτσι πέρα απο την πρόσδεση του συνδέτη, παίζει ρόλο στο διμερισμό, στην αλληλεπίδραση με τις πρωτεΐνες θερμικού πλήγματος και τη μεταγραφική ενεργοποίηση παρουσία συνδέτη. Στην LBD περιοχή εντοπίζεται και η περιοχή μεταγραφικής ενεργοποίησης AF-2 (Activation Function-2), η οποία περικλείει δύο καλά διατηρημένες περιοχές: ένα μοτίβο υπογραφής (signature motif) στο αμινοτελικό άκρο και την AF-2AD περιοχή στο καρβοξυτελικό άκρο (Wurtz et al., 1996). 5

Η AF-2AD περιοχή περιλαμβάνει μια εξελικτικά διατηρημένη αλληλουχία, την φφχεφφ (όπου φ είναι ένα υδρόφοβο αμινοξύ, Χ ένα οποιοδήποτε αμινοξύ και Ε ένα γλουταμινικό οξύ) η οποία παρουσιάζει μία αμφιπαθή α-ελικοειδή διαμόρφωση, με τα καλά διατηρημένα υδρόφοβα αμινοξέα τοποθετημένα στο εσωτερικό της LBD περιοχής, ενώ τα αρνητικά φορτισμένα αμινοξέα βρίσκονται εκτεθειμένα στην επιφάνεια (Danielian et al., 1992). Αυτό το μοτίβο είναι διατηρημένο στα περισσότερα μέλη των πυρηνικών υποδοχέων, με το γλουταμινικό οξύ να παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταγραφική ενεργοποίηση όχι επειδή είναι απαραίτητο για την πρόσδεση του συνδέτη αλλά επειδή είναι απαραίτητο για την αλληλεπίδραση των πυρηνικών υποδοχέων με τους μεταγραφικούς συνενεργοποιητές (Durand et al., 1994). Το μοτίβο υπογραφής εντοπίζεται στις έλικες 3, 4 και στον βρόχο (loop) ανάμεσα τους (Wurtz et al., 1996). Μεταλλάξεις στην περιοχή αυτή ελαττώνουν τη μεταγραφική ενεργότητα του πυρηνικού υποδοχέα και πιο συγκεκριμένα μετάλλαξη μιας καλά διατηρημένης λυσίνης στο καρβοξυτελικό άκρο της έλικας 3 παίζει σημαντικό ρόλο μιας και αποτελεί μέρος ενός φορτισμένου πεδίου (charge clamp) η δημιουργία του οποίου είναι απαραίτητη για την πρόσδεση των συνενεργοποιητών της μεταγραφής όπως θα δούμε στη συνέχεια (Nolte et al., 1998). 1.1.3 Το μοντέλο της ποντικοπαγίδας. Οι αρχικές κρυσταλλογραφικές μελέτες των LBD περιοχών των πυρηνικών υποδοχέων RXRα (Bourguet et al., 1995), RARγ (Renaud et al., 1995) και TRα (Wagner et al., 1995) απουσία συνδέτη (apo-lbd) έδειξαν να παρουσιάζουν μια πρωτόπυπη αναδίπλωση αποτελούμενη απο 12 α-έλικες και δυο β-ελάσματα μεταξύ των ελίκων 5 και 6. Αυτή η αναδίπλωση, γνωστή και ως «αντιπαράλληλο σάντουϊτς α-ελίκων», δημιουργεί ένα τριπλό στρώμα με τις έλικες 4, 5, 8, 9 και 11 να βρίσκονται ανάμεσα στις έλικες 1, 2 και 3 απο τη μία μεριά και τις έλικες 6, 7 και 10 απο την άλλη μεριά, δημιουργώντας με αυτό τον τρόπο μια κοιλότητα (ligand binding pocket) στην οποία προσδένεται ο συνδέτης (Εικ.3). Χαρακτηριστική είναι η θέση της έλικας 12 που βρίσκεται εκτεθειμένη στην επιφάνεια της LBD περιοχής και αποτελεί συνέχεια της έλικας 11 (Bourguet et al., 1995). Η παρουσία του συνδέτη (holo-lbd) προκαλεί μια σειρά απο αλλαγές στη διαμόρφωση του μορίου, έτσι ώστε αρκετές απο τις έλικες να μετακινούνται με πιο χαρακτηριστική τη μετατόπιση της έλικας 12 που έρχεται να σφραγίσει το στόμιο 6

Εικ.3. Σχηματική απεικόνιση της περιοχής πρόσδεση του συνδέτη (LBD) των πυρηνικών υποδοχέων. Αριστερά, η περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη του ρετινοειδικού υποδοχέα X (RXRα) απουσία συνδέτη. Δεξιά, η περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη του υποδοχέα του ρετινοϊκού οξέος (RARγ) παρουσία συνδέτη. Στο σχήμα φαίνονται οι 12 α- έλικες, ενώ παρουσία συνδέτη χαρακτηριστική είναι η μετατόπιση της έλικας 12, που περιέχει την AF-2AD περιοχή, και οδηγεί στο μοντέλο της ποντικοπαγίδας (Aranda and Pascual, 2001). Fig.3. Schematic drawing of the nuclear receptor ligand binding domain (LBD). On the left, the LBD for the unliganded RXRα. On the right, the ligand-bound LBD of the RARγ. Cylinders represent the 12 α-helices and the different position of the COOH-terminal helix 12 that contains the core AF-2AD region can be seen, known as mousetrap model. της κοιλότητας, εγκλωβίζοντας και σταθεροποιώντας το συνδέτη στη νέα του θέση (Wurtz et al., 1996), ενώ παράλληλα δημιουργεί μια νέα επιφάνεια στην οποία έρχονται και προσδένονται οι συνενεργοποιητές (Torchia et al., 1998). Επιπλέον, παρατηρείται μια κάμψη στην έλικα 3 και ορισμένες προσαρμογές στη διαμόρφωση του βρόχου (loop) που συνδέει τις έλικες 1 και 3 έτσι ώστε οι ολο-μορφές του υποδοχέα να παρουσιάζουν μία πιο συμπαγή διαμόρφωση σε σχέση με τις απομορφές. Ο μηχανισμός αυτός, που οδηγεί σε αλλαγή της στερεοδιάταξης της LBD περιοχής απο την απο-μορφή στην ολο-μορφή με αποτέλεσμα τη μεταγραφική ενεργοποίηση της AF-2, είναι γνωστός ως μοντέλο της ποντικοπαγίδας (Renaud et al., 1995). 7

Με αυτόν τον τρόπο ο συνδέτης είναι εγκλωβισμένος σε μια θήκη, η οποία δημιουργείται απο τις έλικες 3, 5, 7, 11, 12 και τον β-βρόχο. Αυτή η θήκη περιβάλλεται κυρίως απο υδρόφοβα αμινοξέα και εντοπίζεται στη βάση της LBD περιοχής. Έχει βρεθεί οτι ποικίλει σημαντικά τόσο σε μέγεθος, όσο και σε σχήμα με αποτέλεσμα να επηρεάζεται και το είδος των επαφών με τον κάθε διαφορετικό συνδέτη (Egea et al., 2000). Συγκεκριμένα, οι διάφοροι συνδέτες παρουσιάζουν έναν κοινό, μη πολικό χαρακτήρα αν και διαφέρουν στο μέγεθος και στη στερεοχημεία τους. Αντίστοιχα, το εσωτερικό της LBD περιοχής αποτελείται κυρίως απο μη πολικά αμινοξέα που ταιριάζει με το χαρακτήρα των συνδετών. Η εκλεκτικότητα του συνδέτη επιτυγχάνεται μέσω κάποιων συγκεκριμένων στερεο-ειδικών πολικών αλληλεπιδράσεων καθώς και εξαιτίας του συγκεκριμένου μεγέθους της LBP. Έτσι, οι υποδοχείς που προσδένονται με μεγάλη συγγένεια με το συνδέτη τους έχουν μικρές θήκες, όπως για παράδειγμα συμβαίνει στον TR (Wagner et al., 1995). Αντίθετα, οι υποδοχείς που προσδένονται σε ένα μεγάλο αριθμό συνδετών αλλά με μικρότερη συγγένεια, όπως ο PPARγ (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor), έχουν μεγάλες θήκες (Nolte et al., 1998) Συμπερασματικά, ο μοριακός μηχανισμός που οδηγεί στην όλο-lbd δομή στηρίζεται σε μια δυναμική ισορροπία ανάμεσα στην απο-δομή, όπου η θήκη πρόσδεσης του συνδέτη είναι μερικώς καλυμμένη απο την υδρόφοβη άκρη της έλικας 11, και στην όλο-δομή, όπου η έλικα 11 εκτείνεται απελευθερώνοντας την LBP για την πρόσδεση του συνδέτη. Η υδρόφοβη θήκη του συνδέτη προκύπτει από τις συντονισμένες και συνεργατικές κινήσεις των ελίκων 3 και 11 με αποτέλεσμα να δεσμεύεται ο συνδέτης. Συγκεκριμένα, η έλικα 3 περιστρέφεται και λυγίζει προς τον πυρήνα της LBD περιοχής φέρνοντας κοντά τα αμινοξέα που είναι σημαντικά τόσο για την πρόσδεση του συνδέτη όσο και για τη σωστή τοποθέτηση της έλικας 12, ενώ η έλικα 11 περιστρέφεται κατά 180º και απομακρύνεται από τη θήκη, η οποία πλέον γίνεται προσβάσιμη για το συνδέτη. Αυτή η κίνηση φέρνει μέσα στη θήκη υδρόφοβα αμινοξέα που ήταν προηγουμένως εκτεθειμένα, ενώ παράλληλα εκτίθενται άλλα αμινοξέα τα οποία μπορούν να έρθουν σε επαφή με τους συνενεργοποιητές (Egea et al., 2000). Η παρουσία ενός ανταγωνιστή επηρεάζει τη στερεοδιαμόρφωση της LBD περιοχής, η οποία εμφανίζει παραπλήσια αναδίπλωση με εκείνη παρουσία ενός αγωνιστή, όμως η έλικα 12 δεν μπορεί να σφραγίσει το στόμιο της υδρόφοβης κοιλότητας όπως στην όλο-μορφή. Αυτό, οφείλεται στο γεγονός οτι οι ανταγωνιστές 8

είναι πιο ογκώδεις και δεν μπορούν να προσαρμοστούν στην κοιλότητα του αγωνιστή με αποτέλεσμα η έλικα 12 να μετακινείται και να πακετάρεται (packed) στην κοιλότητα που δημιουργείται απο τις έλικες 3 και 4 και οι οποίες αποτελούν επιφάνεια αλληλεπίδρασης με τους συνενεργοποιητές. Έτσι, υπάρχει ανταγωνισμός ανάμεσα στην έλικα 12 και στο μοτίβο των συνενεργοποιητών για μια κοινή LBD επιφάνεια (Bourguet et al., 2000). 1.1.4 Μηχανισμός δράσης των πυρηνικών υποδοχέων Οι πυρηνικοί υποδοχείς ακολουθούν μια σειρά βημάτων προκειμένου να ενεργοποιήσουν τα γονίδια-στόχους. Υπάρχουν δύο τρόποι αλληλεπίδρασης μεταξύ του συνδέτη και του πυρηνικού υποδοχέα. Στην πρώτη περίπτωση, οι πυρηνικοί υποδοχείς βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα και είναι ανενεργοί εξαιτίας της σύνδεσής τους με πρωτεΐνες θερμικού πλήγματος, η πρόσδεση όμως του συνδέτη έχει ως αποτέλεσμα ο υποδοχέας να μεταφέρεται στον πυρήνα, να προσδένεται στα HRE και να ενεργοποιεί την έκφραση γονιδίων στόχων. Στη δεύτερη περίπτωση, τα μέλη των πυρηνικών υποδοχέων εντοπίζονται απο την αρχή στον πυρήνα και έχει βρεθεί πως απουσία του συνδέτη προσδένονται στο DNA και συνεργάζονται με συγκαταστολείς που εμποδίζουν την έκφραση των γονιδίων (Tsai and O Malley, 1994). Οι συγκαταστολείς είναι πιθανόν να δρούν στρατολογώντας αποακετυλάσες των ιστονών οδηγώντας σε μια πιο συμπαγή δομή της χρωματίνης που ελαττώνει την πρόσβαση των μεταγραφικών παραγόντων. Η πρόσδεση του συνδέτη προκαλεί αλλαγές στη στερεοδιαμόρφωση του μορίου με αποτέλεσμα να απομακρύνονται οι συγκαταστολείς απο τους υποδοχείς, οι οποίοι είναι πλέον ελεύθεροι να αλληλεπιδράσουν με τους συνενεργοποιητές, έναν ή και περισσότερους, και οι οποίοι μπορούν να αλλάξουν τη δομή της χρωματίνης κατάλληλα (Εικ.4) έτσι ώστε να αυξήσουν τη μεταγραφή των γονιδίων-στόχων (McKenna and O Malley, 2002). Εναλλακτικά, η ενεργοποίηση της μεταγραφής μπορεί να γίνει μέσω φωσφορυλίωσης κάποιου συγκεκριμένου αμινοξέος του υποδοχέα, δηλαδή ανεξάρτητα απο την παρουσία συνδέτη (Hermanson et al, 2002). 9

Απουσία συνδέτη αποακετυλίωση Συνδέτης Παρουσία συνδέτη ακετυλίωση Καταστολή Ενεργοποίηση Εικ.4. Ρύθμιση της μεταγραφής απο τους πυρηνικούς υποδοχείς απουσία και παρουσία συνδέτη. Απουσία συνδέτη, στα διμερή των πυρηνικών υποδοχέων προσδένονται σύμπλοκα συγκαταστολέων, τα οποία στρατολογούν τις αποακετυλάσες των ιστονών και αλληλεπιδρούν με τους βασικούς μεταγραφικούς παράγοντες καταστέλοντας τη μεταγραφή του γονιδίου στόχου. Παρουσία συνδέτη, απομακρύνεται το σύμπλοκο των συγκαταστολέων και στρατολογούνται σύμπλοκα συνενεργοποιητών, τα οποία με τη δράση ακετυλοτρανσφεράσης που περιέχουν επιτρέπουν τη χαλάρωση της χρωματίνης και οδηγούν στην ενεργοποίηση της μεταγραφής (Aranda and Pascual, 2001). Fig.4. Transcriptional regulation of nuclear receptors, in the absence or presence of a ligand. In the absence of ligand, the nuclear receptor is associated with corepressor complexes (SMRT/NCoR) that recruit histone deacetylases (HDACs) and leads to chromatin compactation and transcriptional repression. Ligand binding, causes release of the corepressor complex and recruitment of a coactivator complex that contains at least p160 coactivators, CBP/p300 and PCAF. All these proteins possess histone acetyltransferase (HAT) activity that allows chromatin decompactation and gene activation. 1.2 O ΠΥΡΗΝΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΤΩΝ ΗΠΑΤΟΚΥΤΤΑΡΩΝ HNF-4 Ο πυρηνικός παράγοντας των ηπατοκυττάρων (HNF-4) ανήκει στην υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων, η οποία περιλαμβάνει περισσότερες απο 150 πρωτεΐνες μέλη της οποίας αποτελούν οι υποδοχείς για τις στεροειδείς ορμόνες, τη θυρεοειδή ορμόνη και τα ρετινοειδή (Mangelsdorf et al., 1995b). Είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που εκφράζεται κυρίως στο ήπαρ και ρυθμίζει την έκφραση ενός μεγάλου αριθμού γονιδίων, ενώ παράλληλα ελέγχει λειτουργίες καθοριστικές για τη διαφοροποίηση των ηπατικών κυττάρων και τη διατήρηση του ηπατικού φαινοτύπου. Χαρακτηριστικό είναι οτι ο HNF-4 δρά ως ενεργοποιητής της μεταγραφής απουσία εξωγενούς συνδέτη, χωρίς αυτό να αποκλείει την ύπαρξη ενός ενδογενούς συνδέτη. 10

1.2.1 Δομή του HNF-4 Ως μέλος της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων ο HNF-4 παρουσιάζει την ίδια δομική και λειτουργική οργάνωση που είναι χαρακτηριστική και των υπολοίπων μελών, αποτελούμενη απο έξι λειτουργικά δικαριτές περιοχές, τις A, B, C, D, E και F εκ των οποίων η C και η E είναι οι πιο συντηρημένες μεταξύ των μελών της υπεροικογένειας (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Η Α/Β περιοχή περιέχει την πρώτη περιοχή μεταγραφικής ενεργοποίησης AF-1, η οποία λειτουργεί ως ένας αυτόνομος ενεργοποιητής της μεταγραφής. Η AF- 1 εντοπίζεται στα πρώτα 24 αμινοξέα και ανήκει στους όξινους ενεργοποιητές της μεταγραφής, ενώ πιστεύεται οτι υϊοθετεί μια αμφιπαθή α ελικοειδή δομή (Kistanova et al., 2001). Όταν απαλειφθεί αυτή η περιοχή η ενεργοποίηση μειώνεται κατά 50% (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997), ενώ πειράματα μεταλλαξιγένεσης έδειξαν οτι αρωματικά και ογκώδη υδρόφοβα αμινοξέα είναι αναγκαία για τη λειτουργία της (Kistanova et al., 2001). Η AF-1 μοιράζεται κοινά δομικά μοτίβα με άλλους ενεργοποιητές της μεταγραφής, όπως η ογκοσταλτική πρωτεΐνη p53 και ο μεταγραφικός παράγοντας NF-κB γεγονός που σημαίνει οτι ο HNF-4 μπορεί να μοιράζεται παρόμοιους μηχανισμούς δράσης (Green et al., 1998). Η C περιοχή αντιστοιχεί στην περιοχή πρόσδεσης στο DNA (DBD) και εντοπίζεται μεταξύ των αμινοξέων 48-128. Αποτελείται απο δύο δακτύλιους ψευδαργύρου καθώς και απο μια καρβοξυτελική επέκταση εννέα αμινοξέων. Μελέτες έδειξαν οτι όταν απουσιάζει η καρβοξυτελική περιοχή 340-360 η πρόσδεση στο DNA εμποδίζεται παρά το γεγονός οτι η DBD περιοχή είναι ακέραιη. Μια πιθανή εξήγηση είναι το γεγονός οτι η DBD περιοχή επικαλύπτεται (masking) απο ακολουθίες της Ε περιοχής. Η παρουσία των αμινοξέων της περιοχής 340-360 φαίνεται πως είναι σημαντική όχι μόνο για το διμερισμό του HNF-4, αλλά και για την αποκάλυψη της DBD περιοχής με αποτέλεσμα το μόριο να προσδένεται ισχυρά στο DNA (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Στις περιοχές D και E μεταξύ των αμινοξέων 128-366, εντοπίζεται η δεύτερη περιοχή μεταγραφικής ενεργοποίησης, AF-2. Πρόκειται για μια περιοχή με πολλαπλές λειτουργίες και η ακεραιότητά της είναι απαραίτητη για την πλήρη μεταγραφική της ενεργότητα. Μεταξύ των αμινοξέων 360-366 εντοπίζεται το καλά διατηρημένο μοτίβο φφχεφφ όπου η απαλειφή του εξουδετερώνει τη μεταγραφική ενεργότητα του μορίου, γεγονός που υποδηλώνει πως το μοτίβο αυτό (AF-2 AD) είναι απαραίτητο για τη δράση της AF-2. Σε αντίθεση με άλλους πυρηνικούς 11

υποδοχείς όπου η AF-2 AD μπορεί και δρα αυτόνομα, κάτι τέτοιο δεν ισχύει στην περίπτωση του HNF-4 αν και μπορεί να υϊοθετήσει παρόμοια αμφιπαθή α-ελικοειδή διαμόρφωση. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι ο HNF-4, ο οποίος είναι ένας ισχυρός ενεργοποιητής της μεταγραφής, έχει μια λευκίνη στη θέση 366, όπως ακριβώς και οι πυρηνικοί υποδοχείς ARP-1, EAR-2 και EAR-3, οι οποίοι είναι αρνητικοί ρυθμιστές της μεταγραφής. Αντίθετα, οι πυρηνικοί υποδοχείς RAR, RXR και TR στην αντίστοιχη θέση έχουν ένα γλουταμινικό οξύ που είναι σημαντικό για τη μεταγραφική ενεργοποίηση παρουσία συνενεργοποιητών. Μετάλλαξη της λευκίνης στη θέση 366 σε γλουταμινικό οξύ οδήγησε σε απαλειφή της μεταγραφικής ενεργότητας του HNF-4. Aυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει οτι η AF-2 AD περιοχή του HNF-4 μπορεί να αλληλεπιδρά με διαφορετικούς συνενεργοποιητές από ότι οι πυρηνικοί υποδοχείς RAR, RXR και TR (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Η περιοχή F καταστέλει τη δράση της AF-2, το οποίο είναι ένα μοναδικό γεγονός που παρουσιάζεται αποκλειστικά στον HNF-4. Απαλειφή της F περιοχής αυξάνει τη μεταγραφική ενεργότητα του HNF-4 πέντε με δέκα φορές. Ο μηχανισμός δεν έχει ακόμη διαλευκανθεί, πιστεύεται όμως οτι η F περιοχή μπορεί να επικαλύπτει σημαντικά αμινοξέα στην AF-2 περιοχή είτε από μόνη της είτε σε συνεργασία με άλλες πρωτεΐνες. Ένας πιθανός στόχος της F περιοχής είναι η περιοχή AF-2 AD εξαιτίας του ότι είναι απολύτως απαραίτητη για τη λειτουργία της AF-2 και επιπλέον εξαιτίας του ότι είναι πολύ κοντά στη περιοχή F. Έτσι, ακόμη και μερική κάλυψη της AF-2 AD περιοχής είναι αρκετή για να ελαττωθεί σημαντικά η μεταγραφική ενεργότητα του HNF-4α. Επιπλέον, η αφάιρεση της F περιοχής επιτρέπει τη συνεργασία των δύο περιοχών ενεργοποίησης, AF-1 και AF-2 για την ενεργοποίηση του υποκινητή της απολιποπρωτεΐνης Β. Εξάλειψη της καταστολής που οφείλεται στην παρουσία της F περιοχής μπορεί να γίνει είτε καταστρέφοντας την αλληλεπίδραση με άλλες πρωτεΐνες, είτε με πρωτεόλυση, είτε με αλλαγές στη διαμόρφωση μέσω μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων, είτε με την πρόσδεση του συνδέτη (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Μεταγενέστερες μελέτες εντόπισαν μια περιοχή καταστολής στην F περιοχή (μεταξύ των αμινοξέων 428-441) η οποία είναι αρκετή απο μόνη της για να καταστείλει τη λειτουργία της AF-2, όπως άλλωστε έδειξαν τα πειράματα μεταλλαξιγένεσης (Iyemere et al., 1998). 12

1.2.2 Πρόσδεση του HNF-4α στο DNA O HNF-4α προσδένεται στο DNA αποκλειστικά ως ομοδιμερές σε ευθείες επαναλήψεις (5 -AGGTCA-3 ) που απέχουν μεταξύ τους κατα 1 αμινοξύ (DR1, Jiang et al., 1995). Δεν έχει τη δυνατότητα να ετεροδιμερίζεται με τον RXR, όπως κάνουν πολλοί πυρηνικοί υποδοχείς. Ένας λόγος είναι η ασυμβατότητα των φορτίων που παρουσιάζεται ανάμεσα στον HNF-4α και στον RXR στις έλικες εννέα και δέκα που σε συνδυασμό με τα αμινοξέα στο αμινοτελικό άκρο της LBD περιοχής εμποδίζουν τη δημιουργία ετεροδιμερών (Bogan et al., 2000). Παρά το γεγονός οτι ο HNF-4α δεν ετεροδιμερίζεται, μοιράζεται τα δικά του στοιχεία απόκρισης (HRE) τύπου DR-1 με αρκετούς άλλους υποδοχείς, όπως ο RXR, ο RAR, ο PPAR (Jiang et al., 1995) και τους ορφανούς υποδοχείς, COUP-TFI και COUP-TFII (Chicken Ovalbumin Upstream Promoter-Transcription Factor I/II) (Kimura et al., 1993). Παρόλα αυτά δεν υπάρχουν στοιχεία ταυτόχρονης πρόσδεσης στις περιοχές σύνδεσης του HNF-4, μεταξύ του ίδιου και των άλλων πυρηνικών υποδοχέων, ούτε πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις τόσο παρουσία όσο και απουσία DNA. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι ορφανοί πυρηνικοί υποδοχείς COUP- TFI/ΙΙ, οι οποίοι καταστέλουν τη μεταγραφική ενεργότητα που οφείλεται στην παρουσία του HNF-4. Οι COUP-TFI/ΙΙ μπορούν και προσδένονται στο DNA ως ομοδιμερή και ως ετεροδιμερή με τον RXR. Παρά το γεγονός οτι παρουσιάζουν μία εξειδίκευση στην πρόσδεση στο DNA παραπλήσια με αυτήν του HNF-4 δεν ενεργοποιούν τη μεταγραφή στους περισσότερους υποκινητές. Έτσι, οι υποδοχείς COUP-TFs φαίνεται να ανταγωνίζονται με τον HNF-4 για τον έλεγχο ένος υποκινητή και η σύνδεσή τους στα κοινά στοιχεία απόκρισης έχει ως αποτέλεσμα την καταστολή της έκφρασης των γονιδίων στόχων του HNF-4 (Ktistaki and Talianidis, 1997, Ladias et al., 1992). Αντίθετα, σε ορισμένους υποκινητές όπως του HNF-1α και της α 1 -αντιτρυψίνης η παρουσία των COUP-TFs αυξάνει τη μεταγραφή του HNF-4 δρώντας με συνεργατικό τρόπο (Ktistaki and Talianidis, 1997). Αυτή η συνεργασία εξαρτάται απο πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στον HNF-4 και στους COUP-TFs στο αμινοτελικό άκρο της LBD περιοχής του HNF-4 ενώ σε ορισμένους υποκινητές είναι ανεξάρτητη απο την πρόσδεση του COUP-TF στο DNA (Ktistaki and Talianidis, 1997). Προτείνεται λοιπόν οτι οι COUP-TFs δρούν ως βοηθητικοί συμπαράγοντες, προσανατολίζοντας την περιοχή ενεργοποίησης του HNF-4α σε μια πιο ικανή διαμόρφωση για να πετύχουν αυξημένη μεταγραφική ενεργότητα (Ktistaki and Talianidis, 1997). 13

Επιπλέον, ο HNF-4α βρέθηκε να αλληλεπιδρά μέσω της περιοχής ενεργοποίησης AF-2 με έναν άλλο ορφανό υποδοχέα, τον SHP (Short Heterodimer Partner) χωρίς να σχηματίζει όμως ετεροδιμερή. Ο SHP δεν έχει περιοχή πρόσδεσης στο DNA και καταστέλει τη μεταγραφική ενεργοποίηση του HNF-4 καθώς και των άλλων πυρηνικών υποδοχέων με τους οποίους αλληλεπιδρά, πρώτον, μέσω ανταγωνισμού με τους συνενεργοποιητές και δεύτερον, με απευθείας καταστολή της μεταγραφής εξαιτίας της περιοχής μεταγραφικής καταστολής (repression domain) που υπάρχει στο καρβοξυτελικό άκρο του SHP (Lee et al., 2000). 1.2.3 HNF-4 ακετυλίωση και φωσφορυλίωση. Η ικανότητα του HNF-4α να προσδένεται στο DNA ρυθμίζεται μεταμεταφραστικά μέσω φωσφορυλίωσης. Φωσφορυλιωμένα μόρια του HNF-4α συγκεντρώνονται σε διακριτές περιοχές του πυρήνα. Καταστολή της φωσφορυλίωσης με genistein, έναν γενικό αναστολέα των πρωτεϊνικών κινασών τυροσίνης, έχει ως αποτέλεσμα να χάνεται η πυρηνική διαμερισματοποίηση του HNF-4α καθώς και να ελαττώνεται η μεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων-στόχων (Ktistaki et al., 1995). Επιπλέον, φωσφορυλίωση μιας σερίνης, στη θέση 134 που εντοπίζεται η DBD περιοχή, απο την πρωτεϊνική κινάση Α (PKA) προκάλεσε ελάττωση της ικανότητας πρόσδεσης του HNF-4α στο DNA (Viollet et al., 1997). Η ακετυλίωση είναι μια άλλη μετα-μεταφραστική τροποποίηση του HNF-4α που παίζει πολύ σπουδαίο ρόλο. Ο CBP ακετυλιώνει τον HNF-4α σε αμινοξέα λυσίνης που βρίσκονται στην περιοχή πυρηνικού εντοπισμού του HNF-4α. Η ακετυλίωση είναι σημαντική για την κατακράτηση του HNF-4α στον πυρήνα που υπό άλλες συνθήκες θα είχε μεταφερθεί στο κυτταρόπλασμα ενώ επιπλέον η ακετυλίωση αυξάνει την πρόσδεση του HNF-4α στο DNA καθώς και την αλληλεπίδραση με τον CBP που είναι απαραίτητη για τη μεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων-στόχων (Soutoglou et al., 2000). 1.2.4 HNF-4α: Ισομορφές και ιστολογική κατανομή Ο HNF4α είναι ένας απο τους πιο καλά διατηρημένους εξελικτικά πυρηνικούς υποδοχείς. Το cdna του HNF-4α έχει κλωνοποιηθεί απο γονιδίωμα ανθρώπου, ποντικού, βατράχου και αρκετών εντόμων και παρουσιάζει μεγάλη ομολογία τόσο στην DBD περιοχή όσο και στην LBD περιοχή, γεγονός που σημαίνει πως αν υπάρχει συνδέτης για τον HNF-4α θα είναι το ίδιο καλά συντηρημένος. 14

Εκφράζεται κυρίως στο ήπαρ, αλλά και στα νεφρά, στο πάγκρεας και στα ομόλογα όργανα στα ασπόνδυλα (Sladek et al., 1990, Taraviras et al., 1994, Miquerol et al., 1994). Το γονίδιο του HNF-4α στον άνθρωπο αποτελείται απο 12 εξώνια, έχει μέγεθος 30kb (Furuta et al., 1997) και εμφανίζει επτά ισομορφές (HNF-4α1 εως HNF-4α7) εξαιτίας είτε της εναλλακτικής χρήσης υποκινητών, είτε της εναλλακτικής συραφής (Εικ.5). Στην Α/Β περιοχή δυο επιπλέον εξώνια (1Β,1C) έχουν παρατηρηθεί στη δομή του ανθρώπινου γονιδίου σε σύγκριση με το γονίδιο του ποντικού (Taraviras et al., 1994). Το εξώνιο 1Β κωδικοποιεί ένα ένθεμα 30 αμινοξέων και αντιστοιχεί στην ισομορφή HNF-4α4 του ανθρώπου (Drewes et al., 1996). Το εξώνιο 1C προβλεπόταν ότι κωδικοποιεί επιπλέον 21 αμινοξέα όμως αργότερα αποδείχτηκε ότι η ακολουθία του συνδέεται με την ακολουθία του 1Β στην ισομορφή HNF-4α4 (Furuta et al., 1997). Ένα cdna ποντικού βρέθηκε να περιέχει μια καινούρια αμινοτελική ακολουθία αποτελούμενη απο τα αμινοξέα 30-50 του HNF-4α1 και αποτελεί την ισομορφή HNF-4α7 (Nakhei et al., 1998). Στην περιοχή F βρέθηκαν δύο ισομορφές, η μία περιέχει ένθεμα 10 αμινοξέων (HNF-4α2) (Hata et al., 1995, Chartier et al., 1994) και η άλλη περιέχει μια τελείως ξεχωριστή F περιοχή (HNF-4α3) (Kritis et al., 1996). Αυτό που είναι μοναδικό σε σχέση με τους άλλους πυρηνικούς υποδοχείς είναι ότι στο γονίδιο του HNF-4α ο δεύτερος δακτύλιος ψευδαργύρου κωδικοποιείται από δύο εξώνια, ενώ στους άλλους υποδοχείς υπάρχει ένα εξώνιο για κάθε δακτύλιο ψευδαργύρου (Taraviras et al., 1994). Επιπλέον μοναδικό είναι και το φαινόμενο του ματίσματος στο 3 άκρο του mrna εξαιτίας του οποίου διαφοροποιείται η F περιοχή. Οι ισομορφές που εξετάστηκαν (HNF-4α1, HNF-4α2, HNF-4α3, HNF-4α4 και HNF-4α7) εντοπίζονται κυρίως στο ήπαρ, στο έντερο και στο νεφρό (Hata et al., 1995, Kritis et al., 1996, Nakhei et al., 1998, Drewes et al., 1996). Διατηρούν την ικανότητά τους να προσδένονται στο DNA και να διμερίζονται, ενώ ταυτόχρονα αναμένεται να ετεροδιμερίζονται και μεταξύ τους. Κάποιες απο τις ισομορφές ενεργοποιούν έντονα τη μεταγραφή απουσία εξωγενούς συνδέτη (HNF-4α1, HNF- 4α2 και HNF-4α3), ενώ οι άλλες σε μικρότερο βαθμό (HNF-4α4, και HNF-4α7) (Kritis et al., 1996, Nakhei et al., 1998, Drewes et al., 1996). Παρατηρήθηκαν λοιπόν κάποιες λεπτές διαφορές μεταξύ των ισομορφών, όπως για παράδειγμα η HNF-4α2 15

Εξώνια Εικ.5. Η δομή και οι ισομορφές του HNF-4α γονιδίου. Στην εικόνα φαίνονται τα 12 εξώνια του hhnf-4α γονιδίου καθώς και οι ισομορφές του που είναι αποτέλεσμα αναλλακτικής συρραφής. Οι ισομορφές HNF4α5, HNF4α6, HNF4α8 και HNF4α9 δεν έχουν εντοπιστεί ακόμη in vivo (Sladek and Seidel, 2001). Fig.5. Structure and isoforms of HNF-4α gene. Shown are the 12 exons of hhnf-4α gene and its isoforms generated by alternative splicing. HNF4α5, HNF4α6, HNF4α8 and HNF4α9 have not yet been identified in vivo. ενεργοποιεί τη μεταγραφή κάπως καλύτερα από ότι η HNF-4α1 σε ορισμένες κυτταρικές σειρές (Sladek et al., 1999), ενώ η ενεργοποίηση της HNF-4α7 εξαρτάται απο τον κυτταρικό τύπο (Nakhei et al., 1998). Με αυτό τον τρόπο φαίνεται οτι διαφορετικές ισομορφές παίζουν διαφορετικό ρόλο στο ήπαρ και στα άλλα όργανα. Περαιτέρω μελέτες έδειξαν οτι η ισομορφή HNF-4α7 που διαφέρει μόνο στο αμινοτελικό άκρο απο την ισομορφή HNF-4α1 παρουσιάζει διαφορετική μεταγραφική ενεργότητα (Torres-Padilla et al., 2001). Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι οι δύο ισομορφές προκύπτουν από τη χρήση διαφορετικών υποκινητών, οι οποίοι ευθύνονται και για την αναπτυξιακή και ιστοειδική έκφραση των δύο ισομορφών. Η ισομορφή HNF-4α1 εκφράζεται στον ενήλικα και προκύπττει χρησιμοποιώντας τον υποκινητή P1, ο οποίος περιλαμβάνει το εξώνιο 1Α που κωδικοποιεί την ενεργό περιοχή AF1. Αντίθετα η ισομορφή HNF-4α7 εκφράζεται στα αρχικά στάδια της 16

ανάπτυξης του ήπατος (εμβρυϊκή ισομορφή), πρίν από την ισομορφή HNF-4α1, και προκύπτει χρησιμοποιώντας τον υποκινητή P2, ο οποίος περιλαμβάνει το εξώνιο 1D με αποτέλεσμα να απουσιάζει η ενεργός περιοχή AF1 (Torres-Padilla et al., 2001). Η διαφορά αυτή φαίνεται να επηρεάζει την αλληλεπίδραση με τους συμπαράγοντες όπως θα δούμε παρακάτω (Torres-Padilla et al., 2002). Τέλος, εκτός από τον HNF-4α, που εντοπίζεται κυρίως στο ήπαρ, στα νεφρά και στο έντερο, δύο άλλα HNF-4 γονίδια έχουν κλωνοποιηθεί, το HNF-4β απο το βάτραχο Xenopus, το οποίο εκφράζεται στις ωοθήκες και στους όρχεις (Holewa et al., 1997) και το HNF-4γ απο τον άνθρωπο, που εκφράζεται κυρίως στο νεφρό, στο πάγκρεας και στον εγκέφαλο (Drewes et al., 1996). 1.2.5 Ο ρόλος του HNF-4α στην ανάπτυξη O HNF-4α διαδραματίζει ζωτικό ρόλο στην ανάπτυξη μιας και η απουσία του εμποδίζει την γαστριδιοποίηση και οδηγεί σε εμβρυϊκό θάνατο (Taraviras et al., 1994, Chen et al., 1994a). Το mrna του HNF-4α ανιχνεύεται μετά την 4 η -5 η μέρα της εμβρυϊκής ανάπτυξης, στο πρώιμο ενδόδερμα, με αποτέλεσμα να θεωρείται ένας απο τους πρωιμότερους δείκτες αυτού του ιστού (Coucouvanis and Martin, 1999). Απο το πρώιμο ενδόδερμα προκύπτει το σπλαχνικό ενδόδερμα. Πρόκειται για έναν εξωεμβρυϊκό ιστό, ο οποίος εκφράζει πολλά απο τα γονίδια που εκφράζονται στο ήπαρ, συμπεριλαμβανομένου του HNF-4α και του HNF-1α, ενός άλλου μεταγραφικού παράγοντα σηματικού για τη διαφοροποίηση του ήπατος. Παρά την πρώιμη εμφάνιση του mrna του HNF-4α στους εξωεμβρυϊκούς ιστούς του ποντικού, ο μεταγραφικός αυτός παράγοντας δεν εκφράζεται στους εμβρυϊκούς ιστούς πριν την 8 η -9 η μέρα της ανάπτυξης, οπότε και εμφανίζεται αρχικά στο ήπαρ και στο έντερο (Duncan et al., 1994). Η εμφάνισή του συμπίπτει με τον πολλαπλασιασμό των ηπατικών κυττάρων και την έκφραση ηπατοειδικών γονιδίων, όπως η αλβουμίνη και η α-εμβρυϊκή πρωτεΐνη (α-φετοπρωτεΐνη, AFP) (Duncan et al., 1994). Είναι ενδιαφέρον ότι κανένα από αυτά τα γονίδια δεν ενεργοποιείται απ ευθείας από τον HNF-4α αν και εξαρτώνται απο το μεταγραφικό παράγοντα HNF-1α, ο οποίος αποτελεί με τη σειρά του στόχο για τον HNF-4α. Την 9 η -10 η μέρα της ανάπτυξης η έκφραση του HNF-4α ενισχύεται σημαντικά στο ήπαρ και το μεσαίο τμήμα του εντέρου, δομή απο την οποία θα προκύψουν το πάγκρεας και η χοληδόχος κύστη. Κατά την 10 η -11 η μέρα της ανάπτυξης το mrna του HNF-4α παρατηρείται επίσης στο στομάχι και τα νεφρικά σωληνάρια που θα σχηματίσουν το 17

φλοιό του νεφρού, όπου ο HNF-4α εκφράζεται στον ενήλικα. Το πρότυπο αυτό παραμένει μέχρι την 13 η -14 η μέρα, οπότε και η έκφραση του HNF-4α επεκτείνεται απο το μεσαίο τμήμα του εντέρου σε όλο του το μήκος, μέχρι και το όριο ορθούπρωκτού (Duncan et al., 1994). Την 20 η μέρα υπάρχει μια μεγάλη πτώση στην έκφραση του HNF-4α και κατά τη γέννηση μόνο πολύ χαμηλά επίπεδα είναι ανιχνεύσιμα. Στο ήπαρ του ενήλικα ο HNF-4α εκφράζεται σε επίπεδα παρόμοια με αυτά που εκφράζονται στη γέννηση (Nagy et al., 1994). Πειράματα σε ποντίκια με ανεπάρκεια σε HNF-4α δείχνουν ότι ο HNF-4α παίζει σημαντικό ρόλο στη γαστριδιοποίηση (Chen et al., 1994a). HNF-4α -/- ποντίκια παρουσιάζουν ανώμαλο φαινότυπο την εμβρυϊκή μέρα 6.5, στην αρχή δηλαδή της γαστριδιοποίησης. Αφου ο HNF-4α εκφράζεται αργότερα θεωρήθηκε οτι η ανώμαλη γαστριδιοποίηση οφείλεται στην έλλειψη σωστής λειτουργίας του σπλαχνικού ενδοδέρματος όπου ο HNF-4α εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα. Συγκεκριμένα φάνηκε οτι ο HNF-4α δεν είναι απαραίτητος για τη διαφοροποίηση του σπλαχνικού ενδοδέρματος, αλλά είναι απαραίτητος για την έκφραση εκκρινόμενων πρωτεϊνών, οι οποίες παρέχουν τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά για την ανάπτυξη του εμβρύου (Duncan et al., 1997). Πειράματα χρησιμοποιώντας τετραπλοειδή ανάπτυξη εμβρύων έδειξαν πως ο HNF-4α είναι απαραίτητος για την ηπατική διαφοροποίηση (Li et al., 2000). Τα HNF-4α -/- έμβρυα έζησαν μεχρι τη 12 η ημέρα της κύησης και το ήπαρ τους είναι μορφολογικά πανομοιότυπο με εκείνο των εμβρύων HNF-4α +/+ και HNF-4α +/-. Παρατηρήθηκε όμως οτι στα έμβρυα HNF-4α +/+ παρά το γεγονός οτι οι ηπατοβλάστες σε αυτό το στάδιο της ηπατικής ανάπτυξης είναι ανώριμοι, έχουν ήδη ξεκινήσει την έκφραση γονιδίων που καθορίζουν τον ώριμο ηπατικό φαινότυπο (Li et al., 2000). Η σημασία του ρόλου του HNF-4α στη ρύθμιση της ηπατικής διαφοροποίησης επιβεβαιώθηκε και σε ηπατοκύτταρα ενήλικα (Hayhurst et al., 2001). 1.2.6 Κρυσταλλική δομή του HNF-4 Ο HNF-4α είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που ενεργοποιεί τη μεταγραφή απουσία συνδέτη και μέχρι πρόσφατα ανήκε στην κατηγορία των ορφανών υποδοχέων. Αν και δεν υπήρχαν κρυσταλλογραφικά δεδομένα για την LBD περιοχή του HNF-4 υπήρχε η αντίληψη οτι παρουσιάζει την ίδια διαμόρφωση που παρουσιάζουν και οι άλλοι πυρηνικοί υποδοχείς, όπως ο RXRα με τον οποίο εμφανίζει και τη μεγαλύτερη συγγένεια. Ο RXRα αποτελείται, όπως αναφέρθηκε 18

αναλυτικά παραπάνω, απο 12 αντιπαράλληλες α-έλικες, ενώ η παρουσία του συνδέτη προκαλεί αλλαγές στη διαμόρφωση του μορίου που οδηγούν στην αλληλεπίδραση με συνενεργοποιητές και συνεπώς στην ενεργοποίηση του υποδοχέα (Renaud et al., 1995). Αρχικά οι θειοεστέρες των λιπαρών οξέων είχαν προταθεί ως πιθανοί συνδέτες του HNF-4α (Hertz et al., 1998), υπήρχαν όμως αντικρουόμενες απόψεις απο άλλες ερευνητικές ομάδες, οι οποίες δεν μπόρεσαν να επιβεβαιώσουν αυτό το αποτέλεσμα (Bogan et al., 2000). Οι πρόσφατες κρυσταλλογραφικές μελέτες της LBD περιοχής τόσο του HNF-4α (Dhe-Paganon et al., 2002) όσο και του HNF-4γ (Wisely et al., 2002) πραγματοποιήθηκαν χωρίς την προσθήκη κάποιου πιθανού μορίου-συνδέτη, και έδειξαν οτι ο HNF-4α αντιδρά αυθόρμητα με ένα μείγμα απο ενδογενή κορεσμένα και μονοακόρεστα C14-18 λιπαρά οξέα τα οποία προσδένονται στην υδρόφοβη κοιλότητα πρόσδεσης του συνδέτη, ένω η F περιοχή δεν επηρεάζει την πρόσδεση αυτή (Wisely et al., 2002, Dhe-Paganon et al., 2002). Αναλυτικά, η LBD περιοχή του HNF4α αποτελείται απο 9-10 α-έλικες και 2 β-ελάσματα που υϊοθετούν το γνωστό μοντέλο του αντιπαράλληλου σάντουϊτς. Η έλικα 2 απουσιάζει ενώ οι έλικες 10 και 11 είναι συνεχόμενες. Τα λιπαρά οξέα προσαρμόζονται τέλεια στην LBP κοιλότητα καταλαμβάνοντας όλο το χώρο. Προσπάθειες ανταλλαγής των δεσμευμένων λιπαρών οξέων ήταν ανεπιτυχείς γεγονός το οποίο μπορεί να σημαίνει πως τα λιπαρά οξέα δε δρούν ως κλασσικοί συνδέτες αλλά ως δομικοί συμπαράγοντες, δεσμευόμενοι κατά τη διάρκεια αναδίπλωσης της πρωτείνης και βοηθώντας τον HNF-4 να υϊοθετεί τη σωστή διαμόρφωση. Ετσι, φαίνεται οτι ο HNF-4 ενεργοποιεί τη μεταγραφή με έναν τρόπο που είναι ανεξάρτητος απο την πρόσδεση ενός συνδέτη, όπως είχε παρατηρηθεί για τους άλλους πυρηνικούς υποδοχείς. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός οτι στο ομοδιμερές του HNF-4α η έλικα 12 εμφανίζεται σε δύο διαμορφώσεις, μία «ανοικτή» και μία «κλειστή». Στην ανοικτή διαμόρφωση η έλικα 12 είναι πλήρως εκτεταμένη και σε συνέχεια με την έλικα 10. Αντίθετα, το δεύτερο μόριο του ομοδιμερούς παρουσιάζει την κλειστή διαμόρφωση, με την έλικα 12 να αναδιπλώνεται και να κλείνει την LBP (Εικ.6A). Απο τη στιγμή που τα λιπαρά οξέα προσδένονται τόσο στην ανοικτή όσο και στην κλειστή διαμόρφωση φαίνεται πως η πρόσδεση του συνδέτη στην υδρόφοβη κοιλότητα δεν είναι αρκετή για να προκαλέσει δομικές αναπροσαρμογές και να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή όπως συμβαίνει στους άλλους πυρηνικούς υποδοχείς, και προτάθηκε πως η ταυτόχρονη 19