ΕΝΙΣΧΥΣΗ ΚΑΙ ΒΙΟΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΟΥ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ HNF-4 ΤΟΥ MYTILUS GALLOPROVINCIALIS

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΕΝΙΣΧΥΣΗ ΚΑΙ ΒΙΟΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΟΥ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ HNF-4 ΤΟΥ MYTILUS GALLOPROVINCIALIS ΧΡΙΣΤΙΝΑ ΤΣΕΚΟΥΡΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ: ΜΑΡΓΑΡΙΤΑ ΧΑΤΖΟΠΟΥΛΟΥ ΚΛΑΔΑΡΑ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2006

2 Αφιερωμένη στους γονείς μου Κοσμά και Στεκούλα 2

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στα εργαστήρια Βιολογίας Ανάπτυξης και Γενικής Βιολογίας του Τμήματος Βιολογίας, στα πλαίσια του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών της κατεύθυνσης Εφαρμοσμένη Γενετική και Βιοτεχνολογία, κατά το ακαδημαϊκό έτος Κατά τη διάρκεια αυτού του χρόνου, η σχολή έγινε το δεύτερο σπίτι μου. Έτσι είναι άλλωστε η έρευνα! Τολμώ να πω ότι η χρονιά αυτή ήταν μια από τις πιο δύσκολες αλλά και συνάμα από τις πιο ξεχωριστές της ζωής μου. Την επίβλεψη του θέματος με το οποίο ασχολήθηκα στη διπλωματική μου είχε η καθηγήτρια κ. Μαργαρίτα Χατζοπούλου-Κλαδαρά. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την κ. Χατζοπούλου μέσα από τα βάθη της καρδιάς μου για την όμορφη συνεργασία που είχαμε τόσο αυτή την χρονιά όσο και στην προπτυχιακή διπλωματική μου, για τις πολύτιμες συμβουλές της και για όλη την καθοδήγηση που μου πρόσφερε. Νιώθω μεγάλη ευγνωμοσύνη για εκείνη γιατί με πίστεψε από την πρώτη στιγμή και με υποστήριξε όσο κανένας άλλος. Πραγματικά, της οφείλω πολλά. Παράλληλα, ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ χρωστώ και στον καθηγητή κ. Ζαχαρία Σκούρα για την ευκαιρία που μου έδωσε να εκπονήσω μεγάλο μέρος της διπλωματικής μου στο εργαστήριό του, καθώς και για τη συμμετοχή του στην τριμελή εξεταστική επιτροπή. Ταυτόχρονα, για τη συμμετοχή του στην τριμελή εξεταστική επιτροπή, θα ήθελα να ευχαριστήσω και τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Γεώργιο Μόσιαλο. Επιπλέον, νιώθω την ανάγκη να ευχαριστήσω τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Μηνά Γιάγκου για τον χρόνο που αφιέρωσε προκειμένου να ασχοληθεί με παντός είδους προβλήματα που αντιμετωπίζαμε οι συμφοιτητές μου και εγώ κατά τη διάρκεια του μεταπτυχιακού. Συνοδοιπόροι καθόλη τη διάρκεια της χρονιάς ήταν η υποψήφια διδάκτορας Χρύσα Παντζαρτζή και η συμφοιτήτριά μου Βιολέττα Χαραλαμπίδου. Στη Χρύσα χρωστώ ένα τεράστιο ευχαριστώ για τις αμέτρητες ώρες του προσωπικού της χρόνου που θυσίασε χωρίς δισταγμό προκειμένου να με βοηθήσει κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων, καθώς και για τις πάντα χρήσιμες και εποικοδομητικές συμβουλές και παρατηρήσεις της. Όσο για τη Βιολέττα, ήταν η παρέα μου, το στήριγμά μου, το άτομο που με έκανε να γελάω και μου έφτιαχνε τη διάθεση. Την ευχαριστώ που ήταν δίπλα μου και χωρίς αμφιβολία είμαι πολύ τυχερή που τη γνώρισα και έγινε φίλη μου. 3

4 Θα ήταν μεγάλη μου παράλειψη αν ξεχνούσα να αναφερθώ σε όλα τα μέλη των εργαστηριών Βιολογίας Ανάπτυξης και Γενικής Βιολογίας. Έτσι, ευχαριστώ τη λέκτορα κ. Ελένη Δροσοπούλου, την ερευνήτρια Έλενα Αγγελίδου, τους υποψήφιους διδάκτορες Άννα Ιορδανίδου, Ιωάννα Βαλλιάνου, Σπύρο Βήττα και Γιάννη Παπουλίδη, καθώς και την προπτυχιακή φοιτήτρια Λίλα Βαρθολομαίου για την αρμονική συνύπαρξη στο εργαστήριο και για τη βοήθεια που απλόχερα μου πρόσφεραν όποτε τη χρειάστηκα. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω με όλη μου την καρδιά τους γονείς μου. Είναι οι άνθρωποι που είναι πάντα στο πλευρό μου, με στηρίζουν σε όλες τις επιλογές μου και προσπαθούν να κάνουν τη ζωή μου πιο εύκολη και πιο όμορφη. Σίγουρα, χωρίς εκείνους λίγα θα είχα καταφέρει. 4

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ 7 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 9 Mytilus galloprovincialis 9 Εξωτερική μορφολογία και εσωτερική οργάνωση 10 Γεωγραφική εξάπλωση 11 Πυρηνικοί υποδοχείς 13 Κατάταξη των πυρηνικών υποδοχέων 13 Προέλευση των πυρηνικών υποδοχέων 16 HNF-4 18 Δομή HNF-4 19 Τρόπος δράσης HNF-4 26 Πιθανοί συνδέτες HNF-4 27 Ισομορφές HNF-4 29 Γονίδια-στόχοι του HNF-4 32 Ρόλος HNF-4 στην ανάπτυξη 33 Σκοπός της εργασίας 36 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 37 Απομόνωση DNA από το Mytilus galloprovincialis 37 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης 38 Σχεδιασμός εκκινητών 40 Touchdown PCR 46 Καθαρισμός προϊόντων PCR και εύρεση πρωτοταγούς αλληλουχίας 49 Σάρωση γονιδιωματικής βιβλιοθήκης 51 Τιτλοποίηση γονιδιωματικής βιβλιοθήκης 52 Α κύκλος σάρωσης 54 Μεταφορά βακτηριοφάγων σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης 55 Ραδιενεργός επισήμανση ανιχνευτών 56 Υβριδισμός ραδιενεργά επισημασμένων ανιχνευτών με το DNA βακτηριοφάγων των μεμβρανών 57 Β κύκλος σάρωσης 58 5

6 Απομόνωση βακτηριοφαγικού DNA 58 Κλωνοποίηση προϊόντων της PCR σε πλασμιδιακό φορέα 60 Σύνδεση ενθέματος με τον πλασμιδιακό φορέα 61 Μετασχηματισμός βακτηρίων με ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα 61 Επιλογή μετασχηματισμένων κλώνων και απομόνωση πλασμιδιακού DNA 62 Πέψεις πλασμιδιακού DNA 63 Βιοπληροφορική ανάλυση 64 Διαλύματα 66 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 68 Σάρωση γονιδιωματικής βιβλιοθήκης 68 Εύρεση πρωτοταγούς αλληλουχίας τμήματος του γονιδίου του HNF-4 70 Ανάλυση νουκλεοτιδικής ακολουθίας 81 Ανάλυση αμινοξικής ακολουθίας 84 Σύγκριση πρωτεΐνης HNF-4 M. galloprovincialis με αντίστοιχες άλλων οργανισμών 90 Κατασκευή φυλογενετικών δέντρων 93 Κλωνοποίηση σε πλασμιδιακό φορέα 94 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 97 Σχεδιασμός εκκινητών για το γονίδιο του HNF-4 97 Σάρωση γονιδιωματικής βιβλιοθήκης 98 Εύρεση πρωτοταγούς αλληλουχίας τμήματος του γονιδίου του HNF-4 99 Ανάλυση νουκλεοτιδικής ακολουθίας 102 Ανάλυση αμινοξικής ακολουθίας 102 Σύγκριση πρωτεΐνης HNF-4 M. galloprovincialis με αντίστοιχες άλλων οργανισμών 103 Φυλογενετική ανάλυση 106 Κλωνοποίηση σε πλασμιδιακό φορέα 106 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 107 ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΕΣ ΠΗΓΕΣ 111 6

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Οι πυρηνικοί υποδοχείς είναι επαγώγιμοι μεταγραφικοί παράγοντες, η δράση των οποίων εξαρτάται από κάποιο μόριο-συνδέτη. Ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται σε σημαντικές λειτουργίες των οργανισμών, όπως είναι η ομοιόσταση, η ανάπτυξη, η διαφοροποίηση, η αναπαραγωγή και ο μεταβολισμός. Στην υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων ανήκει ο Ηπατοειδικός Πυρηνικός Παράγοντας-4 (Hepatocyte Nuclear Factor-4, ΗΝF-4), ένας πυρηνικός υποδοχέας για τον οποίο αναγνωρίστηκαν ως συνδέτες ενδογενή λιπαρά οξέα. Ο ΗΝF-4 συνδέεται στο DΝΑ των γονιδίων-στόχων μόνο ως ομοδιμερές και εντοπίζεται αποκλειστικά μέσα στον πυρήνα. Αποτελείται από 5 διακριτές περιοχές με συγκεκριμένο λειτουργικό ρόλο, οι οποίες χαρακτηρίζονται ως Α/Β, C, D, E και F. Η περιοχή C αποτελεί την περιοχή σύνδεσης στο DNA των γονιδίων-στόχων, ενώ η περιοχή Ε αντιπροσωπεύει την περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη. Ανάμεσα στις περιοχές C και Ε βρίσκεται η περιοχή D που αποτελεί έναν ευέλικτο σύνδεσμο. Στις περιοχές Α/Β και Ε εντοπίζονται δύο περιοχές ενεργοποίησης, οι ΑF-1 και ΑF-2, οι οποίες ευθύνονται για την ενεργοποίηση της μεταγραφής στα κύτταρα απουσία ή παρουσία συνδέτη, αντίστοιχα. Όσον αφορά την περιοχή F, αυτή δρα κατασταλτικά στην ενεργοποίηση του HNF-4 που προκύπτει από την AF-2 περιοχή. Οι πιο συντηρημένες περιοχές μεταξύ των διαφορετικών οργανισμών είναι οι περιοχές C και D, ακολουθεί η περιοχή Ε, ενώ οι περιοχές Α/Β και F εμφανίζουν μεγάλη ποικιλομορφία. Ο HNF-4 παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταγραφική ενεργοποίηση από τα πρώτα εμβρυονικά στάδια μέχρι και την ενηλικίωση. Ρυθμίζει την έκφραση μιας πληθώρας γονιδίων που εμπλέκονται σε διάφορα μεταβολικά μονοπάτια, όπως γονίδια των οποίων τα προϊόντα παίρνουν μέρος στο μεταβολισμό των αμινοξέων, των λιπιδίων και της γλυκόζης. Παράλληλα, επάγει την έκφραση μεταγραφικών παραγόντων που ρυθμίζουν τη μεταγραφή των ηπατοειδικών γονιδίων. Έτσι, κατέχει κεντρικό ρόλο στη διαφοροποίηση των ηπατοκυττάρων, ενώ ταυτόχρονα ευθύνεται για τη συγκέντρωση της γλυκόζης στο ήπαρ και για τη δημιουργία του ηπατικού επιθηλίου. Κρίσιμος είναι ο ρόλος του και στη γαστριδιοποίηση, δεδομένου ότι σε ποντίκια στα οποία τα αλληλόμορφα του γονιδίου του HNF-4 δεν κωδικοποιούν λειτουργικό υποδοχέα η γαστριδιοποίηση αρχίζει, αλλά αποτυγχάνει να συνεχίσει περαιτέρω, με αποτέλεσμα την αναστολή της ανάπτυξής τους. 7

8 Στη συγκεκριμένη εργασία, έγινε μελέτη του γονιδίου του πυρηνικού υποδοχέα HNF-4 στο είδος Mytilus galloprovincialis. Πρόκειται για ένα είδος μυδιού που εμφανίζει μεγάλη αναπαραγωγικότητα, μεγάλη αντίσταση στα παράσιτα και αυξημένους ρυθμούς ανάπτυξης σε νερά με υψηλές θερμοκρασίες και υψηλή αλατότητα. Μάλιστα, δεδομένου ότι έχει την ικανότητα να διηθεί τεράστιες ποσότητες νερού, είναι πολύ ευαίσθητο στη ρύπανση που προκαλείται από χημικές ενώσεις ή από μικροοργανισμούς και για το λόγο αυτό χρησιμοποιείται ως βιομάρτυρας της ποιότητας των υδάτων. Συχνά, εκτίθεται σε συνθήκες υποξίας, στις οποίες έχει την ικανότητα να αποκρίνεται ο HNF-4 και να επάγει τη μεταγραφή του γονιδίου της ερυθροποιητίνης. Προκειμένου να ενισχυθεί το γονίδιο του HNF-4 από το M. galloprovincialis, σχεδιάστηκαν 11 εκκινητές. Με την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης ενισχύθηκαν επικαλυπτόμενες ακολουθίες που αντιπροσωπεύουν τμήμα του γονιδίου του πυρηνικού υποδοχέα HNF-4, το οποίο κωδικοποιεί την αμινοξική ακολουθία που εκτείνεται από την αρχή της περιοχής σύνδεσης στο DNA ως το τέλος της περιοχής πρόσδεσης του συνδέτη. Οι ακολουθίες αυτές συγκροτούν μια νουκλεοτιδική ακολουθία μεγέθους 3136 ζευγών βάσεων, η οποία περιλαμβάνει 5 εξόνια και 4 ιντρόνια. Η κωδικοποιούσα περιοχή αντιπροσωπεύεται από 936 ζεύγη βάσεων, από τη μετάφραση των οποίων προκύπτουν 312 αμινοξέα. Τόσο η νουκλεοτιδική όσο και η αμινοξική ακολουθία κατατέθηκαν στη βάση δεδομένων EMBL. Πρόκειται για την πρώτη γονιδιωματική ακολουθία του HNF-4 που έχει απομονωθεί όχι μόνο από το M. galloprovincialis, αλλά και γενικότερα από όλα τα μαλάκια. 8

9 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Mytilus galloprovincialis Το Mytilus galloprovincialis είναι ένας θαλάσσιος βενθικός οργανισμός που αναπτύσσεται πάνω σε στερεά υποστρώματα. Πρόκειται για ένα ευρέως εμπορεύσιμο και καλλιεργούμενο είδος μυδιού που αποτελεί σημαντική πηγή τροφής τόσο για τον άνθρωπο όσο και για διάφορους υδρόβιους οργανισμούς. Η συστηματική ταξινόμηση του M. galloprovincialis έχει απασχολήσει πολύ τους επιστήμονες, κυρίως λόγω του ότι συνυπάρχει και δίνει γόνιμους απογόνους με τα είδη Mytilus edulis και Mytilus trossulus, με τα οποία απαρτίζει το Mytilus spp complex. Θεωρείται ότι αποτελεί ξεχωριστό είδος του γένους Mytilus, ενώ κάποιοι επιστήμονες το θεωρούν ως υποείδος του M. edulis. Η συστηματική κατάταξη του M. galloprovincialis φαίνεται στην Εικόνα 1. Εικόνα 1 Συστηματική κατάταξη Mytilus galloprovincialis Το M. galloprovincialis εμφανίζει μεγάλη αναπαραγωγικότητα, μεγάλη αντίσταση στα παράσιτα και αυξημένους ρυθμούς ανάπτυξης σε νερά με υψηλές θερμοκρασίες και υψηλή αλατότητα. Είναι διηθηματοφάγο και χρησιμοποιεί τα βράγχια ως φίλτρο για την κατακράτηση σωματιδίων τροφής (φυτοβενθόν, φυτοπλαγκτόν και οργανικό υλικό) κατά την είσοδο του νερού στο σώμα. Δεδομένου ότι έχει την ικανότητα να διηθεί τεράστιες ποσότητες νερού που φτάνουν μέχρι τα 9

10 100 λίτρα την ημέρα, είναι πολύ ευαίσθητο στη ρύπανση που προκαλείται από χημικές ενώσεις ή από μικροοργανισμούς. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιείται ως βιομάρτυρας της ποιότητας των υδάτων (Gosling, 1984). Εξωτερική μορφολογία και εσωτερική οργάνωση Το M. galloprovincialis διαθέτει ένα μαύρο κέλυφος που αποτελείται από δύο πλευρικές θυρίδες, οι οποίες συνδέονται μεταξύ τους με έναν ισχυρό ελαστικό σύνδεσμο. Η αύξηση του κελύφους εκδηλώνεται εξωτερικά με τις παχυσμένες συγκεντρικές γραμμές αύξησης. Το άνοιγμα και το κλείσιμο των θυρίδων επιτυγχάνεται με ένα ζεύγος προσαγωγών μυών, των οποίων το αποτύπωμα μένει πάνω σε αυτές. Έχει υποτυπώδες κεφάλι και ένα μανδύα που αποτελείται από δύο λοβούς. Η εξωτερική επιφάνεια των μανδυακών λοβών προσκολλάται στην εσωτερική επιφάνεια των θυρίδων, όπου τα όρια των λοβών διαγράφονται με μια γραμμή που ονομάζεται μανδυακό αποτύπωμα. Μεταξύ των μανδυακών λοβών υπάρχει ένα ζεύγος ελασματοειδών φυλλοειδών βραγχίων, με τα οποία επιτελείται η αναπνοή. Ο μανδύας καλύπτει το μεγαλύτερο μέρος του σπλαχνικού σάκου, ο οποίος περιλαμβάνει τα περισσότερα όργανα του μυδιού, όπως τον πεπτικό σωλήνα, την καρδιά και τους γεννητικούς αδένες. Κατά την αναπαραγωγική περίοδο, ο μανδύας έχει χρώμα πορτοκαλί στα θηλυκά άτομα και κίτρινο στα αρσενικά. Στο εσωτερικό του κελύφους βρίσκεται επίσης ο πόδας, ο οποίος βοηθάει στη μετακίνηση. Στη βάση του πόδα εντοπίζεται ο βύσσος. Πρόκειται για έναν αδένα από τον οποίο εκκρίνονται νημάτια, με τη βοήθεια των οποίων το μύδι παραμένει προσκολλημένο στα βράχια ή σε άλλες επιφάνειες του υδάτινου περιβάλλοντος (Εικόνα 2) (Λαζαρίδου Δηµητριάδου, 1991). 10

11 Εικόνα 2 Εξωτερική μορφολογία και εσωτερική οργάνωση M. galloprovincialis (Ηλ. Πηγές 1, 2) Γεωγραφική εξάπλωση Το M. galloprovincialis εξαπλώνεται γεωγραφικά σε όλη τη Μεσόγειο Θάλασσα, (μεσογειακή μορφή), στη Μεγάλη Βρετανία, στην Ιρλανδία, στη Γαλλία, στην Ισπανία, στην Πορτογαλία (μορφή Ατλαντικού), στη Δυτική Αυστραλία, στη Νέα Ζηλανδία, στην Κίνα, στην Ιαπωνία και στη Νότια Καλιφόρνια (Εικόνα 3) (Suchanek et al., 1997). Εισήλθε για πρώτη φορά στις δυτικές ακτές της Νότιας Αφρικής ανάμεσα στα τέλη της δεκαετίας του 1970 και στις αρχές της δεκαετίας του Από τότε είναι το επικρατέστερο είδος στην περιοχή που εκτείνεται από το Ακρωτήρι της Καλής Ελπίδας ως τη Νότια Ναμίμπια (Griffiths et al., 1992). 11

12 Εικόνα 3 Γεωγραφική εξάπλωση M. galloprovincialis. Πάνω φαίνεται η μεσογειακή μορφή και κάτω η μορφή του Ατλαντικού (Ηλ. Πηγή 3) 12

13 Πυρηνικοί υποδοχείς Οι πυρηνικοί υποδοχείς είναι επαγώγιμοι μεταγραφικοί παράγοντες, η δράση των οποίων εξαρτάται από κάποιο μόριο-συνδέτη (ligand). Οι περισσότεροι συνδέτες που έχουν μελετηθεί ως τώρα είναι ορμόνες, οι οποίες παράγονται από ενδοκρινή όργανα και εισέρχονται στο εσωτερικό του κυττάρου. Άλλοι συνδέτες είναι προϊόντα του μεταβολισμού που συντίθενται αποκλειστικά μέσα στο ίδιο το κύτταρο (Aranda and Pascual, 2001). Ανάλογα με την πρόσδεση ή μη του συνδέτη στον υποδοχέα, ενεργοποιείται ή καταστέλλεται η μεταγραφή των γονιδίων-στόχων, αντίστοιχα. Οι πυρηνικοί υποδοχείς ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται σε σημαντικές λειτουργίες όπως είναι η ομοιόσταση, η ανάπτυξη, η διαφοροποίηση, η αναπαραγωγή και ο μεταβολισμός. Η υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων περιλαμβάνει υποδοχείς για υδρόφοβα μόρια, όπως στεροειδείς ορμόνες (οιστρογόνα, ανδρογόνα, γλυκοκορτικοειδή, μινεραλοκορτικοειδή, προγεστερόνη), βιταμίνη D, εκδυσόνη, οξυστερόλες, χολικά οξέα, ρετινοϊκά οξέα, θυρεοειδείς ορμόνες, λιπαρά οξέα, λευκοτριένια και προσταγλανδίνες. Υπάρχουν, ακόμη, οι λεγόμενοι ορφανοί πυρηνικοί υποδοχείς, που εμφανίζουν ομολογία με τους υπόλοιπους πυρηνικούς υποδοχείς, αλλά δεν έχει αναγνωριστεί με βεβαιότητα το μόριο με το οποίο συνδέονται (Robinson-Rechavi et al., 2003). Κατάταξη των πυρηνικών υποδοχέων Έχουν προταθεί διάφορα συστήματα κατάταξης των πυρηνικών υποδοχέων, τα οποία βασίζονται τόσο σε εξελικτικά όσο και σε λειτουργικά χαρακτηριστικά. Με βάση φυλογενετικές μελέτες, η υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων διακρίνεται σε 6 υποοικογένειες. Η υποοικογένεια Ι περιλαμβάνει τους υποδοχείς θυρεοειδικών ορμονών (TRs), τους υποδοχείς ρετινοϊκού οξέος (RARs), τους υποδοχείς PPARs, τους υποδοχείς της βιταμίνης D (VDRs), τους υποδοχείς εκδυσόνης (EcRs), καθώς και πολλούς ορφανούς υποδοχείς, όπως είναι οι RORs και οι Rev-erbs. Η υποοικογένεια ΙΙ περιλαμβάνει τους ρετινοειδικούς Χ υποδοχείς (RXRs) και τους υποδοχείς HNF-4, COUP, tailless, TR2 και TR4. Η υποοικογένεια ΙΙΙ αποτελείται από όλους τους υποδοχείς στεροειδών ορμονών, όπως είναι οι υποδοχείς οιστρογόνων (ERs), οι υποδοχείς ανδρογόνων (ARs), οι υποδοχείς προγεστερόνης (PRs) και οι υποδοχείς γλυκοκορτικοειδών (GRs). Στην 13

14 υποοικογένεια ΙV ανήκουν οι ορφανοί υποδοχείς NGFIB, ενώ στην υποοικογένεια V οι ορφανοί υποδοχείς FTZ-F1 και SF-1. Τέλος, η υποοικογένεια VI περιλαμβάνει τον ορφανό υποδοχέα GCNF1 (Εικόνα 4) (Laudet, 1997). Με βάση την ικανότητά τους για διμερισμό, τον τρόπο με τον οποίο συνδέονται στο DΝΑ, καθώς και τον ενδοκυττάριο εντοπισμό τους, οι πυρηνικοί υποδοχείς κατατάσσονται σε τέσσερις ομάδες (Εικόνα 5). Στην πρώτη ομάδα ανήκουν οι υποδοχείς των στεροειδών ορμονών. Οι υποδοχείς αυτοί βρίσκονται συνδεδεμένοι στο κυτταρόπλασμα με πρωτεΐνες του θερμικού πλήγματος (heat-shock proteins). Η είσοδος του συνδέτη, δηλαδή των στεροειδών, στο κύτταρο προκαλεί την απελευθέρωσή τους από τις πρωτεΐνες θερμικού πλήγματος και τη σύνδεσή τους με το μόριο-συνδέτη. Το σύμπλοκο αυτό, στη συνέχεια, μεταφέρεται στο εσωτερικό του πυρήνα, όπου με τη μορφή ομοδιμερούς συνδέεται με συγκεκριμένες ακολουθίες του DΝΑ. Η ομάδα των υποδοχέων στεροειδών περιλαμβάνει μεγάλο αριθμό μελών και αποτελεί την πιο διαδεδομένη ομάδα μεταγραφικών παραγόντων στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Η δεύτερη ομάδα περιλαμβάνει τους υποδοχείς των ρετινοειδών, των θυρεοειδών ορμονών, της βιταμίνης D και της εκδυσόνης. Στην περίπτωση αυτή, η διαδικασία του διμερισμού επηρεάζεται από την παρουσία συνδετών, με αποτέλεσμα οι υποδοχείς να συνδέονται σε ευθείες επαναλήψεις στο μόριο του DΝΑ ως ομοδιμερή, ετεροδιμερή ή ακόμη και μονομερή. Στην τρίτη ομάδα των πυρηνικών υποδοχέων ανήκουν υποδοχείς, όπως ο ΝGFI-B και ο SF-1, οι οποίοι συνδέονται στο DΝΑ κυρίως ως μονομερή, αν και είναι δυνατό να σχηματίσουν ετεροδιμερή με υποδοχείς της δεύτερης ομάδας, όπως ο υποδοχέας RXR. Τέλος, στην τέταρτη ομάδα περιλαμβάνεται ο πυρηνικός υποδοχέας ΗΝF-4, ο οποίος συνδέεται σε ευθείες ακολουθίες στο μόριο του DΝΑ, μόνο ως ομοδιμερές. Ένα πολύ σημαντικό χαρακτηριστικό της ομάδας είναι ότι ο συγκεκριμένος υποδοχέας εντοπίζεται αποκλειστικά μέσα στον πυρήνα (Jiang et al., 1997). 14

15 Εικόνα 4 Κατάταξη των πυρηνικών υποδοχέων σε 6 υποοικογένειες με βάση φυλογενετικές μελέτες (Laudet, 1997) 15

16 Εικόνα 5 Κατάταξη των πυρηνικών υποδοχέων σε 4 ομάδες με βάση τις ιδιότητες διμερισμού, σύνδεσης στο DNA και ενδοκυττάριου εντοπισμού (Ηλ. Πηγή 4) Προέλευση των πυρηνικών υποδοχέων Οι πυρηνικοί υποδοχείς έχουν βρεθεί στις 3 κύριες διαιρέσεις των ευμεταζώων και συγκεκριμένα στα κνιδάρια, στα πρωτοστόμια (μαλάκια, αρθρόποδα, νηματώδεις και σκώληκες) και στα δευτεροστόμια (χορδωτά και εχινόδερμα). Αντίθετα, κανένας πυρηνικός υποδοχέας δεν έχει βρεθεί στα ευβακτήρια, στα αρχαιοβακτήρια, στα φυτά και στους μύκητες. Για το λόγο αυτό υποστηρίζεται η άποψη ότι οι πρώτοι πυρηνικοί υποδοχείς εμφανίστηκαν λίγο μετά το διαχωρισμό των μεταζώων από τους μύκητες, αλλά πριν το διαχωρισμό των κνιδαρίων από τα αμφίπλευρα (πρωτοστόμια και δευτεροστόμια) (Εικόνα 6) (Thornton, 2003). Η πληθώρα των πυρηνικών υποδοχέων έχει προκύψει από δύο κύματα γονιδιακών διπλασιασμών που σημειώθηκαν κατά την εξέλιξη αυτής της υπεροικογένειας. Το πρώτο κύμα γονιδιακού διπλασιασμού πραγματοποιήθηκε πριν από το διαχωρισμό αρθροπόδων-σπονδυλωτών και είχε ως αποτέλεσμα τις 6 υποοικογένειες των πυρηνικών υποδοχέων. Το δεύτερο κύμα γονιδιακού 16

17 διπλασιασμού πραγματοποιήθηκε αργότερα στα σπονδυλωτά και οδήγησε στην εμφάνιση παράλογων μορφών των υποδοχέων της κάθε ομάδας (Laudet, 1997). Εικόνα 6 Κατανομή πυρηνικών υποδοχέων στα διάφορα τάξα και εμφάνιση πρώτου πυρηνικού υποδοχέα. Οι αριθμοί αναπαριστούν το σύνολο των πυρηνικών υποδοχέων που έχουν βρεθεί σε κάθε τάξο (M:Metazoa, B:Bilateria, P:Protostomia, D:Deuterostomia, E:Ecdysozoa, L:Lophotrochozoa) (Thornton, 2003) Έχουν διατυπωθεί δύο θεωρίες για την εξέλιξη των πυρηνικών υποδοχέων από έναν κοινό πρόγονο. Σύμφωνα με την πρώτη, ο αρχαίος πυρηνικός υποδοχέας είχε την ικανότητα πρόσδεσης σε κάποιο μόριο-συνδέτη, η οποία χάθηκε για τους ορφανούς πυρηνικούς υποδοχείς κατά τη διάρκεια της εξέλιξης. Σύμφωνα με τη δεύτερη θεωρία, ο αρχαίος πυρηνικός υποδοχέας ήταν ένας ορφανός υποδοχέας και απόκτησε την ικανότητα πρόσδεσης σε κάποιο μόριο-συνδέτη κατά τη διάρκεια της εξέλιξης ανεξάρτητα από τους υπόλοιπους υποδοχείς (Εικόνα 7). Η παρουσία στην ίδια υποοικογένεια πυρηνικών υποδοχέων με συνδέτες που εμφανίζουν εντελώς διαφορετική δομή καθώς και η εμφάνιση των ορφανών πυρηνικών υποδοχέων σε πολλές υποοικογένειες υποστηρίζουν την απουσία συσχέτισης ανάμεσα στις εξελικτικές σχέσεις των υποδοχέων και στη φύση των συνδετών. Αυτή η κατάσταση ενισχύει τη δεύτερη θεωρία (Escriva et al., 2000). 17

18 Εικόνα 7 Μοντέλο για τον τρόπο με τον οποίο οι πυρηνικοί υποδοχείς απόκτησαν την ικανότητα πρόσδεσης ενός μορίου-συνδέτη. Ο αστερίσκος συμβολίζει την απόκτηση ικανότητας πρόσδεσης του συνδέτη σε υποδοχείς που προήλθαν από ορφανούς πυρηνικούς υποδοχείς (Escriva et al., 2000) HNF-4 Ο Ηπατοειδικός Πυρηνικός Παράγοντας-4 (Hepatocyte Nuclear Factor-4, HNF-4) είναι μέλος της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων. Έχουν ανιχνευτεί τρεις διαφορετικοί υποτύποι του HNF-4 που κωδικοποιούνται από παράλογα γονίδια, και συγκεκριμένα ο HNF-4α, ο HNF-4β και ο HNF-4γ (Zhong et al., 1993, Holewa et al., 1997, Drewes et al., 1996). Ο HNF-4α ανιχνεύτηκε για πρώτη φορά σε πυρηνικά εκχυλίσματα ήπατος αρουραίου ως μια πρωτεΐνη που συνδεόταν σε στοιχεία DNA του υποκινητή των ηπατοειδικών γονιδίων της τρανσθυρετίνης και της απολιποπρωτεΐνης CIII. Ο HNF- 4α έχει απομονωθεί τόσο από σπονδυλωτά (Homo sapiens, Macaca mulatta, Mus musculus, Rattus rattus, Rattus norvegicus, Tamias sibiricus, Gallus gallus, Bos taurus, Canis familiaris, Sus scrofa, Xenopus laevis, Danio rerio) όσο και από ασπόνδυλα (Drosophila melanogaster, Bombyx mori, Aedes aegypti, Tribolium castaneum, Strongylocentrotus purpuratus). Ο υποδοχέας αυτός εντοπίζεται στα σπονδυλωτά κυρίως στο ήπαρ, στους νεφρούς, στο έντερο, στο πάγκρεας και στο στομάχι (Sladek et al., 1990), ενώ στα ασπόνδυλα στο λιπαρό σωμάτιο, στα μαλπιγγειανά σωληνάρια και στην κοιλιακή περιοχή (Zhong et al., 1993). Ο HNF-4β έχει βρεθεί μόνο στο είδος Xenopus laevis. Παρουσιάζει διαφορετικό πρότυπο έκφρασης σε σχέση με τον HNF-4α. Συγκεκριμένα, ενώ ο 18

19 HNF-4α εντοπίζεται στο ήπαρ και στους νεφρούς του βατράχου, ο HNF-4β εκφράζεται σε ισοδύναμες ποσότητες στο ήπαρ, στους νεφρούς, στο στομάχι, στο έντερο, στους όρχεις, στις ωοθήκες και στους πνεύμονες (Holewa et al., 1997). Ο HNF-4γ έχει βρεθεί στα είδη Homo sapiens, Macaca mulatta, Mus musculus, Rattus norvegicus, Bos taurus, Canis familiaris και Danio rerio. Εκφράζεται σε όλους τους ιστούς στους οποίους εντοπίζεται ο HNF-4α και συγκεκριμένα στους νεφρούς, στο πάγκρεας, στο έντερο, στους όρχεις, αλλά όχι στο ήπαρ (Drewes et al., 1996). Δομή HNF-4 Ο HNF-4 παρουσιάζει την τυπική δομή των πυρηνικών υποδοχέων. Αποτελείται από 5 διακριτές περιοχές με συγκεκριμένο λειτουργικό ρόλο (domains), που χαρακτηρίζονται ως περιοχές Α/Β, C, D, E και F (Εικόνα 8) (Ribeiro et al., 1995). Εικόνα 8 Διακριτές περιοχές (domains) του πυρηνικού υποδοχέα HNF-4 (Ηλ. Πηγή 5) Η περιοχή Α/Β, η οποία παρουσιάζει μεγάλη ποικιλομορφία στους διάφορους πυρηνικούς υποδοχείς, εντοπίζεται στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης και εμφανίζει ισοηλεκτρικό σημείο ίσο με Στην περιοχή αυτή βρίσκεται η περιοχή ενεργοποίησης-1 (ΑF-1), που είναι υπεύθυνη για την ενεργοποίηση της μεταγραφής στα κύτταρα με αυτόνομο τρόπο, χωρίς τη μεσολάβηση μορίου-συνδέτη. Η AF-1 μπορεί να ενεργοποιηθεί από πρωτεϊνικές κινάσες ενεργοποιούμενες από μιτογόνο (ΜΑΡΚs), από αναπτυξιακούς παράγοντες ή ογκοπρωτεΐνες, από τον p300 και από την p68 RΝΑ ελικάση Α (Fu et al., 2003). Μάλιστα, έχει βρεθεί ότι απαιτείται για την πλήρη μεταγραφική δράση του HNF-4. Η απουσία της περιοχής AF-1, οδηγεί σε μείωση της μεταγραφικής ενεργοποίησης σε ποσοστό περίπου 50%. Εκτεταμένη ανάλυση της περιοχής AF-1 με κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση έδειξε ότι τα 19

20 αρωματικά και ογκώδη υδρόφοβα αμινοξέα έχουν ουσιώδη σημασία για τη διατήρηση της λειτουργικότητάς της. Συγκεκριμένα, ακόμη και μια σημειακή μετάλλαξη των αρωματικών και υδρόφοβων αμινοξέων που περιβάλλουν την αρνητικά φορτισμένη περιοχή οδηγεί σε δραματική μείωση της ενεργού δράσης του υποδοχέα (Kistanova et al., 2001). Η περιοχή C αποτελεί την περιοχή σύνδεσης στο DNA (DNA-binding domain, DBD). Πρόκειται για μια εξελικτικά συντηρημένη περιοχή ανάμεσα στα μέλη των πυρηνικών υποδοχέων, η οποία αποτελείται από 2 δάκτυλα ψευδαργύρου. Σε κάθε δάκτυλο ψευδαργύρου, 4 μόρια κυστεΐνης συνδέονται τετραεδρικά με ένα ιόν ψευδαργύρου (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Στη βάση του πρώτου δακτύλου ψευδαργύρου εντοπίζεται το πλαίσιο P που είναι υπεύθυνο για την αναγνώριση του στοιχείου απόκρισης στο DNA. Η αμινοξική ακολουθία CDGCKG που εντοπίζεται στο πλαίσιο Ρ είναι ένα μοναδικό χαρακτηριστικό του ΗΝF-4 σε σχέση με τα υπόλοιπα μέλη της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων. Στο δεύτερο δάκτυλο ψευδαργύρου εντοπίζεται το πλαίσιο D που εμπλέκεται στο διμερισμό των πυρηνικών υποδοχέων (Εικόνα 9) (Lee et al., 1993). Εικόνα 9 Δομή περιοχής σύνδεσης στο DNA (Ηλ. Πηγή 6) Η περιοχή σύνδεσης στο DΝΑ είναι υπεύθυνη για τη στόχευση μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DΝΑ που ο υποδοχέας αναγνωρίζει και για την οποία διαθέτει αυξημένη τάση σύνδεσης. Η αλληλουχία αυτή του DΝΑ ονομάζεται στοιχείο απόκρισης στην ορμόνη (hormone response element, HRE). Ένα ΗRΕ τυπικά περιέχει δύο ομόφωνες υποπεριοχές που αποτελούνται από 6 ζεύγη βάσεων η καθεμία και χαρακτηρίζεται από τρία στοιχεία: 20

21 1) την αλληλουχία των ζευγών βάσεων στην υποπεριοχή 2) τον αριθμό των ζευγών βάσεων μεταξύ των υποπεριοχών και 3) το σχετικό προσανατολισμό των δύο υποπεριοχών Αν και μερικοί μονομερείς υποδοχείς μπορούν να συνδεθούν σε ένα μόνο εξαμερές μοτίβο, οι περισσότεροι υποδοχείς συνδέονται ως ομο- ή ετερο- διμερή στα στοιχεία απόκρισης που αποτελούνται από δύο εξαμερή μοτίβα. Στα στοιχεία απόκρισης, οι υποπεριοχές μπορεί να είναι ευθείες, παλίνδρομες ή ανεστραμμένες επαναλήψεις (Glass, 1994). Η ομόφωνη αλληλουχία σύνδεσης του HNF-4 στο DNA αποτελείται από δύο ευθείες επαναλήψεις που παρουσιάζουν ομοιότητες με την αλληλουχία AGGTCA και διαχωρίζονται συνήθως από ένα νουκλεοτίδιο (DR1) και σπάνια από δύο νουκλεοτίδια (DR2) (Εικόνα 10) (Laudet et al., 1992). Εικόνα 10 Σύνδεση ομοδιμερούς πυρηνικών υποδοχέων HNF-4 στο στοιχείο απόκρισης του γονιδίουστόχου (King-Jones and Thummel, 2005) Η περιοχή D (hinge region) αποτελεί έναν ευέλικτο σύνδεσμο ανάμεσα στην περιοχή C και στην περιοχή Ε. Με τον τρόπο αυτό, οι παραπάνω περιοχές έχουν τη δυνατότητα να περιστρέφονται και να δημιουργούν εναλλακτικές διαμορφώσεις, όταν οι υποδοχείς διμερίζονται, προκειμένου να συνδεθούν στις επαναλήψεις του DΝΑ. Στην περιοχή αυτή, που αποτελεί την καρβοξυτελική επέκταση της περιοχής C, εντοπίζονται τα πλαίσια Α και Τ, που είναι σημαντικά για τη μονομερή σύνδεση στο DNA και για το διμερισμό (Lee et al., 1993). Η περιοχή Ε αποτελεί την εξελικτικά συντηρημένη περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη (ligand-binding domain, LBD), στην οποία εντοπίζεται η περιοχή ενεργοποίησης-2 (ΑF-2). Η περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη εμφανίζει τη μορφή ενός αντιπαράλληλου ελικοειδούς σάντουιτς τριών στρωμάτων, το οποίο στον HNF-4 αποτελείται από 10 α-έλικες (α1-α12) και 2 β-ελάσματα (β1-β2). Σε αντίθεση με τους άλλους πυρηνικούς υποδοχείς, η α2 έλικα δεν υπάρχει, ενώ η α6 σχηματίζει μια α- ελικοειδή στροφή. Οι α-έλικες που εντοπίζονται στο μέσο του σάντουιτς (α3, α5, α7 και α10) σχηματίζουν μαζί με τα β-ελάσματα την υδρόφοβη θέση πρόσδεσης του 21

22 συνδέτη (Dhe-Paganon et al., 2002). Μάλιστα, έχει βρεθεί ότι σημειακές μεταλλάξεις στα αμινοξέα Ser-181 και Met-182 της έλικας α3, Leu-219, Leu-220 και Arg-226 της έλικας α5, Ile-338 της έλικας α10 και Ile-346 της έλικας α11 παρεμποδίζουν τη μεταγραφική δράση του υποδοχέα, προκαλώντας τοπικές αλλαγές στην περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη (Aggelidou et al., 2004). Με βάση τη σύγκριση της δομής που εμφανίζει η περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη, παρουσία και απουσία του συνδέτη, διατυπώθηκε ένα μοντέλο επαγόμενης από το συνδέτη δράσης του πυρηνικού υποδοχέα. Σύμφωνα με το μοντέλο αυτό, απουσία του συνδέτη, η έλικα 12 που βρίσκεται στο καρβοξυτελικό άκρο είναι προσανατολισμένη μακριά από τον πυρήνα της περιοχής πρόσδεσης του συνδέτη. Παρουσία του συνδέτη, η έλικα 12 αναδιπλώνεται πάνω από την υδρόφοβη θέση σύνδεσης του συνδέτη (Εικόνα 11). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την απομάκρυνση των συγκαταστολέων και το σχηματισμό δομικών επιφανειών για τη σύνδεση βασικών μεταγραφικών παραγόντων και συνενεργοποιητών που είναι απαραίτητοι για την αποτελεσματική ενεργοποίηση της μεταγραφής (Dhe-Paganon et al., 2002). Εικόνα 11 Δομή της περιοχής πρόσδεσης του συνδέτη του HNF-4 απουσία (αριστερά) και παρουσία (δεξιά) του συνδέτη (Dhe-Paganon et al., 2002) Η ΑF-2 περιοχή έχει βρεθεί πως ευθύνεται για την επαγόμενη από συνενεργοποιητές ενεργοποίηση του υποδοχέα. Σε όλους τους πυρηνικούς υποδοχείς περιλαμβάνει μια μικρή περιοχή ενεργοποίησης στο καρβοξυτελικό της άκρο, η οποία ονομάζεται AF-2 AD και περιέχει την εξελικτικά συντηρημένη αλληλουχία φφχεφφ, όπου φ ένα υδρόφοβο αμινοξύ, Χ οποιοδήποτε αμινοξύ και Ε το γλουταμινικό οξύ (Εικόνα 12). Το τμήμα αυτό είναι απαραίτητο για τη δράση του 22

23 υποδοχέα, καθώς μεσολαβεί στην αλληλεπίδρασή του με τους μεταγραφικούς συνενεργοποιητές (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Ακόμη, η καρβοξυτελική περιοχή περιλαμβάνει την επιφάνεια διμερισμού που σχηματίζεται από υδρόφοβα αμινοξέα, τα οποία ανήκουν στις έλικες α7, α9 και α10. Έτσι, η περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη είναι υπεύθυνη τόσο για τη σύνδεση του μορίου-συνδέτη όσο και για τον ομοδιμερισμό (Εικόνα 13) (Dhe-Paganon et al., 2002). Εικόνα 12 Περιοχή ενεργοποίησης AF-2 AD διαφόρων πυρηνικών υποδοχέων (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997) Εικόνα 13 Επιφάνεια ομοδιμερισμού, θέση πρόσδεσης του συνδέτη και θέση πρόσδεσης των συμπαραγόντων στην περιοχή Ε του πυρηνικού υποδοχέα (Ηλ. Πηγή 6) 23

24 Η περιοχή F του HNF-4 παρουσιάζει μοναδικά χαρακτηριστικά σε σχέση με τους υπόλοιπους πυρηνικούς υποδοχείς, δεδομένου ότι δρα κατασταλτικά στην ενεργότητα του HNF-4 που προκύπτει από την AF-2 περιοχή. Πιστεύεται ότι η περιοχή F καλύπτει κρίσιμα αμινοξέα της AF-2 περιοχής για την ενεργοποίηση του HNF-4 είτε μόνη της είτε με αλληλεπίδραση με συγκαταστολείς. Ένας πιθανός στόχος αυτής της κάλυψης είναι η AF-2 AD περιοχή, τόσο επειδή βρίσκεται πολύ κοντά στη περιοχή F όσο και επειδή είναι απαραίτητη για τη δράση της AF-2 περιοχής. Με τον τρόπο αυτό παρεμποδίζεται η πρόσβαση των συνενεργοποιητών. Επιπλέον, θεωρείται ότι η περιοχή F ρυθμίζει το βαθμό αλληλεπίδρασης των δύο περιοχών ενεργοποίησης του υποδοχέα. Απουσία της περιοχής αυτής, οι AF-1 και AF-2 δρουν από κοινού στον υποκινητή του γονιδίου της απολιποπρωτεΐνης Β, επάγοντας τη μεταγραφή του. Μάλιστα, έχει παρατηρηθεί πως αν συμβεί στην περιοχή F οποιαδήποτε μετατροπή, όπως πρωτεόλυση ή μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις, η κατασταλτική της δράση παύει να υπάρχει (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Από τη σύγκριση των πρωτεϊνών HNF-4α που προέρχονται από διάφορους οργανισμούς προκύπτει ότι οι πιο συντηρημένες περιοχές μεταξύ των ειδών είναι οι περιοχές C και D, ενώ ακολουθεί η περιοχή Ε. Αντίθετα, οι περιοχές Α/Β και F εμφανίζουν μεγάλη ποικιλομορφία ιδιαίτερα μεταξύ σπονδυλωτών και ασπόνδυλων (Εικόνα 14). Εικόνα 14 Σύγκριση πρωτεϊνών ΗΝF-4α διαφορετικών οργανισμών με τον ΗΝF-4α του ανθρώπου. Τα ποσοστά αναπαριστούν το βαθμό ομοιότητας της κάθε περιοχής του ΗΝF-4α του κάθε οργανισμού με την αντίστοιχη περιοχή του υποδοχέα του ανθρώπου (Ηλ. Πηγή 7) 24

25 Από τη σύγκριση των πρωτεϊνών HNF-4α και HNF-4β του Xenopus laevis προκύπτει ότι οι πιο συντηρημένες περιοχές είναι οι περιοχές C και D, που εμφανίζουν 94% ομολογία. Ακολουθεί η περιοχή Ε, η οποία είναι αρκετά συντηρημένη ανάμεσα στους δύο υποτύπους, δεδομένου ότι εμφανίζει ομολογία 72%. Όσον αφορά την περιοχή Α/Β, αυτή εμφανίζει βαθμό ομολογίας 48%, ενώ η περιοχή F παρουσιάζει πολύ μικρή ομολογία (25%) και στον HNF-4β είναι κατά 8 αμινοξέα μικρότερη (Εικόνα 15) (Holewa et al., 1997). Εικόνα 15 Σύγκριση πρωτεϊνών HNF-4α και HNF-4β του Xenopus laevis (Holewa et al., 1997) Όσον αφορά τον HNF-4γ του ανθρώπου, οι περιοχές C και D είναι σχεδόν πανομοιότυπες σε σχέση με εκείνες του HNF-4α του ίδιου οργανισμού. Η περιοχή Ε εμφανίζει ομολογία 79%, ενώ οι σημαντικότερες διαφορές μεταξύ αυτών των δύο υποτύπων εντοπίζονται στην περιοχή Α/Β, η οποία εκτείνεται κατά 310 αμινοξέα περισσότερο στον HNF-4γ σε σχέση με τον HNF-4α, και στην περιοχή F, η οποία εμφανίζει 37% ομολογία (Εικόνα 16) (Drewes et al., 1996). Εικόνα 16 Σύγκριση πρωτεϊνών HNF-4α και HNF-4γ του ανθρώπου (Drewes et al., 1996) 25

26 Τρόπος δράσης HNF-4 Απουσία του συνδέτη, στην AF-2 περιοχή του πυρηνικού υποδοχέα συνδέονται συγκαταστολείς, οι οποίοι επιφέρουν καταστολή της μεταγραφής, είτε μέσω μιας μη παραγωγικής αλληλεπίδρασης με τους βασικούς μεταγραφικούς παράγοντες είτε μέσω της στρατολόγησης συμπλόκων για την αποακετυλίωση των ιστονών (HDACs) η οποία οδηγεί στη συμπύκνωση της δομής της χρωματίνης. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της πρόσβασης των διαφόρων μεταγραφικών παραγόντων στο DNA και την καταστολή της μεταγραφής των γονιδίων-στόχων. Μετά την πρόσδεση του συνδέτη στον πυρηνικό υποδοχέα, οι συγκαταστολείς απελευθερώνονται και η AF-2 περιοχή αλληλεπιδρά με διάφορους συνενεργοποιητές, οι οποίοι είναι πρωτεΐνες που στρατολογούνται στον υποκινητή των γονιδίων-στόχων και αυξάνουν τη μεταγραφή τους. Συγκεκριμένα, οι συνενεργοποιητές εξυπηρετούν τρεις ρόλους στη μεταγραφή που ρυθμίζεται από τους πυρηνικούς υποδοχείς: 1) Λειτουργούν ως παράγοντες οι οποίοι στρατολογούν άλλους συμπαράγοντες στους υποδοχείς που συνδέονται με την χρωματίνη. 2) Με την έμφυτη δράση ακετυλοτρανσφεράσης που διαθέτουν, ακετυλιώνουν τις ιστόνες των νουκλεοσωμάτων και πρωτεϊνικούς παράγοντες στους υποκινητές των γονιδίων-στόχων, με αποτέλεσμα την χαλάρωση της δομής της χρωματίνης και τη διευκόλυνση της πρόσβασης των διαφόρων μεταγραφικών παραγόντων στο DNA. 3) Στρατολογούν την RΝΑ πολυμεράση ΙΙ και άλλα συστατικά της βασικής μεταγραφικής μηχανής στους υποκινητές. Έτσι, ο πυρηνικός υποδοχέας επάγει τη μεταγραφή των γονιδίων-στόχων (Εικόνα 17) (Fu et al., 2004). 26

27 Εικόνα 17 Αλληλεπίδραση ομοδιμερούς πυρηνικών υποδοχέων HNF-4 με συνενεργοποιητές και συγκαταστολείς και ενεργοποίηση ή καταστολή της μεταγραφής, αντίστοιχα (Ηλ. Πηγή 8) Πιθανοί συνδέτες HNF-4 Μέχρι πρόσφατα o HNF-4 θεωρούνταν ως ορφανός πυρηνικός υποδοχέας, δεδομένου ότι δεν είχε αναγνωριστεί κάποιο μόριο που να είναι βέβαιο ότι αποτελεί το συνδέτη του. Ο HNF-4 έχει την ικανότητα να επάγει τη μεταγραφή των γονιδίωνστόχων τόσο in vivo όσο και in vitro απουσία εξωγενώς προστιθέμενων συνδετών. Ωστόσο, έχει προταθεί μετά από κρυσταλλογραφικές μελέτες ότι συνδέτες του HNF- 4 είναι οι θειοεστέρες των λιπαρών οξέων με το ακετυλο-συνένζυμο Α. Η άποψη αυτή στηρίζεται στο γεγονός ότι ο HNF-4 συμμετέχει στα ίδια μεταβολικά μονοπάτια στα οποία συμμετέχουν τα συγκεκριμένα μόρια (Hertz et al., 1998). Ωστόσο, η αύξηση της μεταγραφής που επάγεται από τον HNF-4 μετά την πρόσδεση αυτών των μορίων δεν είναι τόσο μεγάλη in vivo. Επιπλέον, υποστηρίζεται ότι η μεγάλη αύξηση της μεταγραφής που παρατηρείται in vitro ίσως να μην οφείλεται στην αλληλεπίδραση μεταξύ των μορίων αυτών και του συγκεκριμένου 27

28 μεταγραφικού παράγοντα. Μάλιστα, οι θειοεστέρες των λιπαρών οξέων αλληλεπιδρούν με πολλούς άλλους πυρηνικούς υποδοχείς, ενώ ταυτόχρονα υπάρχουν πολλές πρωτεΐνες, όπως οι ACBP (acyl CoA binding protein) και FABP (fatty acid binding protein), που εμφανίζουν μεγαλύτερη τάση σύνδεσης για τα μόρια αυτά και είναι άφθονες στο κύτταρο, με αποτέλεσμα να είναι δύσκολος ο συναγωνισμός του HNF-4 για πρόσβαση σε αυτά. Παράλληλα, στη βιβλιογραφία δεν έχει αναφερθεί συνδέτης πυρηνικού υποδοχέα που να έχει τόσο μεγάλο μέγεθος όσο οι συγκεκριμένοι θειοεστέρες. Έτσι, λοιπόν, κρυσταλλογραφικές μελέτες της περιοχής πρόσδεσης του συνδέτη του HNF-4 δείχνουν ότι τα χημικά αυτά μόρια δεν είναι δυνατό να είναι συνδέτες του, γιατί είναι αρκετά ευμεγέθη για να μπορούν να εισχωρήσουν μέσα στη συγκεκριμένη περιοχή (Bogan et al., 2000). Μετά από κρυστάλλωση της περιοχής πρόσδεσης του συνδέτη του HNF-4γ, βρέθηκε ο υποδοχέας να είναι συνδεδεμένος με μεθυλεστέρες κορεσμένων και μονοακόρεστων C14-18 λιπαρών οξέων, χωρίς να έχουν προστεθεί πιθανά μόριασυνδέτες (Wisely et al., 2002). Επιπλέον, ο HNF-4α βρέθηκε να είναι συνδεδεμένος με κορεσμένα και μονοακόρεστα C16-18 λιπαρά οξέα (Εικόνα 18). Δεδομένου ότι και οι δύο υποτύποι του HNF-4 συνδέονται με μια ποικιλία λιπαρών οξέων, υποστηρίζεται ότι ίσως αυτοί οι υποδοχείς να είναι συνδεδεμένοι με ενδογενή λιπαρά οξέα των κυττάρων, να αλληλεπιδρούν με συνενεργοποιητές και να είναι συστατικά ενεργοί ως μεταγραφικοί παράγοντες (Dhe-Paganon et al., 2002). Εικόνα 18 Δομή HNF-4γ (αριστερά) και HNF-4α (δεξιά) που είναι συνδεδεμένοι με λιπαρά οξέα (Wisely et al., 2002, Dhe-Paganon et al., 2002) 28

29 Ισομορφές HNF-4 Το γονίδιο του HNF-4α χαρτογραφείται στον άνθρωπο στο χρωμόσωμα 20q q13.2, μεταξύ των γονιδίων PLCG1 και D20S17, ενώ στον ποντικό στο χρωμόσωμα 2. Αρχικά, θεωρήθηκε ότι το γονίδιο του ανθρώπου αποτελείται από 10 εξόνια, ωστόσο μετά από σύγκριση της οργάνωσής του με το γονίδιο του ποντικού αναγνωρίστηκαν δύο επιπλέον εξόνια. Μετά από την ανάλυση της αλληλουχίας του HNF-4α στον άνθρωπο βρέθηκε ότι υπάρχουν τουλάχιστον 9 διαφορετικές ισομορφές που έχουν προκύψει είτε από εναλλακτική συρραφή είτε από χρήση διαφορετικών υποκινητών (Eικόνα 19). Κάποιες από αυτές τις ισομορφές έχουν απομονωθεί και ταυτοποιηθεί μετά από κλωνοποίηση. Εικόνα 19 Γονίδιο και ισομορφές του HNF-4α στον άνθρωπο (Ηλ. Πηγή 7) Η ισομορφή HNF-4α2 περιέχει σε σύγκριση με την ισομορφή HNF-4α1 ένα παρεμβαλλόμενο τμήμα 10 αμινοξέων στο αμινοξύ 409, ενώ η ισομορφή HNF-4α3 διαθέτει μια εντελώς διαφορετική περιοχή F. Παράλληλα, έχει βρεθεί η ισομορφή 29

30 HNF-4α4 που περιέχει ένα επιπρόσθετο τμήμα 30 αμινοξέων στην περιοχή Α/Β (Kritis et al., 1996). Επιπλέον, από τον ποντικό έχει απομονωθεί cdna που κωδικοποιεί την ισομορφή HNF-4α7, η οποία διαθέτει ένα νέο αμινοτελικό άκρο. Το άκρο αυτό ακολουθείται από τα αμινοξέα της ισομορφής HNF-4α1. Η ισομορφή αυτή εντοπίστηκε και στα β-κύτταρα του παγκρέατος του ανθρώπου και για τη μετάφρασή της το γονίδιο του HNF-4 χρησιμοποιεί έναν μακρινό υποκινητή, τον Ρ2. Η χρησιμοποίηση του υποκινητή Ρ2 έχει ως αποτέλεσμα τη συρραφή του εναλλακτικού εξονίου 1D, το οποίο βρίσκεται περίπου 46 kb πριν την 5 πλευρά του υποκινητή Ρ1 (Εικόνα 20). Έτσι, η έκφραση του HNF-4α θα μπορούσε να ρυθμίζεται μέσω του υποκινητή Ρ2 στο πάγκρεας, ενώ στο ήπαρ μέσω του υποκινητή Ρ1. Ωστόσο, βρέθηκε ότι τόσο στα νησίδια του παγκρέατος όσο και στα ηπατικά κύτταρα εκφράζονται ισομορφές που προκύπτουν από τον υποκινητή Ρ1 και από τον υποκινητή Ρ2. Μάλιστα, η εναλλαγή στην έκφραση των ισομορφών HNF-4α7 και HNF-4α1 ελέγχεται αναπτυξιακά. Η ισομορφή HNF-4α7 κυριαρχεί στα εμβρυονικά στάδια ανάπτυξης, ενώ η ισομορφή HNF-4α1 εντοπίζεται μόνο στον ενήλικο οργανισμό (Torres-Padilla and Weiss, 2003). Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι οι ισομορφές που προκύπτουν από τον υποκινητή Ρ1 παρουσιάζουν μεγαλύτερη δραστικότητα και αυξημένη ικανότητα σύνδεσης με τους συνενεργοποιητές σε σχέση με τις ισομορφές που προκύπτουν από τον υποκινητή Ρ2 (Jiang et al., 2003). Εικόνα 20 Γονίδιο HNF-4α όπου φαίνεται ο υποκινητής Ρ2 και το εναλλακτικό εξόνιο 1D (Jiang et al., 2003) Με βάση όλους τους πιθανούς συνδυασμούς εξονίων από την εναλλακτική συρραφή υπάρχουν τουλάχιστον άλλες 4 πιθανές ισομορφές, οι HNF-4α5, HNF-4α6, HNF-4α8 και HNF-4α9, η ύπαρξη των οποίων δεν έχει ακόμη επιβεβαιωθεί. Παρατηρούμε ότι όλες οι ισομορφές 1-6 του HNF-4α διαθέτουν 9 επιπλέον αμινοξέα 30

31 στο αμινοτελικό τους άκρο, εξαιτίας του γεγονότος ότι η θέση έναρξης της μετάφρασης εντοπίζεται 27 νουκλεοτίδια πριν από τη θέση έναρξης της μετάφρασης που είχε προταθεί προηγουμένως. Το φαινόμενο της εναλλακτικής συρραφής παρατηρείται εμφανώς ανάμεσα στα είδη, με πολλαπλές ισομορφές HNF-4 στις περιοχές A/B και F να έχουν εντοπιστεί στο μεταξοσκώληκα και στο κουνούπι. Μάλιστα, στο κουνούπι έχει βρεθεί μια ισομορφή χωρίς την περιοχή DBD, η οποία όμως δεν είναι λειτουργική. Επιπλέον, και στο βάτραχο έχουν ανιχνευτεί 3 προϊόντα εναλλακτικής συρραφής. Όσον αφορά τον HNF-4β, έχουν βρεθεί 3 διαφορετικά mrnas που προκύπτουν από εναλλακτική συρραφή και ονομάζονται HNF-4β1, HNF-4β2 και HNF-4β3 (Εικόνα 21). Οι HNF-4β2 και HNF-4β3 περιέχουν στη θέση 17, 17 δηλαδή νουκλεοτίδια πριν από το κωδικόνιο έναρξης της μετάφρασης, επιπλέον 36 και 145 νουκλεοτίδια, αντίστοιχα. Δεδομένου ότι τα επιπρόσθετα νουκλεοτίδια εντοπίζονται πριν από τη θέση έναρξης της μετάφρασης, δεν επηρεάζεται η ακολουθία της πρωτεΐνης HNF-4β (Holewa et al., 1996). Εικόνα 21 Διαφορετικά mrnas του HNF-4β από εναλλακτική συρραφή (Holewa et al., 1996) Όσον αφορά το γονίδιο του HNF-4γ, αυτό χαρτογραφείται στο χρωμόσωμα 8 του ανθρώπου και στο χρωμόσωμα 3 του ποντικού. Δεν έχουν γίνει μελέτες για τις ισομορφές του HNF-4γ που μπορεί να υπάρχουν (Taraviras et al., 2000). 31

32 Γονίδια-στόχοι του HNF-4 Ο HNF-4 παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην ιεραρχία των μεταγραφικών παραγόντων που ρυθμίζουν την έκφραση των ηπατοειδικών γονιδίων, δεδομένου ότι επάγει τη μεταγραφή του γονιδίου του μεταγραφικού παράγοντα HNF-1. Μάλιστα, για τον παράγοντα αυτό που είναι υπεύθυνος για την έκφραση πολλών ηπατικών γονιδίων έχει βρεθεί μια θέση σύνδεσης στον υποκινητή του γονιδίου του HNF-4α, γεγονός που υποδεικνύει την ύπαρξη μιας ανάστροφης ρύθμισης (Ryffel, 2001). Επιπλέον, ο HNF-4 ρυθμίζει την έκφραση μιας πληθώρας γονιδίων που εμπλέκονται σε διάφορα μεταβολικά μονοπάτια. Συγκεκριμένα, ενεργοποιεί τη μεταγραφή των γονιδίων των απολιποπρωτεϊνών που ευθύνονται για τη μεταφορά της χοληστερόλης και των λιπιδίων, του γονιδίου της τρανσφερίνης η οποία είναι υπεύθυνη για τη μεταφορά του σιδήρου, καθώς και του γονιδίου της τρανσθυρετίνης που ευθύνεται για τη μεταφορά της θυρεοειδούς ορμόνης Τ 4 (Ladias et al., 1992). Επίσης, ο HNF-4 ρυθμίζει την έκφραση γονιδίων που παίρνουν μέρος στο μεταβολισμό των αμινοξέων, όπως τα γονίδια της αμινοτρανσφεράσης της τυροσίνης (ΤΑΤ), της τρανσκαρβαμυλάσης της ορνιθίνης (OTC) και της οξειδάσης της προλίνης (PDH) (Kamiya et al., 2004), καθώς και γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των λιπιδίων, των στεροειδών και διαφόρων τοξικών ουσιών, όπως τα μέλη της οικογένειας του κυτοχρώματος P450 (Jover et al., 2000). Παράλληλα, ο HNF-4 ενεργοποιεί τη μεταγραφή γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό της γλυκόζης, όπως αυτά της γλυκοκινάσης, της καρβοξυκινάσης του φωσφοενολπυροσταφυλικού οξέος (PEPCK), της κινάσης του L-πυροσταφυλικού οξέος (L-PK) και της αλδολάσης Β (Miquerol et al., 1994). Επιπλέον, ο HNF-4 ρυθμίζει την έκφραση της πλειονότητας των γονιδίων που εξαρτώνται από τη βιταμίνη Κ και παίζουν σημαντικό ρόλο στην πήξη του αίματος. Έτσι, είναι υπεύθυνος για την ενεργοποίηση της μεταγραφής τους είτε άμεσα, όπως συμβαίνει με τα γονίδια των παραγόντων VII-XII, είτε έμμεσα, μέσω της έκφρασης του HNF-1, όπως συμβαίνει στην περίπτωση των γονιδίων που κωδικοποιούν το ινωδογόνο και την προθρομβίνη. Παράλληλα, ο HNF-4 ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου της αντιθρομβίνης ΙΙΙ και με τον τρόπο αυτό συμμετέχει στην αιμόσταση και στην απομάκρυνση θρόμβων. Επίσης, ο HNF-4 έχει την ικανότητα να αποκρίνεται σε συνθήκες υποξίας και να επάγει τη μεταγραφή του γονιδίου της ερυθροποιητίνης (ΕΡΟ), η οποία 32

33 προσδένεται σε ειδικούς υποδοχείς στα πρόδρομα ερυθροκύτταρα και προκαλεί αυξημένη παραγωγή ερυθροκυττάρων. Συγκεκριμένα, σε υποξικές συνθήκες σχηματίζεται στο κυτταρόπλασμα ετεροδιμερές ανάμεσα στον επαγόμενο από την υποξία παράγοντα HΙF-1α και στην πρωτεΐνη HΙF-1β (Ah receptor nuclear transporter, ARNT). Το ετεροδιμερές αυτό μετατοπίζεται στον πυρήνα όπου σχηματίζει σύμπλοκο με τον HNF-4 και τον συμπαράγοντα p300, το οποίο προσδένεται στον ενισχυτή του γονιδίου της ερυθροποιητίνης και προκαλεί την έκφρασή του (Εικόνα 22) (Zhu et al., 2002). Εικόνα 22 Ενεργοποίηση της μεταγραφής του γονιδίου της ερυθροποιητίνης από τον HNF-4 σε συνθήκες υποξίας (Zhu et al., 2002) Ρόλος HNF-4 στην ανάπτυξη Ο HNF-4α παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταγραφική ενεργοποίηση από τα πρώτα εμβρυονικά στάδια μέχρι και την ενηλικίωση. Ο υποδοχέας αυτός ανιχνεύεται κατά την ανάπτυξη στα ωοκύτταρα του μεταξοσκώληκα και του κουνουπιού. Στη 33

34 δροσόφιλα και στο βάτραχο βρίσκεται στο γονιμοποιημένο ωάριο με τη μορφή μητρικού RNA και πρωτεΐνης. Το ίδιο συμβαίνει και με τον HNF-4β στο βάτραχο. Στον ποντικό, το mrna του HNF-4α ανιχνεύεται στην 4.5 ημέρα της εμβρυονικής ανάπτυξης, οπότε και εμφανίζεται στο πρωτογενές ενδόδερμα. Για το λόγο αυτό, ο HNF-4α θεωρείται ένας από τους πρώτους παράγοντες-μάρτυρες του συγκεκριμένου ιστού. Από το πρωτογενές ενδόδερμα σχηματίζεται αργότερα το κοιλιακό ενδόδερμα, το οποίο αποτελεί έναν εξωεμβρυονικό ιστό που βρίσκεται στο λεκιθικό σάκο. Στο λεκιθικό σάκο εκφράζονται πολλά από τα γονίδια που εκφράζονται και στο ήπαρ, μεταξύ των οποίων αυτά του HNF-4α και του HNF-1. Από την ημέρα 5.5 ως και την ημέρα 8.5 της εμβρυονικής ανάπτυξης, το mrna του HNF-4α εκφράζεται έντονα στα κιονοειδή κοιλιακά ενδοδερμικά κύτταρα του λεκιθικού σάκου. Η έκφραση του HNF-4α σε εμβρυονικούς ιστούς αρχίζει κατά την ημέρα 8.5 της ανάπτυξης, οπότε και εμφανίζεται στο ήπαρ και στο οπίσθιο μέρος του εντέρου. Η εμφάνιση του HNF-4α συμπίπτει με τον πολλαπλασιασμό των ηπατικών κυττάρων και την έκφραση ηπατοειδικών γονιδίων, όπως η αλβουμίνη και η α-εμβρυϊκή πρωτεΐνη (α-φετοπρωτεΐνη). Η ενεργοποίηση της μεταγραφής αυτών των γονιδίων μεσολαβείται από τον μεταγραφικό παράγοντα HNF-1, το γονίδιο του οποίου αποτελεί στόχο του HNF-4α. Kατά την ημέρα 9.5 της ανάπτυξης, η έκφραση του HNF-4α αυξάνεται σημαντικά στο ήπαρ και στο μεσαίο τμήμα του εντέρου, από το οποίο θα προκύψουν το πάγκρεας και η χοληδόχος κύστη. Κατά την ημέρα 10.5, το mrna του HNF-4α παρατηρείται επίσης στον στόμαχο και στα μεσονεφρικά σωληνάρια, από τα οποία θα σχηματιστεί ο φλοιός του νεφρού. Κατά την ημέρα 13.5, ο HNF-4α ανιχνεύεται σε όλο το μήκος του εντέρου μέχρι τον πρωκτό. Η έκφραση του HNF-4α στο ήπαρ παρουσιάζει μέγιστο στην ημέρα 18 της ανάπτυξης. Κατά την ημέρα 20 παρατηρείται μια απότομη πτώση στην έκφραση του HNF-4α, ενώ κατά τη γέννηση ανιχνεύονται μικρές συγκεντρώσεις mrna του HNF-4α. Κατά την ημέρα 2-4 μετά τη γέννηση, παρατηρούνται ακόμη χαμηλότερα επίπεδα mrna. Στο ήπαρ των ενήλικων ατόμων, το mrna του HNF-4α εξακολουθεί να βρίσκεται σε παρόμοια επίπεδα με αυτά που παρατηρούνται κατά τις πρώτες ημέρες μετά τη γέννηση. Έρευνες σε ποντίκια στα οποία τα αλληλόμορφα του γονιδίου του HNF-4α δεν κωδικοποιούν λειτουργικό υποδοχέα δείχνουν ότι ο συγκεκριμένος πυρηνικός υποδοχέας παίζει κρίσιμο ρόλο στη γαστριδιοποίηση, στη διαδικασία δηλαδή κατά την οποία από την πολυδύναμη επιβλάστη προκύπτουν οι τρεις βλαστικές στιβάδες. 34

35 Στα ποντίκια αυτά παρατηρήθηκε ανώμαλος φαινότυπος κατά την ημέρα 6.5 της ανάπτυξης, διάστημα που αποτελεί το χρονικό σημείο έναρξης της γαστριδιοποίησης. Όλα τα έμβρυα παρουσίασαν αναστολή της ανάπτυξης, καθώς και ανωμαλία κατά το σχηματισμό του μεσοδέρματος. Δεδομένου ότι η γαστριδιοποίηση συμβαίνει πριν από την έκφραση του HNF-4α στους εμβρυϊκούς ιστούς που παρατηρείται κατά την ημέρα 8.5, υποστηρίχθηκε η άποψη ότι οι ανωμαλίες που παρατηρούνται κατά τη γαστριδιοποίηση οφείλονται στην απουσία φυσιολογικού κοιλιακού ενδοδέρματος, στο οποίο εκφράζεται ο HNF-4α. Συγκεκριμένα, η γαστριδιοποίηση αρχίζει, αλλά αποτυγχάνει να συνεχίσει περαιτέρω, εξαιτίας της αδυναμίας έκφρασης εκκριτικών πρωτεϊνών του ορού του κοιλιακού ενδοδέρματος, η οποία ρυθμίζεται από τον HNF- 4α (Watt et al., 2003). Άλλες μελέτες βασίζονται στη χρησιμοποίηση εμβρυοειδών σωματίων, τα οποία διαφοροποιούνται από εμβρυϊκά στελεχιαία κύτταρα απουσία του παράγοντα LIF, μοιάζουν με τα έμβρυα των ποντικών στα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια και περιέχουν διαφοροποιημένο κοιλιακό ενδόδερμα. Τα HNF-4α -/- εμβρυοειδή σωμάτια που περιέχουν HNF-4α +/+ εξωεμβρυονικούς ιστούς μπόρεσαν να ολοκληρώσουν τη γαστριδιοποίηση. Όλα τα παραπάνω υποδεικνύουν ότι για τη γαστριδιοποίηση είναι απαραίτητη η ύπαρξη ενός πλήρως διαφοροποιημένου κοιλιακού ενδοδέρματος, για τη σωστή λειτουργία του οποίου απαραίτητος παράγοντας είναι ο HNF-4α (Duncan et al., 1997). Σημαντική προσπάθεια έχει καταβληθεί και για την κατανόηση του ρόλου του HNF-4α στην ανάπτυξη του ηπατικού επιθηλίου και στην ηπατική μορφογένεση. Έχει βρεθεί ότι ο HNF-4α κατέχει κεντρικό ρόλο στη διαφοροποίηση των ηπατοκυττάρων. Επιπλέον, ευθύνεται για τη συγκέντρωση της γλυκόζης στο ήπαρ, καθώς και για τη δημιουργία του ηπατικού επιθηλίου. Οι μορφογενετικοί παράγοντες που βρίσκονται κάτω από τον έλεγχο του HNF-4α στα ηπατοκύτταρα είναι ουσιώδεις για την κατάλληλη μορφολογία του ήπατος και για την οργάνωση του ηπατικού επιθηλίου. Σύμφωνα με το προτεινόμενο μοντέλο, η αύξηση της έκφρασης του HNF- 4α κατά το μέσο της κυοφορίας οδηγεί στη διαφοροποίηση των ηπατοκυττάρων και στην έκφραση μορίων κυτταρικής προσκόλλησης και συνδετικών πρωτεϊνών, με αποτέλεσμα τα ηπατικά κύτταρα να σχηματίζουν ένα επιθήλιο που εμφανίζει πολικότητα. Έπειτα, τα ηπατικά κύτταρα εκφράζουν παράγοντες που βοηθούν τη διατήρηση των τριχοειδών στην κορυφαία πλευρά της βασικής μεμβράνης. 35

36 Έχει παρατηρηθεί ότι ένας οργανισμός θα πρέπει να διαθέτει τουλάχιστον ένα λειτουργικό αντίγραφο του γονιδίου του HNF-4α, έτσι ώστε να καταστεί βιώσιμος μέχρι και τη γέννησή του. Μελέτες σε ανθρώπινους πληθυσμούς δείχνουν πως τα ζώντα ενήλικα άτομα είναι ομόζυγα για τον άγριου τύπου HNF-4α ή ετερόζυγα με ένα μεταλλαγμένο αντίγραφο. Σε αντίθεση με τον HNF-4α, άλλοι πυρηνικοί υποδοχείς, όπως ο υποδοχέας ανδρογόνων και ο θυρεοειδικός υποδοχέας, εμφανίζουν μεταλλάξεις και στα δύο αλληλόμορφα γονίδια σε ορισμένες ασθένειες του ανθρώπου. Κάποιοι άλλοι πυρηνικοί υποδοχείς, όπως ο υποδοχέας ρετινοϊκού οξέος (RAR) προϋποθέτουν την απουσία τουλάχιστον του ενός αλληλομόρφου στον ποντικό, ώστε να είναι δυνατή η παρατήρηση κάποιου σημαντικά αλλαγμένου φαινοτύπου. Από τα παραπάνω μπορούμε να συμπεράνουμε ότι οι HNF-4β και HNF- 4γ δεν έχουν την ικανότητα να υποκαταστήσουν τον HNF-4α όταν είναι απών κατά την ανάπτυξη των θηλαστικών, γεγονός που υποδεικνύει διακριτούς ρόλους για αυτούς τους δύο υποδοχείς (Watt et al., 2003). Σκοπός της εργασίας Ο σκοπός της συγκεκριμένης εργασίας είναι η ενίσχυση του γονιδίου που κωδικοποιεί τον πυρηνικό υποδοχέα HNF-4 στο είδος Mytilus galloprovincialis. Όπως είδαμε παραπάνω, ο HNF-4 παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στη μεταγραφική ενεργοποίηση από τα πρώτα εμβρυονικά στάδια μέχρι και την ενηλικίωση των διαφόρων οργανισμών. Ρυθμίζει την έκφραση μιας πληθώρας γονιδίων που εμπλέκονται σε διάφορα μεταβολικά μονοπάτια, ενώ παράλληλα είναι απαραίτητος για τη διαφοροποίηση των ηπατοκυττάρων, τη δημιουργία του ηπατικού επιθηλίου και τη γαστριδιοποίηση. Όλα αυτά φανερώνουν τη σπουδαιότητα της δράσης του καθόλη τη διάρκεια ζωής των οργανισμών. Όσον αφορά το M. galloprovincialis, αυτό αποτελεί το πιο διαδεδομένο είδος μυδιού στη Μεσόγειο θάλασσα. Ωστόσο, παρά τη μεγάλη οικονομική του σημασία, λίγα είναι γνωστά σε μοριακό επίπεδο. Συχνά εκτίθεται σε συνθήκες υποξίας, στις οποίες έχει την ικανότητα να αποκρίνεται ο HNF-4 και να επάγει τη μεταγραφή του γονιδίου της ερυθροποιητίνης. Δεδομένου ότι δεν υπάρχουν καταχωρημένες στις βάσεις δεδομένων νουκλεοτιδικές ακολουθίες του HNF-4 που να ανήκουν στα μαλάκια, είναι πολύ σημαντικό να απομονωθεί το συγκεκριμένο γονίδιο από έναν εκπρόσωπο αυτής της κλάσης, όπως είναι το M. galloprovincialis. 36

37 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Απομόνωση DNA από το Mytilus galloprovincialis Για την απομόνωση DNA από το Mytilus galloprovincialis χρησιμοποιήθηκε μυϊκός ιστός και μανδύας ατόμων του φυσικού πληθυσμού των Νέων Επιβατών στο Θερμαϊκό Κόλπο. Τα βήματα της διαδικασίας φαίνονται στην Εικόνα 23 και είναι τα εξής: Ζυγίζονται gr ιστού και μεταφέρονται σε σωλήνα eppendorf. Στο σωλήνα προστίθενται 400 μl διαλύματος ομογενοποίησης και 10 μl πρωτεϊνάσης Κ συγκέντρωσης 20 mg/ml. Το δείγμα επωάζεται στους 55 o C για 2 ώρες. Προστίθεται ίσος όγκος φαινόλης και ακολουθεί ανάδευση για 20 min και φυγοκέντρηση για 10 min στους 4 o C στις rpm. Η υδάτινη φάση μεταφέρεται σε νέο σωλήνα eppendorf. Προστίθεται ίσος όγκος φαινόλης:χλωροφορμίου 1:1 και ακολουθεί φυγοκέντρηση για 7 min στους 4 o C στις rpm. Η υδάτινη φάση μεταφέρεται σε νέο σωλήνα eppendorf. Προστίθεται ίσος όγκος χλωροφορμίου και ακολουθεί φυγοκέντρηση για 5 min στους 4 o C στις rpm. Η υδάτινη φάση μεταφέρεται σε νέο σωλήνα eppendorf. Προστίθεται διπλάσιος όγκος παγωμένης αιθανόλης 100%, έτσι ώστε να γίνει κατακρήμνιση του DNA, και ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1-2 min στους 4 o C στις rpm. Απομακρύνεται το υπερκείμενο. Προστίθενται 100 μl παγωμένης αιθανόλης 70%, έτσι ώστε να γίνει καθαρισμός του ιζήματος, και ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1-2 min στους 4 o C στις rpm. Απομακρύνεται καλά το υπερκείμενο και το ίζημα στεγνώνει καλά, έτσι ώστε να απομακρυνθούν τα υπολείμματα αιθανόλης. Το ίζημα επαναιωρείται σε 100 μl T.E. (Tris-EDTA ph=8.0). 37

38 Εικόνα 23 Διαδικασία απομόνωσης DNA από το Mytilus galloprovincialis Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) αποτελεί μια ενζυμική in vitro μέθοδο για την ενίσχυση μιας συγκεκριμένης περιοχής DNA και δίνει τη δυνατότητα από ένα μόνο αντίγραφο DNA να προκύψει μεγάλος αριθμός αντιγράφων. Απαραίτητη για την αντίδραση αυτή είναι η ύπαρξη δύο ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών (forward και reverse primers) οι οποίοι είναι μονόκλωνα τμήματα DNA, συμπληρωματικά προς τα 5 άκρα των αλυσίδων της αλληλουχίας-στόχου, που προσδένονται στα άκρα του υπό ενίσχυση τμήματος. Στο μίγμα της αντίδρασης πρέπει να υπάρχει επίσης DNA πολυμεράση και δεοξυριβονουκλεοτίδια για την επιμήκυνση του DNA κατά μήκος της αλληλουχίαςστόχου, καθώς επίσης και MgCl 2 δεδομένου ότι τα ιόντα Mg 2+ είναι απαραίτητα για τη δράση της πολυμεράσης. Η PCR βασίζεται σε επαναλαμβανόμενους κύκλους (συνήθως 25-35), καθένας από τους οποίους αποτελείται από 3 στάδια: 38

39 Θερμική μετουσίωση της δίκλωνης δομής του DNA σε μονόκλωνο DNA με επώαση σε υψηλή θερμοκρασία (90-95 ο C). Υβριδισμός των ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών στις συμπληρωματικές αλυσίδες του DNA. Η θερμοκρασία υβριδισμού (Τ a ) υπολογίζεται με βάση τον τύπο Τ a = T m - 5 ( o C), όπου T m η θερμοκρασία τήξης των εκκινητών. Πολυμερισμός του DNA με τη δράση της DNA πολυμεράσης, η οποία προσθέτει νουκλεοτίδια στο 3 άκρο των εκκινητών. Η DNA πολυμεράση που χρησιμοποιείται είναι θερμοανθεκτική και απομονώνεται από το θερμόφιλο βακτήριο Thermus aquaticus. Το στάδιο αυτό διεξάγεται στη θερμοκρασία των 72 ο C. Η επανάληψη του κύκλου αυτού έχει ως αποτέλεσμα τη γεωμετρική ενίσχυση της επιθυμητής ακολουθίας του DNA, με τελικό αριθμό μορίων 2 n, όπου n ο αριθμός των κύκλων (Εικόνα 24) (Mullis et al., 1986, Saiki et al., 1988). Εικόνα 24 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Ηλ. Πηγή 8) 39

40 Μια ειδική περίπτωση PCR είναι η Touchdown PCR. Κατά τους πρώτους κύκλους της Touchdown PCR, η θερμοκρασία υβριδισμού μειώνεται σταδιακά κατά 0,5 ο C ή 1 ο C μέχρι την αναμενόμενη θερμοκρασία υβριδισμού των εκκινητών ή και μικρότερη από αυτή. Στους επόμενους κύκλους, η θερμοκρασία παραμένει σταθερή. Η Touchdown PCR εμφανίζει το πλεονέκτημα ότι αποφεύγονται οι πολλαπλές δοκιμές για τις βέλτιστες αναλογίες αντιδραστηρίων και τις βέλτιστες συνθήκες θερμοκρασίας και χρόνου. Επιπλέον, μέχρι η θερμοκρασία υβριδισμού να κατέβει στη θερμοκρασία όπου εμφανίζεται μη ειδικός υβριδισμός, το ειδικό-επιθυμητό προϊόν διαθέτει ένα γεωμετρικό προβάδισμα σε σχέση με τα μη ειδικά προϊόντα (Don and Cox, 1991). Σχεδιασμός εκκινητών Για το σχεδιασμό των εκκινητών, αρχικά βρέθηκαν καταχωρημένες σε βάσεις δεδομένων αμινοξικές και νουκλεοτιδικές ακολουθίες του πυρηνικού υποδοχέα HNF- 4 που προέρχονται από διάφορα είδη οργανισμών, τόσο σπονδυλωτά όσο και ασπόνδυλα (Πίνακες 1, 2, 3) (Ηλ. Πηγές 9, 10). Στη συνέχεια, έγινε ευθυγράμμιση των πρωτεϊνικών τμημάτων που καλύπτουν την περιοχή σύνδεσης στο DNA, την περιοχή D και την περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη με το πρόγραμμα ClustalW (Higgins et al., 1994) (Ηλ. Πηγή 11) και εντοπίστηκαν αρκετές συντηρημένες ακολουθίες 9-10 αμινοξέων, οι οποίες κωδικοποιούνται από νουκλεοτιδική περιοχή που δεν διακόπτεται από ιντρόνιο με βάση τα καταχωρημένα γονίδια του HNF-4 (Εικόνα 25). Οι ακολουθίες αυτές μεταφράστηκαν αντίστροφα με βάση τον παγκόσμιο γενετικό κώδικα (Standard) και τον πίνακα χρήσης κωδικονίων (Codon Usage Table) του M. galloprovincialis (Πίνακας 4), ο οποίος βρίσκεται κατατεθειμένος στη βάση δεδομένων CUTG (Ηλ. Πηγή 12). Έπειτα, έγινε σύγκριση των νουκλεοτιδικών ακολουθιών που προέκυψαν από την αντίστροφη μετάφραση με τις νουκλεοτιδικές ακολουθίες (cdna) του HNF-4 διαφορετικών οργανισμών. Με τον τρόπο αυτό σχεδιάστηκαν εκφυλισμένοι εκκινητές, πολλαπλά, δηλαδή, αντίγραφα ενός ολιγονουκλεοτιδίου, όπου σε επιλεγμένες θέσεις το νουκλεοτίδιο ποικίλλει. Στον Πίνακα 5 φαίνεται ο εκφυλισμένος γενετικός κώδικας. Στην Εικόνα 26 φαίνονται όλοι οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση τμήματος του γονιδίου του HNF-4, ενώ οι ακολουθίες τους παρατίθενται στον Πίνακα 6. Πρέπει να σημειωθεί ότι οι εκκινητές MB_F1 και NLB_R δεν είναι εκφυλισμένοι, δεδομένου ότι σχεδιάστηκαν με βάση 40

41 την εύρεση της πρωτοταγούς αλληλουχίας τμημάτων του γονιδίου που προέκυψαν από την ενίσχυση με τους εκφυλισμένους εκκινητές. Ο υπολογισμός της θερμοκρασίας τήξης των εκκινητών (T m ) και ο έλεγχος για το σχηματισμό βρόχων καθώς και ομοδιμερών και ετεροδιμερών μεταξύ των εκκινητών έγινε με τη βοήθεια του προγράμματος Oligoanalyzer. Πίνακας 1 Κωδικοί πρόσβασης και οργανισμοί από τους οποίους προέρχονται οι πρωτεΐνες HNF-4 που χρησιμοποιήθηκαν για το σχεδιασμό των εκκινητών Κωδικός πρόσβασης Οργανισμός Περιγραφή AAP82997 NP_ BAA01411 AAH39220 CAA40412 BAB CAA85763 AAB09592 AAB93762 Bos taurus (αγελάδα) Homo sapiens (άνθρωπος) Rattus norvegicus (νορβηγικός αρουραίος) Mus musculus (ποντίκι) Rattus rattus (μαύρος αρουραίος) Tamias sibiricus (τρωκτικό ταμίας Σιβηρίας) Xenopus laevis (αφρικανικός βάτραχος) Drosophila melanogaster (μύγα των φρούτων) Bombyx mori (οικόσιτος μεταξοσκώληκας) hepatocyte nuclear factor 4 alpha hepatocyte nuclear factor 4 alpha isoform a hepatocyte nuclear factor 4 alpha hepatic nuclear factor 4, alpha transcription factor HNF-4 alpha hepatocyte nuclear factor 4 alpha hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4a) hepatocyte nuclear factor 4 homolog hepatocyte nuclear factor 4 isoform a Πίνακας 2 Κωδικοί πρόσβασης και οργανισμοί από τους οποίους προέρχονται τα γονίδια του HNF-4 που χρησιμοποιήθηκαν για το σχεδιασμό των εκκινητών Κωδικός πρόσβασης Οργανισμός Περιγραφή NC_ NC_ NT_ Homo sapiens (άνθρωπος) Mus musculus (ποντίκι) Drosophila melanogaster (μύγα των φρούτων) Homo sapiens chromosome 20, complete sequence Mus musculus chromosome 2 Drosophila melanogaster chromosome 2L, complete sequence 41

42 Πίνακας 3 Κωδικοί πρόσβασης και οργανισμοί από τους οποίους προέρχονται οι νουκλεοτιδικές ακολουθίες (cdna) του HNF-4 που χρησιμοποιήθηκαν για το σχεδιασμό των εκκινητών Κωδικός πρόσβασης Οργανισμός Περιγραφή AY NM_ D10554 BC X57133 BAB03286 BC U70874 U63843 Bos taurus (αγελάδα) Homo sapiens (άνθρωπος) Rattus norvegicus (νορβηγικός αρουραίος) Mus musculus (ποντίκι) Rattus rattus (μαύρος αρουραίος) Tamias sibiricus (τρωκτικό ταμίας Σιβηρίας) Xenopus laevis (αφρικανικός βάτραχος) Drosophila melanogaster (μύγα των φρούτων) Bombyx mori (οικόσιτος μεταξοσκώληκας) hepatocyte nuclear factor 4 alpha mrna, complete cds hepatocyte nuclear factor 4, alpha (HNF4A), transcript variant 3, mrna mrna for hepatocyte nuclear factor 4 alpha, complete cds hepatic nuclear factor 4, alpha, mrna (cdna clone MGC:31368 IMAGE: ), complete cds mrna for hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4a) hepatocyte nuclear factor 4 alpha hepatic nuclear factor 4 alpha, mrna (cdna clone MGC:53298 IMAGE: ), complete cds hepatocyte nuclear factor 4 homolog (HNF-4(D)) mrna, complete cds hepatocyte nuclear factor 4 isoform a (BmHNF-4) mrna, complete cds 42

43 hndb_f hndb_r B. taurus CAICGDRATGKHYGASSCDGCKGFFRRSVRKNHMYSCRFSRQCVVDKDKRNQCRYCRLKK 60 H. sapiens CAICGDRATGKHYGASSCDGCKGFFRRSVRKNHMYSCRFSRQCVVDKDKRNQCRYCRLKK 60 R. norvegicus CAICGDRATGKHYGASSCDGCKGFFRRSVRKNHMYSCRFSRQCVVDKDKRNQCRYCRLKK 60 M. musculus CAICGDRATGKHYGASSCDGCKGFFRRSVRKNHMYSCRFSRQCVVDKDKRNQCRYCRLKK 60 R. rattus CAICGDRATGKHYGASSCDGCKGFFRRSVRKNHMYSCRFSRQCVVDKDKRNQCRYCRLKK 60 T. sibiricus CAICGDRATGKHYGASSCDGCKGFFRRSVRKNHMYSCRFSRQCVVDKDKRNQCRYCRLKK 60 X. laevis CAICGDRATGKHYGASSCDGCKGFFRRSVRKNHMYSCRFSRQCVVDKDKRNQCRYCRLKK 60 D. melanogaster CAICGDRATGKHYGASSCDGCKGFFRRSVRKNHQYTCRFARNCVVDKDKRNQCRYCRLRK 60 B. mori CAICGDRATGKHYGASSCDGCKGFFRRSVRKNHLYTCRFSRNCVVDKDKRNQCRYCRLRK 60 ********************************* *:***:*:****************:* NF 1 B. taurus CFRAGMKKEAVQNERDRISTRRSSYEDSSLP---SINALLQAEVLSQQITSP---VSGIN 114 H. sapiens CFRAGMKKEAVQNERDRISTRRSSYEDSSLP---SINALLQAEVLSRQITSP---VSGIN 114 R. norvegicus CFRAGMKKEAVQNERDRISTRRSSYEDSSLP---SINALLQAEVLSQQITSP---ISGIN 114 M. musculus CFRAGMKKEAVQNERDRISTRRSSYEDSSLP---SINALLQAEVLSQQITSP---ISGIN 114 R. rattus CFRAGMKKEAVQNERDRISTRRSSYEDSSLP---SINALLQAEVLSQQITSP---ISGIN 114 T. sibiricus CFRAGMKKEAVQNERDRISTRRSSYEDSSLP---SINALLQAEVLSQQITSP---VSGIN 114 X. laevis CFRAGMKKEAVQNERDRISTRRSSYEDSSLP---SINVLIQAEVLSQQITSS---VGVLN 114 D. melanogaster CFKAGMKKEAVQNERDRISCRRTSNDDPDPGNGLSVISLVKAENESRQSKAGAAMEPNIN 120 B. mori CFKAGMKKEAVQNERDRINCRRPSYEEPTQANGLSVVSLLNAELLSRKVIDETVNVS--D 118 **:***************. **.* ::. :*: *::** *:: NR 2 :: B. taurus GDIRAKKIASIADVCESMKEQLLVLVEWAKYIPAFCELPLDDQVALLRAHAGEHLLLGAT 174 H. sapiens GDIRAKKIASIADVCESMKEQLLVLVEWAKYIPAFCELPLDDQVALLRAHAGEHLLLGAT 174 R. norvegicus GDIRAKKIANITDVCESMKEQLLVLVEWAKYIPAFCELLLDDQVALLRAHAGEHLLLGAT 174 M. musculus GDIRAKKIANITDVCESMKEQLLVLVEWAKYIPAFCELLLDDQVALLRAHAGEHLLLGAT 174 R. rattus GDIRAKRIASITDVCESMKEQLLVLVEWAKYIPAFCELLLDDQVALLRAHAGEHLLLGAT 174 T. sibiricus GDIRAKKIANIADVCESMKEQLLVLVEWAKYIPAFCELLLDDQVALLRAHAGEHLLLGAT 174 X. laevis TDIRGKKIACIIDVCDSMKQQLLVLVEWAKYIPAFCELPLDDQVALLRAHAGEHLLLGAT 174 D. melanogaster EDLSNKQFASINDVCESMKQQLLTLVEWAKQIPAFNELQLDDQVALLRAHAGEHLLLGLS 180 B. mori AEINNRKLAKINDVCDSIKQQLLILVEWAKYIPAFTVLHLDDQVALLRAHAGEHLLLGCA 178 :: :::* * ***:*:*:*** ****** **** * ******************* : NF_4 B. taurus KRSMVFKDVLLLGNDYIVPRHC-----PELAEMSRVSVRILDELVLPFQELQIDDNEYAC 229 H. sapiens KRSMVFKDVLLLGNDYIVPRHC-----PELAEMSRVSIRILDELVLPFQELQIDDNEYAY 229 R. norvegicus KRSMVFKDVLLLGNDYIVPRHC-----PELAEMSRVSIRILDELVLPFQELQIDDNEYAC 229 M. musculus KRSMVFKDVLLLGNDYIVPRHC-----PELAEMSRVSIRILDELVLPFQELQIDDNEYAC 229 R. rattus KRSMVFKDVLLLGNDYIVPRHC-----PELAEMSRVSIRILDELVLPFQELQIDDNEYAC 229 T. sibiricus KRSMVFKDVLLLGNDYIVPRHC-----PELAEMSRVSIRILDELVLPFQELQIDDNEYAC 229 X. laevis KRSMMFKDILLLGNDRLIPRNC-----PEL-EVGRVAVRILDELVLPFQELQIDDNEYAC 228 D. melanogaster RRSMHLKDVLLLSNNCVITRHCPDPLVSPNLDISRIGARIIDELVTVMKDVGIDDTEFAC 240 B. mori RRSLHLKDILLLGNNCIITKHNIDGRMD--IDISMIGMRVMDEIVKPLREIDIDDTEFAC 236 :**: :**:***.*: ::.:: : ::. :. *::**:* :::: ***.*:* hnf_f1 hnf_f2 B. taurus LKAIIFFDPDAKGLSDPGKIKRLRSQVQVSLEDYINDRQYDSRGRFGELLLLLPTLQSIT 289 H. sapiens LKAIIFFDPDAKGLSDPGKIKRLRSQVQVSLEDYINDRQYDSRGRFGELLLLLPTLQSIT 289 R. norvegicus LKAIIFFDPDAKGLSDPGKIKRLRSQVQVSLEDYINDRQYDSRGRFGELLLLLPTLQSIT 289 M. musculus LKAIIFFDPDAKGLSDPGKIKRLRSQVQVSLEDYINDRQYDSRGRFGELLLLLPTLQSIT 289 R. rattus LKAIIFFDPDAKGLSDPGKIKRLRSQVQVSLEDYINDRQYDSRGRFGELLLLLPTLQSIT 289 T. sibiricus LKAIIFFDPDAKGLSDPGKIKRLRSQVQVSLEDYINDRQYDSRGRFGELLLLLPTLQSIT 289 X. laevis LKAIIFFDPDAKGLSDPTKIKRMRYQVQVSLEDYINDRQYDSRGRFGELLLLLPTLQSIT 288 D. melanogaster IKALVFFDPNAKGLNEPHRIKSLRHQILNNLEDYISDRQYESRGRFGEILLILPVLQSIT 300 B. mori LKAIVFFDPNAKGLSQPQKIKQLRYQIQINLEDYISDRQYDGRGRFGELLLCLPPLQSIT 296 :**::****:****.:* :** :* *:.*****.****:.******:** ** ***** hnf_r1 hnf_r2 B. taurus WQMIEQIQFIKLFGMAKIDNLLQEMLLG 317 H. sapiens WQMIEQIQFIKLFGMAKIDNLLQEMLLG 317 R. norvegicus WQMIEQIQFIKLFGMAKIDNLLQEMLLG 317 M. musculus WQMIEQIQFIKLFGMAKIDNLLQEMLLG 317 R. rattus WQMIEQIQFIKLFGMAKIDNLLQEMLLG 317 T. sibiricus WQMIEQIQFIKLFGMAKIDNLLQEMLLG 317 X. laevis WQMIEQIQFVKLFGMAKIDNLLQEMLLG 316 D. melanogaster WQMIEQIQFAKIFGVAHIDSLLQEMLLG 328 B. mori WQMIEQIQFAKLFGVAHVDSLLQEMLLG 324 ********* *:**:*::*.******** Εικόνα 25 Συντηρημένες ακολουθίες 9-10 αμινοξέων που παρατηρούνται κατά την ευθυγράμμιση των πρωτεϊνών του HNF-4 διαφόρων οργανισμών και εκκινητές στους οποίους αντιστοιχούν 43

44 Πίνακας 4 Πίνακας χρήσης κωδικονίων του M. galloprovincialis Mytilus galloprovincialis [gbinv]: 38 CDS's (16538 codons) fields: [triplet] [amino acid] [fraction] [frequency: per thousand] ([number]) UUU F (210) UCU S (213) UAU Y (333) UGU C (246) UUC F (219) UCC S (142) UAC Y (214) UGC C (101) UUA L (149) UCA S (316) UAA * (28) UGA * (9) UUG L (230) UCG S (26) UAG * (1) UGG W (118) CUU L (235) CCU P (259) CAU H (167) CGU R (199) CUC L (158) CCC P (110) CAC H (108) CGC R (42) CUA L (86) CCA P (784) CAA Q (373) CGA R (87) CUG L (97) CCG P (21) CAG Q (213) CGG R (8) AUU I (293) ACU T (245) AAU N (335) AGU S (250) AUC I (313) ACC T (201) AAC N (333) AGC S (132) AUA I (115) ACA T (370) AAA K (858) AGA R (393) AUG M (285) ACG T (34) AAG K (581) AGG R (105) GUU V (326) GCU A (504) GAU D (485) GGU G (550) GUC V (231) GCC A (345) GAC D (325) GGC G (228) GUA V (230) GCA A (614) GAA E (729) GGA G (1088) GUG V (113) GCG A (25) GAG E (331) GGG G (69) Genetic code : Standard Πίνακας 5 Εκφυλισμένος γενετικός κώδικας Σύμβολο A C G T R Y M K W S B D H V N Νουκλεοτίδια A C G T AG CT AC GT AT CG CGT AGT ACT ACG ACGT 44

45 Εικόνα 26 Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση τμήματος του γονιδίου του HNF-4 και πρωτεϊνική περιοχή στην οποία αντιστοιχούν. Το βέλος συμβολίζει τους forward εκκινητές, ενώ το βέλος τους reverse εκκινητές. Πίνακας 6 Αλληλουχία εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση τμημάτων του γονιδίου του HNF-4 και πρωτεϊνική περιοχή στην οποία σχεδιάστηκαν Ονομασία εκκινητή Αλληλουχία εκκινητή (5 3 ) Περιοχή ΗΝF-4 στην οποία σχεδιάστηκε hndb_f ATCTGTGGAGAYMGRGCAACAGGMAA C hndb_r CATTGRTTTCKYTTRTCYTTRTCAACAACRCA C NF_1 GAAGCAGTTCAAAATGARMGRGAYMGRAT D MB_F1 TGTGACCTGACACACAAGGTTATAGC E NR_2 GAATGCTGGGATWTRYTTTGCCCAYTC E NF_4 ATCGATGATAMTGAATWYGCATRYMTTAARGC E hnf_f1 GGACTTTCASAWCCASRMARRATCAA E hnf_f2 CTTGAAGAYTATATCAAYGATMGACARTA E NLB_R GGCAACAGTAATAAAATCTCCCCAAATC E hnf_r1 GAATTGGATYTGYTCGATCATYTGCCA E hnf_r2 CATTTCTTGAAGMAGRYTATCRAYTTTKGC E 45

46 Touchdown PCR Η Taq DNA πολυμεράση που χρησιμοποιήθηκε προέρχεται από την εταιρεία Promega και συνοδεύεται από το ρυθμιστικό διάλυμα Α και διάλυμα MgCl 2. Οι εκκινητές hnf_f1, hnf_f2, hnf_r1 και hnf_r2 προέρχονται από το Εργαστήριο Μικροχημείας του Ιδρύματος Τεχνολογίας και Έρευνας της Κρήτης, ενώ οι εκκινητές hndb_f, hndb_r, NF_1, MB_F1, NR_2, NF_4, και NLB_R, καθώς και τα δεοξυριβονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν προέρχονται από την εταιρία Invitrogen. Στους Πίνακες 7, 8, 9 φαίνονται οι συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων και τα προγράμματα της PCR που χρησιμοποιήθηκαν με διάφορους συνδυασμούς των παραπάνω εκκινητών για την ενίσχυση νουκλεοτιδικών αλληλουχιών του γονιδίου που κωδικοποιεί τον HNF-4 στο M. galloprovincialis. Πίνακας 7 Συγκεντρώσεις αντιδραστηρίων για την ενίσχυση του γονιδίου του HNF-4 με τους διάφορους συνδυασμούς εκκινητών Αντιδραστήρια H 2 O Buffer MgCl 2 Μίγμα dntps Forward primer Reverse primer Taq DNA polymerase DNA Συνολικός όγκος Συγκέντρωση Μέχρι τον τελικό όγκο 1 X 2,5 mm 200 μμ 1 μμ 1 μμ 1 Unit 2 μl 25 μl 46

47 Πίνακας 8 Πρόγραμμα PCR για την ενίσχυση νουκλεοτιδικών αλληλουχιών του γονιδίου του HNF-4 με τους συνδυασμούς εκκινητών hndb_f-hndb_r, hnf_f1-hnf_r1, NF_4-NLB_R και hnf_f2- hnf_r2 Στάδια Θερμοκρασία ( ο C) Χρόνος Αρχική μετουσίωση 94 5 min Μετουσίωση 94 1 min Υβριδισμός εκκινητών 55-1/κύκλο 3 min Πολυμερισμός 72 1 min Μετουσίωση 94 1 min Υβριδισμός εκκινητών 45 3 min Πολυμερισμός 72 1 min Τελικό στάδιο πολυμερισμού min 11 κύκλοι 24 κύκλοι Πίνακας 9 Πρόγραμμα PCR για την ενίσχυση νουκλεοτιδικών αλληλουχιών του γονιδίου του HNF-4 με τους συνδυασμούς εκκινητών hndb_f-nr_2, NF_1-NR_2, MB_F1-NLB_R και MB_F1- hnf_r1 Στάδια Θερμοκρασία ( ο C) Χρόνος Αρχική μετουσίωση 94 5 min Μετουσίωση 94 1 min Υβριδισμός εκκινητών /κύκλο 3 min Πολυμερισμός 72 1 min Μετουσίωση 94 1 min Υβριδισμός εκκινητών 55 3 min Πολυμερισμός 72 1 min Τελικό στάδιο πολυμερισμού min 11 κύκλοι 24 κύκλοι 47

48 Μετά την PCR ακολουθεί ηλεκτροφόρηση των προϊόντων σε πηκτή αγαρόζης. Η συγκέντρωση του βρωμιούχου αιθιδίου είναι 5 mg/ml. Οι μάρτυρες μοριακών βαρών που χρησιμοποιήθηκαν είναι ο pucmix8 και ο GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus από την εταιρεία Fermentas και το πρότυπο των ζωνών που δίνουν φαίνεται στην Εικόνα 27. Εικόνα 27 Πρότυπο ζωνών μαρτύρων μοριακών βαρών pucmix8 (αριστερά) και GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus (δεξιά) της εταιρείας Fermentas σε πηκτή αγαρόζης 2% 48

49 Καθαρισμός προϊόντων PCR και εύρεση πρωτοταγούς αλληλουχίας Για τον καθαρισμό της ζώνης που περιέχει το επιθυμητό προϊόν από την πηκτή αγαρόζης χρησιμοποιήθηκε το QIAquick Gel Extraction Kit της εταιρείας Qiagen (Εικόνα 28). Έτσι, μετά την ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR σε πηκτή αγαρόζης, ακολουθείται η εξής διαδικασία: Με τη βοήθεια καθαρής λεπίδας κόβεται το κομμάτι της πηκτής αγαρόζης που περιέχει την επιθυμητή ζώνη, τοποθετείται σε σωλήνα eppendorf και ζυγίζεται. Προστίθεται τριπλάσιος όγκος buffer QG σε σχέση με τον όγκο του κομματιού της πηκτής. Θεωρείται ότι 1 μl =1 mg. Το δείγμα επωάζεται στους 50 ο C για 18 min, αναδεύοντας με vortex κάθε 3 min κατά τη διάρκεια της επώασης, έτσι ώστε να λιώσει και να διαλυθεί καλά η αγαρόζη. Προστίθεται ίσος όγκος ισοπροπανόλης με τον όγκο του κομματιού της πηκτής και ακολουθεί καλή ανάδευση. Το δείγμα τοποθετείται στη στήλη QIAquick spin column, η οποία βρίσκεται μέσα σε ένα σωλήνα των 2 ml, προκειμένου να προσδεθεί το DNA, και ακολουθεί φυγοκέντρηση στις rpm για 1 min. Στη στήλη προστίθενται 500 μl buffer QG και ακολουθεί φυγοκέντρηση στις rpm για 1 min. Στη στήλη προστίθενται 750 μl buffer PE για να ξεπλυθεί, παραμένει σε ηρεμία για 5 min και ακολουθεί φυγοκέντρηση στις rpm για 1 min. Το υγρό απορρίπτεται από το σωλήνα και ακολουθεί ξανά φυγοκέντρηση στις rpm για 1 min. Η στήλη τοποθετείται σε καθαρά eppendorfs του 1.5 ml. Στο κέντρο της στήλης προστίθενται 30 μl buffer EΒ προκειμένου να γίνει η έκλουση του DNA, η στήλη παραμένει σε ηρεμία για 2 min και ακολουθεί φυγοκέντρηση στις rpm για 1 min. Το στάδιο αυτό επαναλαμβάνεται μια ακόμη φορά. Το υγρό που απομένει συλλέγεται σε καθαρά eppendorfs. 49

50 Εικόνα 28 Διαδικασία καθαρισμού προϊόντων PCR με χρήση του QIAquick Gel Extraction Kit της εταιρείας Qiagen (Ηλ. Πηγή 13) Η συγκέντρωση του DNA που εκλούστηκε υπολογίζεται μετά από ηλεκτροφόρηση μιας μικρής ποσότητας του δείγματος σε πηκτή αγαρόζης και σύγκριση με τους μάρτυρες μοριακών βαρών pucmix8 και GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus των οποίων η συγκέντρωση είναι γνωστή. Για την εύρεση της πρωτοταγούς αλληλουχίας του DNA (sequencing), τα δείγματα στάλθηκαν στην εταιρεία Macrogen στην Κορέα. 50

51 Σάρωση γονιδιωματικής βιβλιοθήκης Η γονιδιωματική βιβλιοθήκη που χρησιμοποιήθηκε αποτελείται από βακτηριοφάγους λ, και συγκεκριμένα μέλη του στελέχους Lambda FIXII της εταιρείας Stratagene. Πρόκειται για βακτηριοφαγικούς φορείς που αποτελούνται από δύο βραχίονες και ένα μεσαίο τμήμα (stuffer), το οποίο περιέχει τα γονίδια που παρέχουν λυσιγονικές ιδιότητες. Το τμήμα αυτό απομακρύνεται έπειτα από πέψη με κατάλληλη ενδονουκλεάση περιορισμού και στη θέση του ενσωματώνονται τα επιθυμητά τμήματα γονιδιωματικού DNA. Για το λόγο αυτό οι βακτηριοφάγοι λ ονομάζονται φορείς αντικατάστασης και παρέχουν τη δυνατότητα κλωνοποίησης σχετικά μεγάλων τμημάτων γονιδιωματικού DNA μεγέθους 9-23 kb. Επιπλέον, η αφαίρεση του μεσαίου τμήματος επιτρέπει την εκδήλωση μόνο των λυτικών ιδιοτήτων, που αποτελούν επιθυμητό χαρακτηριστικό επιλογής και πολλαπλασιασμού των ανασυνδυασμένων φάγων. Το γονιδιωματικό DNA που περιλαμβάνει η βιβλιοθήκη που χρησιμοποιήθηκε, προέρχεται από ένα μόνο άτομο Mytilus galloprovincialis, ώστε τα αποτελέσματα να μην επηρεάζονται από πιθανούς πολυμορφισμούς. Με τη σάρωση πραγματοποιείται ανίχνευση, επιλογή και απομόνωση ανασυνδυασμένων βακτηριοφαγικών κλώνων που περιέχουν τις επιθυμητές ακολουθίες. Η σάρωση πρέπει να περιλαμβάνει έλεγχο ικανού αριθμού ανασυνδυασμένων κλώνων που να αντιπροσωπεύουν το σύνολο του γονιδιώματος. Έτσι, ο αριθμός Ν των ανασυνδυασμένων κλώνων που πρέπει να σαρωθεί για να βρεθεί μια ακολουθία που είναι μοναδική στο γονιδίωμα με πιθανότητα 99%, δίνεται από την κατανομή Poisson: ln (1-P) N = ln (1-f) όπου: P = η επιθυμητή πιθανότητα (δηλαδή 99% ή 0,99) f = η αναλογία του μέσου μεγέθους του ενθέματος της γονιδιωματικής βιβλιοθήκης προς το συνολικό μέγεθος του γονιδιώματος (Σκούρας, 1997) Δεδομένου ότι το μέσο μέγεθος του ενθέματος στη γονιδιωματική βιβλιοθήκη είναι ζεύγη βάσεων, ενώ το απλοειδές γονιδίωμα του M. galloprovincialis έχει μέγεθος 1.86 x 10 9 ζεύγη βάσεων, ο αριθμός των κλώνων που πρέπει να εξεταστεί με βάση την κατανομή Poisson προκειμένου να ανιχνευθεί μια μοναδική ακολουθία με πιθανότητα 99%, είναι περίπου 4 x Με βάση τον παραπάνω υπολογισμό 51

52 πραγματοποιήθηκε ο πρώτος κύκλος σάρωσης, ενώ ακολούθησε και δεύτερος για την απομόνωση μοναδικών κλώνων. Τιτλοποίηση γονιδιωματικής βιβλιοθήκης Κατά τη διάρκεια της τιτλοποίησης, βακτηριακά κύτταρα του στελέχους XL 1-Blue MRA (P2) του είδους Escherichia coli επιμολύνονται με ένα μικρό μέρος της βιβλιοθήκης και επιστρώνονται σε τριβλία. Το στέλεχος αυτό επιτρέπει την ανάπτυξη μόνο των ανασυνδυασμένων βακτηριοφάγων. Τα τριβλία επωάζονται μέχρι την εμφάνιση πλακών και στη συνέχεια γίνεται η καταμέτρησή τους. Κάθε πλάκα θεωρείται ότι αντιπροσωπεύει ένα βακτηριοφάγο, αφού δημιουργείται από τη λύση μιας αποικίας κυττάρων που είναι μολυσμένα από έναν αρχικό βακτηριοφάγο και συνεπώς αποτελεί έναν κλώνο (plaque forming unit, pfu) (Εικόνα 29). Η συγκέντρωση της γονιδιωματικής βιβλιοθήκης έχει ως μονάδα τον αριθμό πλακών που εμφανίζονται ανά ml βακτηριοφάγων της βιβλιοθήκης με τους οποίους επιμολύνονται τα βακτήρια (pfu/ ml). Εικόνα 29 Επιμόλυνση βακτηρίων με βακτηριοφάγους και εμφάνιση πλακών (Ηλ. Πηγή 14) 52

53 Πρέπει να σημειωθεί ότι όλα τα στάδια πραγματοποιούνται σε ασηπτικές συνθήκες και χρησιμοποιούνται αποστειρωμένα υλικά. Τα βήματα για την τιτλοποίηση της γονιδιωματικής βιβλιοθήκης είναι τα εξής: 30 ml υγρού θρεπτικού μέσου LB εμπλουτισμένου με μαλτόζη 0.2% και 10 mm MgSO 4 7Η 2 Ο επιμολύνονται με μια αποικία βακτηρίων του στελέχους MRΑ (P2) και επωάζονται κατά τη διάρκεια μιας νύχτας στους 37 C με συνεχή ανάδευση. 20 ml υγρού θρεπτικού μέσου LB εμπλουτισμένου με μαλτόζη 0.2% και 10 mm MgSO 4 7Η 2 Ο επιμολύνονται με 250 μl από την προηγούμενη καλλιέργεια και επωάζονται στους 37 C με συνεχή ανάδευση μέχρι η οπτική πυκνότητα στα 600 nm να φτάσει το πολύ στο 0.4. Τα βακτηριακά κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση για 10 min στις 3000 rpm και σε θερμοκρασία 4 C. Το κυτταρικό ίζημα επαναδιαλύεται σε 10 ml 10 mm MgSO 4 7Η 2 Ο και αποθηκεύεται στους 4 C για 40 min. 200 μl κυττάρων ξενιστών επιμολύνονται με διαφορετικές ποσότητες από τις αραιώσεις της βιβλιοθήκης σε σωλήνες των 4 ml και επωάζονται στους 37 C για 20 min, ώστε να επιτευχθεί η προσρόφηση των βακτηριοφάγων. Το περιεχόμενο των σωλήνων αναμειγνύεται με 3.5 ml αγαρόζης κορυφής προθερμασμένης στους 50 C και γίνεται επίστρωση σε τριβλία με στερεό θρεπτικό μέσο NZYM διαμέτρου 90 mm. Τα τριβλία επωάζονται κατά τη διάρκεια μιας νύχτας στους 37 C μέχρι την εμφάνιση διακριτών πλακών. Γίνεται η καταμέτρηση των πλακών και υπολογίζεται ο τίτλος της βιβλιοθήκης σε pfu/ml. 53

54 Α κύκλος σάρωσης Κατά τον α κύκλο σάρωσης, βακτηριακά κύτταρα επιμολύνονται με τον κατάλληλο αριθμό ανασυνδυασμένων βακτηριοφάγων της γονιδιωματικής βιβλιοθήκης και επιστρώνονται σε τριβλία. Στη συνέχεια, τα τριβλία επωάζονται μέχρι την εμφάνιση πλακών και οι βακτηριοφάγοι μεταφέρονται από τα τριβλία σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Μετά από υβριδισμό με τον κατάλληλο ανιχνευτή και αυτοραδιογραφία, γίνεται η επιλογή των κλώνων που περιέχουν τις επιθυμητές ακολουθίες (Εικόνα 30). Εικόνα 30 Σάρωση γονιδιωματικής βιβλιοθήκης (Ηλ. Πηγή 14) 54

55 Μεταφορά βακτηριοφάγων σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης Τα βήματα που ακολουθούνται για τη μεταφορά των βακτηριοφάγων σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης είναι τα εξής: 600 μl βακτηριακών κυττάρων (προετοιμασμένα με τον τρόπο που περιγράφεται στην ενότητα Τιτλοποίηση γονιδιωματικής βιβλιοθήκης) αναμειγνύονται με γρήγορη ανάδευση σε σωλήνες των 8 ml με ποσότητα από τη γονιδιωματική βιβλιοθήκη, η οποία περιέχει περίπου βακτηριοφάγους. Προετοιμάζονται 6 συνολικά μίγματα, ώστε να επιστρωθεί αριθμός βακτηριοφάγων ίσος με αυτόν που δίνεται από την κατανομή Poisson (4x10 5 ). Τα μίγματα επωάζονται στους 37 C για 20 min, ώστε να επιτευχθεί η προσρόφηση των βακτηριοφάγων. Το περιεχόμενο κάθε σωλήνα αναμειγνύεται με 6.5 ml αγαρόζης κορυφής προθερμασμένης στους 50 C και επιστρώνεται σε τριβλίο με στερεό θρεπτικό μέσο NZYM διαμέτρου 150 mm. Συνολικά, γίνεται επίστρωση σε 6 τριβλία. Τα τριβλία επωάζονται για 7-8 h στους 37 C μέχρι να καλυφθούν πλήρως από πλάκες και στη συνέχεια, παραμένουν στους 4 C για 1 h τουλάχιστον, ώστε να στερεοποιηθεί καλά η αγαρόζη κορυφής. Οι βακτηριοφάγοι μεταφέρονται σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, η οποία αφήνεται με προσοχή πάνω στην επιφάνεια του τριβλίου όπου παραμένει για 2 min. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται με τη νέα μεμβράνη, η οποία παραμένει στην επιφάνεια του τριβλίου για 4 min. Ο προσανατολισμός της μεμβράνης ως προς το τριβλίο σημειώνεται τρυπώντας με βελόνα παράλληλα τη μεμβράνη και το θρεπτικό μέσο του τριβλίου σε μη συμμετρικά σημεία της περιφέρειάς τους. Τα τριβλία φυλάσσονται στους 4ºC. Κάθε μεμβράνη μεταφέρεται πάνω σε 2 φύλλα Whatman στο διάλυμα αποδιάταξης για 3 min, στο διάλυμα εξουδετέρωσης για 5 min και στο διάλυμα ξεπλύματος για 5 min. Οι μεμβράνες επωάζονται στους 80ºC για 1-2 h προκειμένου να προσδεθεί το DNA των βακτηριοφάγων και φυλάσσονται σε ξηρό μέρος μέχρι τον υβριδισμό. 55

56 Ραδιενεργός επισήμανση ανιχνευτών Η επισήμανση των μορίων DNA που χρησιμοποιήθηκαν ως ανιχνευτές πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο των τυχαίων εξαμερών χρησιμοποιώντας ραδιενεργό πρόδρομο μόριο 32 P-dCTP. Από τη στιγμή της προσθήκης του ραδιενεργού μορίου όλα τα στάδια διεξάγονται σε ειδικό θάλαμο και οι χειρισμοί πραγματοποιούνται πίσω από προστατευτικό πλαίσιο. Συγκεκριμένα, η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής: Σε σωλήνα eppendorf τοποθετούνται 250 ng DNA και x μl ddh 2 O, ώστε ο τελικός όγκος της αντίδρασης να είναι 40 μl. Το δείγμα θερμαίνεται στους 100ºC για 10 min προκειμένου να αποδιαταχθεί το DNA και μεταφέρεται άμεσα σε πάγο. Στο δείγμα προστίθενται 4 μl μίγματος εξανουκλεοτιδίων 10x από την εταιρεία Roche, 6.7 μl μίγματος datp, dgtp, dttp συγκέντρωσης 1 mm το καθένα, 5 μl διαλύματος 32 P-dCTP (3000Ci/mmol) και 8 Units ενζύμου Klenow από την εταιρεία Fermentas, έτσι ώστε να γίνει ο πολυμερισμός με το ραδιενεργό πρόδρομο μόριο (Εικόνα 31). Το δείγμα επωάζεται στους 37ºC για 3 h. Προετοιμάζεται στήλη σφαιριδίων Sephadex, η οποία πακετάρεται με φυγοκέντρηση στις 1500 rpm για 1 min. Προστίθεται στη στήλη το δείγμα και ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 1500 rpm για 3 min. Με τον τρόπο αυτό διαχωρίζονται τα επισημασμένα μεγαλομόρια DNA από τα μη ενσωματωμένα ραδιενεργά νουκλεοτίδια, τα οποία συγκρατούνται στη στήλη. Σε ειδικό πλαστικό σωληνάκι τοποθετούνται 500 μl τολουολίου, 200 μl μεθανόλης και 2 μl του επισημασμένου ανιχνευτή και γίνεται μέτρηση της ενσωματωμένης ραδιενέργειας σε σπινθηρογράφο. Ο επισημασμένος ανιχνευτής αποθηκεύεται στους -20ºC σε ειδική μολύβδινη θήκη. Εικόνα 31 Ραδιενεργός επισήμανση ανιχνευτή με τη μέθοδο των τυχαίων εξαμερών (Ηλ. Πηγή 15) 56

57 Υβριδισμός ραδιενεργά επισημασμένων ανιχνευτών με το DNA βακτηριοφάγων των μεμβρανών Η διαδικασία που ακολουθείται προκειμένου να υβριδιστούν οι ραδιενεργά επισημασμένοι ανιχνευτές με το DNA των βακτηριοφάγων που έχει σταθεροποιηθεί πάνω στις μεμβράνες νιτροκυτταρίνης είναι η εξής: Το διάλυμα υβριδισμού προθερμαίνεται στη θερμοκρασία υβριδισμού (62ºC), ενώ το διάλυμα DNA σπέρματος σολομού (ssdna) συγκέντρωσης 10 mg/ml θερμαίνεται στους 100ºC για 10 min, έτσι ώστε να αποδιαταχτεί, και μεταφέρεται γρήγορα σε πάγο. Οι μεμβράνες νιτροκυτταρίνης εμβαπτίζονται σε διάλυμα 5X SSC και τοποθετούνται ανά δύο σε πλαστικά σακουλάκια. Σε κάθε σακουλάκι προστίθενται 20 ml διαλύματος υβριδισμού και 200 μl ssdna συγκέντρωσης 10 mg/ml. Ακολουθεί επώαση με ανάδευση στους 62ºC για 1 h. Γίνεται αλλαγή του διαλύματος υβριδισμού και του ssdna και το στάδιο αυτό επαναλαμβάνεται μια ακόμη φορά. Οι επισημασμένοι ανιχνευτές και διάλυμα ssdna συγκέντρωσης 10 mg/ml αποδιατάσσονται στους 100ºC για 10 min και μεταφέρονται γρήγορα σε πάγο. Το διάλυμα υβριδισμού απομακρύνεται από τα σακουλάκια και προστίθενται σε κάθε σακουλάκι 12 ml διαλύματος υβριδισμού προθερμασμένου στους 62ºC, 120 μl ssdna συγκέντρωσης 10 mg/ml και 7.08 x 10 5 counts/ml διαλύματος υβριδισμού από τον κάθε αποδιαταγμένο ανιχνευτή. Ακολουθεί επώαση με ανάδευση στους 62ºC για 19 h, προκειμένου να επιτευχθεί ο υβριδισμός. Οι μεμβράνες αρχικά τοποθετούνται σε διάλυμα ξεπλύματος σε θερμοκρασία δωματίου για 5 min, στη συνέχεια επωάζονται με διάλυμα ξεπλύματος στους 60ºC για 30 min με ανάδευση και έπειτα εμβαπτίζονται σε διάλυμα 2X SSC για να ξεπλυθούν. Η επώαση με διάλυμα ξεπλύματος στους 60ºC για 30 min με ανάδευση και η εμβάπτιση σε διάλυμα 2X SSC επαναλαμβάνονται μια ακόμη φορά. Κάθε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης τυλίγεται ξεχωριστά σε διαφανή μεμβράνη και τοποθετούνται όλες μαζί σε φιλμ Kodak X-OMAT-100, σε κασέτες αυτοραδιογραφίας στους -80ºC. Τα φιλμ εμφανίζονται μετά από 72 h και αναγνωρίζονται τα σήματα. 57

58 Επιλέγονται οι θετικές πλάκες και μεταφέρονται σε αποστειρωμένα eppendorfs τα οποία περιέχουν 1 ml διαλύματος SM και 100 μl χλωροφορμίου. Τα eppendorfs με τις θετικές πλάκες αποθηκεύονται στους 4ºC. Β κύκλος σάρωσης Σκοπός του δεύτερου κύκλου σάρωσης της γονιδιωματικής βιβλιοθήκης είναι η απομόνωση μοναδικών θετικών κλώνων από το σύνολο των βακτηριοφάγων που απομονώθηκαν στον πρώτο κύκλο σάρωσης. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η ίδια. Βακτηριακά κύτταρα του στελέχους MRΑ (P2) επιμολύνονται με βακτηριοφάγους από τους θετικούς κλώνους που απομονώθηκαν κατά τον πρώτο κύκλο σάρωσης και επιστρώνονται σε τριβλία διαμέτρου 90 mm. Εμφανίζονται απόλυτα διακριτές πλάκες, το DNA των οποίων προσδένεται σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης που υβριδίζονται με ραδιενεργά σημασμένο ανιχνευτή. Ακολουθεί αναγνώριση των σημάτων, επιλογή των θετικών κλώνων και αποθήκευσή τους σε διάλυμα SM. Απομόνωση βακτηριοφαγικού DNA Το DNA των επιλεγμένων βακτηριοφάγων απομονώθηκε με το πρωτόκολλο λύσης από στερεές καλλιέργειες (plate lysate method). Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής: 200 μl βακτηριακών κυττάρων (προετοιμασμένα με τον τρόπο που περιγράφεται στην ενότητα Τιτλοποίηση γονιδιωματικής βιβλιοθήκης) αναμειγνύονται με 100 μl από τον απομονωμένο κλώνο σε σωλήνες των 4 ml και επωάζονται στους 37 C για 20 min, ώστε να επιτευχθεί η προσρόφηση των βακτηριοφάγων. Το περιεχόμενο των σωλήνων αναμειγνύεται με 3.5 ml αγαρόζης κορυφής προθερμασμένης στους 50 C με γρήγορη ανάδευση και επιστρώνεται σε τριβλία με στερεό θρεπτικό μέσο NZCYM διαμέτρου 90 mm. Τα τριβλία επωάζονται κατά τη διάρκεια μιας νύχτας στους 37 C μέχρι να καλυφθούν πλήρως από πλάκες. Στην επιφάνεια κάθε τριβλίου προστίθενται 3.5 ml διαλύματος λ diluent και ακολουθεί συνεχής αργή ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου για 90 min, προκειμένου να προσροφηθούν οι βακτηριοφάγοι. Το λ diluent συλλέγεται σε 58

59 αποστειρωμένο σωλήνα φυγοκέντρου. Το στάδιο αυτό επαναλαμβάνεται μια ακόμη φορά και ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 7000 rpm στους 4ºC για 10 min, έτσι ώστε να απομακρυνθούν τα κυτταρικά υπολείμματα. Το υπερκείμενο μεταφέρεται σε έναν άλλο σωλήνα φυγοκέντρου και προστίθενται 5 μl RNAase A (1 mg/ml) και 5 μl DNAase I (1 mg/ml). Οι σωλήνες επωάζονται στους 37ºC για 15 min. Σε κάθε σωλήνα φυγοκέντρου προστίθεται ίσος όγκος διαλύματος 20% w/v πολυαιθυλενικής γλυκόλης (PEG 8000) σε 2 Μ NaCl. Ακολουθεί απαλή ανάδευση, επώαση για 60 min σε πάγο και φυγοκέντρηση στις rpm στους 4ºC για 10 min, έτσι ώστε να κατακρημνιστούν τα ιοσωμάτια. Το υπερκείμενο απομακρύνεται και το ίζημα επαναιωρείται σε 700 μl ΤΕ (ph 8.0) και μεταφέρεται σε αποστειρωμένο σωλήνα eppendorf. Προστίθενται 3.5 μl 20% SDS, ακολουθεί επώαση στους 68ºC για 5 min και στη συνέχεια προστίθενται σε κάθε σωλήνα 14 μl 5 Μ NaCl. Ακολουθεί καθαρισμός του βακτηριοφαγικού DNA με ίσο όγκο φαινόλης:χλωροφορμίου και στη συνέχεια με ίσο όγκο χλωροφορμίου. Το βακτηριοφαγικό DNA κατακρημνίζεται με ίσο όγκο ισοπροπανόλης. Οι σωλήνες επωάζονται στους -70ºC για 30 min και ακολουθεί φυγοκέντρηση στις rpm στους 4ºC για 25 min. Το υπερκείμενο απομακρύνεται και στο ίζημα προστίθενται 200 μl παγωμένης αιθανόλης 70%, προκειμένου να ξεπλυθεί. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις rpm στους 4ºC για 5 min. Το υπερκείμενο απομακρύνεται και το ίζημα επαναδιαλύεται σε 40 μl ΤΕ (ph 8.0). Μικρή ποσότητα του δείγματος (1-2 μl) ελέγχεται με ηλεκτροφόρηση σε 0,7% πηκτή αγαρόζης. 59

60 Κλωνοποίηση προϊόντων της PCR σε πλασμιδιακό φορέα Το προϊόν της PCR με το ζεύγος εκκινητών MB_F1-hnf_R1 κλωνοποιήθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pgem-t Easy της Promega. Ο φορέας αυτός διαθέτει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό αμπικιλίνη, η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επιλογή των μετασχηματισμένων βακτηρίων, καθώς τα βακτήρια που δεν έχουν δεχτεί το συγκεκριμένο πλασμίδιο δεν μπορούν να επιβιώσουν. Επίσης, διαθέτει την κωδικοποιούσα περιοχή του γονιδίου του α-πεπτιδίου της β-γαλακτοσιδάσης (lacz), το οποίο μπορεί να καταλύσει διάσπαση χρωμογόνου συστατικού. Μέσα στο lacz βρίσκεται η θέση κλωνοποίησης του ενθέματος και έτσι απενεργοποίηση αυτού του γονιδίου με την εισαγωγή του ενθέματος στη συγκεκριμένη θέση επιτρέπει την επιλογή των ανασυνδυασμένων κλώνων, δεδομένου ότι δεν πραγματοποιείται χρωμογόνος αντίδραση. Στα 3 άκρα του φορέα στη θέση εισαγωγής του ενθέματος υπάρχει από μια θυμίνη (3 -Τ), η οποία παρεμποδίζει την κυκλοποίηση του φορέα και είναι υπεύθυνη για τη σύνδεση του προϊόντος της PCR, καθώς οι πολυμεράσες προσθέτουν από μια αδενίνη στα 3 άκρα (3 -Α) του τμήματος DNA που ενισχύουν. Ο χάρτης του πλασμιδιακού φορέα pgem-t Easy φαίνεται στην Εικόνα 32. Εικόνα 32 Χάρτης πλασμιδιακού φορέα pgem-t Easy της Promega (Ηλ. Πηγή 16) 60

61 Σύνδεση ενθέματος με τον πλασμιδιακό φορέα Η ποσότητα του ενθέματος που πρέπει να εισαχθεί στην αντίδραση πρόσδεσής του με το φορέα δίνεται από τον τύπο: ng ενθέματος = ng φορέα x kb ενθέματος / kb φορέα x αναλογία ενθέματος:φορέα Η ελάχιστη επιθυμητή αναλογία ενθέματος:φορέα είναι η 3:1. Η διαδικασία που ακολουθείται για τη σύνδεση του ενθέματος με το φορέα είναι: Ο φορέας pgem-t Easy φυγοκεντρείται σύντομα. Σε σωλήνες eppendorf του 1.5 ml προστίθενται τα αντιδραστήρια που φαίνονται στον Πίνακα 10. Αρχικά γίνεται ανάμειξη του φορέα με το ένθεμα και ακολουθεί η προσθήκη των υπόλοιπων αντιδραστηρίων. Το μίγμα της αντίδρασης σύνδεσης επωάζεται κατά τη διάρκεια μιας νύχτας στους 4 ο C. Πίνακας 10 Αντίδραση σύνδεσης του ενθέματος με τον πλασμιδιακό φορέα Αντιδραστήρια Ποσότητα (μl) pgem-t Easy Vector (50 ng/μl) 1 Προϊόν PCR 2Χ Rapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligase Τ4 DNA Ligase (3 Weiss units/μl) 1 ddh 2 O Συνολικός όγκος 10 X 5 Y Μετασχηματισμός βακτηρίων με ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα Τα βακτήρια που χρησιμοποιήθηκαν για το μετασχηματισμό του πλασμιδιακού φορέα με το ένθεμα είναι τα Library Efficiency DH5α Competent cells από την εταιρεία Invitrogen. Τα στάδια που ακολουθούνται είναι τα εξής: 2 μl από την αντίδραση σύνδεσης και 100 μl από τα βακτήρια προστίθενται σε έναν αποστειρωμένο σωλήνα του 1.5 ml. Ο σωλήνας επωάζεται σε πάγο για 20 min, τοποθετείται σε υδατόλουτρο στους 42 o C ακριβώς για 50 sec και μεταφέρεται άμεσα σε πάγο για 2 min. 61

62 Προστίθενται 900 μl υγρού θρεπτικού μέσου SOC που βρίσκεται σε θερμοκρασία δωματίου και ακολουθεί επώαση στους 37 o C για 60 min με ταυτόχρονη ανάδευση. Το περιεχόμενο του σωλήνα επιστρώνεται σε τριβλίο με στερεό θρεπτικό μέσο LB-agar, αμπικιλίνη συγκέντρωσης 100 μg/ml, IPTG συγκέντρωσης 0.5 mm και X-gal συγκέντρωσης 80 μg/ml. Τα τριβλία επωάζονται στους 37 o C για 20 ώρες. Επιλογή μετασχηματισμένων κλώνων και απομόνωση πλασμιδιακού DNA Οι λευκές αποικίες αποτελούνται από βακτήρια που διαθέτουν τον πλασμιδιακό φορέα, στον οποίο έχει κλωνοποιηθεί το ένθεμα. Μετά την επιλογή των αποικιών, απομονώνεται το πλασμιδιακό DNA με το πρωτόκολλο της αλκαλικής λύσης. Έτσι, τα στάδια που ακολουθούνται είναι: Με αποστειρωμένη οδοντογλυφίδα συλλέγεται από το τριβλίο η λευκή αποικία του μετασχηματισμένου βακτηριακού στελέχους και τοποθετείται σε σωλήνα falcon με 5 ml θρεπτικό μέσο LB που περιέχει αμπικιλίνη συγκέντρωσης 50 μg/ml. Οι σωλήνες επωάζονται στους 37 o C για 22 ώρες με συνεχή ανάδευση. 3 ml από κάθε καλλιέργεια μεταφέρονται σε σωλήνα eppendorf και ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 min στις rpm. Το υπερκείμενο απομακρύνεται και το κυτταρικό ίζημα επαναιωρείται σε 100 μl διαλύματος Ι. Προστίθενται 200 μl διαλύματος ΙΙ, ακολουθεί ανάδεση και αναμονή για 5 min. Προστίθενται 150 μl διαλύματος ΙΙΙ, ακολουθεί ανάδευση και φυγοκέντρηση στους 4 ο C στις rpm για 20 min. Το υπερκειμένο μεταφέρεται σε νέο σωλήνα eppendorf. Ακολουθεί καθαρισμός του πλασμιδιακού DNA με ίσο όγκο φαινόλης/χλωροφορμίου και ίσο όγκο χλωροφορμίου. Προστίθεται διπλάσιος όγκος παγωμένης αιθανόλης 100%, προκειμένου να κατακρημνιστεί το πλασμιδιακό DNA, και ακολουθεί ανάδευση, παραμονή στους 60 ο C για 40 min και φυγοκέντρηση στους 4 ο C στις rpm για 20 min. Το υπερκείμενο απομακρύνεται προσεκτικά. Προστίθενται στο ίζημα 100 μl παγωμένης αιθανόλης 70%, προκειμένου να ξεπλυθεί το πλασμιδιακό DNA, και ακολουθεί ανάδευση και φυγοκέντρηση στους 4 ο C στις rpm για 5 min. 62

63 Το υπερκείμενο απομακρύνεται προσεκτικά και το ίζημα επαναδιαλύεται με την προσθήκη 40 μl διαλύματος ΤΕ και 1 μl RNAase I. Μικρή ποσότητα του δείγματος (1-2 μl) ελέγχεται με ηλεκτροφόρηση σε 0.7% πηκτή αγαρόζης με το μάρτυρα μοριακών βαρών NEB 1 kb Ladder (Εικόνα 33). Εικόνα 33 Πρότυπο ζωνών μάρτυρα μοριακών βαρών NEB 1 kb Ladder Πέψεις πλασμιδιακού DNA Το πλασμιδιακό DNA υποβάλλεται σε απλές και διπλές πέψεις με διάφορες ενδονουκλεάσες περιορισμού, προκειμένου να επιβεβαιωθεί ότι περιέχει το επιθυμητό ένθεμα. Έτσι, ακολουθείται η εξής διαδικασία: Σε σωλήνα eppendorf του 1.5 ml προστίθενται τα αντιδραστήρια που φαίνονται στον Πίνακα 11. Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού που χρησιμοποιήθηκαν είναι οι EcoRI, SacI και HincII. Ο σωλήνας επωάζεται στους 37 ο C για 1-2 ώρες. Γίνεται ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων σε πηκτή αγαρόζης 1%. 63

64 Πίνακας 11 Ποσότητες αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται στις απλές και διπλές πέψεις του πλασμιδιακού DNA Αντιδραστήρια Ποσότητα (μl) Ποσότητα (μl) 10Χ Buffer 1 1 Ενδονουκλεάση περιορισμού ( 20 units/μl) 0,25 0,25 Ενδονουκλεάση περιορισμού ( 20 units/μl) 0,25 Πλασμιδιακό DNA 1,5 1,5 ddh 2 O έως τελικό όγκο Χ Υ Συνολικός όγκος Βιοπληροφορική ανάλυση Προκειμένου να επιβεβαιωθεί ότι οι εκάστοτε ακολουθίες που ενισχύθηκαν από τους διάφορους συνδυασμούς εκκινητών αποτελούν όντως τμήματα του γονιδίου του πυρηνικού υποδοχέα HNF-4 χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα BLASTn (Altschul et al., 1990) (Ηλ. Πηγή 17). Το πρόγραμμα αυτό συγκρίνει την κάθε νουκλεοτιδική ακολουθία με τις καταχωρημένες ακολουθίες στις νουκλεοτιδικές βάσεις δεδομένων. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα BLASTx (Ηλ. Πηγή 17), το οποίο μεταφράζει τη νουκλεοτιδική ακολουθία και στα 6 αναγνωστικά πλαίσια (frames), λαμβάνοντας υπόψη και τη συμπληρωματική αλυσίδα, και συγκρίνει την αμινοξική ακολουθία που προκύπτει με τις καταχωρημένες ακολουθίες στις πρωτεϊνικές βάσεις δεδομένων. Η κωδικοποιούσα περιοχή της νουκλεοτιδικής ακολουθίας που ενισχύθηκε μεταφράστηκε με τη βοήθεια του προγράμματος EMBOSS-Transeq (Ηλ. Πηγή 18). Η αμινοξική ακολουθία που προέκυψε από τη μετάφραση συγκρίθηκε με τη βοήθεια του προγράμματος BLASTp (Ηλ. Πηγή 17) με τις καταχωρημένες σε βάσεις δεδομένων πρωτεΐνες. Στη συνέχεια, με τη βοήθεια του προγράμματος Genomatix (Ηλ. Πηγή 19) βρέθηκε η περιεκτικότητα της ακολουθίας σε καθεμία από τις αζωτούχες βάσεις, ενώ η χρήση των κωδικονίων στο υπό μελέτη νουκλεοτιδικό τμήμα του HNF-4 υπολογίστηκε με το πρόγραμμα CountCodon από τη βάση δεδομένων CUTG (Ηλ. Πηγή 20). Έπειτα, έγινε σύγκριση της χρήσης των κωδικονίων στη συγκεκριμένη νουκλεοτιδική ακολουθία με τον πίνακα χρήσης κωδικονίων του M. 64

65 galloprovincialis. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα CAI Calculator (Ηλ. Πηγή 21), με τη βοήθεια του οποίου υπολογίστηκε ο δείκτης CAI. Ο συγκεκριμένος δείκτης αποτελεί ένα μέτρο σύγκρισης της τάσης που εμφανίζεται σε ένα γονίδιο να χρησιμοποιεί τα κωδικόνια με τον ίδιο τρόπο που χρησιμοποιούνται στο σύνολο των γνωστών γονιδίων του εκάστοτε οργανισμού. Οι θέσεις αναγνώρισης των ενδονουκλεασών περιορισμού στην ακολουθία εντοπίστηκαν με τη βοήθεια του προγράμματος Remap (Ηλ. Πηγή 22). Με το πρόγραμμα ProtParam (Ηλ. Πηγή 23) υπολογίστηκε η συχνότητα εμφάνισης των αμινοξέων στο πρωτεϊνικό τμήμα που κωδικοποιείται από τα εξόνια της νουκλεοτιδικής ακολουθίας που ενισχύθηκε. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα ProtScale (Ηλ. Πηγή 24) για την κατασκευή της γραφικής παράστασης στην οποία φαίνονται οι υδρόφιλες και οι υδρόφοβες περιοχές του πρωτεϊνικού τμήματος. Για την ανάλυση της πρωτοταγούς δομής της αμινοξικής ακολουθίας, εφαρμόστηκε το πρόγραμμα Colorseq (Ηλ. Πηγή 25), ενώ με τη βοήθεια του προγράμματος SMART (Ηλ. Πηγή 26) αναζητήθηκαν χαρακτηριστικά μοτίβα τα οποία μπορούν να εντάξουν την αμινοξική ακολουθία σε μια ευρύτερη οικογένεια πρωτεϊνών. Στη συνέχεια, έγινε πρόβλεψη της δευτεροταγούς δομής του υπό μελέτη πρωτεϊνικού τμήματος με το πρόγραμμα NNPredict (Ηλ. Πηγή 27). Παράλληλα, μετά τη σύγκριση της αμινοξικής ακολουθίας με πρωτεϊνικές δομές που είναι ήδη κατατεθειμένες στη βάση δεδομένων PDB (Ηλ. Πηγή 28) και την ευθυγράμμισή της με τις 4 πιο κοντινές πρωτεϊνικές ακολουθίες, πραγματοποιήθηκε η πρόβλεψη της τριτοταγούς δομής με το πρόγραμμα Geno3d (Ηλ. Πηγή 29). Με το πρόγραμμα Align (Ηλ. Πηγή 30) το πρωτεϊνικό τμήμα του M. galloprovincialis συγκρίθηκε με τα αντίστοιχα τμήματα και των 3 υποτύπων του συγκεκριμένου πυρηνικού υποδοχέα σπονδυλωτών και ασπόνδυλων. Έπειτα, με τη βοήθεια του προγράμματος Mega2 κατασκευάστηκαν φυλογενετικά δέντρα με τα κριτήρια της Μέγιστης Φειδωλότητας (Maximum Parsimony) και της Ελάχιστης Εξέλιξης (Minimum Evolution) (Kumar et al., 2001). 65

66 Διαλύματα Τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται στα διάφορα στάδια των απομονώσεων DNA, της σάρωσης της γονιδιωματικής βιβλιοθήκης, καθώς και της κλωνοποίησης σε πλασμιδιακό φορέα φαίνονται παρακάτω: Αγαρόζη κορυφής (1000 ml): 5 gr NaCl, 2 gr MgSO 4 7Η 2 Ο, 5 gr yeast extract, 10 gr NZ amine, 7 gr αγαρόζης Αμπικιλίνη 50 mg/ml (10 ml): 0.5 gr αμπικιλίνης σε 10 ml ddh 2 O Denhardt s 50Χ (100 ml): 1 gr Ficoll, 1 gr PVP, 10 ml 10% BSA DNA σπέρματος σολομού 10 mg/ml (10 ml): 0.1 gr DNA σπέρματος σολομού σε 10 ml ddh 2 O Διαλύματα απομόνωσης πλασμιδιακού DNA: Διάλυμα Ι: 50 mm glucose, 25 mm Tris-HCl ph=8, 10 mm EDTA, 5 mg/ml lysozyme Διάλυμα ΙΙ: 0.2 N NaOH, 1% SDS Διάλυμα ΙΙΙ: KoAc [Σε 60 ml οξικού καλίου (CH 3 COOK) προστίθενται 11.5 ml οξικού οξέος (CH 3 COOH) και 28.5 ml Η 2 Ο, ώστε το διάλυμα που προκύπτει να έχει συγκέντρωση 3 M CH 3 COOK και 5 M CH 3 COOH.] Διαλύματα μεταφοράς σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης: Διάλυμα αποδιάταξης: 0.5 N NaOH, 1.5 M NaCl Διάλυμα εξουδετέρωσης: 1 M Tris-HCl ph=8.0 Διάλυμα ξεπλύματος: 0.1 M Tris-HCl ph=7.5, 2Χ SSC Διάλυμα ξεπλύματος (για τον υβριδισμό των μεμβρανών): 2Χ SSC, 0.1% SDS Διάλυμα ομογενοποίησης: 0.1 M NaCl, 0.2 M sucrose, 0.1 M Tris-HCl ph=9.1, 0.05 M EDTA ph=8.0, 0.5% SDS Διάλυμα υβριδισμού: 5X SSC, 2Χ Denhardt s, 0.1% SDS LB agar στερεό θρεπτικό μέσο βακτηρίων (1000 ml): όπως LB υγρό θρεπτικό μέσο βακτηρίων και προσθήκη 15 gr agar LB υγρό θρεπτικό μέσο βακτηρίων (1000 ml): 10 gr tryptone, 5 gr yeast extract, 10 gr NaCl λ diluent: 10 mm Tris-HCl ph 7.5, 10 mm MgSO 4 7H 2 O MgSO 4 7Η 2 Ο 1 M (100 ml): gr MgSO 4 7Η 2 Ο σε 100 ml ddh 2 O MgSO 4 7Η 2 Ο 10 mm (100 ml): 1 ml MgSO 4 7Η 2 Ο 1 M σε 99 ml ddh 2 O 66

67 Μαλτόζη 20% (100 ml): 20 gr μαλτόζης σε 100 ml ddh 2 O NaCl 2 M (100 ml): gr NaCl σε 100 ml ddh 2 O NaCl 5 M (1000 ml): gr NaCl σε 1000 ml ddh 2 O NaOH 10N (100 ml): 40 gr NaOH σε 100 ml ddh 2 O NZCYM στερεό θρεπτικό μέσο βακτηρίων (1000 ml): 5 gr NaCl, 2 gr MgSO 4 7Η 2 Ο, 5 gr yeast extract, 10 gr NZ amine, 1 gr casamino-acids, 15 gr agarose NZYM agar στερεό θρεπτικό μέσο βακτηρίων (1000 ml): 5 gr NaCl, 2 gr MgSO 4 7Η 2 Ο, 5 gr yeast extract, 10 gr NZ amine, 15 gr agar PEG (πολυαιθυλενική γλυκόλη) 20% (100 ml): 20 gr PEG 8000 σε 2 Μ NaCl Sephadex: 30 gr Sephadex προστίθενται σε 300 ml T.E. και αναδεύονται. SM buffer (1000 ml): 5.8 gr NaCl, 2 gr MgSO 4 7Η 2 Ο, 50 ml 1 M Tris-HCl ph=7.5, 5 ml 2% (w/v) gelatin SOC υγρό θρεπτικό μέσο βακτηρίων (100 ml): 2 gr tryptone, 0.5 gr yeast extract, 1 ml 1 M NaCl, 0.25 ml 1 M KCl, 1 ml Mg 2+ stock 2 M, 1 ml glucose 2 M (Το Mg 2+ stock και η γλυκόζη αποστειρώνονται με φιλτράρισμα). SSC 20X: 3 M NaCl, 0.3 M C 6 H 5 Na 3 O 7 SSC 5X (1000 ml): 250 ml SSC 20X σε 750 ml ddh 2 O SSC 2X (1000 ml): 100 ml SSC 20X σε 750 ml ddh 2 O Τ.Ε.: 10 mm Tris-HCl ph=8.0, 1 mm EDTA ph=8.0 Tris-HCl 1 M (1000 ml): gr Tris base - x ml 37% HCl ανάλογα με το επιθυμητό ph 67

68 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σάρωση γονιδιωματικής βιβλιοθήκης Κατά τη σάρωση της γονιδιωματικής βιβλιοθήκης του Mytilus galloprovincialis, για την ανίχνευση και απομόνωση βακτηριοφαγικών κλώνων που περιέχουν το γονίδιο του πυρηνικού υποδοχέα HNF-4, χρησιμοποιήθηκαν 2 ομόλογοι ανιχνευτές. Πρόκειται για τις γονιδιωματικές περιοχές που ενισχύθηκαν με PCR από τα ζεύγη των εκκινητών hndb_f-hndb_r και hnf_f1-hnf_r1. Το προϊόν της PCR με τους εκκινητές hndb_f και hndb_r έχει μέγεθος 153 ζευγών βάσεων, ενώ το προϊόν της PCR με τους εκκινητές hnf_f1 και hnf_r1 έχει μέγεθος 168 ζευγών βάσεων (Εικόνα 34). Οι συγκεκριμένες ζώνες καθαρίστηκαν από τα υπόλοιπα προϊόντα που εμφανίζονταν (Εικόνα 35) και στάλθηκαν για εύρεση της πρωτοταγούς αλληλουχίας. Με τη βοήθεια του πρόγραμματος BLAST (Ηλ. Πηγή 17), έγινε σύγκριση της πρωτοταγούς αλληλουχίας τους με τις κατατεθειμένες νουκλεοτιδικές και αμινοξικές ακολουθίες σε βάσεις δεδομένων, η οποία αποκάλυψε ότι όντως πρόκειται για τμήματα του γονιδίου του HNF-4 του M. galloprovincialis. Μάλιστα, το νουκλεοτιδικό τμήμα των 153 ζευγών βάσεων κωδικοποιεί τμήμα της περιοχής σύνδεσης στο DNA, ενώ το νουκλεοτιδικό τμήμα των 168 ζευγών βάσεων κωδικοποιεί τμήμα της περιοχής πρόσδεσης του συνδέτη. Εικόνα 34 Προϊόντα PCR με τα ζεύγη εκκινητών hnf_f1-hnf_r1 (αριστερά) και hndb_f-hndb_r (δεξιά). Ο μάρτυρας που χρησιμοποιήθηκε είναι ο pucmix8. 68

69 Εικόνα 35 Προϊόντα PCR που ενισχύθηκαν από τα ζεύγη εκκινητών hnf_f1-hnf_r1 (αριστερά) και hndb_f-hndb_r (δεξιά), μετά τον καθαρισμό τους. Ο μάρτυρας που χρησιμοποιήθηκε είναι ο GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus. Προκειμένου ο αριθμός των κλώνων που θα εξεταστεί να είναι εκείνος που ορίζεται από την κατανομή Poisson για να βρεθεί μια ακολουθία που είναι μοναδική στο γονιδίωμα με πιθανότητα 99%, επιστρώθηκαν 6 τριβλία διαμέτρου 150 mm με συνολικό αριθμό 4.8 x 10 5 βακτηριοφάγων της γονιδιωματικής βιβλιοθήκης. Στον α κύκλο σάρωσης εμφανίστηκε πλήθος σημάτων, από τα οποία έγινε επιλογή κάποιων και απομόνωση των αντίστοιχων βακτηριοφάγων, με τους οποίους διεξάχθηκε ο β κύκλος σάρωσης. Μετά από τον β κύκλο επιλέχθηκαν κάποιοι κλώνοι και απομονώθηκε το βακτηριοφαγικό τους DNA. Προκειμένου να διαπιστωθεί αν οι συγκεκριμένοι κλώνοι περιέχουν τμήμα ή ολόκληρο το γονίδιο του πυρηνικού υποδοχέα HNF-4, στο DNA τους πραγματοποιήθηκε PCR με τα ζεύγη των εκκινητών hndb_f-hndb_r και hnf_f1-hnf_r1. Οι συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων και το πρόγραμμα της PCR που χρησιμοποιήθηκαν φαίνονται στους Πίνακες 7 και 8. Κανένας από τους κλώνους δεν έδωσε κάποιο από τα αναμενόμενα προϊόντα, γεγονός που υποδεικνύει ότι δεν διαθέτουν ενσωματωμένα στο γονιδίωμά τους τμήματα του γονιδίου του HNF-4. 69

70 Εύρεση πρωτοταγούς αλληλουχίας τμήματος του γονιδίου του HNF-4 Δεδομένου ότι η σάρωση της γονιδιωματικής βιβλιοθήκης δεν οδήγησε στην απομόνωση ανασυνδυασμένων κλώνων που περιέχουν το γονίδιο του HNF-4, σχεδιάστηκαν νέοι εκκινητές με στόχο την ενίσχυση με PCR ακολουθιών του γονιδίου από το γονιδίωμα του M. galloprovincialis. Η ηλεκτροφόρηση των γονιδιωματικών περιοχών που ενισχύθηκαν με PCR από τα διάφορα ζεύγη εκκινητών αποκάλυψε πλήθος προϊόντων διαφορετικού μεγέθους. Ωστόσο, έγινε επιλογή και απομόνωση των πιο πιθανών ζωνών, οι οποίες στάλθηκαν για εύρεση της πρωτοταγούς αλληλουχίας. Μετά την εφαρμογή του προγράμματος BLAST (Ηλ. Πηγή 17), επιβεβαιώθηκε ότι κάποια από τα προϊόντα αποτελούν τμήματα του γονιδίου του HNF-4. Τα προϊόντα της PCR που επιλέχθηκαν για να ελεχθούν προκύπτουν με τα ζεύγη εκκινητών NF_1-NR_2, hndb_f-nr_2, hnf_f2-hnf_r2, NF_4-NLB_R, MB_F1-NLB_R και MB_F1-hnf_R1 και έχουν μέγεθος 973, 1851, 162, 613, 1293, 1339 ζευγών βάσεων, αντίστοιχα (Εικόνα 36). Στην Εικόνα 37 φαίνονται οι παραπάνω ζώνες μετά τον καθαρισμό τους. 70

71 Εικόνα 36 Προϊόντα PCR με τα ζεύγη εκκινητών NF_1-NR_2 (πάνω αριστερά), hndb_f-nr_2 (πάνω δεξιά), hnf_f2-hnf_r2 (κέντρο αριστερά), NF_4-NLB_R (κέντρο δεξιά), MB_F1-NLB_R (κάτω αριστερά) και MB_F1-hnf_R1 (κάτω δεξιά). Ο μάρτυρας που χρησιμοποιήθηκε είναι ο pucmix8. 71

72 Εικόνα 37 Προϊόντα PCR που ενισχύθηκαν από τα ζεύγη εκκινητών NF_1-NR_2 (πάνω αριστερά), hndb_f-nr_2 (πάνω δεξιά), hnf_f2-hnf_r2 (κέντρο αριστερά), NF_4-NLB_R (κέντρο δεξιά), MB_F1-NLB_R (κάτω αριστερά) και MB_F1-hnf_R1 (κάτω δεξιά), μετά τον καθαρισμό τους. Ο μάρτυρας που χρησιμοποιήθηκε είναι ο GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus 72

73 Τα προϊόντα της PCR με τα παραπάνω ζεύγη εκκινητών αποτελούν επικαλυπτόμενες ακολουθίες DNA που όλες μαζί αντιπροσωπεύουν τμήμα του γονιδίου του πυρηνικού υποδοχέα HNF-4. Το τμήμα αυτό είναι υπεύθυνο για την κωδικοποίηση της αμινοξικής ακολουθίας που εκτείνεται από την αρχή της περιοχής σύνδεσης στο DNA ως το τέλος της περιοχής πρόσδεσης του συνδέτη. Οι ακολουθίες αυτές καλύπτουν μια νουκλεοτιδική ακολουθία μεγέθους 3136 ζευγών βάσεων, η οποία περιλαμβάνει 5 εξόνια και 4 ιντρόνια (Εικόνες 38, 39). Πρέπει να επισημανθεί ότι το εξόνιο 1 δεν αποτελεί και το πρώτο εξόνιο του γονιδίου του HNF-4, αλλά το πρώτο εξόνιο από τη συνολική νουκλεοτιδική ακολουθία που ενισχύθηκε. Συγκεκριμένα, τα νουκλεοτίδια από τα οποία αποτελείται κάθε εξόνιο και ιντρόνιο, το μέγεθος τους, καθώς και το τμήμα του HNF-4 που κωδικοποιείται από κάθε εξόνιο είναι: Νουκλεοτίδια 1-202: εξόνιο 1, μεγέθους 202 ζευγών βάσεων, περιοχή σύνδεσης στο DNA και τμήμα της περιοχής D Νουκλεοτίδια : ιντρόνιο 1, μεγέθους 677 ζευγών βάσεων Νουκλεοτίδια : εξόνιο 2, μεγέθους 116 ζευγών βάσεων, τμήμα της περιοχής D και της περιοχής πρόσδεσης του συνδέτη Νουκλεοτίδια : ιντρόνιο 2, μεγέθους 730 ζευγών βάσεων Νουκλεοτίδια : εξόνιο 3, μεγέθους 150 ζευγών βάσεων, τμήμα της περιοχής πρόσδεσης του συνδέτη Νουκλεοτίδια : ιντρόνιο 3, μεγέθους 365 ζευγών βάσεων Νουκλεοτίδια : εξόνιο 4, μεγέθους 241 ζευγών βάσεων, τμήμα της περιοχής πρόσδεσης του συνδέτη Νουκλεοτίδια : ιντρόνιο 4, μεγέθους 428 ζευγών βάσεων Νουκλεοτίδια : εξόνιο 5, μεγέθους 227 ζευγών βάσεων, τμήμα της περιοχής πρόσδεσης του συνδέτη. Εικόνα 38 Κατανομή εξονίων και ιντρονίων που ενισχύθηκαν από το γονίδιο του HNF-4 του M. galloprovincialis και πρωτεϊνική περιοχή που κωδικοποιείται από τα εξόνια 73

74 >Mytilus galloprovincialis HNF-4 sequence length 3136 bp ATTTGTGGGGATAGAGCAACAGGCAAACATTATGGGGCCTCAAGTTGTGACGGCTGTAAGGGATTCTTCC GTCGTAGTGTCAGAAAGAACCATGTTTATTCCTGTCGATTTAGTCGGAATTGCGTTGTTGACAAGGACAA ACGAAACCAATGTCGTTACTGCAGATTACGTAAATGTTTCAAAGCAGGAATGAAAAAAGAAGGTAAGGAA TAAAACAGATTGCTGATGGATGATATTTCATGACAAGAAAATTAAAAGATTTAGTTCATAGTTCATATTA TAACATAAGCTTCGATATAACTTCATTCAACTGTAATGAATGCAATTATAGAGTGACAATTGAACTTTTA AAAAGTCTTTAGTTTTCCCTCCAAGGAAATGATTTAACCCCAGATTTTTTTTTAAAAATTTTGAATTATT ACCCTTGGCCAAGAATTTCCCGAACCAAAATTTGTTGGTTAAAGGTCTGGAAGGGGTTTACCGAATAAAA AAAAATGGGCCAAAAAATTCACAAAAGAGGGTAAAAAAAGGAAAATTCCAATATATTAGCCCGACCCCAT TATCTGGACACTCTTTTATAAAAAATATGGAAATGGTTTGGCTCTAAAATTTAAACGAAACTGAAAAACC CCCCCCCCCTTTCCAATTCTAATTACTATGGAAAATTTTTTGGTGTCCAATTAAATTAAATACAAATTAA AATTAAAACTTACCTTTCCCCCCCCACTTTAGACTTTGTATTCTAAATCCACAGTTCAATTAAAAAAAAA CACACTGGTTTTCTTTTTTGGTTGTGTTCTCCCCCCTACACAAAATGTCCTAAACTATTATTTGATATAA AACTCCTTTATATAAAAATCCCACTCAACTCTTCCCAGGCAGTTCAAAATGAAAGAGATAGAATCAGCAC GCGTAGAGACAGTTATGAAGATACCAGTCAAAACAATTCACTCTCCGTCAGTACTTTGTTAAACGCTGAA ATTCTCTCCAGACAGGTGAGATCATACATTGTTATGTTTAATCTTATTTAATGTGAAAAAAACATGCAGA TGATGAGGATGATCCATAACATAGAGCACATGATTATATAAATATGTAGTGACTAATTTTAGCCTGATTT GTCACTAGAAAAAAAATATGTTTACATTTTGTTAAAATGATATTTCCATAGGTACATCCATGAGCTGTTT TTGACTTGGATATTATGTGGATAGAGAAAATCTGATGAAAAAAACAATTTAGAAAATAAAAGGATATTTA CCTGTTTATTAAATTGGTATGGGAATGGGAATAGGTTCTACAAACATAGAAGGAAGAGAACTAATACTTA ATTTTAAGTATAAATTTGAGATTAACGCTCACATACGTATGAAATACAGTCAAGCCTGTTTTAAAGGTCA TCTTCCAGTCTTTGCCAAAGTGTATTAGGGTTTGTCTGACCGAAAAAAGAAATTTTGACGTTTTTCTTCT ATATATTAAACTAAAAATTCTGAGAATTTCTGTCTGACCTATGACTTTTTGTCTGACATTTTGTCGGACA GACAGAGTTTGGGATACACTGATCTTCTTTGTGACCTGATGTAGTAATACTTGTAACTTTTAAATCTCAT TTTAAATGTCATCTCTATTATAAGGTCAGTTCTCTCTGGACCTTAGGGTAACCTTTAATGCTAGTTTGAC TATATGTAGAACTGTATAAATAACCATGCATGTTTGAATTTTTAGATCTCGTCCCCCGTTGGACAGTGTG ACCTGACACACAAGGTTATAGCGACTGCTGATGATGTGTGTGAATCTATAAAACAACAATTACTTGTTCT TGTAGAATGGGCAAAATATATACCGTGTTTTTGTGAACTGCCATTAGATGATCAGGTAAGAACAAAATAA ATATATGAAAAAATAATTAAAAAACGATAATTTTATCAAATGTAAGCCTTATTAATAGAAGATAATTTTT CATTTATGCAATTAAAGGATTTCCTAGTTTAAAAGGTTTTCTCTGAATTAGATCCAAGATGTCTACTACA GATTTAGATTTCTCAGAAATGAATCAAGATTTCAACTACAGATTAAGAGTTTTCTGCATTGAATAAAAAA TGTCACTGTATTTGATTTTAAATGATCTGAAATGAATCAAATCACTGTGACATATTTAATTTCTCTATAA TTATAGAAATTGGAACACCTTCTTTTAAGGGTTAACAAGATATTTATATATTTGTTATCATTATTATTAG GTTGCCTTATTAAGAGCTCATGCTGGAGAACATTTGGTTCTGGGTGTTGCCAGACGTTCCATGGCCGTCA AGGATGTTTTATTATTGGGAAATGATGGGATAATTCCACGTAACGCTACAGATATGGAGATGGGAACAAT TGCAGCCAGAGTATTAGACGAGTTAGTTGCAGCATTTAGAGACATACAGATAGATGACACAGAGTTTGCC TGTATTAAAGCTATTGTCTTCTTTGATCCTGGTGAGTATCTGTTTTTTTTCTGAATTGAGAAAAAGACAT GATATGATATAAGTGTAGTTCTTTTTTTTTGGGAAGAGAACATCACTTAAGCAGAATTGAAGCGAATATG CACTCCTCCCTTTCATATAAATTGAAGGTTGTTTTGATCTGAATTATAAGATTAGTGTTTGAAATAAAGG AAAAGAGAGGCTTTGATTGAAGTTTAATAATCATATAATGCCCTTGCTTTTGTCCCAAAATGGGAAAAAA AATTCCAAACCAATTGTTAGGTTCCTTTTTTCCAATTTTGGAAAATCCCGGAAAAAAAAGGCTGGAAAGG AAATTTTAGGTATGGTGGAGAGGGTTTTAAAATATTTGGTATTTAAACCTATGGACTTGGAAATTACCCT AAAATGTTTGGTTTCTTACATTGACAATTTTTTTCCAGGAAGCTAAAGGTCTGACAGATCCACAAAAAAT CAAAAGTTTTCGTTACCAAGTACAAGTAAATCTGGAAGATTATATCAACGATCGTCAGTACGACTCTCGA GGCAGATTTGGGGAGATTTTATTACTGTTGCCCGCCTTACAGAGCATTACTTGGCAAATGATTGAACAGA TACAGTTCGCCAAGTTATTTGGAATGGCCAAAATCGATAACCTGCTTCAAGAAATG Εικόνα 39 Νουκλεοτιδική ακολουθία 3136 ζευγών βάσεων τμήματος του γονιδίου του HNF-4 στο M. galloprovincialis. Οι σκιασμένες με χρώμα γκρι περιοχές αντιπροσωπεύουν τα 4 ιντρόνια, ενώ οι μη σκιασμένες περιοχές τα 5 εξόνια. Το πορτοκαλί χρώμα αντιστοιχεί στο νουκλεοτιδικό τμήμα που κωδικοποιεί την περιοχή σύνδεσης στο DNA, το μωβ χρώμα αντιστοιχεί στο νουκλεοτιδικό τμήμα που κωδικοποιεί την περιοχή D, ενώ το μπλε χρώμα αντιστοιχεί στο νουκλεοτιδικό τμήμα που κωδικοποιεί την περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη. Η συνολική νουκλεοτιδική ακολουθία των 3136 ζευγών βάσεων που ενισχύθηκε από το M. galloprovincialis συγκρίθηκε με τη βοήθεια του προγράμματος BLASTn (Ηλ. Πηγή 17) με τις καταχωρημένες ακολουθίες στις νουκλεοτιδικές βάσεις δεδομένων. Στην Εικόνα 40 φαίνονται οι κωδικοί πρόσβασης και οι 74

75 περιγραφές των 20 ακολουθιών που εμφανίζουν το μεγαλύτερο score προς την υπό μελέτη ακολουθία. Sequences producing significant alignments: Score E (Bits) Value XM_ PREDICTED: Macaca mulatta similar to hepatocyte nuclear e-08 factor 4, gamma, transcript variant 1 (LOC697750), mrna XM_ PREDICTED: Macaca mulatta similar to hepatocyte nuclear e-08 factor 4, gamma, transcript variant 2 (LOC697750), mrna XM_ PREDICTED: Canis familiaris similar to hepatocyte nuclear e-08 factor 4, gamma (LOC487005), mrna AY Bos taurus hepatocyte nuclear factor 4gamma mrna, e-08 complete cds NM_ Bos taurus hepatocyte nuclear factor 4gamma (HNF4G),mRNA e-08 DQ Sus scrofa hepatocyte nuclear factor 4alpha (HNF-4alpha) e-06 mrna, complete cds AJ Mus musculus mrna for hepatocyte nuclear factor 4 gamma e-06 AK Mus musculus 6 days neonate spleen cdna, RIKEN full e-06 length enriched library, clone:f430112p22 product: hepatocyte nuclear factor 4, gamma, full insert sequence AB Ciona intestinalis mrna for nuclear receptor,complete cds e-06 NM_ Mus musculus hepatocyte nuclear factor 4,gamma(Hnf4g),mRNA63.9 3e-06 XM_ PREDICTED: Rattus norvegicus hepatocyte nuclear factor 4, e-05 gamma mrna Z X.laevis mrna for hepatocyte nuclear factor 4 beta e-05 Z X.laevis HNF4 mrna encoding hepatocyte nuclear factor e-04 NM_ Rattus norvegicus hepatocyte nuclear factor 4, alpha e-04 (Hnf4a), mrna DQ Danio rerio HNF4gamma mrna, partial cds e-04 XM_ PREDICTED: Danio rerio similar to hepatocyte nuclear e-04 factor 4, alpha, transcript variant 3 (LOC556038), mrna XM_ PREDICTED: Danio rerio similar to hepatocyte nuclear e-04 factor 4, alpha, transcript variant 1 (LOC556038), mrna XM_ PREDICTED: Danio rerio similar to hepatocyte nuclear e-04 factor 4, alpha, transcript variant 2 (LOC556038), mrna X Rat mrna for hepatocyte nuclear factor 4 (HNF4) e-04 D Rattus norvegicus mrna for hepatocyte nuclear factor e-04 Εικόνα 40 Αποτελέσματα προγράμματος BLASTn, όπου διακρίνονται οι κωδικοί πρόσβασης και οι περιγραφές των 20 νουκλεοτιδικών ακολουθιών με το μεγαλύτερο score προς τη συνολική ακολουθία των 3136 ζευγών βάσεων του γονιδίου του HNF-4 στο M. galloprovincialis 75

76 Στη συνέχεια, με το πρόγραμμα BLASTx (Ηλ. Πηγή 17), έγινε μετάφραση της νουκλεοτιδικής ακολουθίας και στα 6 αναγνωστικά πλαίσια (frames), και σύγκριση της αμινοξικής ακολουθίας με τις καταχωρημένες ακολουθίες στις πρωτεϊνικές βάσεις δεδομένων. Στην Εικόνα 41 φαίνονται οι κωδικοί πρόσβασης και οι περιγραφές των 20 πρωτεϊνών που εμφανίζουν το μεγαλύτερο score προς την αμινοξική ακολουθία που προκύπτει από τη μετάφραση του τμήματος του γονιδίου του HNF-4 που ενισχύθηκε στο M. galloprovincialis. Score E Sequences producing significant alignments: (Bits) Value AAB hepatocyte nuclear factor 4 isoform b 149 6e-34 AAB hepatocyte nuclear factor 4 isoform a 149 6e-34 XP_ PREDICTED: similar to Transcription factor HNF-4 homolog 148 2e-33 (dhnf4) [Tribolium castaneum] CAA hepatocyte nuclear factor 4 beta (HNF4 beta) 148 2e-33 [Xenopus laevis] NP_ Hepatocyte nuclear factor 4 CG9310-PB, isoform B 147 3e-33 [Drosophila melanogaster] NP_ Hepatocyte nuclear factor 4 CG9310-PA, isoform A 147 3e-33 [Drosophila melanogaster] NP_ Hepatocyte nuclear factor 4 CG9310-PC, isoform C 147 3e-33 [Drosophila melanogaster] AAB hepatocyte nuclear factor 4 homolog 147 3e-33 [Drosophila melanogaster] NP_ hepatocyte nuclear factor 4 alpha isoform f[homo sapiens] 146 7e-33 NP_ hepatocyte nuclear factor 4 alpha isoform d[homo sapiens] 146 7e-33 NP_ hepatocyte nuclear factor 4 alpha isoform e[homo sapiens] 146 7e-33 AAH Hnf4-prov protein [Xenopus laevis] 146 7e-33 CAI HNF4A [Homo sapiens] 146 7e-33 NP_ hepatocyte nuclear factor 4 alpha isoform c[homo sapiens] 146 7e-33 AAP hepatocyte nuclear factor 4alpha [Bos taurus] 146 7e-33 AAP hepatocyte nuclear factor 4gamma [Bos taurus] 146 7e-33 P41235 Hepatocyte nuclear factor 4-alpha (HNF-4-alpha) 146 7e-33 (Transcription factor HNF-4) AAH Hepatic nuclear factor 4, alpha [Mus musculus] 146 7e-33 AAI Hepatocyte nuclear factor 4, gamma [Homo sapiens] 146 7e-33 AAB hepatocyte nuclear factor 4-alpha [Homo sapiens] 146 7e-33 Εικόνα 41 Αποτελέσματα προγράμματος BLASTx, όπου διακρίνονται οι κωδικοί πρόσβασης και οι περιγραφές των 20 πρωτεϊνών με το μεγαλύτερο score προς την αμινοξική ακολουθία που προκύπτει από τη μετάφραση της νουκλεοτιδικής ακολουθίας του HNF-4 στο M. galloprovincialis 76

77 Η κωδικοποιούσα περιοχή της νουκλεοτιδικής ακολουθίας που ενισχύθηκε μεταφράστηκε με τη βοήθεια του προγράμματος EMBOSS-Transeq (Ηλ. Πηγή 18) (Eικόνα 42). >Mytilus galloprovincialis HNF-4 ICGDRATGKHYGASSCDGCKGFFRRSVRKNHVYSCRFSRNCVVDKDKRNQCRYCRLRKCF KAGMKKEAVQNERDRISTRRDSYEDTSQNNSLSVSTLLNAEILSRQISSPVGQCDLTHKV IATADDVCESIKQQLLVLVEWAKYIPCFCELPLDDQVALLRAHAGEHLVLGVARRSMAVK DVLLLGNDGIIPRNATDMEMGTIAARVLDELVAAFRDIQIDDTEFACIKAIVFFDPEAKG LTDPQKIKSFRYQVQVNLEDYINDRQYDSRGRFGEILLLLPALQSITWQMIEQIQFAKLF GMAKIDNLLQEM Εικόνα 42 Μετάφραση με το πρόγραμμα EMBOSS-Transeq της κωδικοποιούσας περιοχής της νουκλεοτιδικής ακολουθίας που ενισχύθηκε από το M. galloprovincialis. Το πορτοκαλί χρώμα αντιστοιχεί στην περιοχή σύνδεσης στο DNA, το μωβ χρώμα αντιστοιχεί στην περιοχή D, ενώ το μπλε χρώμα αντιστοιχεί στην περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη. Η αμινοξική ακολουθία που προέκυψε από τη μετάφραση συγκρίθηκε με τη βοήθεια του προγράμματος BLASTp (Ηλ. Πηγή 17) με τις καταχωρημένες σε βάσεις δεδομένων πρωτεΐνες. Με τον τρόπο αυτό, βρέθηκαν οι 20 πρωτεΐνες που εμφανίζουν το μεγαλύτερο score, των οποίων οι κωδικοί πρόσβασης και οι περιγραφές φαίνονται στην Eικόνα

78 Sequences producing significant alignments: Score E (Bits) Value NP_ hepatocyte nuclear factor 4, alpha [Danio rerio] 510 3e-143 AAW hepatic nuclear factor 4alpha [Gallus gallus] 506 7e-142 AAB hepatocyte nuclear factor 4-alpha [Homo sapiens] 505 9e-142 XP_ PREDICTED: similar to hepatocyte nuclear factor 4 alpha 505 1e-141 isoform 3 [Canis familiaris] CAA hepatocyte nuclear factor 4 (HNF4) [Xenopus laevis] 503 3e-141 AAP hepatocyte nuclear factor 4alpha [Bos taurus] 503 5e-141 XP_ PREDICTED: similar to hepatocyte nuclear factor 4 alpha 502 6e-141 isoform a, partial [Macaca mulatta] XP_ PREDICTED: similar to hepatocyte nuclear factor 4, alpha 502 1e-140 [Strongylocentrotus purpuratus] CAA hepatocyte nuclear factor 4 alpha [Homo sapiens] 501 1e-140 AAZ hepatic nuclear factor 4 [Sus scrofa] 501 1e-140 ABE hepatocyte nuclear factor 4alpha [Sus scrofa] 501 1e-140 NP_ hepatocyte nuclear factor 4 alpha isoform e[homo sapiens] 501 2e-140 XP_ PREDICTED: similar to hepatocyte nuclear factor 4 alpha 501 2e-140 isoform b isoform 2 [Canis familiaris] XP_ PREDICTED: similar to Transcription factor HNF-4 homolog 501 2e-140 [Tribolium castaneum] AAH Hnf4-prov protein [Xenopus laevis] 501 2e-140 XP_ PREDICTED: similar to hepatocyte nuclear factor 4 alpha 501 2e-140 isoform a isoform 1 [Canis familiaris] BAB hepatocyte nuclear factor 4 [Tamias sibiricus] 496 5e-139 AAH Hepatic nuclear factor 4, alpha [Mus musculus] 493 6e-138 NP_ hepatocyte nuclear factor 4 alpha [Rattus norvegicus] 492 7e-138 CAA transcription factor HNF-4 [Rattus rattus] 492 8e-138 Εικόνα 43 Αποτελέσματα προγράμματος BLASTp, όπου διακρίνονται οι κωδικοί πρόσβασης και οι περιγραφές των 20 πρωτεϊνών με το μεγαλύτερο score προς την αμινοξική ακολουθία που κωδικοποιεί το τμήμα του γονιδίου του HNF-4 στο M. galloprovincialis Τόσο η νουκλεοτιδική ακολουθία που ενισχύθηκε όσο και η αμινοξική ακολουθία που κωδικοποιείται από αυτή καταχωρήθηκαν στη βάση δεδομένων EMBL. Στην Εικόνα 44 φαίνεται η καταχώρηση και ο κωδικός πρόσβασης της ακολουθίας. 78

79 ID standard; genomic DNA; INV; 3136 BP. XX HD * confidential 12-DEC-2007 XX XX SV XX DT 20-DEC-2005 (Rel. 86, Created) DT 20-DEC-2005 (Rel. 86, Last updated, Version 0) XX DE Mytilus galloprovincialis partial hnf-4 gene for putative hepatocyte DE nuclear factor 4 XX KW hepatocyte nuclear factor 4; hnf-4 gene. XX OS Mytilus galloprovincialis (Mediterranean mussel) OC Eukaryota; Metazoa; Mollusca; Bivalvia; Pteriomorphia; Mytiloida; OC Mytiloidea; Mytilidae; Mytilinae; Mytilus. XX RN [1] RC revised by author [01-SEP-2006] RP RA Hadzopoulou-Cladaras M.; RT ; RL Submitted (12-DEC-2005) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases. RL Hadzopoulou-Cladaras M., Dept. Genetics, Dev. and Molecular Biol, School of RL Biology, Aristotle University of Thessaloniki, University campus, RL Thessaloniki, GR-54124, GREECE. XX RN [2] RA Tsekoura C.K., Pantzartzi C.N., Scouras Z.G., Hadzopoulou-Cladaras M.; RT "Isolation of nuclear receptor HNF-4 clones from a Mytilus RT galloprovincialis genomic library"; RL Unpublished. XX FH Key Location/Qualifiers FH FT source FT /organism="mytilus galloprovincialis" FT /mol_type="genomic DNA" FT /country="greece:thermaikos gulf" FT /tissue_type="mantle, adductor muscle" FT /db_xref="taxon:29158" FT CDS join(<1..202, , , ,2910..>3136) FT /gene="hnf-4" FT /product="putative hepatocyte nuclear factor 4" FT /protein_id="caj " FT /translation="icgdratgkhygasscdgckgffrrsvrknhvyscrfsrncvvdk FT DKRNQCRYCRLRKCFKAGMKKEAVQNERDRISTRRDSYEDTSQNNSLSVSTLLNAEILS FT RQISSPVGQCDLTHKVIATADDVCESIKQQLLVLVEWAKYIPCFCELPLDDQVALLRAH FT AGEHLVLGVARRSMAVKDVLLLGNDGIIPRNATDMEMGTIAARVLDELVAAFRDIQIDD FT TEFACIKAIVFFDPEAKGLTDPQKIKSFRYQVQVNLEDYINDRQYDSRGRFGEILLLLP FT ALQSITWQMIEQIQFAKLFGMAKIDNLLQEM" FT exon < FT /gene="hnf-4" FT /number=1 FT intron FT /gene="hnf-4" FT /number=1 FT exon FT /gene="hnf-4" FT /number=2 FT intron FT /gene="hnf-4" FT /number=2 FT exon FT /gene="hnf-4" FT /number=3 FT intron

80 FT /gene="hnf-4" FT /number=3 FT exon FT /gene="hnf-4" FT /number=4 FT intron FT /gene="hnf-4" FT /number=4 FT exon >3136 FT /gene="hnf-4" FT /number=5 XX SQ Sequence 3136 BP; 1079 A; 474 C; 556 G; 1027 T; 0 other; atttgtgggg atagagcaac aggcaaacat tatggggcct caagttgtga cggctgtaag 60 ggattcttcc gtcgtagtgt cagaaagaac catgtttatt cctgtcgatt tagtcggaat 120 tgcgttgttg acaaggacaa acgaaaccaa tgtcgttact gcagattacg taaatgtttc 180 aaagcaggaa tgaaaaaaga aggtaaggaa taaaacagat tgctgatgga tgatatttca 240 tgacaagaaa attaaaagat ttagttcata gttcatatta taacataagc ttcgatataa 300 cttcattcaa ctgtaatgaa tgcaattata gagtgacaat tgaactttta aaaagtcttt 360 agttttccct ccaaggaaat gatttaaccc cagatttttt tttaaaaatt ttgaattatt 420 acccttggcc aagaatttcc cgaaccaaaa tttgttggtt aaaggtctgg aaggggttta 480 ccgaataaaa aaaaatgggc caaaaaattc acaaaagagg gtaaaaaaag gaaaattcca 540 atatattagc ccgaccccat tatctggaca ctcttttata aaaaatatgg aaatggtttg 600 gctctaaaat ttaaacgaaa ctgaaaaacc ccccccccct ttccaattct aattactatg 660 gaaaattttt tggtgtccaa ttaaattaaa tacaaattaa aattaaaact tacctttccc 720 cccccacttt agactttgta ttctaaatcc acagttcaat taaaaaaaaa cacactggtt 780 ttcttttttg gttgtgttct cccccctaca caaaatgtcc taaactatta tttgatataa 840 aactccttta tataaaaatc ccactcaact cttcccaggc agttcaaaat gaaagagata 900 gaatcagcac gcgtagagac agttatgaag ataccagtca aaacaattca ctctccgtca 960 gtactttgtt aaacgctgaa attctctcca gacaggtgag atcatacatt gttatgttta 1020 atcttattta atgtgaaaaa aacatgcaga tgatgaggat gatccataac atagagcaca 1080 tgattatata aatatgtagt gactaatttt agcctgattt gtcactagaa aaaaaatatg 1140 tttacatttt gttaaaatga tatttccata ggtacatcca tgagctgttt ttgacttgga 1200 tattatgtgg atagagaaaa tctgatgaaa aaaacaattt agaaaataaa aggatattta 1260 cctgtttatt aaattggtat gggaatggga ataggttcta caaacataga aggaagagaa 1320 ctaatactta attttaagta taaatttgag attaacgctc acatacgtat gaaatacagt 1380 caagcctgtt ttaaaggtca tcttccagtc tttgccaaag tgtattaggg tttgtctgac 1440 cgaaaaaaga aattttgacg tttttcttct atatattaaa ctaaaaattc tgagaatttc 1500 tgtctgacct atgacttttt gtctgacatt ttgtcggaca gacagagttt gggatacact 1560 gatcttcttt gtgacctgat gtagtaatac ttgtaacttt taaatctcat tttaaatgtc 1620 atctctatta taaggtcagt tctctctgga ccttagggta acctttaatg ctagtttgac 1680 tatatgtaga actgtataaa taaccatgca tgtttgaatt tttagatctc gtcccccgtt 1740 ggacagtgtg acctgacaca caaggttata gcgactgctg atgatgtgtg tgaatctata 1800 aaacaacaat tacttgttct tgtagaatgg gcaaaatata taccgtgttt ttgtgaactg 1860 ccattagatg atcaggtaag aacaaaataa atatatgaaa aaataattaa aaaacgataa 1920 ttttatcaaa tgtaagcctt attaatagaa gataattttt catttatgca attaaaggat 1980 ttcctagttt aaaaggtttt ctctgaatta gatccaagat gtctactaca gatttagatt 2040 tctcagaaat gaatcaagat ttcaactaca gattaagagt tttctgcatt gaataaaaaa 2100 tgtcactgta tttgatttta aatgatctga aatgaatcaa atcactgtga catatttaat 2160 ttctctataa ttatagaaat tggaacacct tcttttaagg gttaacaaga tatttatata 2220 tttgttatca ttattattag gttgccttat taagagctca tgctggagaa catttggttc 2280 tgggtgttgc cagacgttcc atggccgtca aggatgtttt attattggga aatgatggga 2340 taattccacg taacgctaca gatatggaga tgggaacaat tgcagccaga gtattagacg 2400 agttagttgc agcatttaga gacatacaga tagatgacac agagtttgcc tgtattaaag 2460 ctattgtctt ctttgatcct ggtgagtatc tgtttttttt ctgaattgag aaaaagacat 2520 gatatgatat aagtgtagtt cttttttttt gggaagagaa catcacttaa gcagaattga 2580 agcgaatatg cactcctccc tttcatataa attgaaggtt gttttgatct gaattataag 2640 attagtgttt gaaataaagg aaaagagagg ctttgattga agtttaataa tcatataatg 2700 cccttgcttt tgtcccaaaa tgggaaaaaa aattccaaac caattgttag gttccttttt 2760 tccaattttg gaaaatcccg gaaaaaaaag gctggaaagg aaattttagg tatggtggag 2820 agggttttaa aatatttggt atttaaacct atggacttgg aaattaccct aaaatgtttg 2880 gtttcttaca ttgacaattt ttttccagga agctaaaggt ctgacagatc cacaaaaaat 2940 caaaagtttt cgttaccaag tacaagtaaa tctggaagat tatatcaacg atcgtcagta 3000 cgactctcga ggcagatttg gggagatttt attactgttg cccgccttac agagcattac 3060 ttggcaaatg attgaacaga tacagttcgc caagttattt ggaatggcca aaatcgataa 3120 cctgcttcaa gaaatg 3136 Εικόνα 44 Καταχωρημένη ακολουθία πυρηνικού υποδοχέα HNF-4 στη βάση δεδομένων EMBL 80

81 Ανάλυση νουκλεοτιδικής ακολουθίας Αρχικά, υπολογίστηκε με το πρόγραμμα Genomatix (Ηλ. Πηγή 19) η περιεκτικότητα της ακολουθίας σε καθεμία από τις αζωτούχες βάσεις (Εικόνα 45). Βρέθηκε ότι το ποσοστό σε ΑΤ είναι 67,16% και το ποσοστό σε GC είναι 32,84%. Εικόνα 45 Ποσοστά αζωτούχων βάσεων του τμήματος του γονιδίου του HNF-4 που ενισχύθηκε από το M. galloprovincialis, όπως προκύπτουν από το πρόγραμμα Genomatix Στη συνέχεια, υπολογίστηκε η χρήση των κωδικονίων στο υπό μελέτη νουκλεοτιδικό τμήμα του HNF-4 με τη βοήθεια του προγράμματος CountCodon από τη βάση δεδομένων CUTG (Ηλ. Πηγή 20) (Εικόνα 46). Έπειτα, με το πρόγραμμα CAI Calculator (Ηλ. Πηγή 21) έγινε σύγκριση της χρήσης των κωδικονίων στη συγκεκριμένη νουκλεοτιδική ακολουθία με τον πίνακα χρήσης κωδικονίων του M. galloprovincialis και υπολογίστηκε ο δείκτης CAI. Η τιμή του δείκτη βρέθηκε να είναι

82 (312 codons) fields: [triplet] [amino acid] [frequency: per thousand] ([number]) UUU F 25.6 (8) UCU S 6.4 (2) UAU Y 16.0 (5) UGU C 35.3(11) UUC F 16.0 (5) UCC S 16.0 (5) UAC Y 9.6 (3) UGC C 6.4 (2) UUA L 44.9(14) UCA S 6.4 (2) UAA * 0.0 (0) UGA * 0.0 (0) UUG L 12.8 (4) UCG S 3.2 (1) UAG * 0.0 (0) UGG W 6.4 (2) CUU L 9.6 (3) CCU P 3.2 (1) CAU H 12.8 (4) CGU R 28.8 (9) CUC L 6.4 (2) CCC P 6.4 (2) CAC H 3.2 (1) CGC R 0.0 (0) CUA L 0.0 (0) CCA P 9.6 (3) CAA Q 32.1(10) CGA R 9.6 (3) CUG L 22.4 (7) CCG P 3.2 (1) CAG Q 25.6 (8) CGG R 3.2 (1) AUU I 28.8 (9) ACU T 9.6 (3) AAU N 16.0 (5) AGU S 22.4 (7) AUC I 16.0 (5) ACC T 3.2 (1) AAC N 22.4 (7) AGC S 6.4 (2) AUA I 22.4 (7) ACA T 19.2 (6) AAA K 41.7 (13) AGA R 38.5(12) AUG M 22.4 (7) ACG T 3.2 (1) AAG K 19.2 (6) AGG R 0.0 (0) GUU V 38.5(12) GCU A 22.4 (7) GAU D 51.3(16) GGU G 6.4 (2) GUC V 12.8 (4) GCC A 28.8 (9) GAC D 28.8 (9) GGC G 9.6 (3) GUA V 12.8 (4) GCA A 22.4 (7) GAA E 38.5(12) GGA G 22.4 (7) GUG V 3.2 (1) GCG A 3.2 (1) GAG E 12.8 (4) GGG G 12.8 (4) Translation exception table: Standard Εικόνα 46 Χρήση κωδικονίων στην υπό μελέτη νουκλεοτιδική ακολουθία του M. galloprovincialis, όπως υπολογίστηκε με το πρόγραμμα CountCodon Επιπρόσθετα, βρέθηκαν οι θέσεις αναγνώρισης των ενδονουκλεασών περιορισμού στην ακολουθία με τη βοήθεια του προγράμματος Remap (Ηλ. Πηγή 22). Στην Εικόνα 47 φαίνονται οι ενδονουκλεάσες περιορισμού που έχουν την ικανότητα να κόβουν στις πρώτες 300 βάσεις της ακολουθίας. 82

83 Tsp45I MaeIII Sau96I MnlI EcoO109I FalI BspLI FalI CviJI CviJI BshFI MboII BpuEI SmlI TspGWI \ \\\ \ \ \\ \ \\ ATTTGTGGGGATAGAGCAACAGGCAAACATTATGGGGCCTCAAGTTGTGACGGCTGTAAG : : : : : :---- FatI PfeI FalI CviAII HinfI FalI MmeI Hpy188I BceAI Hpy99I Hpy188I NlaIII TaqI Tsp509I \ \ \ \\ \\ \ \ \\ GGATTCTTCCGTCGTAGTGTCAGAAAGAACCATGTTTATTCCTGTCGATTTAGTCGGAAT : : : : : :---- MaeIII SfcI CviRI BspMAI MaeII BsaAI Hpy8I SnaBI HincII TaiI \ \ \ \ \ \\ \ TGCGTTGTTGACAAGGACAAACGAAACCAATGTCGTTACTGCAGATTACGTAAATGTTTC : : : : : :---- BseGI RcaI FatI CviAII TspDTI BccI TspDTI Hpy188II \ \ \ \ \\ AAAGCAGGAATGAAAAAAGAAGGTAAGGAATAAAACAGATTGCTGATGGATGATATTTCA : : : : : :---- HindIII AluI Tsp509I CviJI FokI MseI TaqI NlaIII TspDTI TspDTI PsiI TspDTI \\ \ \ \ \ \ \ \ \ TGACAAGAAAATTAAAAGATTTAGTTCATAGTTCATATTATAACATAAGCTTCGATATAA : : : : : :---- Εικόνα 47 Αποτελέσματα προγράμματος Remap, όπου φαίνονται οι θέσεις αναγνώρισης των ενδονουκλεασών περιορισμού στις πρώτες 300 βάσεις της νουκλεοτιδικής ακολουθίας που ενισχύθηκε από το M. galloprovincialis 83

84 Ανάλυση αμινοξικής ακολουθίας Αρχικά, με το πρόγραμμα ProtParam (Ηλ. Πηγή 23) υπολογίστηκε η συχνότητα εμφάνισης των αμινοξέων στο πρωτεϊνικό τμήμα που κωδικοποιείται από τα εξόνια της νουκλεοτιδικής ακολουθίας που ενισχύθηκε (Εικόνα 48). Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα ProtScale (Ηλ. Πηγή 24) για την κατασκευή της γραφικής παράστασης στην οποία φαίνονται οι υδρόφιλες και οι υδρόφοβες περιοχές του πρωτεϊνικού τμήματος (Εικόνα 49). Ala (A) % Leu (L) % Arg (R) % Lys (K) % Asn (N) % Met (M) 7 2.2% Asp (D) % Phe (F) % Cys (C) % Pro (P) 7 2.2% Gln (Q) % Ser (S) % Glu (E) % Thr (T) % Gly (G) % Trp (W) 2 0.6% His (H) 5 1.6% Tyr (Y) 8 2.6% Ile (I) % Val (V) % Εικόνα 48 Συχνότητα εμφάνισης αμινοξέων στην υπό μελέτη αμινοξική ακολουθία, όπως προκύπτει από το πρόγραμμα ProtParam Εικόνα 49 Γραφική παράσταση που κατασκευάστηκε με το πρόγραμμα ProtScale, στην οποία διακρίνονται οι υδρόφιλες (score μικρότερο από 0) και οι υδρόφοβες περιοχές (score μεγαλύτερο από 0) του πρωτεϊνικού τμήματος του πυρηνικού υποδοχέα HNF-4 84

85 Έπειτα, χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα Colorseq (Ηλ. Πηγή 25) για την ανάλυση της πρωτοταγούς δομής της αμινοξικής ακολουθίας. Το πρόγραμμα αυτό χρωματίζει κόκκινα τα υδρόφοβα, τα υδρόφιλα, τα θετικά φορτισμένα, τα αρνητικά φορτισμένα ή τα αρωματικά αμινοξέα, ανάλογα με την επιλογή που κάνουμε κάθε φορά (Εικόνα 50). Υδρόφοβα αμινοξέα ICGDRATGKHYGASSCDGCKGFFRRSVRKNHVYSCRFSRNCVVDKDKRNQCRYCRLRKCFKAGMKKEAVQ NERDRISTRRDSYEDTSQNNSLSVSTLLNAEILSRQISSPVGQCDLTHKVIATADDVCESIKQQLLVLVE WAKYIPCFCELPLDDQVALLRAHAGEHLVLGVARRSMAVKDVLLLGNDGIIPRNATDMEMGTIAARVLDE LVAAFRDIQIDDTEFACIKAIVFFDPEAKGLTDPQKIKSFRYQVQVNLEDYINDRQYDSRGRFGEILLLL PALQSITWQMIEQIQFAKLFGMAKIDNLLQEM Υδρόφιλα αμινοξέα ICGDRATGKHYGASSCDGCKGFFRRSVRKNHVYSCRFSRNCVVDKDKRNQCRYCRLRKCFKAGMKKEAVQ NERDRISTRRDSYEDTSQNNSLSVSTLLNAEILSRQISSPVGQCDLTHKVIATADDVCESIKQQLLVLVE WAKYIPCFCELPLDDQVALLRAHAGEHLVLGVARRSMAVKDVLLLGNDGIIPRNATDMEMGTIAARVLDE LVAAFRDIQIDDTEFACIKAIVFFDPEAKGLTDPQKIKSFRYQVQVNLEDYINDRQYDSRGRFGEILLLL PALQSITWQMIEQIQFAKLFGMAKIDNLLQEM Θετικά φορτισμένα αμινοξέα ICGDRATGKHYGASSCDGCKGFFRRSVRKNHVYSCRFSRNCVVDKDKRNQCRYCRLRKCFKAGMKKEAVQ NERDRISTRRDSYEDTSQNNSLSVSTLLNAEILSRQISSPVGQCDLTHKVIATADDVCESIKQQLLVLVE WAKYIPCFCELPLDDQVALLRAHAGEHLVLGVARRSMAVKDVLLLGNDGIIPRNATDMEMGTIAARVLDE LVAAFRDIQIDDTEFACIKAIVFFDPEAKGLTDPQKIKSFRYQVQVNLEDYINDRQYDSRGRFGEILLLL PALQSITWQMIEQIQFAKLFGMAKIDNLLQEM Αρνητικά φορτισμένα αμινοξέα ICGDRATGKHYGASSCDGCKGFFRRSVRKNHVYSCRFSRNCVVDKDKRNQCRYCRLRKCFKAGMKKEAVQ NERDRISTRRDSYEDTSQNNSLSVSTLLNAEILSRQISSPVGQCDLTHKVIATADDVCESIKQQLLVLVE WAKYIPCFCELPLDDQVALLRAHAGEHLVLGVARRSMAVKDVLLLGNDGIIPRNATDMEMGTIAARVLDE LVAAFRDIQIDDTEFACIKAIVFFDPEAKGLTDPQKIKSFRYQVQVNLEDYINDRQYDSRGRFGEILLLL PALQSITWQMIEQIQFAKLFGMAKIDNLLQEM Αρωματικά αμινοξέα ICGDRATGKHYGASSCDGCKGFFRRSVRKNHVYSCRFSRNCVVDKDKRNQCRYCRLRKCFKAGMKKEAVQ NERDRISTRRDSYEDTSQNNSLSVSTLLNAEILSRQISSPVGQCDLTHKVIATADDVCESIKQQLLVLVE WAKYIPCFCELPLDDQVALLRAHAGEHLVLGVARRSMAVKDVLLLGNDGIIPRNATDMEMGTIAARVLDE LVAAFRDIQIDDTEFACIKAIVFFDPEAKGLTDPQKIKSFRYQVQVNLEDYINDRQYDSRGRFGEILLLL PALQSITWQMIEQIQFAKLFGMAKIDNLLQEM Εικόνα 50 Ανάλυση πρωτοταγούς δομής του πρωτεϊνικού τμήματος του πυρηνικού υποδοχέα HNF- 4 με το πρόγραμμα Colorseq 85

86 Επιπλέον, με τη βοήθεια του προγράμματος Colorseq βρέθηκε η ακολουθία CDGCKG που εντοπίζεται στην περιοχή σύνδεσης στο DNA και είναι ένα μοναδικό χαρακτηριστικό του ΗΝF-4 σε σχέση με τα υπόλοιπα μέλη της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων. Παράλληλα, βρέθηκε η ακολουθία LLQEM που αντιστοιχεί στα 5 από τα 6 αμινοξέα της AF-2 AD περιοχής (φφχεφφ), εντοπίζεται στην περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη του ΗΝF-4 και είναι πλήρως συντηρημένη σε όλους τους οργανισμούς (Εικόνα 51) ICGDRATGKHYGASSCDGCKGFFRRSVRKNHVYSCRFSRNCVVDKDKRNQCRYCRLRKCFKAGMKKEAVQ NERDRISTRRDSYEDTSQNNSLSVSTLLNAEILSRQISSPVGQCDLTHKVIATADDVCESIKQQLLVLVE WAKYIPCFCELPLDDQVALLRAHAGEHLVLGVARRSMAVKDVLLLGNDGIIPRNATDMEMGTIAARVLDE LVAAFRDIQIDDTEFACIKAIVFFDPEAKGLTDPQKIKSFRYQVQVNLEDYINDRQYDSRGRFGEILLLL PALQSITWQMIEQIQFAKLFGMAKIDNLLQEM Εικόνα 51 Εύρεση με το πρόγραμμα Colorseq των ακολουθιών CDGCKG και LLQEM που αποτελούν μοναδικά χαρακτηριστικά του ΗΝF-4 σε σχέση με τους υπόλοιπους πυρηνικούς υποδοχείς Στη συνέχεια, αναζητήθηκαν με τη βοήθεια του προγράμματος SMART (Ηλ. Πηγή 26) χαρακτηριστικά μοτίβα τα οποία μπορούν να εντάξουν την αμινοξική ακολουθία σε μια ευρύτερη οικογένεια πρωτεϊνών (Εικόνα 52). Παρατηρούμε ότι επαληθεύτηκε η ύπαρξη της περιοχής σύνδεσης στο DNA και της περιοχής πρόσδεσης του συνδέτη. Παράλληλα, έγινε δυνατή η αναγνώριση των πλαισίων P και D που εντοπίζονται στην περιοχή σύνδεσης στο DΝΑ (Εικόνα 53). 86

87 Εικόνα 52 Χαρακτηριστικά μοτίβα του υπό μελέτη πρωτεϊνικού τμήματος, η ύπαρξη των οποίων επαληθεύτηκε με τη βοήθεια του προγράμματος SMART Εικόνα 53 Σχηματική απεικόνιση περιοχών C και D του πρωτεϊνικού τμήματος του HNF-4 του M. galloprovincialis, στην οποία διακρίνονται τα δάκτυλα ψευδαργύρου και τα πλαίσια P και D Η πρόβλεψη της δευτεροταγούς δομής του υπό μελέτη πρωτεϊνικού τμήματος πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα NNPredict (Ηλ. Πηγή 27) (Εικόνα 54). Sequence HNF-4: ICGDRATGKHYGASSCDGCKGFFRRSVRKNHVYSCRFSRNCVVDKDKRNQCRYCRLRKCF KAGMKKEAVQNERDRISTRRDSYEDTSQNNSLSVSTLLNAEILSRQISSPVGQCDLTHKV IATADDVCESIKQQLLVLVEWAKYIPCFCELPLDDQVALLRAHAGEHLVLGVARRSMAVK DVLLLGNDGIIPRNATDMEMGTIAARVLDELVAAFRDIQIDDTEFACIKAIVFFDPEAKG LTDPQKIKSFRYQVQVNLEDYINDRQYDSRGRFGEILLLLPALQSITWQMIEQIQFAKLF GMAKIDNLLQEM Secondary structure prediction (H = helix, E = strand, - = no prediction): H-HH------EE HHH HH----HH EEEEHHHHHHHH HHH E-----HHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHH--HHHHHHHHH-HHHH HHHH HHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHEEEE EEEE EEHHHHHH--H--HHHHHHHHHHHHH --HHHHHHHH-- 87

88 Εικόνα 54 Πρόβλεψη της δευτεροταγούς ακολουθίας του υπό μελέτη πρωτεϊνικού τμήματος με το πρόγραμμα NNPredict Με το πρόγραμμα Geno3d (Ηλ. Πηγή 29) έγινε η πρόβλεψη της τριτοταγούς δομής. Συγκεκριμένα, η αμινοξική ακολουθία αρχικά συγκρίθηκε με πρωτεϊνικές δομές που είναι ήδη κατατεθειμένες στη βάση δεδομένων PDB (Ηλ. Πηγή 28). Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ευθυγράμμισή της με τις 4 πιο κοντινές πρωτεϊνικές ακολουθίες, οι κωδικοί και οι περιγραφές των οποίων φαίνονται στον Πίνακα 12. Με βάση την ευθυγράμμιση αυτή πραγματοποιήθηκε η πρόβλεψη της δομής του υπό ανάλυση πρωτεϊνικού τμήματος. Στην Εικόνα 55 φαίνονται τα 3 προτεινόμενα μοντέλα τριτοταγούς διαμόρφωσης. Πρέπει να σημειωθεί ότι κατέστη δυνατή η πρόβλεψη της τριτοταγούς δομής μόνο των 225 από τα 312 αμινοξέα που αντιστοιχούν στην περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη και κωδικοποιούνται από τη νουκλεοτιδική ακολουθία που ενισχύθηκε στο M. galloprovincialis, εξαιτίας του γεγονότος ότι υπάρχουν κρυσταλλογραφικά δεδομένα μόνο για το συγκεκριμένο αμινοξικό τμήμα. Πίνακας 12 Κωδικοί και περιγραφές των 4 πιο κοντινών πρωτεϊνών προς το πρωτεϊνικό τμήμα του πυρηνικού υποδοχέα HNF-4 του M. galloprovincialis, οι οποίες ανήκουν στη βάση δεδομένων PDB Κωδικός PDB Οργανισμός Περιγραφή Περιοχή (αα) pdb1lbd_0 Homo sapiens Nuclear receptor pdb1lv2a_0 Homo sapiens Transcription factor pdb1m7wa_0 Rattus rattus Transcription factor pdb1pzla_0 Homo sapiens Transcription factor

89 Εικόνα 55 Προτεινόμενα μοντέλα τριτοταγούς διαμόρφωσης του πρωτεϊνικού τμήματος του HNF-4 του M. galloprovincialis από το πρόγραμμα Geno3d Σύγκριση πρωτεΐνης HNF-4 M. galloprovincialis με αντίστοιχες άλλων οργανισμών Το πρωτεϊνικό τμήμα που κωδικοποιείται από τη νουκλεοτιδική ακολουθία του γονιδίου του HNF-4 στο M. galloprovincialis συγκρίθηκε με τα αντίστοιχα τμήματα και των 3 υποτύπων του συγκεκριμένου πυρηνικού υποδοχέα σπονδυλωτών και ασπόνδυλων. Αρχικά, με τη βοήθεια του προγράμματος Align (Ηλ. Πηγή 30) έγινε ευθυγράμμιση της υπό μελέτη περιοχής (C, D ή E) του M. galloprovincialis με την αντίστοιχη περιοχή του HNF-4 καθενός από τους υπόλοιπους οργανισμούς. Με τον τρόπο αυτό βρέθηκε σε κάθε περιοχή ο αριθμός των αμινοξέων που είναι ακριβώς ίδια μεταξύ των 2 οργανισμών και υπολογίστηκε το εκατοστιαίο ποσοστό ομοιότητας. Στις Εικόνες 56, 57, 58 φαίνονται τα ποσοστά ομοιότητας των περιοχών C, D και E των πρωτεϊνών HNF-4α σπονδυλωτών, των πρωτεϊνών HNF-4β και HNF- 89

90 4γ σπονδυλωτών και των πρωτεϊνών HNF-4 ασπόνδυλων, με τις αντίστοιχες περιοχές του HNF-4 στο M. galloprovincialis. Οι κωδικοί πρόσβασης, οι περιγραφές και οι οργανισμοί από τους οποίους προέρχονται οι αμινοξικές ακολουθίες που χρησιμοποιήθηκαν παρατίθενται στον Πίνακα 13. Εικόνα 56 Ποσοστά ομοιότητας των περιοχών C, D και E πρωτεϊνών HNF-4α σπονδυλωτών με τις αντίστοιχες περιοχές του HNF-4 του M. galloprovincialis Εικόνα 57 90

91 Ποσοστά ομοιότητας των περιοχών C, D και E πρωτεϊνών HNF-4β και HNF-4γ σπονδυλωτών με τις αντίστοιχες περιοχές του HNF-4 του M. galloprovincialis Εικόνα 58 Ποσοστά ομοιότητας των περιοχών C, D και E πρωτεϊνών HNF-4 ασπόνδυλων με τις αντίστοιχες περιοχές του HNF-4 του M. galloprovincialis Πίνακας 13 Κωδικοί πρόσβασης, περιγραφές και οργανισμοί από τους οποίους προέρχονται οι πρωτεΐνες που χρησιμοποιήθηκαν στην κατασκευή φυλογενετικών δέντρων Κωδικός πρόσβασης Οργανισμός Περιγραφή EAT36599 AAB93762 AAP82997 Aedes aegypti (κουνούπι) Bombyx mori (μεταξοσκώληκας) Bos taurus (αγελάδα) hepatocyte nuclear factor 4 hepatocyte nuclear factor 4 isoform a hepatocyte nuclear factor 4 alpha AAP Bos taurus (αγελάδα) hepatocyte nuclear factor 4 gamma XP_ XP_ Canis familiaris (σκύλος) Canis familiaris (σκύλος) similar to hepatocyte nuclear factor 4 alpha isoform a similar to hepatocyte nuclear factor 4, gamma NP_ Danio rerio (ψάρι) hepatocyte nuclear factor 4, alpha 91

92 AAY Danio rerio (ψάρι) HNF4 gamma AAB09592 Drosophila melanogaster (μύγα των φρούτων) hepatocyte nuclear factor 4 homolog AAW Gallus gallus (όρνιθα) hepatic nuclear factor 4 alpha NP_ CAA XP_ XP_ Homo sapiens (άνθρωπος) Homo sapiens (άνθρωπος) Macaca mulatta (μαϊμού) Macaca mulatta (μαϊμού) hepatocyte nuclear factor 4 alpha isoform a hepatocyte nuclear factor 4 gamma (HNF4 gamma) similar to hepatocyte nuclear factor 4 alpha isoform a, partial similar to hepatocyte nuclear factor 4, gamma isoform 2 AAH39220 Mus musculus (ποντίκι) hepatic nuclear factor 4, alpha CAB Mus musculus (ποντίκι) hepatocyte nuclear factor 4 gamma BAA01411 XP_ CAA40412 Rattus norvegicus (νορβηγικός αρουραίος) Rattus norvegicus (νορβηγικός αρουραίος) Rattus rattus (μαύρος αρουραίος) hepatocyte nuclear factor 4 alpha similar to hepatocyte nuclear factor 4, gamma transcription factor HNF-4 alpha XP_ Strongylocentrotus purpuratus similar to hepatocyte nuclear factor 4 ABE Sus scrofa (χοίρος) hepatocyte nuclear factor 4 alpha BAB XP_ CAA85763 CAA Tamias sibiricus (τρωκτικό ταμίας Σιβηρίας) Tribolium castaneum (κόκκινο σκαθάρι) Xenopus laevis (αφρικανικός βάτραχος) Xenopus laevis (αφρικανικός βάτραχος) hepatocyte nuclear factor 4 alpha similar to Transcription factor HNF- 4 homolog (dhnf4) hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4a) hepatocyte nuclear factor 4 beta (HNF4 beta) Κατασκευή φυλογενετικών δέντρων Με τη βοήθεια του προγράμματος Mega2 (Kumar et al., 2001) κατασκευάστηκαν φυλογενετικά δέντρα με τα κριτήρια της Μέγιστης Φειδωλότητας (Maximum Parsimony) και της Ελάχιστης Εξέλιξης (Minimum Evolution) (Eικόνες 59, 60). Για την κατασκευή των δέντρων χρησιμοποιήθηκαν τα ομόλογα τμήματα με την υπό μελέτη αμινοξική ακολουθία του M. galloprovincialis που ανήκουν στις πρωτεΐνες των οργανισμών του Πίνακα

93 Εικόνα 59 Φυλογενετικό δέντρο των πρωτεϊνών HNF-4 που κατασκευάστηκε με τη μέθοδο Μέγιστης Φειδωλότητας. Τα νούμερα στους κόμβους αναπαριστούν τις τιμές Bootstrap μετά από 1000 επαναλήψεις. Εικόνα 60 Φυλογενετικό δέντρο των πρωτεϊνών HNF-4 που κατασκευάστηκε με τη μέθοδο Ελάχιστης Εξέλιξης. Τα νούμερα στους κόμβους αναπαριστούν τις τιμές Bootstrap μετά από 1000 επαναλήψεις. Κλωνοποίηση σε πλασμιδιακό φορέα Το προϊόν της PCR με το ζεύγος εκκινητών MB_F1-hnf_R1, μεγέθους 1339 ζευγών βάσεων, που κωδικοποιεί ένα μεγάλο τμήμα της περιοχής πρόσδεσης του συνδέτη, κλωνοποιήθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pgem-t Easy. Στη συνέχεια, έγινε μετασχηματισμός των βακτηρίων DH5α Competent cells με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο και απομόνωση του πλασμιδιακού DNA των θετικών κλώνων που επιλέχτηκαν (Εικόνα 61). 93

94 Εικόνα 61 Ηλεκτροφόρηση του απομονωμένου πλασμιδιακού DNA 5 θετικών κλώνων της κλωνοποίησης. Ο μάρτυρας που χρησιμοποιήθηκε είναι ο NEB 1 kb Ladder. Προκειμένου να επιβεβαιωθεί ότι στο πλασμιδιακό DNA που απομονώθηκε από κάθε βακτηριακό κλώνο έχει ενσωματωθεί το συγκεκριμένο νουκλεοτιδικό τμήμα, έγινε αρχικά πέψη με το ένζυμο περιορισμού EcoRI. Στη συνέχεια, ακολούθησε απλή πέψη με το ένζυμο SacI και διπλές πέψεις με τα ένζυμα περιορισμού EcoRI και SacI, SacI και HincII, EcoRI και HincII. Από την ανάλυση της νουκλεοτιδικής ακολουθίας με το πρόγραμμα Remap προκύπτει ότι δεν υπάρχει θέση αναγνώρισης του ενζύμου EcoRI, ενώ αντίθετα στον φορέα το συγκεκριμένο ένζυμο κόβει λίγο πριν και λίγο μετά τη θέση εισαγωγής του ενθέματος. Όσον αφορά το ένζυμο περιορισμού SacI, αυτό διαθέτει μια θέση αναγνώρισης τόσο στο ένθεμα όσο και στο φορέα. Αντίθετα, το ένζυμο HincII αναμένεται να κόβει μόνο μία φορά στο ένθεμα, και καμία στο φορέα (Εικόνα 62). Έτσι, με βάση τα παραπάνω, τα προϊόντα της απλής πέψης με EcoRI αναμένεται να είναι 2 ζώνες μεγέθους 3015 και 1340 ζευγών βάσεων, ενώ τα προϊόντα της απλής πέψης με SacI 2 ζώνες μεγέθους 3475 και 880 ζευγών βάσεων. Όσον αφορά τη διπλή πέψη με EcoRI και SacI αναμένονται 4 ζώνες μεγέθους 2965, 830, 510 και 50 ζευγών βάσεων. Τα προϊόντα της διπλής πέψης με SacI και HincII αναμένεται να είναι 3 ζώνες μεγέθους 3425, 880 και 50 ζευγών βάσεων, ενώ τα προϊόντα της διπλής πέψης με EcoRI και HincII 3 ζώνες μεγέθους 3015, 885 και 455 ζευγών βάσεων. 94

95 Εικόνα 62 Χάρτης πλασμιδιακού φορέα pgem-t Easy με ενσωματωμένο το επιθυμητό ένθεμα των 1339 ζευγών βάσεων, στον οποίο φαίνονται οι θέσεις αναγνώρισης των ενζύμων περιορισμού EcoRI, SacI και HincII. Το μπλε χρώμα αντιπροσωπεύει τον φορέα, ενώ το πράσινο χρώμα το ένθεμα. Από την ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της εκάστοτε πέψης στην οποία υποβλήθηκε το πλασμιδιακό DNA των θετικών κλώνων προκύπτει ότι ακολουθούνται τα αναμενόμενα πρότυπα (Εικόνα 63). Μοναδική εξαίρεση είναι η εμφάνιση 1 ζώνης 4355 ζευγών βάσεων στα προϊόντα της διπλής πέψης με SacI και HincII, η οποία πιθανότατα αντιπροσωπεύει άκοπο πλασμιδιακό DNA. Όλα τα παραπάνω επιβεβαιώνουν ότι κλωνοποιήθηκε το επιθυμητό τμήμα DNA στον πλασμιδιακό φορέα, το οποίο ονομάστηκε MgHNF4LBD1. 95

96 Εικόνα 63 Προϊόντα απλών και διπλών πέψεων με τα ένζυμα περιορισμού EcoRI, SacI και HincII στις οποίες υποβλήθηκε το DNA ενός θετικού κλώνου. Ο μάρτυρας που χρησιμοποιήθηκε είναι ο NEB 1 kb Ladder. Ε: EcoRI, S: SacI, H: HincII 96