ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ Μελέτη του ρόλου του αυξητικού παράγοντα HARP στην παθοφυσιολογία του ανθρώπινου προστάτη ΧΑΤΖΗΑΠΟΣΤΟΛΟΥ ΜΑΡΙΑ Βιολόγος, Μ Ε ΕΥΧΑΡΙΣΤΟΥΜΕ ΤΟ ΕΥΡΩΠΑΪΚΟ ΚΟΙΝΩΝΙΚΟ ΤΑΜΕΙΟ (ESF), ΤΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΕΚΠΑΙ ΕΥΣΗΣ ΚΑΙ ΕΠΑΓΓΕΛΜΑΤΙΚΗΣ ΚΑΤΑΡΤΙΣΗΣ (ΕΠΕΑΕΚ ΙΙ) ΚΑΙ ΣΥΓΚΕΚΡΙΜΕΝΑ ΤΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΗΡΑΚΛΕΙΤΟΣ ΠΑΤΡΑ 2005

Πρόλογος Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιολογίας του Τµήµατος Βιολογίας και στο Εργαστήριο Μοριακής Φαρµακολογίας του Τµήµατος Φαρµακευτικής, του Πανεπιστηµίου Πατρών. Ένα µεγάλο ευχαριστώ οφείλω στον Αναπληρωτή και Επιβλέποντα Καθηγητή του Τµήµατος Βιολογίας Παναγιώτη Κατσώρη, ο οποίος µου έδωσε την ευκαιρία να δοκιµαστώ στην έρευνα, µε εµπιστεύτηκε και κυρίως µε δίδαξε τον τρόπο σκέψης και τις αναζητήσεις που οφείλει να έχει καθηµερινά ένας ερευνητής. Επίσης, νιώθω ότι πολλά ευχαριστώ χρωστάω στην Επίκουρο Καθηγήτρια του Τµήµατος Φαρµακευτικής Ευαγγελία Παπαδηµητρίου γιατί πίστεψε εξαρχής σε εµένα, καθοδήγησε ένα µεγάλο µέρος της εργασίας µου και µου συµπαραστάθηκε σε όλες τις δύσκολες στιγµές τόσο µε την ιδιότητα του Ακαδηµαϊκού εκπαιδευτικού όσο και ως ένας καλός φίλος. Ακόµη, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή του Τµήµατος Φαρµακευτικής Σωκράτη Τζάρτο που δέχτηκε να συµµετάσχει στην Επταµελή Εξεταστική Επιτροπή, για τις εύστοχες παρατηρήσεις και συµβουλές του, για το ενδιαφέρον που έδειξε για την εργασία µου και κυρίως για την ηθική συµπαράσταση. Επίσης, ευχαριστώ πολύ τον Καθηγητή του Τµήµατος Χηµείας Νικόλαο Καραµάνο, την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια του Τµήµατος Βιολογίας Μαρία Λαµπροπούλου και τον Καθηγητή του Τµήµατος Βιολογίας Γεώργιο ηµητριάδη, που δέχθηκαν να συµµετάσχουν στην Επταµελή Εξεταστική Επιτροπή της παρούσας διατριβής και για τις πολύτιµες συµβουλές και υποδείξεις τους. Επιπλέον πολλά ευχαριστώ οφείλω στον Αναπληρωτή Καθηγητή του Τµήµατος Φαρµακευτικής Ανδρέα Παπαπετρόπουλο, για τη συµµετοχή του στην Επταµελή Εξεταστική Επιτροπή, τις παραγωγικές συζητήσεις µας, τις πολύτιµες παρατηρήσεις του και για την ευκαιρία που µου έδωσε να εργαστώ πάνω σε κάποιο θέµα του ερευνητικού του αντικειµένου. Ακόµη, θα ήθελα να τον ευχαριστήσω για τη διευκόλυνση που µας παρείχε όσον αφορά κάποια αντιδραστήρια και όργανα. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω το Ίδρυµα Κρατικών Υποτροφιών που στήριξε οικονοµικά ένα µέρος της ιδακτορικής µου ιατριβής καθώς και το Πρόγραµµα Ηράκλειτος που ενίσχυσε οικονοµικά ολόκληρη τη ιδακτορική αυτή ιατριβή. Επιπρόσθετα, δεν ξεχνώ όλους τους µεταπτυχιακούς φοιτητές µε τους οποίους συνεργάστηκα και µοιράστηκα µαζί τους εύκολες και δύσκολες στιγµές. Ιδιαίτερα ευχαριστώ τον ιδάκτορα του Τµήµατος Φαρµακευτικής Χρίστο Πολυτάρχου, για τη συνεργασία

µας όλα αυτά τα χρόνια καθώς και για τις εύστοχες πάντα συµβουλές του. Τέλος, το πιο µεγάλο ευχαριστώ θέλω να εκφράσω στους Γονείς µου και την Αδελφή µου για την υλική και ηθική συµπαράστασή τους προκειµένου να φέρω εις πέρας τις Μεταπτυχιακές Σπουδές µου.

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 Ε.1 HARP 1 Ε.1.1 Γενικά 1 Ε.1.2 οµή και έκφραση του γονιδίου της HARP 1 Ε.1.3 οµή της πρωτεΐνης HARP 5 Ε.1.4 Yποδοχείς της HARP και µεταγωγή σήµατος 8 Ε.1.5 Βιολογικές δράσεις της HARP 11 Ε.1.5.1 Ρόλος της HARP στην ανάπτυξη 11 Ε.1.5.2 HARP και κυτταρικός πολλαπλασιασµός 12 Ε.1.5.3 HARP και αγγειογένεση 13 Ε.1.6 HARP και καρκίνος 16 Ε.1.6.1 Έκφραση της HARP και υποδοχέων της στον καρκίνο 16 Ε.1.6.2 Ρόλος της HARP και των υποδοχέων της στον καρκίνο 18 Ε.1.6.2.1 Ρόλος της HARP στην εξαλλαγή των κυττάρων σε καρκινικά 19 Ε.1.6.2.2 Ρόλος της HARP στην επαγόµενη από όγκους αγγειογένεση 21 Ε.1.6.3. HARP: Μελλοντικό µόριο στη διάγνωση και θεραπεία του καρκίνου 22 Ε.1.6.3.1 Η HARP ως µόριο-στόχος στη θεραπεία του καρκίνου 23 Ε.1.6.3.1.1 Χρησιµοποίηση ριβοενζύµων 23 Ε.1.6.3.1.2 Αντινοηµατικές στρατηγικές 24 Ε.1.6.3.2 Η HARP ως διαγνωστικός δείκτης 25 Ε.2 Προστάτης 26 Ε.2.1 Γενικά 26 Ε.2.2 Σύσταση επιθηλίου του φυσιολογικού προστάτη 27 Ε.2.3 Φυσιολογική και παθολογική ανάπτυξη του προστάτη 28 Ε.2.3.1 Ενδοκρινείς παράγοντες 28 Ε.2.3.2 Αυξητικοί παράγοντες 31 Ε.3 Αυξητικοί παράγοντες ινοβλαστών (Fibroblast Growth Factors, FGFs) 36 Ε.3.1 Γενικά 36 Ε.3.2 Υποδοχείς των FGFs (FGFRs) οµή και λειτουργία 36 Ε.3.3 Ρόλος του εξωκυτταρικού υλικού 37 Ε.4 FGF-2 (basic-fgf) 41 Ε.4.1 Γενικά 41 Ε.4.2 Ισοµορφές του FGF-2 41 Ε.4.3 Υποδοχείς του FGF-2 και µεταγωγή σήµατος 43 E.4.4 Έκφραση του FGF-2 και των υποδοχέων FGFRs στο φυσιολογικό προστάτη 46 E.4.5 Έκφραση του FGF-2 και των υποδοχέων FGFRs στον καρκίνο του προστάτη 47 E.4.6 Βιολογικές δράσεις του FGF-2 στον καρκίνο του προστάτη 52 E.4.6.1 Επίδραση του FGF-2 στον πολλαπλασιασµό και την επιβίωση των 53 κυττάρων E.4.6.2 Επίδραση του FGF-2 στη µεταναστευτική και διεισδυτική ικανότητα των 55 κυττάρων E.4.6.3 Επίδραση του FGF-2 στην αγγειογένεση και τη µετάσταση 56 E.4.7 FGFRs και FGFR-µεταγωγή σήµατος ως στόχοι για τη θεραπεία καρκίνου του 58 προστάτη ΣΚΟΠΟΣ 61 ΜΕΘΟ ΟΙ 65 Μ.1 Ανακαλλιέργεια κυττάρων LNCaP 65 Μ.2. Μέτρηση κυττάρων σε αιµατοκυτταρόµετρο Neubauer 66 Μ.3 Σταθερή διαµόλυνση κυττάρων LNCaP (stable transfection) 67 Μ.4 Ψύξη κυττάρων LNCaP, PC-LNCaP και AS-LNCaP 72 Μ.5 Απόψυξη κυττάρων LNCaP, PC-LNCaP και AS-LNCaP 73 Μ.6 Αποµόνωση ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC από φλέβα οµφάλιου λώρου 74 ανθρώπου Μ.7 Ανακαλλιέργεια κυττάρων HUVEC 76 Μ.8 Έλεγχος της επίδρασης ουσιών στον πολλαπλασιασµό των κυττάρων LNCaP, 77

PC-LNCaP και AS-LNCaP Μ.9 Έλεγχος της επίδρασης της εκκρινόµενης HARP, από τα κύτταρα PC-LNCaP και 79 AS-LNCaP, στον πολλαπλασιασµό των κυττάρων HUVEC Μ.10 Μελέτη του χηµειοτακτισµού των κυττάρων LNCaP, PC-LNCaP και AS-LNCaP 80 (Τransfilter assay) Μ.11 Μελέτη της επίδρασης της εκκρινόµενης HARP, από τα κύτταρα PC-LNCaP και 82 AS-LNCaP, στο χηµειοτακτισµό των κυττάρων HUVEC (Transfilter assay) Μ.12 Μελέτη της επίδρασης της εκκρινόµενης HARP, από τα κύτταρα PC-LNCaP και 83 AS-LNCaP, στην ικανότητα των κυττάρων HUVEC να δηµιουργούν αυλούς in vitro σε υπόστρωµα matrigel Μ.13 Μελέτη της ανάπτυξης των κυττάρων LNCaP, PC-LNCaP και AS-LNCaP σε 84 πήκτωµα άγαρ (soft agar) Μ.14.1 Προετοιµασία αυγών 86 Μ.14.2 Εµφύτευση σπόγγων ζελατίνης στη χοριοαλλαντοϊκή µεµβράνη εµβρύου 87 όρνιθας (CAM) και µελέτη της αγγειογενετικής απόκρισης (sponge assay) Μ.15 Αποµόνωση της HARP από το θρεπτικό µέσο των κυττάρων 88 Μ.16 Ανάλυση πρωτεϊνών µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου, σε 90 αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) Μ.17 Ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western 92 Μ.18 Αποµόνωση ολικού RNA από κύτταρα LNCaP 94 Μ.19 Προσδιορισµός της συγκέντρωσης RNA 95 Μ.20 Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊνικών οξέων σε πήκτωµα αγαρόζης 96 Μ.21 Ανάλυση της έκφρασης γονιδίων µε τη χρήση συνδυασµένης αντίστροφης 98 µεταγραφής και αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (RT-PCR) Μ.21.1 Σχεδιασµός εναρκτήριων αλληλουχιών (primers) 98 Μ.21.2 Πραγµατοποίηση των αντιδράσεων RT-PCR 99 Μ.22 Μελέτη της ενδοκυττάριας παραγωγής δραστικών µορφών οξυγόνου (ROS) 101 Μ.23 Εκτίµηση της συγκέντρωσης ολικής πρωτεΐνης σε διάλυµα (Μέθοδος Bradford) 103 Μ.24 Τεχνική Ολίγο-δεoξυριβονουκλεϊνικών δολωµάτων (Decoy ODN Technique) 104 M.25 Εισαγωγή του πλασµιδιακού DNA σε βακτήρια (Transformation) 106 M.25.1 Προετοιµασία δεκτικών βακτηριακών κυττάρων (competent cells) 108 M.25.2 Μετασχηµατισµός δεκτικών βακτηριακών κυττάρων 109 M.25.3 Ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων σε υγρή καλλιέργεια 111 M.25.4 Έλεγχος µετασχηµατισµένων βακτηριακών κυττάρων και αποµόνωση 111 πλασµιδιακού DNA µε τη µέθοδο βρασµού Μ.25.5 Αντίδραση πέψης µε ένζυµα περιορισµού 113 M.25.6 Μικρής κλίµακας αποµόνωση πλασµιδιακού DNA (Miniprep) 114 M.26 Προσδιορισµός της συγκέντρωσης DNA 115 M.27 Τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης 116 M.28 Αποµόνωση πυρηνικού εκχυλίσµατος από κύτταρα LNCaP 119 M.29 Ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισµός των υποµονάδων του µεταγραφικού 120 παράγοντα AP-1 µε τη µέθοδο ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) M.30 Ποσοτικοποίηση ανοσοαποτυπωµάτων και ηλεκτροφορηµάτων νουκλεϊνικών 126 οξέων µε σύστηµα ανάλυσης εικόνας M.31 Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων 127 Μ.32 Αντιδραστήρια 127 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 129 A.1 Ο αυξητικός παράγοντας HARP είναι µιτογόνος για τα κύτταρα LNCaP 129 A.2 Έκφραση της αντινοηµατικής αλληλουχίας της HARP οδηγεί σε εξασθένιση της 130 σύνθεσης και έκκρισης της HARP στα κύτταρα LNCaP A.3 Έκφραση της αντινοηµατικής αλληλουχίας της HARP οδηγεί σε αναστολή του 131 πολλαπλασιασµού των κυττάρων LNCaP Α.4 Έκφραση της αντινοηµατικής αλληλουχίας της HARP οδηγεί σε αναστολή της 132 ανάπτυξης των κυττάρων LNCaP σε τρισδιάστατο περιβάλλον Α.5 Έκφραση της αντινοηµατικής αλληλουχίας της HARP οδηγεί σε αναστολή της 133 µετανάστευσης των κυττάρων LNCaP Α.6 Αναστολή έκφρασης της HARP οδηγεί σε αδυναµία των LNCaP να διεγείρουν 134

λειτουργίες των ενδοθηλιακών κυττάρων που σχετίζονται µε την αγγειογένεση Α.7 Αναστολή έκφρασης της HARP οδηγεί σε αδυναµία των LNCaP να διεγείρουν την αγγειογένεση in vivo Α.8 Ο αυξητικός παράγοντας FGF-2 επάγει τον πολλαπλασιασµό και τη µετανάστευση 139 των κυττάρων LNCaP Α.9 Η έκφραση της πρωτεΐνης HARP απαιτείται για την επαγωγική δράση του FGF-2 141 στον πολλαπλασιασµό και τη µετανάστευση των κυττάρων LNCaP Α.10 Ο FGF-2 επάγει την έκφραση και έκκριση της πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα 143 LNCaP Α.11 Ο FGF-2 επάγει τη δραστηριότητα του υποκινητή του γονιδίου της HARP στα 146 κύτταρα LNCaP Α.12 Ο SU-5402 αναστέλλει την επαγωγική δράση του FGF-2 στον πολλαπλασιασµό 147 των κυττάρων LNCaP Α.13 Ο SU-5402 αναστέλλει την επαγόµενη από τον FGF-2 έκφραση και έκκριση της 149 πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα LNCaP Α.14 Ο FGF-2 διεγείρει την παραγωγή ROS στο εσωτερικό των κυττάρων LNCaP 151 Α.15 Ο SU-5402 αναστέλλει την επαγόµενη από τον FGF-2 παραγωγή ROS στα 153 κύτταρα LNCaP Α.16 Ο FGF-2 διεγείρει την παραγωγή Η 2 Ο 2 στο εσωτερικό των κυττάρων LNCaP 154 A.18. Το Η 2 Ο 2 επάγει την ικανότητα δέσµευσης συγκεκριµένων υποµονάδων του AP-1 στη συντηρηµένη αλληλουχία δέσµευσης. Α.17 Το πυροσταφυλικό νάτριο αναστέλλει την επαγόµενη από τον FGF-2 έκκριση της 155 πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα LNCaP Α.18 Το πυροσταφυλικό νάτριο αναστέλλει την επαγωγική δράση του FGF-2 στον 156 πολλαπλασιασµό των κυττάρων LNCaP Α.19 Τα Ο Ν δολώµατα έναντι του AP-1 αναστέλλουν την επαγόµενη από τον FGF-2 158 έκκριση της πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα LNCaP Α.20 Εµπλοκή των αλληλουχιών δέσµευσης του AP-1 του υποκινητή του γονιδίου της 160 HARP στην επαγόµενη από τον FGF-2 µεταγραφική δραστηριότητα Α.21 Ο FGF-2 επάγει την ικανότητα δέσµευσης συγκεκριµένων υποµονάδων του AP-1 161 στη συντηρηµένη αλληλουχία δέσµευσης Α.22 Ο FGF-2 επάγει την ικανότητα δέσµευσης των c-jun, JunD και Fra-1 στη 162 ρυθµιστική περιοχή του γονιδίου της HARP ΣΥΖΗΤΗΣΗ 165 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 178 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 179 SUMMARY 181 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 183 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ 209 BRIEF RESUME OF THE PRESENT WORK 215 ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ 223 137

Εισαγωγή Ε.1 HARP Ε.1.1 Γενικά Ο αυξητικός παράγοντας HARP (Heparin-Affin Regulatory Peptide) έχει µοριακή µάζα 18 kda και ανήκει σε µια σχετικά νέα οικογένεια αυξητικών παραγόντων που δεσµεύονται στην ηπαρίνη και η οποία περιλαµβάνει επιπλέον την πρωτεΐνη Μidkine (MK) (Kadomatsu et al., 1988) και την οµόλογη αυτής στα πτηνά, την επαγόµενη από το ρετινοϊκό οξύ πρωτεΐνη (Retinoic acid-inducible Heparin Binding protein, RI-HB) (Raulais et al., 1991). Η HARP περιγράφηκε αρχικά ως κυτταροκίνη, που η έκφρασή της ρυθµίζεται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και ελέγχει την αύξηση κυττάρων του νευροεξωδέρµατος και µεσοδέρµατος. Ωστόσο, τα επίπεδά της µειώνονται στα τελευταία στάδια της εµβρυογένεσης, ενώ η έκφρασή της είναι περιορισµένη στον ενήλικα οργανισµό. Το όνοµα πλειοτροπίνη αντικατοπτρίζει την ικανότητά της να επηρεάζει την αύξηση και τη διαφοροποίηση µιας πληθώρας τύπων κυττάρων, όπως νευροβλάστες και ινοβλάστες, επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κύτταρα (Souttou et al., 1998). Το µόριο της HARP αποµονώθηκε παράλληλα από πολλές ερευνητικές οµάδες και από διάφορους ιστούς. Κάθε ερευνητική οµάδα, ανάλογα µε τον ιστό προέλευσης ή βάσει κάποιας από τις ιδιότητες του µορίου, έδωσε στον παράγοντα διαφορετική ονοµασία. Για το λόγο αυτό, απαντάται στη βιβλιογραφία µε πολλές ονοµασίες, από τις οποίες επικρατέστερες σήµερα είναι: HARP (Courty et al.,1991), πλειοτροπίνη (Pleiotrophin, PTN) (Li et al., 1992), HB-GAM (Heparin- Binding Growth Associated Molecule) (Rauvala, 1989) και OSF-1 (Osteoblast Specific Factor-1) (Tezuka et al., 1990). Ε.1.2 οµή και έκφραση του γονιδίου της HARP Το γονίδιο της HARP έχει αναλυθεί στον άνθρωπο, τον επίµυ και το µυ. Εντοπίζεται στο 7 ο (Li et al., 1992), το 6 ο (Hornum et al., 1996) και το 4 ο χρωµόσωµα (Li et al., 1992) αντίστοιχα και παρουσιάζει παρόµοια οργάνωση. Στον άνθρωπο οργανώνεται σε επτά εξώνια µε συνολικό µέγεθος 42 kb (Lai et al., 1

Εισαγωγή 1992; Kretschmer et al., 1993). Το mrna της HARP περιέχεται σε πέντε εξώνια που δίνουν προϊόν 1.650 νουκλεοτιδίων. Το πεπτίδιο σινιάλο και τα πέντε πρώτα αµινοξέα του ώριµου µορίου κωδικοποιούνται στο 2 ο εξώνιο, ενώ η πρωτεΐνη κατά κύριο λόγο στα εξώνια 3 και 4 (Kretschmer et al., 1993). Η 5 -µη µεταφραζόµενη περιοχή (5 -UTR) του γονιδίου περιλαµβάνεται στο 1 ο εξώνιο, καθώς και σε πρόσθετες περιοχές ανοδικά του 1 ου εξωνίου, οι οποίες έχουν ταυτοποιηθεί στον άνθρωπο και το µυ (Lai et al., 1995; Sato et al., 1993). Η περιοχή αυτή των γονιδίων τυπικά περιέχει τις αλληλουχίες που ενέχονται στην έναρξη της µεταγραφής και τη ρύθµισή της. Το 1992, χαρακτηρίστηκε η ρυθµιστική περιοχή του γονιδίου της HARP στον άνθρωπο. Σε αυτή την ανάλυση εντοπίστηκε η αλληλουχία CCAAT, 91 νουκλεοτίδια ανοδικά της βασικής θέσης έναρξης της µεταγραφής. Στην αλληλουχία αυτή δύνανται να δεσµευτούν γενικοί µεταγραφικοί παράγοντες, όπως ο C/EBP (CAAT-box/enhancer-binding protein) ή ο CTF/NF1 (CAAT-box-binding Factor/ NuclearFactor1). Εντούτοις, δεν ανευρέθηκε η αλληλουχία ΤΑΤΑ. Στην αλληλουχία ΤΑΤΑ δεσµεύεται η πρωτεΐνη δέσµευσης στην ΤΑΤΑ (TATA-Binding Protein, TBP), η οποία αποτελεί βασικό συστατικό του µεταγραφικού παράγοντα ΙΙD (Transcription factor IID, TF II D). Είναι αξιοσηµείωτο το γεγονός ότι η πρωτεΐνη TBP είναι απαραίτητη για τη µεταγραφή, ακόµη και αν απουσιάζει η αλληλουχία ΤΑΤΑ. Φαίνεται ότι ένας από τους ρόλους της αλληλουχίας αυτής είναι ο καθορισµός ενός ακριβούς σηµείου έναρξης της µεταγραφής (Johnson and Jameson, 1998). Υποκινητές πολλών γονιδίων στερούνται της αλληλουχίας ΤΑΤΑ και χαρακτηρίζονται από πολλαπλά σηµεία έναρξης της µεταγραφής, όπως συµβαίνει και στην περίπτωση του γονιδίου της HARP (Li et al., 1992). Η αλληλουχία αυτή απουσιάζει επιπλέον από τη ρυθµιστική περιοχή του γονιδίου της ΜΚ (Matsubara et al., 1990), του γονιδίου Wnt-2, το οποίο ενεργοποιείται σε µύες κατά την πρώιµη ανάπτυξη (Smith et al., 1988), της p18 που εκφράζεται σε εµβρυϊκούς ιστούς µυός (Luo et al., 1991) και άλλων γονιδίων. Το κοινό αυτό χαρακτηριστικό µεταξύ γονιδίων που ενεργοποιούνται κατά την ανάπτυξη, πιθανολογεί ένα διαφορετικό µηχανισµό ρύθµισης που ελέγχεται διαφορικά στο χώρο και το χρόνο. Στην εγγύς περιοχή του υποκινητή συνήθως εντοπίζονται αλληλουχίες δέσµευσης πολλαπλών µεταγραφικών παραγόντων, καθώς και πιθανών παραγόντων που εµπλέκονται σε έκφραση εξαρτώµενη από τον τύπο του κυττάρου. Σε περιοχές 2

Εισαγωγή αποµακρυσµένες από τον υποκινητή εντοπίζονται ρυθµιστικές αλληλουχίες, τοποθετηµένες κατά τέτοιο τρόπο, ώστε να σχηµατίζονται σύνθετοι ενισχυτές. Αυτές οι περιοχές δύναται να είναι µικρές ή να περιέχουν επαναλαµβανόµενες αλληλουχίες δέσµευσης διαφορετικών µεταγραφικών παραγόντων, διασπαρµένες σε εκατοντάδες βάσεις. Αν και οι ενισχυτές και ο υποκινητής συνήθως διευθετούνται κατά ένα γραµµικό πρότυπο στο DNA, φαίνεται ότι η αλληλεπίδραση µεταγραφικών παραγόντων που δεσµεύονται στους ενισχυτές, µε συστατικά του βασικού υποκινητή, επιτυγχάνεται µε το σχηµατισµό θηλειάς που φέρνει σε γειτνίαση τις περιοχές αυτές (Johnson and Jameson, 1998). Η αρχική ανάλυση του γονιδίου της HARP δεν ανέδειξε αλληλουχίες δέσµευσης για γενικούς µεταγραφικούς παράγοντες. Ωστόσο, στην αποµακρυσµένη 5 - περιοχή αναγνωρίστηκαν δύο πιθανές αλληλουχίες δέσµευσης για τον AP-1 (Activator protein-1), τέσσερις για τον MyoD και µία αλληλουχία SRE (Serum Response Element) (Li et al., 1992), χωρίς όµως να αξιολογηθεί η λειτουργικότητά τους. Αργότερα, προτάθηκε η ύπαρξη µίας αλληλουχίας δέσµευσης (GT1) του µεταγραφικού παράγοντα Sp1 (ρετροϊικής προελεύσεως), µε σηµαντικό ρόλο στην έκφραση της HARP σε κύτταρα χοριοκαρκινώµατος ανθρώπου (Schulte et al., 2000). Πρόσφατα η ερευνητική µας οµάδα ανέδειξε την εµπλοκή του µεταγραφικού παράγοντα AP-1 στη µεταγραφική δραστηριότητα του γονιδίου της HARP, στην κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη LNCaP (Polytarchou et al., 2005b). Επιπλέον, έχει προταθεί η ρύθµιση έκφρασης της HARP από το µεταγραφικό παράγοντα HOXA5, ο οποίος παίζει σηµαντικό ρόλο σε διαδικασίες όπως η εµβρυογένεση, η αιµατοποίηση και η καρκινογένεση (Chen et al., 2005). Η κατανοµή των προτεινόµενων αλληλουχιών δέσµευσης µεταγραφικών παραγόντων στη ρυθµιστική περιοχή του γονιδίου της HARP ανθρώπου, αναφέρονται στην Εικόνα Ε.1. Στην 3 -UTR περιοχή του γονιδίου εντοπίστηκαν τρεις αλληλουχίες τύπου ΑΤΤΤΑ. Αυτές οι αλληλουχίες εντοπίζονται στην αντίστοιχη περιοχή και άλλων ογκογονιδίων και εµπλέκονται στη ρύθµιση της σταθερότητας του mrna (Lai et al., 1992). 3

Εισαγωγή Εικόνα Ε.1: Σχηµατική απεικόνιση της ρυθµιστικής περιοχής του γονιδίου της HARP. ιακρίνεται η περιοχή CCAAT, πιθανές αλληλουχίες δέσµευσης µεταγραφικών παραγόντων και η βασική θέση έναρξης της µεταγραφής. Τα νουκλεοτίδια είναι αριθµηµένα συγκριτικά µε τη βασική θέση έναρξης της µεταγραφής (+1). Το πρότυπο έκφρασης της HARP αντικατοπτρίζει τη δράση της στη νευριδίωση, την κυτταρική µετανάστευση, τη δευτερογενή οργανογένεση και τις αλληλεπιδράσεις ανάµεσα στο µεσόδερµα και το επιθήλιο. Το παραπάνω συµπέρασµα εξάγεται από πειράµατα in situ υβριδοποίησης, στα οποία διαπιστώθηκε ότι η HARP εκφράζεται µε συγκεκριµένο αναπτυξιακό πρότυπο σε πολλούς µεσοδερµικούς και νευροεξωδερµικούς ιστούς, αλλά όχι στο ενδόδερµα και τους τροφοβλάστες (Vanderwinden et al., 1992). Η HARP εκφράζεται (σε µικρότερα ποσά) και µετά από τη γέννηση, γεγονός το οποίο σηµαίνει ότι υπάρχει µια χρονική ρύθµιση της έκφρασης του µορίου (Wellstein et al., 1992). Κατά την εµβρυϊκή περίοδο, η HARP συµµετέχει στις αλληλεπιδράσεις επιθηλίου- µεσεγχύµατος. Με χρήση πολυκλωνικών αντισωµάτων έναντι της HARP έγινε φανερό ότι κατά την ανάπτυξη του µυός, η έκφραση του µορίου σε όργανα όπου επιτελείται µορφογένεση, συµβάδιζε µε τη διαφοροποίηση του επιθηλίου (Mitsiadis et al., 1995). Στο αναπτυσσόµενο νευροµυικό σύστηµα επίµυος, η HARP βρίσκεται δεσµευµένη στην επιφάνεια των µυών στις καταβολές των άκρων (Szabat et al., 1996). Η HARP βρίσκεται στα υψηλότερα επίπεδα παραγωγής της την περίοδο κοντά στη γέννηση του ατόµου, κατά την οποία πραγµατοποιείται ο σχηµατισµός των συνάψεων. Την ίδια περίοδο εντοπίζεται και στο αναπτυσσόµενο µυικό ιστό in vivo. Καθώς η HARP εντοπίζεται στην επιφάνεια των µυών και πριν από την άφιξη των αξόνων στην περιοχή όπου θα δηµιουργηθεί η σύναψη, είναι πιθανό να καθοδηγεί τους κώνους αύξησης προς την περιοχή αυτή και να συµβάλλει στη δηµιουργία της σύναψης (Szabat et al., 4

Εισαγωγή 1996). Επιπρόσθετα, η HARP ανιχνεύεται στις ίδιες περιοχές µε τα συσσωµατώµατα των υποδοχέων ακετυλοχολίνης. Από σχετικά πειράµατα, φαίνεται ότι µπορεί να επάγει και τη συσσώρευση των υποδοχέων αυτών σε µυικά κύτταρα από Xenopus. Εάν τα κύτταρα αυτά καλλιεργηθούν µε αντισώµατα έναντι της HARP, τότε µειώνεται η συσσώρευση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης στα σηµεία δηµιουργίας συνάψεων (Peng et al., 1995). Η HARP εκφράζεται κυρίως κατά τη µετεµβρυική περίοδο στον αναπτυσσόµενο φλοιό της παρεγκεφαλίδας επίµυος και παραµένει σε υψηλά επίπεδα στο ενήλικο άτοµο (Rauvala et al., 1994; Matsumoto et al., 1994; Bloch et al., 1992). Το mrna της HARP εκφράζεται σε πολύ µεγάλα ποσά στο νεοπάλαιο φλοιό και στο µεσεγκέφαλο µυός (Mitsiadis et al., 1995) και πιθανώς εµπλέκεται σε αλληλεπιδράσεις µεταξύ των νευρικών κυττάρων και των κυττάρων της γλοίας κατά την ανάπτυξη του οργανισµού, καθώς και στον ώριµο εγκέφαλο. Πράγµατι, το mrna ανιχνεύεται κατά τη µετεµβρυϊκή περίοδο τόσο σε νευρώνες, όσο και σε κύτταρα της γλοίας (Wanaka et al., 1993). Στο ώριµο άτοµο, το µόριο εκφράζεται κυρίως στον ιππόκαµπο και σε νευρώνες του φλοιού (Vanderwinden et al., 1992; Wanaka et al., 1993). Τόσο η πρωτεΐνη, όσο και το mrna της HARP ανιχνεύονται στο περιφερικό νευρικό σύστηµα και κυρίως στα γάγγλια της ραχιαίας ρίζας και σε νευρικές προεκτάσεις (Mitsiadis et al., 1995), υποδηλώνοντας ότι δύναται να συµµετέχει στην οργάνωση των νευρικών ινών για την είσοδό τους στο νωτιαίο µυελό. Μετά από τοπική ισχαιµία στην παρεγκεφαλίδα ενήλικα επίµυος, έχει αναφερθεί έκφραση της HARP σε µακροφάγα, αστροκύτταρα και ενδοθηλιακά κύτταρα, σε περιοχές αυξηµένης αγγειογένεσης (Yeh et al., 1998). Μεγάλα ποσοστά έκφρασης της HARP έχουν αναφερθεί επίσης σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες, όπως η νόσος Alzheimer και το σύνδροµο Down (Wisniewski et al., 1996). Ε.1.3 οµή της πρωτεΐνης HARP Η HARP, όπως προκύπτει από µελέτη του cdna της, είναι ένα πολυπεπτίδιο µε 168 αµινοξέα (Li et al., 1990), µε υψηλή οµολογία σε διάφορα είδη, όπως ο άνθρωπος, ο επίµυς, ο βους και η όρνιθα (Li et al., 1990; Hampton et al., 1992; 5

Εισαγωγή Merenmies and Rauvala, 1990). Η φαινοµενική µοριακή µάζα της HARP όταν αναλύεται υπό αποδιατακτικές συνθήκες σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου, είναι 18 kda. Αυτό δεν αντικατοπτρίζει την αµινοξική σύσταση του ώριµου µορίου, αφού µε φασµατοσκοπία µάζας στη HARP βοός, το µόριο εµφανίζεται να έχει µοριακή µάζα 15,3 kda (Hampton et al., 1992). Το παραπάνω φαινόµενο οφείλεται πιθανότατα στη µεγάλη περιεκτικότητα του µορίου σε βασικά αµινοξέα, µε αποτέλεσµα την προσρόφηση µεγαλύτερης, από την αναµενόµενη, ποσότητας SDS στο µόριο. Έτσι, κατά την ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτικές συνθήκες αυξάνεται το φαινοµενικό µοριακό βάρος του µορίου, λόγω µικρότερης κινητικότητας (Raulais et al., 1991; Wellstein et al., 1992). Τα πρώτα 32 αµινοξέα του αµινοτελικού άκρου της HARP είναι υδρόφοβα και αποτελούν ένα πεπτίδιο σινιάλο, ενώ η καρβοξυτελική περιοχή της πρωτεΐνης είναι υδρόφιλη (Li et al., 1990; Hampton et al., 1992; Merenmies and Rauvala, 1990). Ανάλογα µε τον τύπο του κυττάρου, µπορεί να πραγµατοποιηθεί αποικοδόµηση του µορίου σε σηµείο µετά από το πεπτίδιο-σινιάλο, µε αποτέλεσµα την παραγωγή δύο διαφορετικών µορφών του µορίου που διαφέρουν στα 3 τελευταία αµινοξέα του αµινοτελικού άκρου. Η µια µορφή της πρωτεΐνης απαρτίζεται από 136 αµινοξέα και η άλλη από 139 (Bernard-Pierrot et al., 2001). Το 24% των αµινοξέων του ώριµου µορίου της HARP είναι βασικά αµινοξέα, κυρίως λυσίνες, ενώ περιλαµβάνει και 10 κυστεΐνες. Οι 28 λυσίνες του µορίου είναι οµαδοποιηµένες στο αµινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο. Οι περιοχές αυτές θεωρήθηκαν σηµαντικές για την ιδιότητα της HARP να συνδέεται µε την ηπαρίνη (Bohlen et al., 1991) και το εξωκυτταρικό υλικό (Li et al., 1990; Kinnunen et al., 1996). Οι περιοχές αυτές εµφανίζουν µια συνεκτική αλληλουχία βασικών αµινοξέων, που απαντάται σε αρκετούς αυξητικούς παράγοντες που έχουν συγγένεια µε την ηπαρίνη. Οι κυστεΐνες συµµετέχουν στο σχηµατισµό πέντε ενδοπεπτιδικών δισουλφιδικών δεσµών. Υπάρχουν αναφορές οι οποίες εµπλέκουν έξι µόνο κυστεΐνες στη δηµιουργία των δισουλφιδικών δεσµών, ωστόσο οι περισσότερες εργασίες κάνουν λόγο για τη συµµετοχή όλων των κυστεϊνών σε δισουλφιδικές γέφυρες (Fabri et al., 1992; Kuo et al., 1992; Seddon et al., 1994; Kilpelainen et al., 2000). Οι δισουλφιδικές γέφυρες αν και προσδίδουν σταθερότητα στο µόριο της HARP, σε ότι αφορά φυσικοχηµικές προσβολές από 6

Εισαγωγή αλλαγές στο ph και οργανικούς διαλύτες, παρόλα αυτά την καθιστούν ιδιαίτερα ευαίσθητη σε αναγωγικές συνθήκες. Ενδιαφέρον προκαλεί η παρατήρηση ότι στην πρωτοταγή δοµή της HARP υπάρχουν τρεις περιοχές οι οποίες φέρουν το µοτίβο K-R/K-X-R/K. Οι περιοχές αυτές, που περιέχουν θετικά φορτισµένα αµινοξέα, εντοπίζονται κατά κανόνα σε εσωτερικές θέσεις της πολυπεπτιδικής αλυσίδας και θεωρούνται υπεύθυνες για την είσοδο πρωτεϊνών στον πυρήνα. Παρόλα αυτά, δεν έχει εξακριβωθεί µέχρι σήµερα η παρουσία της HARP στον πυρήνα. Μια βιβλιογραφική αναφορά, προτείνει ότι η HARP δεσµεύεται στη νουκλεολίνη (Take et al., 1994), ενώ και η δική µας ερευνητική οµάδα έχει ανιχνεύσει τη HARP στον πυρήνα ενδοθηλιακών κυττάρων της χοριοαλλαντοϊκής µεµβράνης εµβρύου όρνιθας (αδηµοσίευτα αποτελέσµατα). Μέχρι σήµερα δεν έχει διασαφηνιστεί η τρισδιάστατη διαµόρφωση του µορίου της HARP. Ωστόσο, µε χρησιµοποίηση της τεχνικής του πυρηνικού µαγνητικού συντονισµού (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) αποδείχθηκε ότι η ανασυνδυασµένη HARP που παράχθηκε τόσο σε κύτταρα εντόµων όσο και σε βακτήρια E. coli, αποτελείται από δύο κεντρικές περιοχές, οι οποίες συνδέονται µεταξύ τους µε ένα εύκαµπτο τµήµα (Kilpelainen et al., 2000). Και οι δύο κεντρικές περιοχές περιέχουν από τρεις αντιπαράλληλες β-πτυχωτές επιφάνειες, παρόµοιες µε εκείνες που εντοπίζονται στη ΜΚ (Iwasaki et al., 1997). Στην ίδια µελέτη αναφέρεται ότι τα δύο πλούσια σε λυσίνη άκρα της HARP έχουν τυχαία διαµόρφωση. Τα δεδοµένα αυτά έρχονται σε αντιπαράθεση µε παλαιότερη αναφορά, σύµφωνα µε την οποία τα άκρα της HARP διαθέτουν δοµή α-έλικας (Delbe et al., 1995). Η µελέτη των κεντρικών περιοχών της HARP και της ΜΚ αποκάλυψε ότι έχουν αλληλουχίες που αντιστοιχούν στις επαναλαµβανόµενες περιοχές της θροµβοσπονδίνης τύπου Ι (Thrombospondin type I repeat, TSR) (Rauvala et al., 2000; Kilpelainen et al., 2000). Φαίνεται ότι οι περιοχές TSR των διαφόρων πρωτεϊνών έχουν παρόµοια δοµικά στοιχεία, τα οποία δικαιολογούν την ικανότητα δέσµευσής τους στην ηπαρίνη. Σε συµφωνία µε τα δεδοµένα αυτά, οι δύο κεντρικές περιοχές της HARP διατηρούν την ικανότητα δέσµευσής τους µε την ηπαρίνη, γεγονός που καθιστά δυνατή την αποµόνωση και τον καθαρισµό της, χρησιµοποιώντας χρωµατογραφία συγγένειας µε την ηπαρίνη (Kilpelainen et al., 7

Εισαγωγή 2000). Ωστόσο θα πρέπει να αναφερθεί ότι σύµφωνα µε άλλα δεδοµένα, οι β- πτυχωτές επιφάνειες της HARP και της ΜΚ δεν παρουσιάζουν ανάλογη τρισδιάστατη δοµή µε εκείνη των περιοχών TSR I (Roszmusz et al., 2002; Tan et al., 2002). Ε.1.4 Yποδοχείς της HARP και µεταγωγή σήµατος Η HARP δεσµεύεται στην πρωτεογλυκάνη 6Β4, η οποία ονοµάζεται και φωσφακάνη (phosphacan). Η πρωτεογλυκάνη αυτή αντιπροσωπεύει την κύρια πρωτεογλυκάνη θειικής χονδροϊτίνης στον εγκέφαλο και αποτελεί µια εξωκυτταρικά τροποποιηµένη µορφή του διαµεµβρανικού υποδοχέα µε δράση φωσφατάσης τυροσινών β/ζ (Receptor-like Protein Tyrosine Phosphatase β/ζ, RPTPβ/ζ) (Maeda et al., 1996). Μέχρι σήµερα έχουν ανιχνευθεί τρεις διαφορετικές ισοµορφές της RPTPβ/ζ, δύο διαµεµβρανικές και µία εκκρινόµενη (γνωστή και ως φωσφακάνη), οι οποίες είναι αποτέλεσµα εναλλακτικής ωρίµανσης του µετάγραφου. Οι ισοµορφές της RPTPβ/ζ ανιχνεύονται στο αναπτυσσόµενο νευρικό σύστηµα, κυρίως στη γλοία και τα αστροκύτταρα και θεωρείται ότι παίζουν ρόλο στη µετανάστευση των νευρώνων και στον προσανατολισµό των νευριτών. Σε in vitro καλλιέργειες, η µετανάστευση των νευριτών που επάγεται από την παρουσία της HARP στο θρεπτικό µέσο, αναστέλλεται εάν χρησιµοποιηθούν αντισώµατα έναντι του εξωκυτταρικού τµήµατος της RPTPβ/ζ (Maeda et al., 1998). Πρόσφατα, ανεδείχθη ο ρόλος της RPTPβ/ζ ως υποδοχέα της HARP στα ενδοθηλιακά κύτταρα από φλέβα οµφάλιου λώρου ανθρώπου (Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC) και αποσαφηνίστηκε το µονοπάτι µεταγωγής σήµατος της HARP στα κύτταρα αυτά. Η HARP µετά από τη δέσµευσή της στην RPTPβ/ζ επάγει τη µετανάστευση και τη διαφοροποίηση των κυττάρων HUVEC. Η δέσµευση αυτή οδηγεί σε ενεργοποίηση της κινάσης Src, της κινάσης εστιακής προσκόλλησης FAK (Focal Adhesion Kinase), της 3-κινάσης των φωσφοϊνοσιτιδίων (PI3K) και των ERK (Extracellular Signal Regulated Kinase). Επιπλέον, η µείωση της έκφρασης της RPTPβ/ζ, µε τη χρησιµοποίηση παρεµβαλλόµενου RNA (si-rna), παρεµπόδισε τα ενδοκυτταρικά σήµατα και την 8

Εισαγωγή επακόλουθη επαγωγή της µετανάστευσης και διαφοροποίησης των κυττάρων που προκαλείται από τη HARP (Polykratis et al., 2005). Πολύ πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδοµένα ανέδειξαν ότι πρόσδεση της HARP στον υποδοχέα RPTPβ/ζ στην κυτταρική σειρά HeLa, οδηγεί σε απενεργοποίηση της δράσης φωσφατάσης του υποδοχέα και κατά συνέπεια σε ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC). Η κινάση PKC φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη β- αντουσίνη στη σερίνη των θέσεων 713 και 726. Η φωσφορυλιωµένη β-αντουσίνη παρουσιάζει µειωµένη συγγένεια για τα ινίδια της ακτίνης. Τελικό αποτέλεσµα είναι η αποδέσµευση της β-αντουσίνης από τα ινίδια της ακτίνης, αποσταθεροποίηση του κυτταροσκελετού και συγκεκριµένα των ινιδίων ακτίνης και των συνδέσεων σπεκτρίνης-ακτίνης και αποικοδόµηση και ανακατανοµή της β-αντουσίνης σε διαφορετικά κυτταρικά διαµερίσµατα. Το συγκεκριµένο µονοπάτι µεταγωγής σήµατος ερµηνεύει την παρατηρηθείσα αποδιοργάνωση και αστάθεια του κυτταροσκελετού σε καρκινικά κύτταρα στα οποία είναι διαρκώς ενεργό το γονίδιο της HARP (Pariser et al., 2005a). Επιπρόσθετα προτάθηκε ότι η πρωτεΐνη Fyn, µέλος της οικογένειας των κινασών Src, αλληλεπιδρά µε την κυτταροπλασµατική περιοχή του υποδοχέα RPTPβ/ζ µετά από διέγερση των κυττάρων από τη HARP. Η δέσµευση αυτή οδηγεί σε φωσφορυλίωση της κινάσης Fyn, της β-κατενίνης και της β-αντουσίνης µε τελικό επακόλουθο την εκδήλωση αστάθειας του κυτταροσκελετού, αυξηµένης κυτταρικής πλαστικότητας και µείωση της προσκόλλησης κυττάρου µε κύτταρο (Pariser et al., 2005b). Ο πιο πρόσφατα χαρακτηρισµένος υποδοχέας της HARP έχει δράση κινάσης της τυροσίνης και ονοµάζεται κινάση του αναπλαστικού λεµφώµατος (Anaplastic Lymphoma Kinase, ALK). Πρόκειται για µια διαµεµβρανική πρωτεΐνη µε µοριακή µάζα 200 kda. Η HARP δεσµεύεται στην εξωκυτταρική περιοχή της ALK µε υψηλή συγγένεια. Η δέσµευση αυτή είναι ειδική για τη συγκεκριµένη περιοχή του υποδοχέα και πιθανότατα πραγµατοποιείται µέσω του καρβοξυτελικού άκρου της HARP, και πιο συγκεκριµένα µε το τµήµα που περιλαµβάνει τα αµινοξέα 111-136 (Bernard-Pierrot et al., 2002). έσµευση της HARP στην ALK έχει παρατηρηθεί σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων (Stoica et al., 2002). Η δέσµευση της HARP στην ALK προάγει την επιβίωση και τον πολλαπλασιασµό των επιθηλιακών κυττάρων SW-13 και των ινοβλαστών NIH3T3. Οι πιο πάνω διαδικασίες φαίνεται ότι δροµολογούνται µέσω της κινάσης PI3K αλλά και του µονοπατιού των κινασών 9

Εισαγωγή MAPΚ (Mitogen Activated Protein Kinases) (Bowden et al., 2002). Ωστόσο, σύγχρονες αναφορές θέτουν υπό αµφισβήτηση την ικανότητα ενεργοποίησης του υποδοχέα ALK από τη HARP. Αφενός αντισώµατα ανταγωνιστές για τον υποδοχέα δεν ανέστειλαν τη µεταγωγή σήµατος από τη HARP, αφετέρου αντισώµατα αγωνιστές οδήγησαν στην ενεργοποίηση διαφορετικού µονοπατιού (Moog-Lutz et al., 2005). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η πρόσφατα διατυπωθείσα άποψη που υποστηρίζει τη ρύθµιση διαφορετικών κυτταρικών λειτουργιών ανάλογα µε τον υποδοχέα ο οποίος διεγείρεται από τη HARP και τα πεπτίδια που προκύπτουν από την πρωτεολυτική αποικοδόµησή της. Συγκεκριµένα σε καλλιέργειες κυττάρων γλοιοβλαστώµατος, διαπιστώθηκε ότι ενώ το µόριο της HARP δεν ενεργοποιεί την ALK το αντίστοιχο πεπτίδιο των 15 kda, που προέχεται από πρωτεολυτική αποικοδόµηση της HARP, δύναται να ενεργοποιήσει τον υποδοχέα. Η διέγερση του υποδοχέα ALK έχει σαν αποτέλεσµα την επαγωγή του κυτταρικού πολλαπλασιασµού. Ωστόσο, παρατηρήθηκε ότι ο αυξητικός παράγοντας HARP (18 kda) προσδένεται στον υποδοχέα RPTPβ/ζ και οδηγεί σε ενεργοποίησή του, µε τελικό επακόλουθο την αύξηση της µεταναστευτικής ικανότητας των κυττάρων (Lu et al., 2005). Η HARP έχει επίσης ισχυρή συγγένεια µε την ηπαρίνη. Η ιδιότητά της αυτή έχει χρησιµοποιηθεί ευρύτατα για την αποµόνωση και τον καθαρισµό του µορίου από το θρεπτικό µέσο διαφόρων τύπων κυττάρων (Papadimitriou et al., 2000), αλλά και την ανίχνευσή του σε βιολογικής σηµασίας υγρά (Soulie et al., 2002; Bernard- Pierrot et al., 2004), χρησιµοποιώντας χρωµατογραφία συγγένειας µε την ηπαρίνη. Οι αλυσίδες θειικής ηπαράνης διαφόρων πρωτεογλυκανών της κυτταρικής επιφάνειας ή του εξωκυτταρικού υλικού, παρουσιάζουν και αυτές ισχυρή ικανότητα δέσµευσης της HARP. Εκτός από τη θειική ηπαράνη (Heparan Sulfate, HS), η HARP έχει συγγένεια σε µικρότερο βαθµό µε τη θειική δερµατάνη (Dermatan Sulfate, DS), τη θειική χονδροϊτίνη Α (Chondroitin Sulfate A, CS-A) και C (CS-C), αλλά όχι µε τη θειική κερατάνη (Keratan Sulfate, KS) (Vacherot et al., 1999). Μελέτες έδειξαν ότι είναι δυνατή η αλληλεπίδραση της HARP µε δύο πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης (Heparan Sulfate Proteoglycans, HSPG) της κυτταρικής επιφάνειας, τις συνδεκάνες 1 και 3 (syndecan-1, syndecan-3). Η συνδεκάνη 3,γνωστή και ως Ν-συνδεκάνη (N-syndecan), αλληλεπιδρά και 10

Εισαγωγή δεσµεύεται ισχυρά στη HARP. Αυτή η HSPG εµπλέκεται στην προέκταση των νευριτών που προκαλείται από τη HARP, αφού εάν χρησιµοποιηθούν αντισώµατα έναντι της Ν-συνδεκάνης ή πραγµατοποιηθεί επώαση των νευρώνων µε ηπαριτινάση, η δράση αυτή αναστέλλεται (Raulo et al., 1994; Rauvala et al., 1994). Πρόσφατα προτάθηκε ότι η HARP δύναται να προσδεθεί στη νουκλεολίνη, µια πρωτεΐνη της κυτταρικής επιφάνειας η οποία αποτελεί υποδοχέα µιας ποικιλίας προσδετών. Ενδεικτικά αναφέρεται ότι η νουκλεολίνη αποτελεί υποδοχέα του παράγοντα J, της α-1 αλυσίδας της λαµινίνης καθώς και αρκετών ιών όπως ο ιός της επίκτητης ανοσολογικής ανεπάρκειας (HIV) (Larrucea et al., 1998; Kleinman et al., 1991; De Verdugo et al., 1995; Bose et al., 2004; Nisole et al., 2002). Η πρόσδεση της HARP στη νουκλεολίνη οδηγεί σε αναχαίτιση της πρόσδεσης του ιού HIV στην επιφάνεια των κυττάρων in vitro (Said et al., 2005). Παρόλα αυτά δεν είναι ξεκάθαρο εάν η HARP διαδραµατίζει κάποιο συγκεκριµένο ρόλο σε συνθήκες προσβολής από τον ιό in vivo, δεδοµένου ότι δεν ανιχνεύεται στα Τ λεµφοκύτταρα (Callebaut et al., 2001). Ε.1.5 Βιολογικές δράσεις της HARP Ε.1.5.1 Ρόλος της HARP στην ανάπτυξη Η πρώτη αναφερθείσα δράση της HARP είναι η ικανότητά της να επάγει την προέκταση νευριτών σε νευρικά κύτταρα (Rauvala et al., 1989). Επιπλέον, η HARP παίζει σηµαντικό ρόλο στα γεγονότα που λαµβάνουν χώρα κατά τη διαφοροποίηση και την οργάνωση του εγκεφάλου (Rauvala et al., 1994). Πρόσφατες µελέτες υποδεικνύουν τη HARP ως µόριο που ευθύνεται τόσο για την αναστολή πολλαπλασιασµού των πολυδύναµων κυττάρων του µετωπιαίου φλοιού, όσο και την επαγωγή της διαφοροποίησής τους. Παράλληλα, η HARP αντισταθµίζει τη µιτογόνο δράση του FGF-2 στα κύτταρα αυτά (Hienola et al., 2004). Αν και τα επίπεδα έκφρασης της HARP είναι ιδιαίτερα χαµηλά στον ενήλικα οργανισµό, αυξηµένη ενεργοποίηση του γονιδίου της παρατηρείται κατά τη διαδικασία ανάπλασης ιστών µετά από µηχανικό τραυµατισµό. Πρόσφατα 11

Εισαγωγή δεδοµένα αναδεικνύουν την εµπλοκή της HARP στην ανάπλαση τραυµατισµένων περιφερικών νεύρων. Ανοσοϊστοχηµική ανάλυση έδειξε ότι σε ανάλογες καταστάσεις, διεγείρεται η έκφραση της HARP σε µη νευρικά κύτταρα όπως τα κύτταρα Schwann, µακροφάγα και ενδοθηλιακά (Blondet et al., 2005). Η HARP διαδραµατίζει σηµαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια ανάπτυξης του νευρικού συστήµατος και της µνήµης, καθώς ρυθµίζει το κατώφλιο επίπεδο της µακροχρόνιας ρύθµισης (Long-Term Potentiation, LTP) των νευρώνων της C1 περιοχής του ιππόκαµπου. Μύες, στους οποίους έχει απαλειφθεί το γονίδιο της HARP, εµφανίζουν σηµαντικά χαµηλότερα επίπεδα LTP, φαινόµενο το οποίο αναστρέφεται µετά από χορήγηση εξωγενούς HARP (Amet et al., 2001). Επιπλέον, η HARP φαίνεται να συµµετέχει στη µορφογένεση των κυττάρων Purkinje στην αναπτυσσόµενη παρεγκεφαλίδα (Tanaka et al., 2003). Όπως προαναφέρθηκε, η HARP εµπλέκεται στη δηµιουργία της νευροµυϊκής σύναψης, αφού επάγει τη συσσώρευση των υποδοχέων της ακετυλοχολίνης στον Xenopus και εντοπίζεται στην περιοχή όπου παρατηρείται η σύνδεση, δηλαδή ανάµεσα στους σωµίτες (Peng et al., 1995; Zhou et al., 1997). Η HARP εµπλέκεται επίσης και στην οστεογένεση που επάγεται από τη µορφογενετική πρωτεΐνη των οστών (Bone Morphogenetic Protein, BMP), ρυθµίζοντας τη δράση της τελευταίας (Sato et al., 2002). Επίσης επάγει τη χονδρογένεση στα αναπτυσσόµενα άκρα της όρνιθας (Dreyfus et al., 1998), ενώ δύναται να επάγει και τη µετανάστευση των οστεοβλαστών (Imai et al., 1998). Τέλος, η HARP φαίνεται να έχει σηµαντικό ρόλο στη διαδικασία της σπερµατογένεσης, αφού υπάρχουν δεδοµένα που υποστηρίζουν ότι η καταστολή της µπορεί να οδηγήσει σε στειρότητα. Όταν εµβρυϊκά κύτταρα µυών διαµολύνθηκαν µε ανενεργές µορφές του µορίου, αναπτύχθηκαν µη γόνιµοι χιµαιρικοί µύες. Επιπρόσθετα, έφεραν ατροφικούς όρχεις, ενώ τα παραγόµενα σπερµατοζωάρια παρουσίαζαν µεγάλο ποσοστό απόπτωσης σε όλα τα στάδια διαφοροποίησής τους (Zhang et al., 1999). Ε.1.5.2 HARP και κυτταρικός πολλαπλασιασµός Η HARP διεγείρει τον πολλαπλασιασµό σε ποικιλία τύπων κυττάρων, όπως: ενδοθηλιακά (Courty et al., 1991; Papadimitriou et al., 2000), επιθηλιακά (Fang et 12

Εισαγωγή al., 1992; Vacherot et al., 1999), ινοβλάστες (Takamatsu et al., 1992; Fang et al., 1992), λεία µυικά (Fabri et al., 1992), κερατινοκύτταρα (Florin et al., 2005) και ηπατικά (Antoine et al., 2005). Παρόλα αυτά, η µιτογόνος δράση της HARP αµφισβητήθηκε από πολλές ερευνητικές οµάδες. Συγκεκριµένα, διατυπώθηκε η άποψη ότι η συγκεκριµένη δράση πιθανώς οφείλεται στην επιµόλυνση της HARP κατά τη διάρκεια της αποµόνωσης, µε άλλους αυξητικούς παράγοντες, όπως οι FGF (Hampton et al., 1992; Raulo et al., 1992). Ωστόσο αντισώµατα έναντι του FGF-2, σε καλλιέργειες επιθηλιακών κυττάρων, δεν είχαν καµία επίπτωση στη µιτογόνο δράση της HARP, αναδεικνύοντας µε τον τρόπο αυτό ότι οι δύο αυξητικοί παράγοντες έχουν ανεξάρτητη δράση (Souttou et al., 1997). Ακόµη και σήµερα η µιτογόνος δράση της HARP είναι αµφισβητήσιµη, δεδοµένου ότι ανάλογα µε το είδος της HARP που χρησιµοποιείται και τον τύπο του κυττάρου που µελετάται προκύπτουν αντιφατικά µεταξύ τους αποτελέσµατα. Αντίθετα είναι γενικά αποδεκτό ότι υπάρχουν διάφορες µορφές του µορίου που ασκούν µια ποικιλία δράσεων (Szabat et al., 1996; Souttou et al., 1997; Polykratis et al., 2004; Lu et al., 2005). Πρόσφατα δεδοµένα υποστηρίζουν την άποψη ότι η πολυδιάστατη απόκριση διαφορετικών συστηµάτων στο µόριο της HARP, οφείλεται στη διαφορική δράση ξεχωριστών τµηµάτων του µορίου. Τα τµήµατα αυτά του µορίου της HARP δύναται να σχηµατίζονται υπό την επίδραση των εκάστοτε συστατικών του µικροπεριβάλλοντος των κυττάρων (Polykratis et al., 2004), και να δρουν σε διαφορετικούς υποδοχείς (Lu et al., 2005). Ε.1.5.3 HARP και αγγειογένεση Η αγγειογένεση αναφέρεται στο σχηµατισµό νέων αγγείων από προϋπάρχοντα και αποτελεί µια πολύπλοκη διαδικασία, στην οποία ενέχονται εκτεταµένες αλληλεπιδράσεις µεταξύ κυττάρων, διαλυτών παραγόντων και συστατικών του εξωκυτταρικού υλικού. Αγγειογένεση κάτω από αυστηρό έλεγχο παρατηρείται στο αναπαραγωγικό σύστηµα των θηλυκών ατόµων στα θηλαστικά και κατά την επούλωση πληγών (Hyder and Stancel, 1999). Ανεξέλεγκτη αγγειογένεση αποτελεί συστατικό διαφόρων παθολογιών, όπως η ρευµατοειδής αρθρίτιδα, η διαβητική αµφιβληστροειδοπάθεια, η ψωρίαση και η αιµαγγείωση. Τέλος, η ανάπτυξη καρκινικών όγκων και η µετάσταση είναι διαδικασίες εξαρτώµενες από την αγγειογένεση (Carmeliet and Jain, 2000). 13

Εισαγωγή Ένας πιθανός ρόλος της HARP στη φυσιολογική αγγειογένεση προτάθηκε για πρώτη φορά, όταν ανιχνεύθηκε το mrna και αποµονώθηκε η πρωτεΐνη της από αγγειοβριθείς ιστούς, όπως είναι η µήτρα βοός και η µήτρα επίµυος (Milner et al., 1989; Vanderwinden et al., 1992). Στις µέρες µας πληθώρα αναφορών υποδεικνύει µια θετική συσχέτιση της HARP µε την αγγειογένεση in vivo, αλλά και διαδικασίες που σχετίζονται µε την αγγειογένεση in vitro. Η αγγειογενετική δράση της HARP έχει διαπιστωθεί σε in vivo συστήµατα µελέτης, όπως η χοριοαλλαντοϊκή µεµβράνη εµβρύου όρνιθας (CAM assay) και εµφυτεύµατα matrigel σε µυες (Papadimitriou et al., 2001; Bernard-Pierrot et al., 2002). Πολλές in vitro µελέτες δείχνουν ότι η HARP επάγει τον πολλαπλασιασµό και τη µετανάστευση πολλών τύπων ενδοθηλιακών κυττάρων (Courty et al., 1991; Laaroubi et al., 1994; Papadimitriou et al., 2000; Souttou et al., 2001; Papadimitriou et al., 2001; Brockmann et al., 2003). Επιπλέον, η HARP διεγείρει τα ενδοθηλιακά κύτταρα ώστε να σχηµατίσουν αυλούς in vitro, σε µια ποικιλία πηκτωµάτων, όπως κολλαγόνου (Laaroubi et al., 1994; Papadimitriou et al., 2001), ινώδους (Papadimitriou et al., 2001) και matrigel (Papadimitriou et al., 2001). Η ανίχνευση τόσο του µηνύµατος όσο και της πρωτεΐνης της HARP σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC παραπέµπει σε ένα πιθανό αυτοκρινή ρόλο για τον αυξητικό αυτό παράγοντα (Papadimitriou et al., 2004). ιαφορετικές περιοχές του µορίου της HARP δύνανται να εκδηλώνουν ακόµη και αντίθετες δράσεις, όσον αφορά το σχηµατισµό νέων αγγείων. Τα δύο πλούσια σε λυσίνη άκρα µπορούν να επάγουν την αγγειογένεση τόσο in vitro όσο και in vivo (Papadimitriou et al., 2000; 2001). Επιπλέον, τόσο το τµήµα που περιλαµβάνει τα τελευταία 25 αµινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου του µορίου, όσο και αυτό που περιλαµβάνει τα αµινοξέα 65-136, θεωρούνται πολύ σηµαντικά για την αγγειογενετική δράση της HARP (Bernard-Pierrot et al., 2001; Zhang et al., 1999). Πέντε διαφορετικά πεπτίδια, τα οποία προκύπτουν µετά από πρωτεολυτική αποικοδόµηση της HARP από την πλασµίνη, επηρεάζουν µε διαφορετικό τρόπο την αγγειογένεση in vivo και in vitro (Polykratis et al., 2004). Η HARP αποτελεί επιπλέον υπόστρωµα για την τρυψίνη και τη χυµοτρυψίνη (Delbe et al., 1995), ενώ έχει διατυπωθεί η υπόθεση ότι και άλλα πρωτεολυτικά ένζυµα πιθανόν να αποικοδοµούν τη HARP, ρυθµίζοντας µε τον τρόπο αυτό την αγγειογενετική της δράση. Η παραπάνω υπόθεση ενισχύεται από την παρατήρηση ότι πεπτίδια που 14

Εισαγωγή προκύπτουν µετά από πρωτεόλυση της HARP, ανιχνεύονται στο θρεπτικό µέσο ενδοθηλιακών κυττάρων και αρκετών καρκινικών κυτταρικών σειρών (Papadimitriou et al., 2000; 2004). Μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζει η πρόσφατη παρατήρηση άµεσης αλληλεπίδρασης της HARP και του VEGF 165 (Heroult et al., 2004). Ο VEGF είναι από τους σηµαντικότερους επαγωγείς αγγειογένεσης µε διττό ρόλο, αφού συµµετέχει στο σχηµατισµό νέων αγγείων και συνάµα στην οµοιόστασή τους (Carmeliet and Jain, 2000; Ferrara et al., 2002). Προτείνεται ότι η αλληλεπίδραση που πραγµατοποιείται µέσω των δύο β-πτυχών του µορίου της HARP έχει ως αποτέλεσµα την αναστολή της αγγειογενετικής δράσης του VEGF 165 (Polykratis et al., 2004; Heroult et al., 2004). Τέλος, φαίνεται ότι η HARP συµµετέχει στη λειτουργία του αγγειακού συστήµατος, καθώς αποτελεί ρυθµιστή του συστήµατος ρενίνης-αγγειοτενσίνης. Σε αορτή από µύες, όπου είχε απαλειφθεί το γονίδιο της HARP, παρατηρήθηκαν πολύ µικρότερα επίπεδα του mrna του ενζύµου µετατροπής της αγγειοτενσίνης (Angiotensin Converting Enzyme, ACE). Αντίθετα, παρατηρήθηκε πολύ µεγάλη αύξηση στα ώριµα µετάγραφα των υποδοχέων της αγγειοτενσίνης ΙΙ, τύπου 1 και 2 (Herradon et al., 2004). Τα αποτελέσµατα αυτά είναι ιδιαίτερης σηµασίας, καθώς το σύστηµα ρενίνης-αγγειοτενσίνης εµπλέκεται σε πολλές φυσιολογικές διαδικασίες, µεταξύ των οποίων και η αγγειογένεση. Ο αγγειογενετικός ρόλος της HARP συµβάλλει στην εκδήλωση και ανάπτυξη παθολογικών καταστάσεων. Έτσι, αυξηµένη έκφραση της HARP σχετίζεται µε την παθογένεση του ενδοµήτριου, µια ήπια γυναικολογική διαταραχή (Chung et al., 2002). Επιπλέον, η HARP εντοπίζεται σε ενήλικα άτοµα σε καταστάσεις φλεγµονής, όπως κατά τη ρευµατοειδή αρθρίτιδα όπου µπορεί να δρα ως αγγειογενετικός παράγοντας. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης HARP είναι ιδιαίτερα αυξηµένα στο υγρό των αρθρώσεων ασθενών µε ρευµατοειδή αρθρίτιδα και λιγότερο σε ασθενείς µε οστεοαρθρίτιδα (Pufe et al., 2003a). Παρόλα αυτά, είναι αξιόλογη η παρατήρηση ότι στα πρώτα στάδια της οστεοαρθρίτιδας, τα επίπεδα της HARP είναι αυξηµένα (Pufe et al., 2003b). 15

Εισαγωγή Ε.1.6 HARP και καρκίνος Η καρκινογένεση είναι µια πολυσύνθετη διαδικασία που περιλαµβάνει τη µετατροπή των φυσιολογικών κυττάρων σε καρκινικά (µια διαδικασία που καλείται µετασχηµατισµός, transformation), την απώλεια ικανότητας διαφοροποίησης των κυττάρων και τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασµό τους. Οι παραπάνω αποκρίσεις, πιθανολογείται ότι πυροδοτούνται από αυξητικούς παράγοντες που εκκρίνονται από τα καρκινικά κύτταρα, παίζοντας καθοριστικό ρόλο στην επακόλουθη ανάπτυξη και µετάσταση των καρκινικών όγκων (Dickson and Lipman, 1987). Ε.1.6.1 Έκφραση της HARP και υποδοχέων της στον καρκίνο Ο πιθανός ρόλος της HARP στον καρκίνο, προτάθηκε µετά από αποµόνωση του αυξητικού αυτού παράγοντα από το θρεπτικό µέσο καλλιεργειών επιθηλιακών κυττάρων καρκίνου του µαστού (MDA-MB-231) (Lupu et al., 1992). Έλεγχος µιας πληθώρας κυτταρικών σειρών καρκίνου ανθρώπου, καθώς και δειγµάτων όγκων, έδειξε ότι η HARP εκφράζεται στις 18 από τις 36 κυτταρικές σειρές που ελέγχθηκαν, καθώς και στο 60% των δειγµάτων από όγκους µαστού. Αξιοσηµείωτο είναι το γεγονός ότι οι καρκινικές κυτταρικές σειρές, στις οποίες εκφράζεται η HARP, είναι διαφορετικής προέλευσης, για παράδειγµα µελάνωµα, καρκίνος του µαστού και του προστάτη και χοριοκαρκίνωµα (Πίνακας Ε.Ι) (Fang et al., 1992). Εξαιτίας της µεσοδερµικής και νευροεξωδερµικής της προέλευσης, δεν προκάλεσε έκπληξη το γεγονός ότι υψηλά επίπεδα έκφρασης της HARP παρατηρήθηκαν σε µηνιγγιώµατα (Mailleux et al., 1992), νευροβλαστώµατα (Nakagawara et al., 1995), γλοιοβλαστώµατα (Mentlein et al., 2002), µελάνωµα (Schulte et al., 1997) και σε κυτταρικές σειρές µικροκυτταρικού καρκινώµατος του πνεύµονα (Small Cell Lung Cancer, SCLC) (Jager et al., 1997). Αξίζει να αναφερθεί στο σηµείο αυτό ότι η HARP θα µπορούσε να χρησιµοποιηθεί ως µοριακός µάρτυρας για τη διάγνωση του µικροκυτταρικού καρκινώµατος πνεύµονα, αφού το mrna της ανιχνεύεται συχνότερα και σε υψηλότερα επίπεδα συγκριτικά µε το µη µικροκυτταρικό καρκίνωµα του πνεύµονα (Jager et al., 1997). Επιπλέον, υψηλά επίπεδα έκφρασης της HARP έχουν παρατηρηθεί στο 78% των δειγµάτων όγκων από ασθενείς µε καρκίνο του παγκρέατος (Souttou et al., 1998). Πρόσφατες αναφορές επισηµαίνουν την έκφραση της HARP σε κακοήθεις όγκους των όρχεων (Aigner et al., 2003), σε καρκίνο αυχένος της µήτρας (Moon et al., 16

Εισαγωγή 2003), καθώς και σε συµπαγείς όγκους παιδιών (Barthlen et al., 2003). Τέλος, η έκφραση της HARP έχει συσχετιστεί και µε διαδικασίες που προηγούνται της ανάπτυξης νεοπλασίας του ήπατος (Kohashi et al., 2002). Το γεγονός ότι η HARP µπορεί να δράσει ως ογκογόνος παράγοντας, ενισχύεται επιπλέον από δεδοµένα που αναφέρουν αυξηµένη έκφραση των υποδοχέων της σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές σειρές και δείγµατα όγκων ανθρώπου. Έτσι, η ALK έχει παρατηρηθεί ότι υπερεκφράζεται στο γλοιοβλάστωµα, στο 35% κυτταρικών σειρών καρκίνου του µαστού και στο 50% δειγµάτων όγκων από ασθενείς µε καρκίνο του µαστού (Powers et al., 2002). Η RPTPβ/ζ υπερεκφράζεται επίσης σε µια πληθώρα καρκίνων, όπως στο γλοιοβλάστωµα και στο νευροβλάστωµα (Muller et al., 2003), στο µελάνωµα και στον καρκίνο αυχένος µήτρας (Moon et al., 2003). Ωστόσο, η έκφραση της RPTPβ/ζ είναι µειωµένη στον καρκίνο του παχέος εντέρου (Yamakawa et al., 1999). Πίνακας Ε.Ι: Ανίχνευση του µηνύµατος της HARP σε καρκινικές κυτταρικές σειρές και ιστούς (Papadimitriou et al., 2004). 17

Εισαγωγή Ε.1.6.2 Ρόλος της HARP και των υποδοχέων της στον καρκίνο Η πρώτη αναφορά εµπλοκής της HARP στην ανάπτυξη των όγκων περιγράφηκε από τον Wellstein και την ερευνητική του οµάδα, το 1992, όταν αποµονώθηκε από το θρεπτικό µέσο καλλιέργειας των κυττάρων MDA-MB-231 και δείχθηκε ότι ανασυνδυασµένη HARP ευκαρυωτικής προέλευσης, επάγει τη µίτωση επιθηλιακών κυττάρων. Επίσης, η συγκεκριµένη ερευνητική οµάδα ανίχνευσε τη HARP και στο θρεπτικό µέσο καλλιέργειας κυττάρων µελανώµατος ανθρώπου (Wellstein et al., 1992). Η ανάδειξη της HARP ως σηµαντικού αυξητικού παράγοντα των όγκων επιβεβαιώθηκε από την ίδια ερευνητική οµάδα. Συγκεκριµένα, βρέθηκε ότι το θρεπτικό µέσο καλλιέργειας κυττάρων SW-13, που είχαν διαµολυνθεί µε το cdna της HARP, διεγείρει ενδοθηλιακά κύτταρα, ινοβλάστες και τα ίδια τα κύτταρα SW-13. Επιπλέον, τα κύτταρα SW-13 απέκτησαν αυτονοµία στην ανάπτυξή τους σε τρισδιάστατο περιβάλλον και ανεξάρτητα από την προσκόλληση σε υπόστρωµα (σε πήκτωµα soft agar), ενώ ένεση των κυττάρων σε αθυµικούς µύες είχε ως αποτέλεσµα την εγκαθίδρυση και ανάπτυξη όγκων (Fang et al., 1992). Κατά αντιστοιχία, η HARP που αποµονώθηκε από κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύµονα, προήγαγε τον πολλαπλασιασµό και την ανάπτυξη σε πήκτωµα soft agar διαφόρων τύπων κυττάρων, όπως ενδοθηλιακών, ινοβλαστών και κυττάρων SW-13 (Jager et al., 1997). Από την άλλη µεριά, η HARP που παράγεται από κύτταρα γλοιώµατος, δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασµό των ίδιων των κυττάρων, αλλά διέγειρε τον πολλαπλασιασµό και τη µετανάστευση κυττάρων µικρογλοίας (Mentlein et al., 2002). Ίσως στην περίπτωση αυτή, η HARP δρα ως παρακρινής αυξητικός παράγοντας, που παράγεται από τα γλοιώµατα και δρα σε ενδοθηλιακά κύτταρα και κύτταρα µικρογλοίας. Σε µια προσπάθεια περαιτέρω εµβάθυνσης στον τρόπο µε τον οποίο εκπληρώνονται όλες οι προαναφερθείσες δράσεις της HARP, διαπιστώθηκε ότι η δέσµευσή της στον υποδοχέα ALK και η επακόλουθη µεταγωγή σήµατος, αποτελούν προϋπόθεση για την ανάπτυξη πολλών τύπων καρκίνου. Καταστολή της έκφρασης της ALK σε κύτταρα καρκίνου του µαστού (Hs578T), ανέστειλε σηµαντικά την ανάπτυξη όγκων σε αθυµικούς µύες και παρέτεινε την επιβίωσή τους. Παρατηρήθηκε επίσης σηµαντική επαγωγή της απόπτωσης µέσα στους όγκους (Wang et al., 1997), κάτι το οποίο αναφέρθηκε και για την κυτταρική σειρά 18

Εισαγωγή γλοιοβλαστώµατος U87MG (Powers et al., 2002). Στην ανάπτυξη του γλοιοβλαστώµατος εµπλέκεται επιπλέον και ο υποδοχέας RPTPβ/ζ, αφού πρόσφατα δεδοµένα δείχνουν µια ρυθµιστική δράση του στη µετανάστευση των κυττάρων. Μάλιστα προτείνεται ότι αντισώµατα έναντι της RPTPβ/ζ, θα αποτελούσαν χρήσιµα θεραπευτικά εργαλεία για όγκους του εγκεφάλου (Muller et al., 2003). Ε.1.6.2.1 Ρόλος της HARP στην εξαλλαγή των κυττάρων σε καρκινικά (transformation) Το γεγονός ότι το γονίδιο της HARP εκφράζεται στον καρκίνο του µαστού και σε κύτταρα µελανώµατος, αλλά όχι σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα µαστού και σε µελανοκύτταρα (Wellstein et al., 1992), δηµιούργησε υπόνοιες ότι το συγκεκριµένο γονίδιο πιθανώς επάγεται κατά την εγκαθίδρυση καρκινικού φαινότυπου στα κύτταρα (transformation). Η διερεύνηση της υπόθεσης αυτής θα µπορούσε να παρέχει ένα ελκυστικό µοντέλο για την κατανόηση τόσο των διαδικασιών που µεσολαβούν ώστε ένα κύτταρο να µετασχηµατιστεί σε καρκινικό, όσο και φυσιολογικών διαδικασιών που ενέχονται στη ρύθµιση της ανάπτυξης (Cross and Dexter, 1991). Πράγµατι, αποδείχθηκε ότι υπερέκφραση της HARP σε κυτταρική σειρά ινοβλαστών (NIH 3T3) οδήγησε σε καρκινικό φαινότυπο. Το συµπέρασµα αυτό εξήχθη από µελέτη τεσσάρων, ανεξάρτητων µεταξύ τους, κριτηρίων: Τον αριθµό των κυττάρων όταν είναι προσκολληµένα σε υπόστρωµα, το σχηµατισµό εστιών προσκόλλησης, την ανάπτυξη των κυττάρων σε συνθήκες ανεξάρτητες από προσκόλληση σε υπόστρωµα και το σχηµατισµό όγκων σε αθυµικούς µύες (Chauhan et al., 1993). Παρόλο που δεν διαλευκάνθηκε ο ακριβής µηχανισµός µε τον οποίο η HARP προκαλεί µετασχηµατισµό των κυττάρων NIH 3T3, η απρόσµενη εµφάνιση και ανάπτυξη όγκων στους αθυµικούς µύες έδειξε ότι υπερέκφραση του γονιδίου της HARP µπορεί να προκαλέσει σηµαντική αποδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, µε επακόλουθη την ανεξέλεγκτη αύξηση. Όπως προαναφέρθηκε, πέραν της µιτογόνου δράσης της, η HARP επάγει την προέκταση νευριτών in vitro. Η δράση της αυτή, επίσης υποδεικνύει ότι η HARP επηρεάζει τη δοµή του κυτταροσκελετού ή/και δρα ως µόριο προσκόλλησης προκειµένου να διεκπεραιωθεί τόσο η προέκταση των νευριτών, όσο και η ανάπτυξη σε πήκτωµα soft agar. 19