ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ Διπλωματική Εργασία για το Μεταπτυχιακό Δίπλωμα Ειδίκευσης στην κατεύθυνση «Μοριακή Φαρμακολογία-Κλινική Φαρμακευτική» ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΣΥΜΜΕΤΟΧΗΣ ΤΩΝ ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ FAK ΚΑΙ ILK ΣΤΗΝ ΕΠΑΓΟΜΕΝΗ ΑΠΟ ΤΟΝ ΑΥΞΗΤΙΚΟ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ ΠΛΕΙΟΤΡΟΠΙΝΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΜΕΤΑΝΑΣΤΕΥΣΗ Επιβλέπουσα καθηγήτρια: Ευαγγελία Παπαδημητρίου Κατερίνα Θεοχάρη Βιολόγος ΠΑΤΡΑ 2009

2 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Μοριακής Φαρμακολογίας του Τμήματος Φαρμακευτικής, του Πανεπιστημίου Πατρών. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την Επίκουρη Καθηγήτρια του Τμήματος Φαρμακευτικής Παπαδημητρίου Ευαγγελία, η οποία μου έδωσε την ευκαιρία να δουλέψω στην ερευνητική της ομάδα και με καθοδήγησε καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης αυτής της εργασίας. Ακόμη, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή κ. Ανδρέα Παπαπετρόπουλο και τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Σταύρο Τοπούζη που δέχτηκαν να συμμετάσχουν στην Τριμελή Εξεταστική Επιτροπή, για τις εύστοχες παρατηρήσεις και συμβουλές. Τέλος, οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στους γονείς μου, Τριαντάφυλλο και Νικολαΐτσα, καθώς και στη φίλη μου Σωτηρία Τσιρμούλα, που μου έδιναν δύναμη και με στήριζαν κάθε στιγμή. 1

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 1 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 2 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 5 Ε.1 Δημιουργία νέων αγγείων 6 Ε.1.1 Νεοαγγειογένεση 6 Ε.1.2 Αγγειογένεση 7 Ε.1.3 Επαγωγείς και αναστολείς της αγγειογένεσης 9 Ε.2 Πλειοτροπίνη (Pleiotrophin, PTN) 10 Ε.2.1 Δομή του γονιδίου της PTN 12 Ε.2.2 Ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου 14 Ε.2.3 Πρωτεϊνική δομή του μορίου της PTN 15 Ε.2.4 Ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της PTN 18 E.2.5 Έκφραση του γονιδίου της PTN κατά την εμβρυική ανάπτυξη και την ενήλικη ζωή Ε.2.6 Αλληλεπιδράσεις και υποδοχείς της PTN 22 Ε.2.7 Μεταγωγή σήματος από την ΡΤΝ 29 Ε.2.8 Βιολογικές δράσεις της PTN 32 Ε Ρόλος της PTN στην ανάπτυξη 32 Ε PTN και κυτταρικός πολλαπλασιασμός 34 Ε PTN και μετανάστευση 35 Ε PTN και αγγειογένεση 36 Ε.2.9 Σχέση δομής-βιολογικής δράσης 37 E PTN και καρκίνος 41 Ε Έκφραση και ρόλος της PTN στον καρκίνο 41 Ε Έκφραση και ρόλος των υποδοχέων της PTN στον καρκίνο 44 E Στόχευση της έκφρασης της PTN στον καρκίνο 45 E Η PTN ως διαγνωστικός δείκτης 46 Ε.3 Σηματοδοτικό μονοπάτι ιντεγκρινών 47 Ε.4 ILK (Integrin-linked kinase) 48 E.4.1 Δομή της κινάσης ILK

4 E.4.2 Προσδέτες της κινάσης ILK 50 E.4.3 Σηματοδοτικό μονοπάτι της κινάσης ILK 52 E.4.4 Βιολογικές δράσεις της κινάσης ILK 55 Ε.4.5 ILK και καρκίνος 58 Ε.5 FAK (Focal Adhesion Kinase) 59 Ε.5.1 Κινάση FAK και σηματοδοτικό μονοπάτι ιντεγκρινών 60 ΣΚΟΠΟΣ 64 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 67 Μ.1 Παρασκευή πλήρους θρεπτικού μέσου για HUVEC 67 Μ.2 Απομόνωση κυττάρων HUVEC από φλέβα ομφάλιου λώρου ανθρώπου 68 Μ.3 Μέτρηση κυττάρων σε αιματοκυτταρόμετρο Neubauer 71 Μ.4 Ανακαλλιέργεια κυττάρων HUVEC 72 Μ.5 Κατάψυξη κυττάρων HUVEC 74 Μ.6 Απόψυξη κυττάρων HUVEC 76 Μ.7 Επώαση κυττάρων HUVEC με ουσίες για μελέτη φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών 77 Μ.8 Εκχύλιση πρωτεϊνών από κύτταρα σε καλλιέργεια 78 Μ.9 Εκτίμηση της συγκέντρωσης ολικής πρωτείνης σε διάλυμα 80 Μ.10 Ανοσοκατακρήμνιση πρωτεϊνών 80 Μ.11 SDS ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) 82 M.12 Ανοσοστύπωμα (Western blot) 86 Μ.13 Ποσοτικοποίηση ανοσοστυπωμάτων με σύστημα ανάλυσης εικόνας 91 Μ.14 Διαδικασία αποδέσμευσης αντισώματος από μεμβράνη PVDF (stripping) 92 Μ.15 Διαμόλυνση των κυττάρων HUVEC με παρεμβαλόμενο RNA (sirna 93 Μ.16 Μελέτη του χημειοτακτισμού των κυττάρων HUVEC (Θάλαμος Transwell) 97 Μ.17 Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων 99 Μ.18 Ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός της ενεργοποιημένης και ολικής FAK με τη μέθοδο ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) Μ.19 Ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός της ενεργότητας της κινάσης ILK 103 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 106 Α.1 Επίδραση της ΡΤΝ στη φωσφορυλίωση των τυροσινών των θέσεων 397, 576 και 925 της κινάσης FAK

5 Α.1.1 Η ΡΤΝ επάγει τη φωσφορυλίωση της κινάσης FAK στην τυροσίνη 397 σε 106 κύτταρα HUVEC Α.1.2 Η ΡΤΝ μειώνει τη φωσφορυλίωση της κινάσης FAK στην τυροσίνη 576 σε κύτταρα HUVEC 108 Α.1.3 Η ΡΤΝ επάγει τη φωσφορυλίωση της κινάσης FAK στην τυροσίνη 925 σε κύτταρα HUVEC 109 A.2 H κινάση ILK εντοπίζεται στα κύτταρα HUVEC 111 Α.3 Η μείωση της έκφρασης της κινάσης ILK με sirna στα κύτταρα HUVEC έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της επαγόμενης από PTN 112 κυτταρικής μετανάστευσης Α.4 Η ΡΤΝ επάγει την ενεργοποίηση της κινάσης ILK σε κύτταρα HUVEC 115 Α.5 Διερεύνηση των μορίων που αλληλεπιδρούν με την κινάση ILK και συμμετέχουν στην επαγόμενη από ΡΤΝ μεταγωγή σήματος στα κύτταρα 116 HUVEC Α.6 Διερεύνηση της επίδρασης της κινάσης ILK στην επαγόμενη από ΡΤΝ φωσφορυλίωση της β-κατενίνης στα κύτταρα HUVEC 119 Α.6.1 Η ΡΤΝ αυξάνει με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο τη φωσφορυλίωση της β- κατενίνης σε κύτταρα HUVEC 119 Α.6.2 Η ΡΤΝ αυξάνει με χρονο-εξαρτώμενο τρόπο τη φωσφορυλίωση της β- κατενίνης σε κύτταρα HUVEC 120 Α.6.3 Η μείωση της έκφρασης της κινάσης ILK με sirna στα κύτταρα HUVEC έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της επαγόμενης από PTN φωσφορυλίωσης της β- κατενίνης 122 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 124 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 129 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 151 SUMMARY 152 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ 153 4

6 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα φυσιολογικά κύτταρα χρειάζονται οξυγόνο και θρεπτικά συστατικά για την επιβίωση και αύξησή τους, γι αυτό και βρίσκονται σε απόσταση μm από τα αγγεία του αίματος. Χωρίς την παρουσία αιμοφόρων αγγείων, ακόμα και ένας καρκινικός όγκος δεν μπορεί να αναπτυχθεί πέρα από ένα κρίσιμο μέγεθος ή να δημιουργήσει μεταστάσεις. Το 1971 ο Folkman πρότεινε ότι η ανάπτυξη του όγκου και η μετάσταση εξαρτώνται από την αγγειογένεση, οπότε αναστέλλοντας την αγγειογένεση θα μπορούσε να ανασταλεί και η ανάπτυξη του όγκου. Το 1976, ο Gullino έδειξε ότι κύτταρα σε προ-καρκινικό ιστό αποκτούν αγγειογενετική ικανότητα, καθώς μετατρέπονται σε καρκινικά. Σήμερα, είναι αποδεκτό ότι τα κύτταρα διαθέτουν έναν αγγειογενετικό διακόπτη, ο οποίος ρυθμίζεται με την ισορροπία ανάμεσα στους επαγωγείς της αγγειογένεσης και στους αντίστοιχους αναστολείς. Ο αγγειογενετικός διακόπτης ενεργοποιείται από διάφορα σήματα. Αυτά περιλαμβάνουν μεταβολικό στρες (π.χ. χαμηλή τάση O 2, χαμηλό ph, υπογλυκαιμία), μηχανικό στρες που προκαλεί ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, ανοσολογικές αντιδράσεις, και γενετικές μεταλλάξεις που ενεργοποιούν ογκογονίδια ή εξαλείφουν ογκοκατασταλτικά γονίδια, τα οποία ελέγχουν την παραγωγή ρυθμιστικών μορίων της αγγειογένεσης (Carmeliet and Jain, 2000). Υπάρχουν ενδείξεις ότι διαφορετικοί τύποι καρκινικών κυττάρων χρησιμοποιούν ξεχωριστούς τρόπους ενεργοποίησης της αγγειογένεσης. Επιπλέον, η καρκινική αγγειογένεση μεταβάλλεται ανάλογα με τον τύπο του καρκινικού όγκου, τη θέση που αναπτύσσεται, καθώς με τα αγγειο- και αντιαγγειογενετικά μόρια που παράγουν τόσο τα ίδια τα κύτταρα του όγκου, όσο και τα κύτταρα του στρώματος, τα ενδοθηλιακά κύτταρα και η εξωκυτταρική ύλη (Fukumura et al., 1998). Οι περισσότερες από τις παραπάνω ιδιότητες που εμφανίζουν τα καρκινικά κύτταρα προκύπτουν από μεταλλάξεις στα γονίδια των φυσιολογικών κυττάρων και η καθεμιά εκδηλώνεται σε διαφορετικά στάδια της καρκινικής ανάπτυξης. Η ανάπτυξη και η διασπορά ενός όγκου γίνεται σταδιακά και εξαρτάται από τις αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στα κύτταρα του όγκου και στα γειτονικά φυσιολογικά κύτταρα. 5

7 Ε.1 Δημιουργία νέων αγγείων Υπάρχουν δύο διακριτοί μηχανισμοί σχηματισμού αιμοφόρων αγγείων, η νεοαγγειογένεση και η αγγειογένεση (Folkman, 1995). Ε.1.1 Νεοαγγειογένεση Κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη, τα αιμοφόρα αγγεία σχηματίζονται από τους αγγειοβλάστες, τα πρόδρομα κύτταρα των ενδοθηλιακών κύτταρων, με τη διαδικασία της νεοαγγειογένεσης (vasculogenesis). Οι αγγειοβλάστες που προέρχονται από το μεσόδερμα, μεταναστεύουν, διαφοροποιούνται και πολλαπλασιάζονται in situ σε έναν μη αγγειωμένο ιστό και στη συνέχεια συνενώνονται σχηματίζοντας ένα πρώιμο αγγειακό πλέγμα. Τα πρώτα αιμοφόρα αγγεία που δημιουργούνται έχουν τη μορφή χορδών ή κυτταρικών συστάδων, τα οποία σταδιακά αναπτύσσονται και διαμορφώνουν έναν αυλό κοντά στο κέντρο της μάζας των κυττάρων. Αυτό το εμβρυϊκό πλέγμα περιλαμβάνει μερικά από τα μεγαλύτερα αγγεία του εμβρύου, όπως είναι η ραχιαία αορτή, οι πρόσθιες καρδιακές φλέβες και τα αρχικά αγγεία του λεκιθικού σάκου. Στη συνέχεια, τα ενδοθηλιακά κύτταρα διασυνδέονται με τα υποστηρικτικά κύτταρα των αγγείων, τα λεία μυϊκά κύτταρα και τα περικύτταρα, και έτσι ωριμάζει το αγγειακό τοίχωμα. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι νεοαγγειογένεση επιτελείται και σε ενήλικα άτομα, στα οποία εντοπίστηκαν πρόδρομα κύτταρα των ενδοθηλιακών κύτταρων. Σύμφωνα με μία από τις αρχικές μελέτες, ο VEGF επάγει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των πρόδρομων ενδοθηλιακών κυττάρων από το μυελό των οστών στην κυκλοφορία του αίματος πειραματοζώων, υποδεικνύοντας ότι η διαδικασία της νεοαγγειογένεσης λαμβάνει χώρα και στο ενήλικο άτομο (Asahara et al., 1999). Ιn vitro πειράματα δείχνουν ότι πρόδρομα κύτταρα του μυελού των οστών ενήλικων ατόμων, μπορούν να διαφοροποιήθουν σε υπόστρωμα matrigel, χωρίς την επίδραση αυξητικών παραγόντων. Φαίνεται ότι στα ενήλικα άτομα, εκτός από το μηχανισμό της αγγειογένεσης παρατηρείται ο σχηματισμός αγγειακών δομών από πρόδρομα κύτταρα του μυελού των οστών 6

8 (Rüger et al., 2008). Σε ασθενείς με χρόνια αρτηριακή απόφραξη μελετάται ως πιθανός μηχανισμός επιδιόρθωσης των αγγείων η επιστράτευση πρόδρομων ενδοθηλιακών κυττάρων και η διαφοροποίηση τους σε κύτταρα των αγγείων (Matsuo et al., 2008). Επίσης, πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι η μεταμόσχευση πρόδρομων ενδοθηλιακών κυττάρων σε ισχαιμικούς ιστούς συμβάλλει στην αναδόμηση του καταστραμμένου ιστού μέσω της διαδικασίας της νεοαγγειογένεσης (Sepulveda et al., 2007). Ε.1.2 Αγγειογένεση Ο σχηματισμός αγγείων από τα ήδη υπάρχοντα επιτελείται με τη διαδικασία της αγγειογένεσης και πραγματοποιείται και στο έμβρυο και στο ενήλικο άτομο (Folkman, 1987, 1990). Στο αναπτυσσόμενο έμβρυο, ορισμένα όργανα αγγειώνονται και με το μηχανισμό της αγγειογένεσης, όπως π.χ. ο εγκέφαλος και τα νεφρά. Συγκεκριμένα στον εγκέφαλο, ο πολλαπλασιασμός των νευροεπιθηλιακών κυττάρων προκαλεί πάχυνση του νευρικού σωλήνα, ο οποίος για να συνεχίσει να αναπτύσσεται δέχεται την είσοδο τριχοειδών αγγείων που προέρχονται από το περινευρικό αγγειακό πλέγμα. Στο ενήλικο άτομο, αγγειογένεση παρατηρείται σε φυσιολογικές καταστάσεις, όπως είναι η επούλωση τραυμάτων και τα στάδια του θηλυκού αναπαραγωγικού κύκλου που περιλαμβάνουν την ανάπτυξη των ωοθυλακίων και των ωχρών σωματίων, και την εκτεταμένη αγγειογένεση που εμφανίζεται στο ενδομήτριο κατά τη διάρκεια της εμμηνορρυσίας. Επιπρόσθετα, η αγγειογένεση παρατηρείται και σε παθολογικές καταστάσεις, όπως η αθηροσκλήρωση, η ψωρίαση, η ενδομητρίωση, η διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια και ο καρκίνος. Τα νέα αγγεία στο ενήλικο άτομο σχηματίζονται με εκβλάστηση (sprouting), με δημιουργία γεφυρών ανάμεσα στα ενδοθηλιακά κύτταρα (bridging) και με διχοτόμηση ή ενδίπλωση (intussuseption). Ο μηχανισμός που έχει μελετηθεί πιο εκτεταμένα είναι η αγγειογένεση με εκβλάστηση, η οποία ρυθμίζεται από ειδικούς 7

9 αγγειακούς αυξητικούς παράγοντες, όπως ο VEGF, οι αγγειοποιητίνες Ang-1 και Ang-2 και οι εφρίνες ephrin-b1/b2 (Ferrara et al., 2002, Masonpierre et al., 1997 Kuijper et al., 2007). Κατά την αγγειογένεση με εκβλάστηση, αγγειογενετικοί παράγοντες δεσμεύονται σε ειδικούς υποδοχείς των ενδοθηλιακών κυττάρων και ενεργοποιούν μονοπάτια μεταγωγής σήματος μέσα στο κύτταρο, όπως π.χ. η ενεργοποίηση των MAP κινασών (Mitogen Activator Protein Kinases, MAPKs), με τελικό στόχο την τροποποιημένη έκφραση γονιδίων. Στη συνέχεια, οι μεταλλοπρωτεϊνάσες αποικοδομούν το εξωκυτταρικό υλικό, επιτρέποντας στα ενδοθηλιακά κύτταρα να μεταναστεύσουν από το τοίχωμα των προϋπαρχόντων αγγείων και να πολλαπλασιαστούν. Στην επιφάνεια των αγγείων υπάρχουν μόρια προσκόλλησης, τα οποία συμμετέχουν και διευκολύνουν τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Η έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων επάγεται από παράγοντες που διεγείρουν την αγγειογενετική διαδικασία και διευκολύνει τη μετανάστευση και προσκόλληση των ενδοθηλιακών κυττάρων στο εξωκυτταρικό υλικό. Μετά τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων, οι αγγειοποιητίνες δεσμεύονται στους αντίστοιχους υποδοχείς τους, Tie1/2, που εκφράζονται αποκλειστικά από τα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων και σταθεροποιούν τη δομή των νεοσχηματισμένων πρώιμων αγγείων, ενεργοποιώντας την αλληλεπίδραση ενδοθηλιακών και περιενδοθηλιακών κυττάρων (Klagsbrun et al., 1999). Τα πρώιμα αγγεία αναδιαρθρώνονται με την προσέλκυση μεσεγχυματικών κυττάρων, τα οποία με την επίδραση του PDGF, που εκφράζουν τα ενδοθηλιακά κύτταρα, διαφοροποιούνται σε περικύτταρα και λεία μυϊκά κύτταρα που επενδύουν εξωτερικά τον αγγειακό αυλό, προστατεύοντας τα αγγεία από μεταβολές στην παροχή οξυγόνου ή στο ορμονικό ισοζύγιο. Η διατήρηση των νέων αγγείων εξαρτάται από την επιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων, τα οποία σε φυσιολογικές συνθήκες μπορούν να επιβιώσουν για αρκετά χρόνια (Εικόνα 1.1) (Carmeliet et al., 2000). 8

10 Εικόνα Ε.1: Σχηματική αναπαράσταση του σχηματισμού αγγείων με εκβλάστηση. A) Αγγειογενετικοί παράγοντες δεσμεύονται στους ειδικούς υποδοχείς των ενδοθηλιακών κυττάρων και ενεργοποιούν μονοπάτια μεταγωγής σήματος. Β) Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες (ΜΜΡs) αποικοδομούν εξωκυτταρικό υλικό, επιτρέποντας έτσι τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων. Γ) Η ιντεγκρίνη α ν β 3 εκφράζεται από ενδοθηλιακά κύτταρα και διευκολύνει τη μετανάστευσή και προσκόλλησή τους στο εξωκυτταρικό υλικό. Δ) Η αγγειοποιητίνη-1 δεσμεύεται στον υποδοχέα Tie-2 των ενδοθηλιακών κυττάρων, γεγονός που διευκολύνει τη δημιουργία νέων αγγείων. Ε) Τα ενδοθηλιακά κύτταρα εκκρίνουν παράγοντες που προσελκύουν πρόδρομα περικύτταρα, τα οποία αλληλεπιδρώντας με τα ενδοθηλιακά κύτταρα διαφοροποιούνται στα περικύτταρα. Ε.Υ.: εξωκυτταρικό υλικό, Ε.Κ.: ενδοθηλιακά κύτταρα. Ε.1.3 Επαγωγείς και αναστολείς της αγγειογένεσης Η αγγειογένεση ρυθμίζεται από την ισορροπία στην έκφραση των ενδογενών προ-αγγειογενετικών και αντι-αγγειογενετικών παραγόντων. Οι επαγωγείς της αγγειογένεσης (Πίνακας E.1) δρουν επηρεάζοντας τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση ή τη διαφοροποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Οι ενδογενείς αναστολείς της αγγειογένεσης (Πίνακας E.2) είτε δρουν άμεσα στοχεύοντας τα ενδοθηλιακά κύτταρα, είτε έμμεσα αναστέλλοντας τη σύνθεση αυξητικών παραγόντων από τα κύτταρα του όγκου (Kerbel and Folkman, 2002). 9

11 Πίνακας E.I. Μόρια που επάγουν την αγγειογένεση. VEGF PIGF FGF-1, FGF-2 PTN HIV-tat PDGF HGF/SF TGF-α TGF-β EGF IGF-1 TNF-α IL-8 IL-3 ΝΟ Επαγωγείς της αγγειογένεσης Προσταγλαδίνη Ε1, Ε2 PD-ECGF/TP COX-2 Αγγειογενίνη Οιστρογόνα Προλιφερίνη Τμήματα του υαλουρονικού οξέος Ολιγοσακχαρίτες Ερυθροποιητίνη G-CSF GM-CSF E-σελεκτίνη VCAM-1 Αγγειοποιητίνη-1 Πλειοτροπίνη Ε.2 Πλειοτροπίνη (Pleiotrophin, PTN) Η ΡΤΝ είναι ένας εκκρινόμενος αυξητικός παράγοντας 18 kda, με μεγάλη συγγένεια πρόσδεσης για την ηπαρίνη. Παρουσιάζει 55% ομολογία στην αμινοξική αλληλουχία με τη Midkine, με την οποία συγκροτούν μια οικογένεια αυξητικών παραγόντων, και περιέχει 10 υψηλά συντηρημένες κυστεΐνες στο μόριό της. Εκτός από την αμινοξική τους ομολογία, η PΤΝ και η Midkine χρησιμοποιούν επίσης τους ίδιους υποδοχείς και έχουν κοινές βιολογικές δράσεις, οι πιο καλά χαρακτηρισμένες από τις οποίες είναι η επαγωγή των νευριτών και η ανάπτυξη των όγκων (Papadimitriou et al, 2004; Mikelis et al., 2007). 10

12 Πίνακας E.2. Μόρια που αναστέλλουν την αγγειογένεση. Από το εξωκυτταρικό υλικό και τη βασική μεμβράνη Αρρεστίνη Ενδογενείς αναστολείς Αναστολείς που δεν προέρχονται από το εξωκυτταρικό υλικό και τη βασική μεμβράνη Αυξητικοί παράγοντες και κυτταροκίνες Κουνστατίνη Παράγοντας αιμοπεταλίων -4 Θρομβοσπονδίνη-1 και -2 Τμήματα κολλαγόνου Ενδοστατίνη EFC-XV Τμήματα ινονεκτίνης PEDF PEX Αγγειοστατίνη Φιμπουλίνη Αντιθρομβίνη ΙΙΙ Ενδορεπελλίνη Plasminogen kringle 5 Τουμστατίνη Φιμπουλίνη Τμήματα προλακτίνης Μεθοξυοιστραδιόλη Chondromodulin Βασοστατίνη Ιντερφερόνες Ιντερλευκίνες TIMPs Prothrombin kringle 2 Τροπονίνη 1 Το μόριο της PTN απομονώθηκε παράλληλα από πολλές ερευνητικές ομάδες και από διάφορους ιστούς. Κάθε ερευνητική ομάδα, ανάλογα με τον ιστό προέλευσης ή βάσει κάποιας από τις ιδιότητες του μορίου, έδωσε στον παράγοντα διαφορετική ονομασία. Για το λόγο αυτό, απαντάται στη βιβλιογραφία με πολλές ονομασίες, από τις οποίες επικρατέστερες σήμερα είναι: HARP (heparin affin regulatory peptide) (Courty et al., 1991), PTN (Li et al., 1992), HB-GAM (Heparin- Binding Growth Associated Molecule) (Rauvala, 1989) και OSF-1 (Osteoblast Specific Factor-1) (Tezuka et al., 1990). 11

13 Αρχικά, η PTN απομονώθηκε από τον εγκέφαλο νεογέννητων αρουραίων και ενήλικων βοών ως μόριο το οποίο μπορεί να επάγει την προέκταση νευριτών (Rauvala 1989), υποδεικνύοντας πιθανό ρόλο στη φυσιολογία του νευρικού συστήματος (Merenmies et al., 1990). Επιπλέον έρευνες έδειξαν ότι το μόριο αυτό εντοπίζεται και σε άλλους, μη νευρικούς ιστούς, όπως η καρδιά (Hampton et al., 1992), η μήτρα (Milner et al., 1989), οι χόνδροι και τα οστά (Neame et al., 1993), και η επίφυση (Azizan et al., 2000), υποδηλώνοντας ότι η βιολογική της δράση δεν περιορίζεται μόνο στο νευρικό σύστημα, όπως είχε αρχικά εικαστεί (Rauvala 1989). Υψηλά επίπεδα του γονιδίου εκφράζονται επίσης σε αρκετούς ανθρώπινους όγκους, μεταξύ των οποίων είναι το νευροβλάστωμα, το γλοιοβλάστωμα, ο καρκίνος του προστάτη και του πνεύμονα και πολλοί άλλοι, όπως θα αναφερθεί εκτενέστερα παρακάτω. Ε.2.1 Δομή του γονιδίου της PTN Το γονίδιο της PTN έχει αναλυθεί στον άνθρωπο, τον επίμυ, το μυ, το κουνέλι και πρόσφατα στο zebrafish. Το cdna της PTN στα παραπάνω είδη παρουσιάζει παρόμοια οργάνωση. Το γονίδιο της PTN στον άνθρωπο εντοπίζεται στο μεγάλο βραχίονα του 7 ου χρωμοσώματος, στις περιοχές (Li et al, 1992). Όσο για τα γονίδια της PTN στα τρωκτικά, αυτά έχουν βρεθεί στα χρωμοσώματα 4 και 6 στο ποντίκι και στον αρουραίο αντίστοιχα (Hornum et al, 1996). Στον άνθρωπο, το γονίδιο της PTN καταλαμβάνει πάνω από 65 kb, περιέχει τουλάχιστον επτά εξόνια και το ελάχιστο μέγεθός του είναι 42 kb (Lai et al, 1992; Kretshmer et al, 1993). Το m-rna της PTN οργανώνεται σε πέντε εξόνια με συνολικό μέγεθος 1650 νουκλεοτίδια (Kretshmer et al, 1993). Το σηματοδοτικό πεπτίδιο, καθώς και τα πρώτα πέντε αμινοξέα του ώριμου μορίου, εντοπίζονται στο εξόνιο 2, ενώ το μεγαλύτερο τμήμα της κωδικής περιοχής της πρωτεΐνης εντοπίζεται στα εξόνια 3 και 4 (Kretshmer et al, 1993). Μια 5 -μη μεταφραζόμενη περιοχή (5 -UTR), η οποία καλύπτει ένα ολόκληρο εξώνιο, έχει περιγραφεί από πολλούς ερευνητές (Lai et al., 1992; Kretschmer et al., 1993). 12

14 Οι 3 - και 5 - μη μεταφρασμένες περιοχές του γονιδίου της PTN στον άνθρωπο παρουσιάζουν αντίστοιχα υψηλή ομολογία με τα αντινοηματικά cdnas της hsp (heat shock protein) 70 και της L17 πρωτεΐνης του ριβοσώματος (Lai et al, 1992). Επίσης, στην 3 - μη μεταφρασμένη περιοχή έχουν εντοπιστεί 3 επαναλήψεις του μοτίβου ΑΤΤΤΑ. Η αλληλουχία αυτή, η οποία εμπλέκεται στη σταθερότητα του mrna εντοπίζεται στην 3 περιοχή αρκετών ογκογονιδίων (Lai et al, 1992). Το γονίδιο της PTN στο ποντίκι εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 6, περιορίζεται σε πέντε εξόνια και τέσσερα ιντρόνια και δεν καταλαμβάνει περισσότερo από 32 kb (Katoh et al, 1992). Στην 5 περιοχή στο γονίδιο της PTN στο ποντίκι εντοπίζονται δυο επαγωγείς (Ι και ΙΙ). Και οι δυο περιέχουν τις περιοχές CCAAT και TATA και αλληλουχίες ρυθμιστικών στοιχείων, όπως το στοιχείο απόκρισης στο cαmp (camp responsive element), την περιοχή δέσμευσης του SP-1 και το στοιχείο απόκρισης της θυρεοειδούς ορμόνης στον επαγωγέα Ι και την αλληλουχία απόκρισης των γλυκοκορτικοειδών στον επαγωγέα ΙΙ (Sato et al, 1997). Το γονίδιο της PTN στο zebrafish αποτελείται από πέντε εξόνια, τέσσερα ιντρόνια και καταλαμβάνει 82 kb. Το πρώτο και το τέταρτο ιντρόνιο, όπως και στον άνθρωπο, είναι τα μεγαλύτερα, με μέγεθος 60,3 και 14,7 kb αντίστοιχα. Η μεγάλη ομοιότητα στις αλληλουχίες σύνδεσης των εξονίων με τα ιντρόνια στον άνθρωπο, το ποντίκι, το zebrafish και τη Midkine, πιθανά υποδεικνύει ότι εξελικτικά έχουν κοινό πρόγονο (Chang et al., 2004). Πρόσφατα ανακαλύφθηκαν στη Drosophila Melanogaster οι πρωτεΐνες Miple1 και Miple 2, οι οποίες θεωρούνται νέα μέλη της οικογένειας PTN/MK. Τα γονίδια Miple1 και Miple 2 εντοπίζονται στον αριστερό βραχίονα του τρίτου χρωμοσώματος στην περιοχή 61Β3. Αποτελούνται από πέντε εξόνια και το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης για το κάθε γονίδιο κωδικοποιείται από τα εξόνια 2-5, ενώ η 3 μη μεταφρασμένη περιοχή του Miple1 είναι αρκετά μεγαλύτερη από αυτή του Miple2. Το mrna του Miple1 έχει μέγεθος βάσεις, ενώ του Miple2 έχει συνολικό μέγεθος βάσεις (Englund et al., 2006). 13

15 Ε.2.2 Ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου Η ανάλυση του υποκινητή του γονιδίου στον άνθρωπο έδειξε ότι δεν υπάρχει η περιοχή ΤΑΤΑ, αλλά έχει εντοπιστεί η περιοχή CAAT σε μια απόσταση 91 νουκλεοτιδίων πριν από το σημείο έναρξης της μεταγραφής (Kretschmer et al., 1993; Li et al., 1992). Στην αλληλουχία αυτή δύνανται να δεσμευτούν γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες, όπως ο C/EBP (CAAT-box/enhancer-binding protein) ή ο CTF/NF1 (CAAT-box-binding Factor/ Nuclear Factor 1). Στην αλληλουχία TATA δεσμεύεται η πρωτεΐνη δέσμευσης στην ΤΑΤΑ (ΤΑΤΑ-Βinding Protein, TBP), η οποία αποτελεί βασικό συστατικό του μεταγραφικού παράγοντα ΙΙD (Transcription Factor IID, TF II D). Η πρωτεΐνη TBP είναι απαραίτητη για τη μεταγραφή ακόμα και αν απουσιάζει η αλληλουχία ΤΑΤΑ και φαίνεται να καθορίζει το ακριβές σημείο έναρξης της μεταγραφής (Johnson and Jameson, 1998). Η αλληλουχία αυτή εκλείπει και από τη ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου της Midkine (Matsubara et al., 1990), του γονιδίου της Wnt-2, το οποίο ενεργοποιείται σε μύες κατά την πρώιμη ανάπτυξη (Smith et al., 1988), της p18 που εκφράζεται σε εμβρυικούς ιστούς μυός (Luo et al., 1991) και άλλων γονιδίων. Το κοινό αυτό χαρακτηριστικό μεταξύ γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη, πιθανολογεί ένα διαφορετικό μηχανισμό ρύθμισης που ελέγχεται διαφορικά στο χρόνο και το χώρο. Στην απομακρυσμένη 5 περιοχή έχουν βρεθεί δύο αλληλουχίες δέσμευσης για τον AP-1 (Activator Protein-1), τέσσερις για το MyoD (myogenic factor D), μια αλληλουχία στοιχείου απόκρισης στον ορό (Serum Response Element, SRE) (Li et al.,1992) και μια για το μεταγραφικό παράγοντα HOXA5 (Homeobox A5) (Chen et al., 2005). Ενδιαφέρον είναι επίσης το γεγονός ότι πριν από το ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο του γονιδίου βρίσκεται ενσωματωμένο στο γονίδιο της PTN ένα στοιχείο που μοιάζει με τον ανθρώπινο ενδογενή ρετροϊό (human endogenous retrovirouslike element, HERV), το οποίο πλαισιώνεται από επαναλαμβανόμενες τελικές ακολουθίες 502 και 495 νουκλεοτιδίων. Λόγω της ειδικότητάς του να δεσμεύεται στο Glu-tRNA και του γεγονότος ότι είναι ενσωματωμένο στο εσωτερικό του 14

16 γονιδίου της PTN, το στοιχείο αυτό ονομάστηκε HERV-E.PTN (ή GT-1). Έχει δειχτεί επίσης ότι ο μεταγραφικός παράγοντας Sp1, ο οποίος δεσμεύεται στο HERV-E.PTN είναι πολύ σημαντικός για την έκφραση του γονιδίου σε καρκινικά κύτταρα χορίου ανθρώπου (Schulte et al., 2000). Με ανάλυση κατά Southern έγινε γνωστό ότι το HERV-E.PTN εκτός από τον άνθρωπο υπάρχει στο χιμπατζή και το γορίλα, αλλά όχι στον πίθηκο rhezus, υποδηλώνοντας ότι η ενσωμάτωση του στο γονιδίωμα πραγματοποιήθηκε μετά από τον αποχωρισμό των πιθήκων και των χιμπατζήδων, πριν από 25 περίπου εκατομμύρια χρόνια (Schulte και Wellstein 1998). Στην εικόνα Ε.2 φαίνεται η δομή της ρυθμιστικής περιοχής του γονιδίου της PTN. Εικόνα Ε.2: Απεικόνιση της ρυθμιστικής περιοχής του γονιδίου της PTN. Διακρίνεται η περιοχή CAAT, καθώς και οι θέσεις αναγνώρισης από μεταγραφικούς παράγοντες. Ε.2.3 Πρωτεϊνική δομή του μορίου της PTN Η φαινομενική μοριακή μάζα της PTN, όπως υπολογίζεται από SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση, είναι 18 kda. Το νούμερο όμως αυτό δεν αντικατοπτρίζει την αμινοξική αλληλουχία στο ώριμο πολυπεπτίδιο, αφού φασματοφωτομετρικές μελέτες έδωσαν μοριακή μάζα 15,291 kda (Hampton et al, 1992). Η διαφοροποιημένη κινητικότητα του μορίου της PTN στην SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση, σε αντίθεση με την αμινοξική αλληλουχία, οφείλεται στην μεγάλη περιεκτικότητα του μορίου σε βασικά αμινοξέα (Raulais et al., 1991; Wellstein et al., 1992). 15

17 Η πρωτογενής δομή της PTN (Πίνακας Ε.II), όπως αποκαλύφθηκε από cdna κλώνους, αποτελείται από 168 αμινοξέα, τα οποία είναι υψηλά συντηρημένα σε διαφορετικά είδη, όπως στον άνθρωπο, στον αρουραίο, στο βόδι και στην όρνιθα (Li et al., 1990). Η PTN περιέχει μια υψηλά υδρόφοβη αμινοτελική αλληλουχία 32 αμινοξέων, η οποία αντιστοιχεί στην αλληλουχία «σινιάλο» (signal peptide) του μορίου και ένα υδρόφιλο αμινοτελικό άκρο (Merenmies and Rauvala, 1990). Η αποκοπή του σηματοδοτικού αυτού πεπτιδίου φαίνεται να είναι εξαρτώμενη από το είδος του κυττάρου, και οδηγεί στην παραγωγή δυο διαφορετικών μορίων που διαφέρουν κατά τρία αμινοξέα στο αμινοτελικό άκρο του μορίου, με αποτέλεσμα να προκύπτουν πρωτεΐνες 136 και 139 αμινοξέων (Bernard-Pierrot et al, 2001). Η αμινοτελική αλληλουχία της ανθρώπινης, μιτογόνου, ανασυνδυασμένης PTN, η οποία απομονώνεται από έκφραση του γονιδίου σε ευκαρυωτικό σύστημα, περιέχει τρία επιπλέον αμινοξέα στο αμινοτελικό της άκρο (Laaroubi et al, 1994). Η απομόνωση αυτής της προεκτεινόμενης μορφής του μορίου (με τα τρία αμινοξέα στο αμινοτελικό άκρο) δημιούργησε πολλά ερωτηματικά σχετικά με τις διεργασίες κατά τη διάρκεια της βιοσύνθεσης του μορίου και αναφορικά με τη μιτογόνο δραστηριότητά του. Αξιοσημείωτο είναι ότι ανάλογη μορφή του μορίου μπορεί να εμφανισθεί και στη Midkine, το άλλο μέλος της οικογένειας των αυξητικών παραγόντων στην οποία ανήκει η PTN (Muramatsu 1993). Πίνακας Ε.3: Αμινοξική αλληλουχία της PTN. Tο υπογραμμισμένο τμήμα αντιστοιχεί στην αλληλουχία σινιάλου. Με * σημειώνονται τα δύο σημεία στα οποία μπορεί να πραγματοποιηθεί η πέψη και απομάκρυνση του πεπτιδίου αυτού. Πέψη σε διαφορετικά σημεία έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ώριμων μορίων με διαφορετικό αμινοτελικό άκρο. Μ S S Q Q Y Q Q Q R R K F A Α A F L A L I F I L A Α V D T *A E A * G K Κ E K P E K Κ V K Κ S D C G E W Q W S V C V P T S G T C G L G T R E G T R T G A E C K Q T M K T Q R C K I P C N W K Κ Q F G A E C K Y Q F Q A W G E C D L N T A L K T R T G S L T R A L H N A D C Q K T V T I S K P C G K L T K P K P Q A E S K Κ K Κ K E G K Κ Q E K M L D 16

18 Η ώριμη πρωτεΐνη αποτελείται κατά 24% από βασικά αμινοξέα, κυρίως λυσίνες, και περιέχει 10 κυστεΐνες. Οι 28 λυσίνες οργανώνονται σε δυο αλληλουχίες στο αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο του μορίου και οι κυστεΐνες σχηματίζουν πέντε δισουλφιδικούς δεσμούς ανάμεσα στις αλυσίδες, οι οποίοι και καθορίζουν την τριτοταγή δομή του μορίου. Έχει αναφερθεί ότι τέσσερις από αυτές παραμένουν αδέσμευτες (Hampton et al, 1992), ενώ σήμερα ισχύει άποψη ότι και οι πέντε συμμετέχουν στη δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών (Kilpeainnen et al, 2000). Η πρωτογενής μορφή της PTN περιέχει επίσης τρεις περιοχές που φέρουν το μοτίβο K-R/K-X-R/K, και υποδηλώνουν πυρηνική εντόπιση (Hampton et al., 1992). Σε συμφωνία με αυτό, μέχρι τώρα υπάρχουν δύο αναφορές που υποστηρίζουν ότι η PTN δεσμεύεται στη νουκλεολίνη (Τake et al., 1994; Said et al., 2005). Η τριτοταγής δομή του μορίου της PTN οργανώνεται σε δυο β-δομές, οι οποίες συνδέονται μεταξύ τους με έναν εύκαμπτο συνδέτη, και κάθε μια από αυτές τις δομές περιέχει τρεις αντιπαράλληλες β-πτυχές. Οι πλούσιες σε λυσίνες καρβοξυτελική και αμινοτελική περιοχές δε σχηματίζουν κάποια ανιχνεύσιμη δομή και έχουν τυχαία διαμόρφωση (Εικόνα Ε.3). Κάθε μια από τις β-δομές περιέχει από μια περιοχή πρόσδεσης στην ηπαρίνη και αυτές οι περιοχές θεωρούνται ότι παρουσιάζουν ομολογία με το μοτίβο της επαναλαμβανόμενης αλληλουχίας της θρομβοσπονδίνης τύπου Ι (throsmbospondin type I repeat, TSR), που εντοπίζεται στο εξωκυττάριο υλικό και σε πρωτεΐνες της κυτταρικής επιφάνειας (Kilpelainen et al, 2000). Ωστόσο, πιο πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι αυτές οι περιοχές της PTN παρουσιάζουν πολύ μικρή αμινοξική ομολογία με το μοτίβο της TSR δομής (Roszmusz et al, 2002). 17

19 Εικόνα Ε.3: Σχηματική αναπαράσταση της τριτοταγούς δομής της πρωτεΐνης της PTN. Οι β-πτυχές αντιπροσωπεύονται από τα βέλη και οι τυχαίες διαμορφώσεις στο αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρα από τους κυλίνδρους. Διακρίνονται επίσης και οι πέντε δισουλφιδικοί δεσμοί. Οι αριθμοί αντιστοιχούν στα αντίστοιχα αμινοξέα της πρωτεΐνης (Papadimitrou et al., 2004). Ε.2.4 Ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της PTN Όσον αφορά στη γονιδιακή ρύθμιση της PTN, λίγα είναι τα στοιχεία που υπάρχουν στη βιβλιογραφία. Εάν κύτταρα BALB/ 3C 3T διεγερθούν με FGF-2, τότε μειώνεται η έκφραση του mrna της PTN (Menremies et al., 1992). Αντίθετα, αν σε κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3 επιδράσει ο αυξητικός παράγοντας των αιμοπεταλίων (PDGF) ή ο FGF-2, τότε αυξάνεται η έκφραση του mrna της PTN (Li et al., 1992). Η έκφραση του mrna της PTN επάγεται και σε ηπατικά κύτταρα από τον αυξητικό παράγοντα των αιμοπεταλίων (PDGF-BB) και την υποξία (Antoine et al, 2005). Η ερευνητική μας ομάδα ανέδειξε την εμπλοκή του μεταγραφικού παράγοντα AP-1 στη μεταγραφική δραστηριότητα του γονιδίου της PTN, στην κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη. Ο FGF-2 και το υπεροξείδιο του 18

20 υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) επάγουν τη μεταγραφή του γονιδίου της PTN μέσω ενεργοποίησης του AP-1, με αποτέλεσμα την επαγωγή του πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης των κυττάρων (Hatziapostolou et al., 2006; Polytarchou et al., 2005). Η δράση του FGF-2 οφείλεται σε επαγωγή της NADPH οξειδάσης και αύξηση της παραγωγής του Η 2 Ο 2, μέσω αλληλεπίδρασης με τον υποδοχέα FGFR1 (Hatziapostolou et al., 2006), ενώ απαιτούνται και οι δύο θέσεις δέσμευσης του ΑΡ-1 (Hatziapostolou et al., 2006; Polytarchou et al., 2005). Επίσης, δείξαμε ότι η ακτινοβόληση με ακτίνες-χ επάγει την έκφραση του γονιδίου της PTN στο in vivo μοντέλο της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας (Polytarchou et al., 2004) Πρόσφατα αποδείχθηκε ότι ο HOXA5, ένας μεταγραφικός παράγοντας που ρυθμίζει την εμβρυική ανάπτυξη, επάγει άμεσα τη μεταγραφή του γονιδίου της PTN, μετά την πρόσδεση του στο αντίστοιχο στοιχείο απόκρισης στη θέση -106 του υποκινητή του γονιδίου (Chen et al, 2005). Το γεγονός αυτό ενισχύει τη θέση της PTN ως μόριο-ρυθμιστή της εμβρυικής ανάπτυξης. Αντιφατικά είναι τα αποτελέσματα όσον αφορά στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης της PTN από το ρετινοϊκό οξύ. Από πειράματα σε κύτταρα Ρ 9 και NT 2 /D 1, τα οποία προέρχονται από τερατοκαρκίνωμα ποντικού και ανθρώπου αντίστοιχα, διατυπώθηκε η άποψη ότι το ρετινοϊκό οξύ επάγει την έκφραση της PTN (Kretschmer et al., 1991), κάτι όμως που δεν επιβεβαιώθηκε σε κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3 (Li et al., 1992). Σε οστεοβλάστες, η έκφραση του γονιδίου της PTN μειώνεται από τη βιταμίνη D3 (Tamura et al., 1994). Αύξηση της έκφρασης του γονιδίου της PTN παρατηρείται μετά από προσθήκη του οφθαλμικού νευροτροφικού παράγοντα (Ciliary Neurotrophic Factor, CTNF) σε αμφιβληστροειδικά μοσχεύματα στον οφθαλμό ποντικού (Roger et al, 2006). Επίσης, έχει δειχθεί ότι η κυκλική AMP επάγει τα επίπεδα της PTN σε ντοπαμινεργικούς νευρώνες, χωρίς όμως να έχει διευκρινιστεί ο ακριβής μηχανισμός (Mourlevat et al., 2005). Σε εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού που τους λείπουν και τα δύο αλληλόμορφα για την PTEN (Phosphatase and Tensin homologue deleted on chromosome 10), η έκφραση της 19

21 PTN επάγεται μέσω του μονοπατιού PTEN-PI3K-AKT (Li et al., 2006). Τέλος, σε ωοθήκες ποντικών, το μονοπάτι των Wnt/β-κατενίνη, αναστέλλει την έκφραση της PTN (Boerboom et al., 2006). E.2.5 Έκφραση του γονιδίου της PTN κατά την εμβρυική ανάπτυξη και την ενήλικη ζωή Η PTN απομονώθηκε το 1989 από εγκέφαλο νεογέννητου αρουραίου (Rauvala, 1989) και από μήτρα βοός (Milner et al., 1989; Li et al., 1990). Η έκφραση του γονιδίου επάγεται κυρίως κατά την όψιμη εμβρυογένεση και τη μετεμβρυϊκή ανάπτυξη (Rauvala, 1989; Li et al, 1990; Vanderwinden et al, 1992; Yeh et al, 1998). Σε παλαιότερες μελέτες έχει βρεθεί ότι το mrna της PTN ανιχνεύεται με in situ υβριδοποίηση κατά τη διάρκεια της εμβρυικής ανάπτυξης στο νευροεξώδερμα και το μεσόδερμα, φθάνοντας το μέγιστο έκφρασης λίγο μετά τη γέννηση (Vanderwinden et al, 1992). Η έκφραση της PTN ξεκινά στο νευρωνικό δίσκο την 8 η εμβρυική μέρα και στην πλευρική επιφάνεια του νευρωνικού αυλού την 9 η. Κατά το διάστημα μεταξύ 11 ης και 13 ης ημέρας περιορίζεται στη ραχιαία κοιλιακή ζώνη και τέλος, κατά την 15 η ημέρα ανευρίσκεται στους κεντρικούς νευρώνες της φαιάς ουσίας (Fan et al., 2000). Το mrna της PTN εκφράζεται και στα πλάγια κέρατα του νωτιαίου μυελού (Fan et al., 2000), καθώς επίσης και στα πρόδρομα νευρωνικά κύτταρα του μεσεγκέφαλου (Jung et al., 2004). Επίσης εκφράζεται στους αναπτυσσόμενους άξονες εγκεφάλου ποντικού κατά τη διάρκεια της όψιμης εμβρυικής, αλλά και της πρώιμης μετεμβρυϊκής ζωής (Rauvala et al, 1994). Στο μέγιστο της έκφρασης της, ανιχνεύεται σε αστροκύτταρα, ολιγοδενδροκύτταρα και σε νευρώνες του νωτιαίου μυελού (Wang et al, 2004). Κατά τη μετεμβρυϊκή ζωή επίμυων, η PTN εκφράζεται κυρίως στον αναπτυσσόμενο φλοιό της παρεγκεφαλίδας και διατηρείται σε υψηλά επίπεδα και κατά την ενήλικη ζωή (Rauvala et al., 1994; Matsumoto et al., 1994; Bloch et al., 1992). Έχει ανευρεθεί σε μεγάλα ποσά στο νεοπάλαιο φλοιό και στο μεσεγκέφαλο 20

22 μυός (Mitsiadis et al., 1995), ενώ πιθανόν εμπλέκεται στις αλληλεπιδράσεις νευρικών κυττάρων-γλοίας κατά την ανάπτυξη του οργανισμού, αφού ανιχνεύεται και στα δύο αυτά είδη κυττάρων (Wanaka et al., 1993). Στο νευρικό σύστημα του ώριμου ατόμου, η PTN εκφράζεται κυρίως στον ιππόκαμπο και σε νευρώνες του φλοιού (Vanderwinden et al., 1992; Wanaka et al., 1993). Μεγάλα ποσοστά έκφρασης της PTN έχουν αναφερθεί επίσης σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες, όπως η νόσος Alzheimer, το σύνδρομο Down (Wisniewski et al., 1996) και η νόσος του Parkinson (Ferrario et al., 2004). Η PTN εκφράζεται και στις νευρομυϊκές συνάψεις. Εντοπίζεται στην επιφάνεια των μυών και πριν την άφιξη των αξόνων στην περιοχή που θα δημιουργηθεί η σύναψη, και πιθανόν παίζει ρόλο στην καθοδήγηση των κώνων αύξησης και τη δημιουργία της σύναψης (Szabat and Rauvala, 1996). Το mrna της PTN έχει ανιχνευτεί σε λεία μυϊκά κύτταρα επίμυος (Milhiet et al, 1998) και σε μυοκαρδιακά κύτταρα ποντικού, ενώ τα επίπεδα του μειώνονται κατά τη μετεμβρυϊκή διαφοροποίηση του μυοκαρδίου (Chen et al, 2004). Το mrna και η πρωτεΐνη PTN ανιχνεύονται στο αναπτυσσόμενο οστό και ανευρίσκονται σε μεγάλες ποσότητες στο χόνδρο και τα χονδροκύτταρα, κυρίως κατά τη διάρκεια της εμβρυικής και πρώιμης μετεμβρυϊκής ζωής, και λιγότερο κατά την ενηλικίωση (Azizan et al., 2000). Έχει ανευρεθεί σε κυτταρικό υλικό που δρα ως υπόστρωμα για το σχηματισμό χόνδρου (Imai et al., 1998), στον οδοντικό πολφό επίμυος (Vanderwinden et al, 1992) και σε οστεοβλάστες βοός (Tezuka et al., 1990). Αυξημένα επίπεδα mrna της PTN παρατηρούνται στις επιφυσιακές πλάκες των οστών κατά την διάρκεια της επιδιόρθωσης τους (Imai et al., 199), ενώ η πρωτεΐνη ανιχνεύεται και κατά τη διάρκεια της επούλωσης του οστού μετά από κατάγματα (Petersen et al., 2004). Επίσης σε οστεοαρθρικούς χόνδρους παρατηρείται υπερέκφραση του mrna της PTN σε σχέση με το φυσιολογικό χόνδρο (Pufe et al., 2006). Κατά την κύηση, η έκφραση της PTN αυξάνεται στο μυομήτριο ενήλικα αρουραίου, ενώ έχει παρατηρηθεί και διαφορική έκφραση του mrna του μορίου 21

23 κατά τη διάρκεια του έμμηνου κύκλου (Milhiet et al., 1998). Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι η PTN βρίσκεται υπό ορμονικό έλεγχο. Το mrna της PTN ανιχνεύεται στα κύτταρα Leydig όρχεων αρουραίου (Vanderwinden et al., 1992), ενώ υπερεκφράζεται στην νόσο του Peyronie και τη νόσο Dupuytren (Qian et al., 2004). Ε.2.6 Αλληλεπιδράσεις και υποδοχείς της PTN Η PTN απομονώθηκε αρχικά ως ένας αυξητικός παράγοντας των νευριτών μετά από έκλουση στήλης ηπαρίνης-σεφαρόζης από 1Μ ΝaCl (Rauvala et al., 1989). Όπως αποδείχθηκε αργότερα, παρόλο που οι άμινο- και καρβοξυτελικές ουρές είναι πλούσιες σε λυσίνη και είναι ισχυρά φορτισμένες, η πρόσδεση της PTN στην ηπαρίνη εξαρτάται από τις TSR περιοχές εντός των β-πτυχωτών δομών. Όπως αποδείχθηκε με φασματοσκοπία μαγνητικού συντονισμού (NMR), η ηπαρίνη σε διάλυμα δεσμεύεται και στις δύο β-περιοχές (Kilpelainen et al, 2000). Επίσης, παρόλο που οι τελικές, πλούσιες σε λυσίνη περιοχές περιέχουν αλληλουχίες πρόσδεσης της ηπαρίνης, οι τελευταίες δεν απαιτούνται για την υψηλής συγγένειας πρόσδεση της PTN στην ηπαρίνη και τη θειική ηπαράνη (Raulo et al, 2005) και αλλαγές στις αλληλουχίες των πλούσιων σε λυσίνη τελικών περιοχών του μορίου, δεν επηρεάζουν την πρόσδεση (Munoz et al, 2004). Η μεγάλη συγγένεια της ηπαρίνης για την PTN χρησιμοποιείται ως αρχή απομόνωσης του μορίου από το μέσο καλλιέργειας κυττάρων και τα βιολογικά υγρά (Soulie et al, 2002). Η υψηλή συγγένεια πρόσδεσης της ηπαρίνης στην PTN οδήγησε στο σκεπτικό ότι πιθανά να δεσμεύεται σε πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης παρούσες στην κυτταρική επιφάνεια και το εξωκυτταρικό υλικό. Πράγματι, η PTN αποδείχτηκε να αλληλεπιδρά με τις παραπάνω πρωτεογλυκάνες του εξωκυττάριου τμήματος σε διάφορες κυτταρικές σειρές (Papadimitriou et al., 2000;2001; Polycratis et al., 2004; Soulie et al., 2002; Bernard-Pierrot et al., 2004; Vacherot et al., 1999). Στη συνέχεια, έγιναν αναφορές σχετικά με την πρόσδεση της PTN, με 22

24 χαμηλότερη όμως συγγένεια, με διάφορες άλλες γλυκοζαμινογλυκάνες θειικής δερματάνης και θειικής χονδροϊτίνης Α, αλλά όχι με γλυκοζαμινογλυκάνες θειικής χονδροϊτίνης C και θειικής κερατάνης (Vacherot et al., 1999). Η θειική δερματάνη και η θειική χονδροϊτίνη είναι πρωτεογλυκάνες, των οποίων η γλυκοζαμινογλυκανική πλευρική αλυσίδα αποτελείται από επαναλαμβανόμενες δισακχαριδικές μονάδες -GlcUA-GalNAc- (D-γλυκουρονικό οξυ-) και IdoUA- GalNAc- (L-ιδουρονικό οξυ-) αντίστοιχα, εμφανίζουν πολλά και διαφορετικά ποσοστά θειικών και μπορούν να υπάρξουν και ως συμπολυμερή (CS/DS) (Silbert and Sugumaran, 2002; Sugahara et al., 2003). Οι τελευταίες είναι σημαντικές για την πρόσδεση αυξητικών παραγόντων, τη γένεση των νευριτών και την ανάπτυξη του εγκεφάλου (Sugahara et al., 2003; Bandtlow and Zimmermann, 2000). Έχει αποδειχθεί ότι η PTN επάγει την προέκταση των νευριτών μέσω αλληλεπιδράσεων με την πλευρική αλυσίδα θειικής ηπαράνης της συνδεκάνης-3 (Kinnunen et al., 1996), ενώ άλλες μελέτες δείχνουν ότι η PTN αλληλεπιδρά με ενδογενείς και εξωγενείς αλυσίδες θειικής χονδροϊτίνης και δερματάνης (Deepa et al, 2002; Bao et al., 2004; Nandini et al., 2004; 2005; Bao et al., 2005). Έχει αναφερθεί ότι η πρόσδεση της PTN στην ηπαρίνη ευνοείται όταν η PTN είναι προσκολλημένη στον πυθμένα των τρυβλίων επώασης (Mitsiadis et al, 1995). Και εδώ παίζουν ρόλο οι γλυκοζαμινογλυκάνες της κυτταρικής επιφάνειας, αφού έτσι υπάρχει πιο ισχυρή πρόσδεση τους με την PTN, με αποτέλεσμα να επάγεται ο πολλαπλασιασμός σε αντίθεση με την περίπτωση που η PTN βρίσκεται διαλυμένη στο θρεπτικό μέσο (Papadimitriou et al., 2000). Οι γλυκοζαμινογλυκάνες φαίνεται να προστατεύουν τη PTN από την πρωτεολυτική δράση της πλασμίνης επί του πεπτιδικού δεσμού Κ59-Κ60, o οποίος βρίσκεται μεταξύ των δύο β-πτυχωτών δομών αλλά όχι σε άλλες θέσεις (Polykratis et al, 2004), γεγονός που οδηγεί στη σκέψη ότι πιθανόν να είναι υπεύθυνες για την παρουσίαση του μορίου στους ειδικούς υποδοχείς του. Η PTN έχει βρεθεί ότι προσδένεται και στις συνδεκάνες 1 και 3 (Raulo et al, 1994). Η τελευταία, η οποία ονομάζεται και Ν-συνδεκάνη, είναι μια πρωτεΐνη της κυτταρικής επιφάνειας μοριακής μάζας 200 kda που περιέχει αλυσίδες θειικής 23

25 ηπαράνης, με υψηλά ποσοστά σε 2-Ο σουλφωνικά κατάλοιπα ιδουρονικού οξέος, με αποτέλεσμα να προσδένεται εύκολα με την PTN (Kinnunen et al, 1996). H N- συνδεκάνη έχει βρεθεί ότι προσδένει την PTN σε οστεοβλάστες και πρόδρομα οστικά κύτταρα (Imai et al, 1998; Tare et al., 2002). Το mrna για την Ν- συνδεκάνη και την PTN έχει ανευρεθεί και στα πρόδρομα νευρωνικά κύτταρα, επηρεάζοντας την περαιτέρω εξέλιξη τους (Furuta et al, 2004). Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι το Y-P30, ένα πολυπεπτίδιο που παράγεται κατά τη κύηση από τα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος του μητρικού ανοποιητικού συστήματος, μπορεί να εγκλωβίσει μεγάλα μακρομοριακά σύμπλοκα PTN/Nσυνδεκάνης. Αυτό σημαίνει ότι η επαγωγική δράση του Υ-Ρ30 στη προέκταση των νευριτών κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου βασίζεται σε μεγάλο βαθμό στην αλληλεπίδρασή του με το σύμπλοκο PTN/συνδεκάνη (Landgraf et al., 2008). Η PTN έχει βρεθεί να δεσμεύεται στο διαμεμβρανικό υποδοχέα με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (Receptor-like Protein Tyrosine Phosphatase β/ζ, RPTP β/ζ) (Maeda et al., 1996). Η φαινομενική μοριακή μάζα του είναι 250 kda, ενώ οι γλυκοζυλιωμένες του μορφές αναλύονται στα 300 kda. Παρόλο που περιέχει δύο περιοχές με αλληλουχία φωσφατάσης τυροσίνης στο κυτταροπλασματικό τμήμα του, μόνο αυτή που είναι πλησιέστερη στη μεμβράνη παρουσιάζει τέτοια δράση (Krueger and Saito, 1992). Ο RPTPβ/ζ είναι η κύρια πρωτεογλυκάνη θειικής ηπαράνης στο αναπτυσσόμενο νευρικό σύστημα (Canoll et al, 1993; Krueger and Saito, 1992; Levy et al, 1993) και η εξαρτώμενη από το χώρο και τη χρονική στιγμή έκφραση του, υποδεικνύει τον πιθανό του ρόλο στη μορφογένεση και την πλαστικότητα του νευρικού συστήματος (Canoll et al, 1993). Σε in vitro καλλιέργειες, η μετανάστευση των νευριτών που επάγεται από τη PTN, αναστέλλεται εάν χρησιμοποιηθούν αντισώματα έναντι του εξωκυττάριου τμήματος του RPTP β/ζ (Maeda et al., 1998). Ο RPTPβ εκφράζεται σε γλοιοβλαστώματα και νευροβλαστώματα (Goldmann et al, 2000), καθώς επίσης και σε μηνιγγιώματα (Tong et al, 2006). Ωστόσο, τα επίπεδα του υποδοχέα εμφανίζονται μειωμένα σε καρκίνο του ορθού (Yamakawa et al, 1999). Έχει επίσης βρεθεί σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα και διαμεσολαβεί την 24

26 επαγόμενη από PTN μετανάστευση αυτών (Polykratis et al., 2005). Φαίνεται ότι ο RPTP β/ζ παίζει ρόλο στη μορφολογία των κυττάρων Purkinje της παρεγκεφαλίδας και ανιχνεύεται μαζί με την PTN στους δενδρίτες (Tanaka et al. 2007). O RPTPβ/ζ έχει τέσσερεις διαφορετικές ισομορφές: δυο διαμεμβρανικές, μια τρίτη εκκρινόμενη (γνωστή και ως φωσφακάνη) και μια τελευταία γνωστή ως PSI, οι οποίες είναι αποτέλεσμα εναλλακτικής ωρίμανσης του μετάγραφου (Barnea et al, 1994; Maurel et al, 1994; Garwood et al., 2003). Οι διαμεμβρανικές μορφές του υποδοχέα εκφράζονται κυρίως στους νευρώνες του φλοιού (Canoll et al, 1996). Η έκφραση της φωσφακάνης, στην οποία λείπει η διαμεμβρανική και η κυτταροπλασματική περιοχή (Krueger and Saito, 1992; Maurel et al, 1994; Barnea et al, 1994) επάγεται κατά την εμβρυική ανάπτυξη του νευρικού συστήματος (Sakurai et al, 1997). Επίσης, μετεμβρυϊκά εκφράζεται από τα κύτταρα της γλοίας ανάλογα με τη φάση ανάπτυξης του νευρικού συστήματος και συνεκφράζεται με διάφορα μόρια προσκόλλησης (Canoll et al, 1993; Milev et al, 1994; Grumet et al, 1994). Οι δύο άλλες μορφές αναφέρονται ως long και short μορφές. Η τελευταία διαφέρει από την πρώτη στο ότι της λείπει ένα μεγάλο τμήμα της εξωκυττάριας περιοχής πλησίον της μεμβράνης (Levy et al, 1993). Τέλος, η PSI (Phophacan Short Isoform) αντιστοιχεί στο εξωκυττάριο τμήμα της short μορφής του υποδοχέα. Όπως και η φωσφακάνη, επάγει την προέκταση των νευριτών του φλοιού (Garwood et al, 2003), ενώ μετεμβρυϊκά περιορίζεται στους νευρώνες και όχι στα κύτταρα της γλοίας, όπως συμβαίνει με τη φωσφακάνη (Heck et al, 2005). Η φωσφακάνη και η long μορφή του υποδοχέα είναι ισχυρά γλυκοζυλιωμένες πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης, ενώ το PSI και η short μορφή είναι γλυκοπρωτεΐνες (Garwood et al, 2003). Φαίνεται ότι στους οστεοβλάστες, σε αντίθεση με τα νευρικά κύτταρα, εκφράζεται κυρίως η μικρή διαμεμβρανική ισομορφή του RPTP και παίζει καθοριστικό ρόλο στη μορφογένεση των οστών σε ποντίκια (Schinke et al., 2007). Εκτός από τις ισομορφές του RPTPβ/ζ που εκφράζονται φυσικά, κάτω από φυσιολογικές συνθήκες ο RPTPβ/ζ πρωτεολύεται από τη μεταλλοπρωτεϊνάση ΜΜΡ-9, το μετατρεπτικό ένζυμο του TNF-α, την 25

27 πρεσενιλίνη/γ-σεκρετάση και την πλασμίνη (Chow et al., 2008), δίνοντας εκκρινόμενες, διαμεμβρανικές ή κυτταροπλασματικές μορφές, των οποίων οι βιολογικές δράσεις δεν έχουν ταυτοποιηθεί. Φαίνεται ότι η πρωτεόλυση του RPTPβ/ζ από την πλασμίνη εμπλέκεται στις λειτουργικές διαδικασίες της ανάπτυξης των συνάψεων και του εγκεφάλου (Chow et al., 2008). Η πρόσδεση της PTN στον RPTP β/ζ γίνεται μέσω των αλυσίδων θειικής χονδροϊτίνης και αναστολή αυτής έχει ως αποτέλεσμα τη δραστική μείωση της συγγένειας πρόσδεσης και της μεταγωγής σήματος από αυτόν τον υποδοχέα (Maeda et al, 1996; Maeda et al, 1998). Εικόνα Ε.4 : Οι διαμεμβρανικές μορφές του υποδοχέα RPTP β/ζ και η εκκρινόμενη μορφή γνωστή και ως φωσφακάνη. Ολες οι ισομορφές περιλαμβάνουν την περιοχή που προσομοιάζει την αλληλουχία καρβονικής ανυδράσης (κατάλοιπα ) και την περιοχή τύπου ΙΙΙ ινονεκτίνης (κατάλοιπα ). Οι διαμεμβρανικές ισομορφές έχουν μία διαμεμβρανική περιοχή που ακολουθείται από δύο κυτταροπλασματικές περιοχές με δράση φωσφατάσης τυροσίνης (Garwood et al, 2003). 26

28 Ένας άλλος χαρακτηρισμένος υποδοχέας της PTN έχει δράση κινάσης τυροσίνης και ονομάζεται κινάση του αναπλαστικού λεμφώματος (Anaplastic Lymphoma Kinase, ALK). Πρόκειται για μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη με μοριακό βάρος 200 kda. O ALK ανακαλύφθηκε ως τμήμα μιας πρωτεΐνης σύντηξης με δράση κινάσης τυροσίνης, της νουκλεοφωσμίνης-alk, η οποία σχετίζεται με το αναπλαστικό λέμφωμα των μεγακαρυοκυττάρων (Morris et al, 1994). Έχουν βρεθεί δύο μορφές του ALK, με μοριακές μάζες 220 και 140 kda (Lutz et al, 2005; Iwahara et al, 1997; Morris et al, 1997). Η 140 kda μορφή προέρχεται από τμήση της 220 kda μορφής (Lutz et al, 2005). Η τελευταία έχει την τυπική δομή υποδοχέα με δράση κινάσης τυροσίνης και αποτελείται από μια μεγάλη εξωκυττάρια περιοχή, μια λιπόφιλη διαμεμβρανική περιοχή και ένα κυτταροπλασματικό τμήμα με δράση κινάσης τυροσίνης (Iwahara et al, 1997; Morris et al, 1997). Το γονίδιο για τον ALK εκφράζεται στο νευρικό σύστημα (Pulford et al, 1997), σε καλλιέργειες ινοβλαστών, ενδοθηλιακών κυττάρων, καθώς επίσης και σε καρκινικές κυτταρικές σειρές παγκρέατος και μαστού (Stoica et al, 2001; 2002; Perez-Pinera et al., 2007b), μελανώματος (Dirks et al, 2002), νευροβλαστώματος (Lamant et al., 2000;), γλοιοβλαστώματος (Powers et al, 2002) και σε non- Hodgkin λεμφώματα (Delsol et al, 1997). Η PTN προσδένεται στην εξωκυτταρική περιοχή του ALK σε διάφορους τύπους κυττάρων (Stoica et al., 2002) με μεγάλη συγγένεια, ενώ αντισώματα έναντι του συγκεκριμένου τμήματος του υποδοχέα ή για την PΤΝ παρεμποδίζουν την πρόσδεση και τη μεταγωγή σήματος (Stoica et al, 2001; Bowden et al, 2002; Powers et al, 2002; Lu et al, 2005). Η δέσμευση είναι ειδική και πιθανότατα πραγματοποιείται μέσω του καρβοξυτελικού άκρου της PTN, και πιο συγκεκριμένα με το τμήμα που περιλαμβάνει τα αμινοξέα (Bernard-Pierrot et al., 2002). Γενικά, υπάρχουν αντικρουόμενες πληροφορίες σχετικά με την άμεση αλληλεπίδραση και ενεργοποίηση της ALK από την PTN (Miyake et al., 2002; Dircks et al., 2002; Moog-Lutz et al., 2005; Motegi et al., 2004; Duyster et al., 2001; Mourali et al., 2006; Mathivet et al., 2007). Μία πιθανή εκδοχή είναι η διαφορετική ενεργοποίηση της ALK από τις δύο φυσικές μορφές 27

29 της PTN (Lu et al., 2005) ή η έμμεση ενεργοποίηση της ALK από τη PTN, μέσω της PTN- επαγώμενης απενεργοποίησης του υποδοχέα της RPTPβ/ζ ( Perez-Pinera P. et al., 2007). H PTN προσδένεται και στη νουκλεολίνη, η οποία πιθανά τη μεταφέρει μεταξύ κυτταροπλάσματος και πυρήνα (Said et al, 2005). Η νουκλεολίνη είναι μια πρωτεΐνη με μοριακή μάζα 100 kda, η οποία εμπλέκεται άμεσα ή έμμεσα σε πολλές διαδικασίες, όπως η κυτταροκίνηση, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η μεταφορά συστατικών του ριβοσώματος μεταξύ κυτταροπλάσματος και πυρήνα, η μεταγωγή σήματος και η αποσυμπύκνωση της χρωματίνης (Tuteja and Tuteja, 1998; Ginisty et al, 1999). Εντοπίζεται στον πυρήνα, στο κυτταρόπλασμα και στην επιφάνεια σε κάποιους τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των ενδοθηλιακών (Christian et al., 2003) και καρκινικών κυττάρων (Destouches et al., 2008; Ayelet et al., 2008; Joo et al., 2005). Το ψευδοπεπτίδιο HB-19, ένας ειδικός ανταγωνιστής που προσδένεται στο C-άκρο της νουκλεολίνης, φαίνεται να αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και την αγγειογένεση σε ποικίλα in vitro και in vivo πειραματικά μοντέλα (Destouches et al., 2008). Φαίνεται ότι η νουκλεολίνη της κυτταρικής επιφάνειας βοηθά στην είσοδο της PTN στο εσωτερικό του κυττάρου, ενώ οι πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης και θειικής χονδροϊτίνης υποβοηθούν την αλληλεπίδραση της PTN με τη νουκλεολίνη (Said et al, 2005). Τέλος, πρόσφατα αποτελέσματα της ερευνητικής μας ομάδας δείχνουν ότι η ιντεγκρίνη α ν β 3 αποτελεί λειτουργικό υποδοχέα της PTN και παίζει σημαντικό ρόλο στην PTN-επαγόμενη κυτταρική μετανάστευση μέσω του RPTPβ/ζ (Mikelis et al., 2009). Η ιντεγκρίνη α ν β 3 είναι μία διαμεμβρανική ετεροδιμερής γλυκοπρωτεΐνη που εκφράζεται σχεδόν σε όλα τα κύτταρα που προέρχονται από το μεσέγχυμα και σε διάφορους τύπους κυττάρων των αγγείων, όπως ενδοθηλιακά κύτταρα, λεία μυϊκά, ινοβλάστες, αιμοπετάλια κ.τ.λ. Φαίνετα να έχει τη πιο σημαντική de novo έκφραση στην επιφάνεια των αγγειογενετικών ενδοθηλιακών κυττάρων και να εκφράζεται ευρέως κατά την εμβρυογένεση, ενώ στο ενήλικο 28

30 άτομο, η έκφρασή της περιορίζεται κυρίως στα αγγειογενετικά ενδοθηλιακά και λεία μυϊκά κύτταρα (Κumar, 2003). Ε.2.7 Μεταγωγή σήματος από την ΡΤΝ Tο μονοπάτι μεταγωγής σήματος που ενεργοποιείται μετά από πρόσδεση της PTN στον RPTPβ/ζ δεν έχει διασαφηνιστεί πλήρως. Πρόσδεση της PTN στον RPTPβ/ζ έχει ως αποτέλεσμα τη μεταγωγή σήματος μέσω διαφόρων μορίων, όπως η β-κατενίνη (Meng et al., 2000), η πρωτεϊνική κινάση C (PKC) (Pariser et al., 2005), η β-αντουσίνη (Pariser et al., 2005), η κοντακτίνη (Peles et al., 1995) και δύο μέλη της οικογένειας των κινασών Src, η Fyn (Pariser et al., 2005b) και c-src (Polykratis et al., 2005). Στα κύτταρα U373, η επαγώμενη από τη ΡΤΝ αύξηση της φωσφορυλίωσης των διάφορων υποστρωμάτων του RPTPβ/ζ είναι απαραίτητη για το φαινόμενο epithelial-mesenchymal transition ή ΕΜΤ (Pinera et al, 2006). Υπάρχουν αντικρουόμενα αποτελέσματα ως προς το εάν δέσμευση της PTN στον RPTPβ/ζ οδηγεί σε ενεργοποίηση ή απενεργοποίηση της δράσης φωσφατάσης τυροσίνης του υποδοχέα. Για παράδειγμα, στην κυτταρική σειρά HeLA, η PTN οδηγεί σε απενεργοποίηση της δράσης φωσφατάσης του υποδοχέα και ενεργοποίηση της PKC. Η PKC φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη β-αντουσίνη στη σερίνη των θέσεων 713 και 726. Η φωσφορυλιωμένη β-αντουσίνη παρουσιάζει μειωμένη συγγένεια για τα ινίδια της ακτίνης. Τελικό αποτέλεσμα είναι η αποδέσμευση της β-αντουσίνης από τα ινίδια της ακτίνης, αποσταθεροποίηση του κυτταρικού σκελετού και συγκεκριμένα των ινιδίων ακτίνης και των συνδέσεων σπεκτρίνης-ακτίνης και αποικοδόμηση και ανακατανομή της β-αντουσίνης σε διαφορετικά κυτταρικά διαμερίσματα. Το συγκεκριμένο μονοπάτι μεταγωγής σήματος ερμηνεύει την παρατηρούμενη αποδιοργάνωση και αστάθεια του κυτταροσκελετού σε καρκινικά κύτταρα, στα οποία είναι συνεχώς ενεργό το γονίδιο της PTN (Pariser et al., 2005). Επίσης, δείχθηκε ότι η PTN απενεργοποιεί τον RPTPβ/ζ μέσω ολιγοδιμερισμού και επάγει τη φωσφορυλίωση σε τυροσίνη του Git1 (G protein-coupled receptor kinase-interactor 1) και της Magi1 (Membrane associated guanylate kinase 1) (Fukada et al., 2006). Από την άλλη 29

31 πλευρά, στα κύτταρα HUVEC, η PTN ενεργοποιεί τη δράση φωσφατάσης του υποδοχέα με αποτέλεσμα την αποφωσφορυλίωση της κινάσης Src στη θέση Tyr527 που οδηγεί σε ενεργοποίησή της και τη φωσφορυλίωση της κινάσης εστιακής προσκόλλησης FAK, της PI3-K και των ERK1/2. Το μονοπάτι αυτό οδηγεί σε επαγωγή της διαφοροποίησης και της μετανάστευσης ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Αποσιώπηση του υποδοχέα με χρήση παρεμβαλλόμενου RNA, είχε ως αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της μεταγωγής σήματος και της μετανάστευσης των κυττάρων (Polykratis et al., 2005). Πρόσφατα επίσης αναφέρθηκε ότι ο RPTPβ/ζ παίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της μνήμης, τροποποιώντας τη δράση της Rho GTPάσης διαμέσου αποφοσφωρυλίωσης της RhoGAP (Tamura et al., 2006). Επιπλέον, η PTN αυξάνει τη φωσφορυλίωση σε τυροσίνες των υποστρωμάτων του RPTPβ/ζ, όπως ο G protein-coupled receptor kinase-interactor 1 και η μεμβρανική γουανυλική κινάση, WW and PDZ domain containing 1, μέσω ολιγομερισμού και απενεργοποίησης του RPTPβ/ζ (Fukada et al., 2006). Τέλος, μελέτες έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση του ALK εξαρτάται από το σηματοδοτικό μονοπάτι PTN/RPTPβ/ζ και όχι από την απ ευθείας αλληλεπίδραση της κινάσης με τον αυξητικό παράγοντα. Σε μη διεγερμένα κύτταρα από PTN, o RPTPβ/ζ αποφωσφορυλιώνει του ALK στις θέσεις αυτοφωσφορυλιωσής της, οπότε απενεργοποιείται. Όταν τα κύτταρα διεγερθούν με PTN, τότε απενεργοποιείται ο RPTPβ/ζ, με αποτέλεσμα να αυξάνονται τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του ALK (Perez-Pinera et al., 2007). Όσον αφορά στη μεταγωγή σήματος μετά από πρόσδεση της PTN στον υποδοχέα της ALK, έχει δειχθεί ότι επάγεται η φωσφορυλίωση των IRS-1 και Shc, η φωσφολιπάση C-γ και η PI3-K (Stoica et al., 2001). Αναστολή της έκφρασης του ALK σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος ανέστειλε και τη φωσφορυλίωση της αντι-αποπτωτικής πρωτεΐνης Akt (Powers et al., 2002), ενώ σε ινοβλάστες το αντιαποπτωτικό σήμα της PTN διαμεσολαβείται από τις MAP κινάσες (Bowden et al., 2002). Σε κακοήθη Τ λεμφοκύτταρα, η ενεργοποίηση του ALK φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη STAT-3 με μη εξαρτώμενο από την κινάση Jak3 τρόπο (Marzec et al., 2005). 30

32 Όσον αφορά στην πρόσδεση της PTN στην Ν-συνδεκάνη, αποδείχθηκε ότι ενεργοποιείται το μονοπάτι της κινάσης Src (Kinnunen et al., 1998; Rauvala et al., 2000). Εικόνα Ε.5 : Ο υποδοχέας RPTP β/ζ διατηρεί σταθερά τα επίπεδα φωσφορυλίωσης πολλών κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών με ποικίλες δράσεις. Η δέσμευση της PTN στην RPTP β/ζ διαταράσσει την ισορροπία φωσφορυλίωσης/ αποφωσφορυλίωσης με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση διαφορετικών σηματοδοτικών μονοπατιών στο κύτταρο (Perez-Pinera et al., 2007). Τελευταίες μελέτες ανέδειξαν την ιντεγκρίνη α ν β 3 ως μόριο-κλειδί που καθορίζει τη θετική ή αρνητική επίδραση της PTN στη κυτταρική μετανάστευση. Σχετικά με το σηματοδοτικό μονοπάτι της PTN και της ιντεγκρίνης α ν β 3, γνωρίζουμε ότι η τελευταία αλληλεπιδρά επίσης με το RPTPβ/ζ, οδηγώντας στην ενεργοποίηση της c-src και την επαγωγή της κυτταρικής μετανάστευσης. 31

33 Εκτός από τα αποτελέσματα που αφορούν στη μεταγωγή σήματος μετά τη δέσμευση της PTN στους χαρακτηρισμένους υποδοχείς της, υπάρχουν και δεδομένα για ενεργοποίηση μορίων μεταγωγής σήματος, χωρίς να είναι γνωστός ο εμπλεκόμενος υποδοχέας. Για παράδειγμα, αναστολή της έκφρασης της PTN έχει ως αποτέλεσμα την αποφωσφορυλίωση της AKT και της GSK-3β (Li et al., 2006). Στο χολοστεάτωμα, η PTN εμπλέκεται στην παθογένεια της νόσου και θεωρείται ότι στο σηματοδοτικό μονοπάτι συμμετέχουν οι PI3-K, MAPK και η Adenosine Kinase (Κim, 2004). Eπίσης, μελέτες με ποντίκια που δεν εκφράζουν την ΡΤΝ (PTN deficient mice), έδειξαν ότι ρυθμίζει το σύστημα ρενίνης-αγγειοτενσίνης (Herradon et al., 2004) και τη βιοσύνθεση των κατεχολαμινών (Ezquerra et al., 2004). H PTN αναστέλλει τη λιπογένεση μέσω του μονοπατιού PI3-K/AKT/GSK- 3β/β-κατενίνη, το οποίο επικοινωνεί με το μονοπάτι Wnt/Fz/GSK-3β/β-κατενίνη (Gu et al., 2007). Τέλος, τo NO φαίνεται να παίζει ρόλο στο μονοπάτι μεταγωγής σήματος, αφού αναστολή του σχηματισμού του οδηγεί σε μείωση της μεταναστευτικής ικανότητας των κυττάρων EPCs και HUVEC (Heiss et al., 2007). Ε.2.8 Βιολογικές δράσεις της PTN Ε Ρόλος της PTN στην ανάπτυξη Η πρώτη αναφερθείσα δράση της PTN είναι η ικανότητα της να επάγει την προέκταση νευριτών σε νευρικά κύτταρα (Rauvala et al., 1989). Παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση και οργάνωση του εγκεφάλου (Rauvala et al., 1994). Έχει συσχετιστεί με την αναστολή του πολλαπλασιασμού των πολυδύναμων κυττάρων του μετωπιαίου φλοιού και την επαγωγή της διαφοροποίησης τους, ενώ φαίνεται να αντισταθμίζει τη μιτογόνο δράση του FGF- 2 στα κύτταρα αυτά (Hienola et al., 2004). Στο νευρικό σύστημα του ενήλικα εκφράζεται από αστροκύτταρα, μακροφάγα και ενδοθηλιακά κύτταρα μετά από τραυματισμό, υποδεικνύοντας την εμπλοκή της στην ανάπλαση των τραυματισμένων ιστών (Yeh et al., 1998; Blondet et al., 2005; Wang et al., 2004). H PTN διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη της μνήμης, καθώς ρυθμίζει το κατώφλιο επίπεδο της μακροχρόνιας ρύθμισης (Long-Term Potentiation, LTP) 32

34 των νευρώνων της C1 περιοχής του ιππόκαμπου. Σε μύες στους οποίους έχει απαλειφθεί το γονίδιο της PTN, εμφανίζονται σημαντικά χαμηλότερα LTP, φαινόμενο το οποίο αναστρέφεται μετά από εξωγενή χορήγηση PTN (Amet et al., 2001). Επιπλέον, φαίνεται να συμμετέχει στη μορφογένεση των κυττάρων Purkinje κατά τη διάρκεια ανάπτυξης της παρεγκεφαλίδας (Tanaka, et al., 2003) και στη νευρομυική σύναψη, αφού σε μυϊκά κύτταρα Xenopus επάγει τη συσσώρευση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης στην περιοχή όπου παρατηρείται η σύνδεση (Peng et al., 1995; Zhou et al., 1997). Τέλος, η PTN αποτρέπει τη τοξικότητα που επάγεται από τη κοκαΐνη στα κύτταρα NG και PC12, υποδηλώνοντας ότι η υπερέκφρασή της σε διαφορετικές περιοχές του εγκεφάλου μετά από απόκριση σε κατάχρηση ναρκωτικών ουσιών μπορεί να σχετίζεται με την αναστολή της τοξικότητας in vivo (Gramage et al., 2008). H PTN συμμετέχει επίσης στη διαδικασία της σπερματογένεσης. Όταν εμβρυικά κύτταρα μυών επιμολυνθούν με ανενεργές μορφές του μορίου, αναπτύσσονται μη γόνιμοι χιμαιρικοί μύες που φέρουν ατροφικούς όρχεις και παρουσιάζουν μεγάλο ποσοστό απόπτωσης των σπερματοζωαρίων (Zhang et al., 1999). Θηλυκά ποντίκια που δεν εκφράζουν PTN και Midkine παρουσιάζουν μειωμένη περίοδο οίστρου και τα μισά από αυτά εμφανίζουν ανωμαλίες στην ανατομία του κόλπου και στειρότητα (Muramatsu et al., 2006). Επιπρόσθετα, ρυθμίζει τη δράση της πρωτεΐνης των οστών (Bone Morphogenetic Protein, BMP) (Sato et al., 2002) και επάγει τη χονδρογένεση στα αναπτυσσόμενα άκρα της όρνιθας (Dreyfus et al., 1998), ενώ δύναται να επάγει και τη μετανάστευση των οστεοβλαστών (Imai et al., 1998). Έρευνες έδειξαν την ανασταλτική δράση της ΡΤΝ μέσω του μονοπατιού PTN/PI3K/Akt/GSK-3K/β-catenin, στο μηχανισμό της λιπογένεσης (Gu et al. 2007). Έχει βρεθεί ότι τα επίπεδα έκφρασης της PTN σε υποξικά κύτταρα του μυοκαρδίου είναι αυξημένα. Επίσης φαίνεται να επάγει στα ίδια κύτταρα την 33

35 παραγωγή κασπασών, οδηγώντας τα κύτταρα σε απόπτωση, μέσω αναστολής της δράσης της κινάσης ΑΚΤ/ΡΚΒ (Li et al., 2007). Τέλος, φαίνεται να συμμετέχει στη λειτουργία του αγγειακού συστήματος, καθώς αποτελεί ρυθμιστή του συστήματος ρενίνης-αγγειοτενσίνης. Σε αορτή από μύες στους οποίους έχει απαλειφθεί το γονίδιο της PTN, παρατηρoύνται πολύ μικρότερα επίπεδα του mrna του ενζύμου μετατροπής της αγγειοτενσίνης (Angiotensin Converting enzyme, ACE). Αντίθετα, παρατηρείται πολύ μεγάλη αύξηση στα ώριμα μετάγραφα των υποδοχέων της αγγειοτενσίνης ΙΙ, τύπου 1 και 2 (Herradon et al., 2004). Ε PTN και κυτταρικός πολλαπλασιασμός Έχει αποδειχθεί ότι η PTN επάγει τον πολλαπλασιασμό σε ποικιλία τύπων κυττάρων, όπως ενδοθηλιακά (Courty et al., 1991; Papadimitriou et al., 2000), επιθηλιακά (Fang et al., 1992; Vacherot et al., 1999), ινοβλάστες (Τakamatsu et al., 1992; Fang et al., 1992), λεία μυϊκά κύτταρα (Fabri et al., 1992), κερατινοκύτταρα (Florin et al., 2005) και ηπατικά κύτταρα (Antoine et al., 2005). Τα αποτελέσματα σχετικά με τη μιτογόνο δράση της PTN αμφισβητήθηκαν από πολλές ερευνητικές ομάδες. Ειδικότερα, διατυπώθηκε η άποψη ότι η δράση αυτή πιθανά να οφείλεται σε αυξητικούς παράγοντες που επιμόλυναν την PTN κατά τη διάρκεια απομόνωσης της (Hampton, et al., 1992; Raulo et al., 1992). Η χρήση αντισώματος έναντι του FGF-2, σε καλλιέργειες ενδοθηλιακών κυττάρων, δεν ανέστειλε τη μιτογόνο δράση της PTN, υποδεικνύοντας ότι οι δύο αυξητικοί παράγοντες έχουν ανεξάρτητη δράση (Souttou et al., 1997). Παρόλα αυτά, τα αποτελέσματα σχετικά με τη μιτογόνο δράση της PTN είναι αντιφατικά, δεδομένου ότι εξαρτάται από το είδος της PTN που χρησιμοποιείται, το σύστημα έκφρασης και τον τύπο του κυττάρου που μελετάται. Αντίθετα, είναι γενικά αποδεκτό ότι υπάρχουν διάφορες μορφές του μορίου, που εξαρτώνται από την επίδραση των εκάστοτε συστατικών του μικροπεριβάλλοντος των κυττάρων και ασκούν ποικιλία δράσεων μέσω διαφορετικών υποδοχέων (Szabat et al., 1996; Souttou et al., 1997; Polykratis et al., 2004; Lu et al., 2005). 34

36 Ε PTN και μετανάστευση Η PTN επάγει τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων (Papadimitriou et al., 2001; Polykratis et al., 2005) με παραπλήσια αποτελεσματικότητα με τους αυξητικούς παράγοντες bfgf και VEGF (Souttou et al., 2001; Li et al., 2004), ενώ έχει διατυπωθεί και η ανασταλτική δράση της PTN έναντι της επαγόμενης από VEGF 165 μετανάστευσης και πολλαπλασιασμού (Heroult et al., 2004; Kokolakis et al., 2006). Οι διαμεμβρανικές μορφές της RPTPβ/ζ επίσης εκφράζονται στους νευρώνες που μεταναστεύουν, ενώ η επαγόμενη από PTN μετανάστευση των νευρώνων αναστέλλεται είτε με αντίσωμα έναντι της εξωκυτταρικής περιοχής του RPTPβ/ζ, είτε με το ορθοβαναδικό νάτριο, που είναι αναστολέας φωσφατασών τυροσίνης (Maeda et al., 1998). Η PTN επάγει τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων και τον σχηματισμό αυλών σε υπόστρωμα matrigel μέσω πρόσδεσης στον RPTPβ/ζ και ενεργοποίησης των Src, FAK, PI3K και Erk1/2 (Polykratis et al., 2005). Ακόμα έχει προταθεί πως η επαγόμενη από υπεροξείδιο, εξαρτώμενη από τον AP-1 θετική ρύθμιση του ανθρώπινου γονιδίου της PTN, οδηγεί σε αυξημένη μετανάστευση και πολλαπλασιασμό των LNCaP καρκινικών κυττάρων (Polytarchou et al., 2005). Η PTN διεγείρει τη χημειοτακτική μετανάστευση κυττάρων γλοιώματος in vitro, ρυθμίζει θετικά την έκφραση του RPTPβ/ζ, και σε καρκινικά αστροκύτταρα πιθανά δημιουργεί αυτοκρινή βρόγχο, ο οποίος είναι σημαντικός για τη μεταναστευτική διαδικασία (Ulbricht et al., 2003; Muller et al., 2004). Ενεργοποίηση του υποδοχέα FGFR από τον FGF2 αυξητικό παράγοντα σε LNCaP κύτταρα, οδήγησε σε αυξημένη έκφραση της PTN και τελικά αυξημένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μετανάστευση. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν τον διαμεσολαβητικό ρόλο της PTN στις βιολογικές δράσεις του FGF2 (Hatziapostolou et al., 2006). Έχει προταθεί πως η υπερέκφραση της PTN και του RPTPβ/ζ σε ανθρώπινα αστροκυτταρώματα, δημιουργούν αυτοκρινή βρόγχο δράσης, ο οποίος είναι σημαντικός για τη μετανάστευση των γλοιωματικών κυττάρων, ενώ η επαγόμενη από PTN μετανάστευση ανθρώπινων 35

37 κυττάρων γλοιώματος μειώνεται κατά % όταν καταστέλλεται η έκφραση του RPTPβ/ζ (Ulbricht et al., 2003). Επίσης, έχει την ικανότητα να προάγει την προσκόλληση, τη μετανάστευση, την επέκταση και τη διαφοροποίηση των πρόδρομων οστικών κυττάρων στον άνθρωπο. Το γεγονός αυτό παρέχει την προοπτική να αναπτυχθούν θεραπείες που να χρησιμοποιούν τη PTN στον de novo σχηματισμό οστών για σκελετικές επιδιορθώσεις, κάτι που μέχρι στιγμής δεν έχει επιτευχθεί με τη χρήση άλλων αυξητικών παραγόντων ή παραγόντων διαφοροποίησης (Yang et al., 2003). H PTN επάγει τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό χονδροκυττάρων και ίσως να εμπλέκεται στη συσσωμάτωση και τον πολλαπλασιασμό χονδροκυττάρων στην οστεοαρθρίτιδα (Pufe et al., 2007). Τα πεπτίδια της PTN, ΗΔ1-21 και ΗΔ επάγουν την in vivo αγγειογένεση και την in vitro μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, καθώς επίσης και το σχηματισμό αυλών σε υπόστρωμα matrigel (Papadimitriou et al., 2001). Πρόσφατα αναφέρθηκε πρωτεολυτική διάσπαση της PTN από την MMP-2. Από την πρωτεόλυση αυτή, το τμήμα της PTN που αντιστοιχεί στα αμινοξέα 9-59 προκαλεί αύξηση του επαγόμενου από PTN κυτταρικού πολλαπλασιασμού, ενώ το τμήμα που αντιστοιχεί στα αμινοξέα φέρει ανταγωνιστικές δράσεις και αναστέλλει την επαγόμενη από PTN μετανάστευση και κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Dean et al., 2007). Ε PTN και αγγειογένεση Ένας πιθανός ρόλος της PTN στη φυσιολογική αγγειογένεση προτάθηκε όταν ανιχνεύτηκε το mrna και απομονώθηκε η πρωτεΐνη της από αγγειοβριθείς ιστούς, όπως είναι η μήτρα βοός και η μήτρα επίμυος (Milner et al., 1989; Vanderwinden et al., 1992). Η αγγειογενετική δράση της PTN έχει διαπιστωθεί σε in vivo συστήματα μελέτης, όπως η χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη εμβρύου όρνιθας (CAM assay) και εμφυτεύματα matrigel σε μυς (Papadimitriou et al., 2000; Bernard-Pierott et al., 2002). Μέχρι σήμερα πολλές είναι οι αναφορές που 36

38 εμπλέκουν τη PTN στον πολλαπλασιασμό (Bohlen et al., 1988, Courty et al., 1991, Papadimitriou et al., 2000, Souttou et al., 2001), τη διαφοροποίηση ενδοθηλιακών κυττάρων (Papadimitriou et al., 2000, Souttou et al., 2001) και το σχηματισμό αυλών σε μια ποικιλία πηκτωμάτων, όπως κολλαγόνου (Laaroubi et al., 1994; Papadimitriou et al., 2001), ινώδους και matrigel (Papadimitriou et al., 2001). Ο αγγειογενετικός ρόλος της PTN μπορεί να σχετίζεται με την παθογένεση του ενδομητρίου, μια ήπια γυναικολογική διαταραχή (Chung et al., 2002). Επιπλέον, η PTN εντοπίζεται σε ενήλικα άτομα σε καταστάσεις φλεγμονής, όπως κατά τη ρευματοειδή αρθρίτιδα (Pufe et al., 2003), όπου μπορεί να δρα ως παρακρινής αγγειογενετικός παράγοντας. Φαίνεται ότι η έκφρασή της σχετίζεται με παθολογικές καταστάσεις του μεσοσπονδύλιου δίσκου. Ανοσοϊστοχημικές μελέτες σε τομές μεσοσπονδύλιων δίσκων έδειξαν ότι η ΡΤΝ εντοπίζεται στα κύτταρα του δίσκου, στα ενδοθηλιακά κύτταρα και στο εξωκυτταρικό υλικό και επάγει την αγγειογένεση του ιστού (Johnson et al., 2007). Τέλος, σημαντικός είναι ο ρόλος της PTN στην επάγομενη από όγκους αγγειογένεση. Ε.2.9 Σχέση δομής-βιολογικής δράσης Η πρώτη αναφερθείσα δράση της PTN είναι η ικανότητα της να επάγει την προέκταση νευριτών (Rauvala et al., 1989), ενώ συμμετέχει και στα γεγονότα που λαμβάνουν χώρα κατά τη διαφοροποίηση και την οργάνωση του εγκεφάλου (Rauvala et al., 1994). Το μεταλλαγμένο πεπτίδιο ΗΔ , παρόλο που δεν παρουσιάζει μιτογόνο δράση, δε διατηρεί την ικανότητα να επάγει τη διαφοροποίηση πρωτογενών νευρώνων (Bernard-Pierrot et al., 2001). Πειράματα με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη PTN που παρουσιάζει έλλειμμα στην καρβοξυτελική περιοχή έδειξαν ότι η συγκεκριμένη περιοχή δεν παίζει ρόλο στην προέκταση νευριτών από εγκεφαλικά κύτταρα εμβρύου αρουραίου, σε αντίθεση με έλλειμμα στην Ν-τελική περιοχή, όπου ανεστάλη σχεδόν πλήρως αυτή η δράση (Innui et al, 1999). 37

39 Έχει αποδειχθεί ότι η PTN επάγει τον πολλαπλασιασμό σε ποικιλία τύπων κυττάρων. Αρχικά, θεωρείτο ότι τα τρία τελευταία αμινοξέα στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης σχετίζονται με τη σταθερότητα και τη μιτογόνο δράση της (Delbe et al, 1995). Αργότερα, αποδείχθηκε ότι και οι δύο τύποι της PTN, PTN 136 και PTN 139, παρουσιάζουν μιτογόνο δράση σε κύτταρα NIH-3T3 και BEL, συνεπώς τα τρία επιπλέον αμινοξέα δεν είναι σημαντικά για αυτή της τη δράση (Pierrot et al, 2001). Tα πεπτίδια της PTN 1-21 και επάγουν τον πολλαπλασιασμό κυττάρων BBC (bovine brain capillaries) και RAME (rat adrenal medulla) αλλά όχι των HUVEC (Papadimitriou et al., 2000), γεγονός που υποδηλώνει ότι ο τύπος των κυττάρων παίζει σημαντικό ρόλο. Επιπλέον, δεν είναι ξεκαθαρισμένο εάν η μιτογόνος δράση της PTN και των πεπτιδίων της είναι άμεση ή οφείλεται στην απελευθέρωση άλλων αυξητικών παραγόντων από τον εξωκυττάριο χώρο, γεγονός που υποδηλώνει ότι το μικροπεριβάλλον των κυττάρων μπορεί να είναι σημαντικό. Έρευνες δείχνουν ότι η MMP-2 διασπά το σύμπλοκο της PTN με τον VEGF, ελευθερώνεται η αμινοτελική περιοχή της PTN και επάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε αντίθεση με το καρβοξυτελικό άκρο, που δρα ως ανταγωνιστής και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και την μετανάστευση των κυττάρων (Dean et al., 2007). Τα αμινοξέα φαίνεται να είναι υπεύθυνα για τη μιτογόνο δράση της PTN στην καρκινική σειρά CHO-K1, αφού το μεταλλαγμένο πεπτίδιο ΗΔ δεν παρουσιάζει καμία δράση επί του πολλαπλασιασμού, ενώ το μεταλλαγμένο πεπτίδιο ΗΔ εμφανίζει παρόμοια μιτογόνο δράση με αυτή του αγρίου τύπου (Pierrot et al, 2001). Αυτό ενισχύεται από το γεγονός ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού των MAP κινασών αναστέλλεται από το μεταλλαγμένο πεπτίδιο ΗΔ σε κύτταρα BEL (Souttou et al, 1997). Σχεδιάστηκαν δύο συνθετικά πεπτίδια της PTN: το ένα P(13-32) που αποτελεί τμήμα του αμινοτελικού άκρου και το άλλο P(65-97) που αποτελεί τμήμα του καρβοξυτελικού άκρου. Το δεύτερο πεπτίδιο αναστέλλει τη μιτογόνο, ογκογόνο και αγγειογενετική δράση της PTN. Επίσης αυτό το πεπτίδιο και όχι το Ρ(13-32) αναστέλλει την πρόσδεση της PTN με την ηπαρίνη, με συνέπεια μείωση της δράσης της (Hamma- Kourbali et al. 2008). Τέλος, έχουν ανευρεθεί σε κύτταρα 38

40 HEK 293T δύο μορφές της PTN, με μοριακές μάζες 18 και 15 kda, ως προϊόντα πιθανής μετα-μεταφραστικής αποκοπής των 12 τελικών αμινοξέων από το καρβοξυτελικό άκρο. Η PTN15 επάγει τον πολλαπλασιασμό κυττάρων γλοιοβλαστώματος μέσω του υποδοχέα ALK, ενώ η PTN 18 προάγει στην ίδια καρκινική σειρά τη μετανάστευση των κυττάρων μέσω του υποδοχέα RPTPβ/ζ (Lu et al, 2005), γεγονός που υποδηλώνει σημαντικό ρόλο του τύπου του υποδοχέα της PTN που εκφράζει ο κάθε κυτταρικός τύπος. Αντιφατικά αποτελέσματα έχουν δείξει ότι οι δύο μορφές της PTN, σε αντίθεση με μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι του υποδοχέα ALK, δεν τον ενεργοποιούν σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος και νευροβλαστώματος, ενισχύοντας την θεωρία που χαρακτηρίζει τον ALK ως ορφανό υποδοχέα (Mathivet et al. 2007). Όσον αφορά στην αγγειογενετική δράση της PTN, έχει αποδειχθεί ότι χημικά συντιθέμενο καρβοξυτελικό άκρο της PTN, που αποτελείται από τα τελευταία 43 αμινοξέα, προάγει την δραστικότητα του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου (Plasminogen Activator, PA) και αναστέλλει τα επίπεδα του αναστολέα του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου (Plasminogen Activator Inhibitor, PAI) σε ενδοθηλιακά κύτταρα από αορτή βοός, δείχνοντας συνεπώς αγγειογενετική δράση (Kojima et al., 1995). Έκτοπη έκφραση του καρβοξυτελικού άκρου της PTN σε μοσχεύματα SW-13 κυττάρων σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια παρουσίασε την ίδια αγγειογεννετική δράση με ολόκληρο το μόριο της PTN, ενώ η έκφραση του αμινοτελικού άκρου δεν είχε παρόμοια αποτελέσματα (Zhang et al, 2006). Η PTN, αποτελεί υπόστρωμα για την τρυψίνη και τη χυμοτρυψίνη (Delbe et al., 1995), ενώ έχει διατυπωθεί η άποψη ότι και άλλα πρωτεολυτικά ένζυμα πιθανόν να αποικοδομούν την PTN, ρυθμίζοντας με αυτό τον τρόπο την αγγειογεννετική της δράση. Πράγματι, πεπτίδια που προκύπτουν μετά από πρωτεολυτική αποικοδόμηση της PTN από την πλασμίνη εμφανίζουν διαφορετική in vivo και in vitro αγγειογενετική δράση. Τα πεπτίδια που περιέχουν μόνο τη μια από τις δύο περιοχές β-πτυχωτής έλικας επάγουν την αγγειογένεση in vitro, ενώ αυτά που περιέχουν και τις δύο περιοχές παρουσιάζουν ανασταλτική δράση. 39

41 Ωστόσο, στο in vivo μοντέλο της CAM και τα πέντε αυτά πεπτίδια επάγουν την νεοαγγείωση, πιθανώς μέσω ενεργοποίησης των κυττάρων του αίματος στην CAM και όχι λόγω άμεσης αλληλεπίδρασης με τα ενδοθηλιακά κύτταρα της CAM, ενώ φαίνεται να παίζουν ρόλο και διάφορες πρωτεϊνάσες της CAM, που πρωτεολύοντας περαιτέρω το μόριο επάγουν την αγγειογενετική του δράση (Polykratis et al., 2004). Το γεγονός ότι το γονίδιο της PTN εκφράζεται στον καρκίνο του μαστού και σε κύτταρα μελανώματος, αλλά όχι σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα μαστού και σε μελανοκύτταρα (Wellstein et al., 1992), δημιούργησε υπόνοιες ότι το συγκεκριμένο γονίδιο πιθανώς επάγεται κατά την εγκαθίδρυση καρκινικού φαινοτύπου στα κύτταρα (transformation). Πράγματι, υπερέκφραση της PTN σε κυτταρική σειρά ινοβλαστών (ΝΙΗ 3Τ3) οδήγησε σε καρκινικό φαινότυπο (Chauhan et al., 1993). Προκειμένου να διαλευκανθεί ο μηχανισμός με τον οποίο η PTN ενέχεται στο μετασχηματισμό κυττάρων, χρησιμοποιήθηκαν μια σειρά από ανασυνδιασμένα πλασμίδια, στα οποία είχαν κλωνοποιήσει διαφορετικά τμήματα του μορίου της PTN και μελετήθηκε η ικανότητα τους να προκαλούν την εξαλλαγή κυττάρων NIH 3T3. Διαπιστώθηκε ότι το τμήμα που περιέχει τα αμινοξέα 41-64, είναι απαραίτητο για τον μετασχηματισμό των κυττάρων, ενώ τα κατάλοιπα 1-64 επάγουν τον σχηματισμό αποικιών (Zhang et al., 1999). Έχει επίσης αποδειχθεί ότι η περιοχή της PTN παίζει ρόλο στο σχηματισμό όγκων (Bernard-Pierrot et al, 2001). Αποκοπή των τελευταίων 26 αμινοξέων της PTN φαίνεται να δρα αρνητικά όσον αφορά στον πολλαπλασιασμό, το μετασχηματισμό, την αγγειογενετική και την ογκογόνο της δράση σε κύτταρα MDA-MB231, μέσω ετεροδιμερισμού του συνθετικού πεπτιδίου με την αγρίου τύπου PTN. Επίσης, το συνθετικό πεπτίδιο της PTN , ανέστειλε τις in vitro δράσεις της αγρίου τύπου πρωτεΐνης, λόγω ανταγωνισμού για την πρόσδεση στον υποδοχέα ALK (Bernard-Pierrot et al, 2002). Έκφραση του τμήματος της PTN 1-40 σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος U87 οδηγεί σε τετραπλοειδία και ανευπλοειδία. Τα κύτταρα συσσωρεύονται στην G1 φάση του κυτταρικού κύκλου και πιθανώς οδηγούνται σε απόπτωση (Chang et al, 40

42 2006). Τέλος, τα αμινοξέα του μορίου της PTN φαίνεται να είναι υπεύθυνα για την in vitro αναχαίτιση της πρόσδεσης του ιού HIV στη νουκλεολίνη της επιφάνειας των κυττάρων (Said et al., 2005). E PTN και καρκίνος Ε Έκφραση και ρόλος της PTN στον καρκίνο Το γονίδιο της PTN είναι πρωτο-ογκογονίδιο και βρίσκεται στη ζώνη q33-34, στο 7 ο χρωμόσωμα (Li et al., 1992). O πιθανός ρόλος της PTN στον καρκίνο προτάθηκε μετά από απομόνωση της από το θρεπτικό μέσο της κακοήθους καρκινικής σειράς μαστού, MDA-MB-231 (Lupu et al., 1992). Έλεγχος δειγμάτων όγκων και 36 ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών διαφορετικής προέλευσης, έδειξε ότι η PTN εκφράζεται στις 18 από αυτές και μάλιστα στο 60% πρωτοπαθών καρκίνων του μαστού (Fang et al., 1992). Στον πίνακα Ε.3 αναγράφονται καρκινικές κυτταρικές σειρές και ιστοί στους οποίους ανιχνεύεται το μετάγραφο της PTN. Tα υψηλότερα επίπεδα PTN ανευρέθηκαν σε μηνιγκιώματα (Mailleux et al., 1992), νευροβλαστώματα (Nakagawara et al., 1995), διάχυτα αστροκυτώματα (Huang et al., 2000) και γλοιοβλαστώματα (Mentlein et al., 2002). Υψηλά επίπεδα ανιχνεύονται και σε ορό ασθενών με καρκίνο του μαστού, του κόλου, του παγκρέατος και του πνεύμονα καθώς επίσης και σε πολλαπλό μυέλωμα (Soulie et al., 2004; Souttou et al., 1998; Wu et al., 2005; Yeh et al., 2006). Φαίνεται ότι η έκτοπη υπερέκφρασή του γονιδίου της PTN με τη χρήση του MMTV (mouse mammary tumor virus), σε διαγονιδιακά ποντίκια με καρκίνο του μαστού, προκάλεσε πιο κακοήθη φαινότυπο στα καρκινικά κύτταρα (Perez-Pinera et al., 2007). Αναστολή της δράσης της PTN σε κύτταρα μυελώματος, με τη χρήση μονοκλωνικού αντισώματος, προκαλεί μείωση της ανάπτυξης του όγκου, μέσω επαγωγής της αποπτωτικής διαδικασίας (Chen et al. 2007). Σημαντικό είναι το γεγονός ότι η PTN ανιχνεύεται σε υψηλότερα επίπεδα σε καρκινικές σειρές από μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (Small Cell Lung Cancer, SCLC) σε σχέση 41

43 με το μη μικροκυτταρικό (Non Small Cell Lung Cancer, NSCLC) (Jager et al., 1997) και συνεπώς θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως μοριακός μάρτυρας για τη διάγνωση του πρώτου. Η PTN ανιχνεύεται και σε κακοήθη καρκίνο των όρχεων (Aigner et al., 2003), του τραχήλου της μήτρας (Moon et al., 2002), σε λειομυώματα (Roth et al., 2007), σε συμπαγείς παιδιατρικούς όγκους (Barthlen et al.,2003), καθώς επίσης και στο 78% δειγμάτων ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος (Souttou et al., 1998). Η PTN είναι σημαντικός αυτοκρινής αυξητικός παράγοντας για καρκινικά κύτταρα προστάτη και επάγει την αγγειογέννεση in vivo και in vitro (Hatziapostolou et al., 2005). Από την άλλη μεριά, υπερέκφραση της PTN σε καρκινικά κύτταρα μαστού, παρόλο που δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των ίδιων των κυττάρων, προάγει την αγγειογένεση σε in vivo μοντέλα (Choundhuri et al., 1997). Επίσης η PTN που παράγεται από κύτταρα γλοιώματος, δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των ίδιων των κυττάρων, αλλά διεγείρει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση κυττάρων μικρογλοίας (Mentlein et al., 2002). Πιθανώς, η PTN να δρα ως παρακρινής αυξητικός παράγοντας για τα ενδοθηλιακά και τα κύτταρα γλοίας. Τέλος, υπάρχουν και αναφορές ότι η PTN δρα αρνητικά επί της ογκογένεσης. Για παράδειγμα, μελέτη με 149 δείγματα καρκίνου του μαστού και 32 φυσιολογικά, απέδειξε ότι τα επίπεδα της PTN είναι σημαντικά μειωμένα στην πρώτη περίπτωση, ενώ στο 60% των περιπτώσεων είχε ανασταλεί και η έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα HOXA5. Δεδομένου ότι η PTN, αποτελεί άμεσο μεταγραφικό στόχο του HOXA5, φαίνεται ότι η καταστολή του σε καρκίνο του μαστού οδηγεί στη μείωση της έκφρασης της PTN (Chen et al., 2005). Επίσης, στο in vivo μοντέλο νευροβλαστώματος που είναι ανθεκτικό σε θεραπεία με ιρινοτεκάνη, η PTN φαίνεται να έχει αντι-αγγειογενετική δράση (Calvet et al., 2006). 42

44 Πίνακας Ε.4: Ανίχνευση του mrna της PTN σε καρκινικές κυτταρικές σειρές και ιστούς (Papadimitriou et al., 2004). Προέλευση PTN m RNA Βιβλιογραφία Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές Καρκίνος του προστάτη LNCaP, PC-3, DU-145 Fang et al., 1992; Hatziapostolou et al., 2005 Καρκίνος του μαστού T47Dco, MDA-MB- 231, MDA-MB-361, Hs-578T Σταδίου Ι,ΙΙ,IV-S Γλοίωμα A172, U112,U118, U138, U343, U373 Fang et al., 1992 Mentlein et al., 2002 Γλοιοβλάστωμα C6, U87MG Powers et al., 2002 Νευροβλάστωμα SK-N-SH, IMR-32 Berthlen et al., 2003 Καρκίνος παγκρέατος A816-4, BXPC-3, Panc- Tul, SW-850, Panc89, Colo357 Weber et al., 2000 Λευχαιμία HL-60 Fang et al., 1992 Καρκίνος στομάχου HGT-1, KATO III Fang et al., 1992 Μελάνωμα WM852, WM239A, 1205Lu Fang et al., 1992; Souttou et al., 1998 Καρκίνος Ωοθηκών A1827, PA-1 Fang et al., 1992 Μικροκυτταρικό καρκίνωμα πνεύμονα Καρκινικοί ιστοί NCl-H526, NCl- H510,SCLC-16H, SCLC-22H, DMS-79, NCl-H69, NCl-H187, NCl-H146 Jager et al., 1997 Καρκίνος παγκρέατος Souttou et al., 1998 Καρκίνος μαστού Fang et al., 1992 Καρκίνος προστάτη Vacherot et al., 1999 Αστροκυττάρωμα Σταδίου ΙΙ Huang et al., 2000 Γλοίωμα Σταδίου ΙΙΙ, ΙV Mentlein et al., 2002 Νευροβλάστωμα Nakagawara et al.,

45 Ε Έκφραση και ρόλος των υποδοχέων της PTN στον καρκίνο Η έκφραση των υποδοχέων της PTN σε διάφορους τύπους καρκίνου φαίνεται να είναι σημαντική, δεδομένου ότι υπάρχουν πολλά βιβλιογραφικά δεδομένα που αναφέρουν αυξημένη έκφραση τους σε διάφορες καρκινικές σειρές και δείγματα ανθρώπινων όγκων. Ο RPTPβ/ζ υπερεκφράζεται σε μια πληθώρα καρκίνων, όπως γλοιοβλάστωμα (Muller et al., 2003), νευροβλάστωμα (Goldman et al., 2000), μηνιγγιώματα (Tong et al., 2006), καρκίνο του τραχήλου της μήτρας (Moon et al., 2003) και οστεοσάρκωμα (Hausser et al., 2005), ενώ η έκφραση του στον καρκίνο του παχέος εντέρου είναι μειωμένη σε σχέση με τον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό (Yamakawa et al., 1999). Έχει αναφερθεί ότι μια ανοσοτοξίνη έναντι του RPTPβ/ζ καθυστερεί την ανάπτυξη όγκων μετά την εμφύτευση ανθρώπινων γλοιωματικών κυττάρων U87 σε ποντίκια (Foehr et al., 2006), καθώς επίσης και ότι καταστολή της έκφρασης του RPTPβ/ζ αναστέλλει τη μετανάστευση κυττάρων γλοιοβλαστώματος U251-MG (Ulbricht et al., 2006). Ο RPTPβ/ζ εκφράζεται σε πολλούς υποτύπους ανθρώπινου καρκίνου του μαστού, στους οποίους εκφράζεται και ο ALK υποδοχέας. Οι υποδοχείς, πέραν της κυτταρικής μεμβράνης, εντοπίζoνται διάσπαρτοι στο κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα. H κατανομή του RPTPβ/ζ μεταβάλλεται καθώς ο καρκίνος του μαστού γίνεται περισσότερο επιθετικός (Perez-Pinera et al., 2007a; Perez-Pinera et al., 2007b). Η PTN διαταράσσει συμπλέγματα κυτταροσκελετικών πρωτεϊνών, διακόπτει την εξαρτώμενη από ιόντα ασβεστίου ομοφιλική προσκόλληση μεταξύ κυττάρων, επάγει την ουμπικουιτινυλίωση και αποικοδόμηση της N-καντερίνης, αναδιοργανώνει τον κυτταροσκελετό και επάγει τη μορφολογική μετάβαση από επιθηλιακό σε μεσεγχυματικό φαινότυπο, σε διεγερμένα από PTN U373 κύτταρα, υποδηλώνοντας πως η αυξημένη φωσφωρυλίωση τυροσινών διαφορετικών υποστρωμάτων του RPTPβ/ζ σε διεγερμένα με PTN κύτταρα, είναι ικανή να διεγείρει διαφορετικές δράσεις, απαραίτητες για την προαναφερόμενη μορφολογική μετάβαση (Perez-Pinera et al., 2006). Πολλές μελέτες έχουν δείξει την έκφραση του ALK σε μελανώματα (Dirks et al., 2002), νευροβλαστώματα (Stoica et al., 2002), γλοιοβλαστώματα (Powers et 44

46 al., 2002), non-ηodgkin λεμφώματα (Delsol et al., 1997), σε καρκίνο του παγκρέατος (Stoica et al., 2001) και του μαστού (Stoica et al., 2002). Ειδικότερα, έχει βρεθεί ότι ο ALK υπερεκφράζεται στο γλοιοβλάστωμα, στο 35% κυτταρικών σειρών καρκίνου του μαστού και στο 50 % δειγμάτων από ασθενείς με καρκίνο του μαστού (Powers et al., 2002). Καταστολή της έκφρασης του ALK έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της ανάπτυξης όγκων μετά την εμφύτευση ανθρώπινων γλοιωματικών κυττάρων U87 σε αθυμικά ποντίκια, και την αύξηση του χρόνου επιβίωσης (Powers et al., 2002). Στην κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού Hs578T, μείωση της έκφρασης του ALK αναστέλλει και την ανάπτυξη των όγκων in vivo (Wang et al., 1997). Στοιχεία δείχνουν ότι η χρήση ειδικών αναστολέων της κινάσης θα αποτελούσε μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση για πολλές μορφές καρκίνου (Li et al., 2007). E Στόχευση της έκφρασης της PTN στον καρκίνο Όταν σε κύτταρα μελανώματος ανθρώπου που εκφράζουν υψηλά επίπεδα του mrna της PTN, κατασταλεί η έκφραση της με χρησιμοποίηση ριβοενζύμων, μειώνεται ο αριθμός των αποικιών σε soft agar και επιβραδύνεται η ανάπτυξη όγκων σε μύες (Czubayko et al., 1994). H χρήση ριβοενζύμων σε άλλη κυτταρική σειρά μελανώματος οδηγεί σε αναστολή αύξησης του όγκου και της αγγειογέννεσης σε αθυμικούς μύες (Czubayko et al., 1996). Σε κυτταρική σειρά καρκίνου του παγκρέατος, καταστολή της έκφρασης της PTN οδηγεί σε μείωση του ρυθμού πολλαπλασιασμού, του σχηματισμού αποικιών σε soft agar και της ανάπτυξης των όγκων, δράση η οποία αναστέλλεται μερικώς μετά τη χορήγηση εξωγενούς PTN (Weber et al., 2000). Χρήση ριβοενζύμων σε ξενομοσχεύματα κυττάρων μελανώματος σε αθυμικά ποντίκια, έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της ανάπτυξης υποδόριων μελανωμάτων (Malerczyk et al., 2005), καθώς επίσης και σε ξενομοσχεύματα κυττάρων γλοιοβλαστώματος U87 και T98G. Η καταστολή της έκφρασης της PTN οδήγεί σε αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της μεταναστευτικής ικανότητας και του σχηματισμού αποικιών σε πήκτωμα soft agar. Όταν τα διαμολυθέντα κύτταρα ενύονται σε αθυμικούς μύες, διαπιστώνεται 45

47 μείωση της ανάπτυξης του όγκου, η οποία συνοδεύεται από μειωμένα επίπεδα της PTN στον ορό αίματος των ζώων. Παράλληλα ανοσοϊστοχημική ανάλυση των όγκων δείχνει μειωμένη αγγειακή πυκνότητα (Grzelinski et al., 2005;2006). Σε κύτταρα μελανώματος 1205Lu, χρησιμοποιήθηκε ως φορέας της αντινοηματικής αλληλουχίας της PTN ένας αδενοιός. Όταν τα κύτταρα τοποθετούνται σε sofr agar in vitro και σε ανοσοκατεσταλμένους μύες in vivo, αναστέλλεται σημαντικά η ανάπτυξη όγκου. Ταυτόχρονα, μειώνεται η έκφραση της κυκλίνης Ε (ρυθμιστικό μόριο του κυτταρικού κύκλου) και αυξάνεται η έκφραση της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1 (αναστολέας του κυτταρικού κύκλου) (Satyamoorthy et al., 2000). E Η PTN ως διαγνωστικός δείκτης Πρόσφατα δεδομένα αναφέρουν αυξημένα επίπεδα της PTN στον ορό αίματος ασθενών με νευροβλάστωμα, γλοίωμα (Soulie et al., 2004) και μελάνωμα (Wu et al., 2005). Δεδομένου ότι τα επίπεδα της PTN είναι αυξημένα στα πρώιμα στάδια του καρκίνου των όρχεων, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως νέος διαγνωστικός μάρτυρας (Aigner et al., 2003). Αυξημένα επίπεδα της PTN έχουν ανευρεθεί και στον ορό αίματος ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος και του κόλον. Τα επίπεδα αυτά μειώνονται αισθητά μετά από επιτυχή απομάκρυνση του όγκου (Souttou et al., 1998). Ανάλυση στον ιστό του παγκρέατος έδειξε ότι η έκφραση της PTN αυξάνεται σημαντικά σε περιπτώσεις φλεγμονής (35%) και καρκίνου (65%) του συγκεκριμένου ιστού. Επίσης σε ασθενείς με χρόνια παγκρεατίτιδα, μια ασθένεια που συνήθως προηγείται του καρκίνου του παγκρέατος, ανευρέθηκαν υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης στον ορό των ασθενών (Klomp et al., 2002). H διαφοροδιάγνωση της χρόνιας παγκρεατίτιδας από τον καρκίνο του παγκρέατος είναι δύσκολη και συνεπώς θα είχε μεγάλη κλινική αξία ένας διαγνωστικός μάρτυρας που θα επέτρεπε τη διάκριση των ασθενειών αυτών (Juhl et al., 1996). 46

48 Ε.3 Σηματοδοτικό μονοπάτι ιντεγκρινών Η κυτταρική επιβίωση εξαρτάται από ποικίλα μόρια μεταγωγής σήματος, όπως αυξητικοί παράγοντες, θρεπτικά στοιχεία και προσκόλληση σε γειτονικά κύτταρα και σε στοιχεία του εξωκυττάριου υλικού (ECM). Τα παραπάνω ισχύουν και στις περιπτώσεις καρκίνου, οι οποίοι συχνά αναπτύσσονται φαινομενικά ανεξάρτητα από αυτά τα σήματα. Τα μόρια κυτταρικής προσκόλλησης της οικογένειας των ιντεγκρινών είναι μία μεγάλη οικογένεια υποδοχέων της επιφάνειας πολλών ευκαρυωτικών κυττάρων. Οι ιντεγκρίνες αναγνωρίζουν ποικίλες πρωτεΐνες του εξωκυττάριου υλικού, συμπεριλαμβανομένης της ινονεκτίνης, του κολλαγόνου και της βιτρονεκτίνης (Giancotti and Ruoslahti, 1999). Αποτελούνται από 18α και 8β υπομονάδες, οι οποίες σχηματίζουν 24 γνωστά ετεροδιμερή, ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο και λειτουργία (Hynes, 2002; Schwartz και Ginsberg, 2002; Watt, 2002). Οι ιντεγκρίνες είναι οι κύριοι υποδοχείς των πρωτεϊνών του ECM, όπως το κολλαγόνο, η ινονεκτίνη και η λαμινίνη. Οι αλληλεπιδράσεις κυττάρου-ecm μέσω των ιντεγκρινών είναι απαραίτητες για την εμβρυϊκή ανάπτυξη, πολλαπλασιασμό, επιβίωση, προσκόλληση, διαφοροποίηση, μετανάστευση των κυττάρων, κ.ά. (Watt, 2002; Brakebusch και Fassler, 2003). Μέσω της κυτταρικής μεμβράνης, μεσολαβούν στη μεταγωγή σημάτων και προς τις 2 κατευθύνσεις: 1. Προσδένοντας μόρια για τη σηματοδότηση μέσα στο κύτταρο, οδηγώντας στην αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, έκφραση γονιδίων και κυτταρική διαφοροποίηση ( outside-in σηματοδότηση). 2. Εκπέμποντας σήματα από το κύτταρο, ρυθμίζοντας έτσι τη συγγένεια πρόσδεσης ιντεγκρίνης-προσδέτη και τη κυτταρική προσκόλληση ( insideout σηματοδότηση) (Hynes, 1992; Schwartz et al., 1995). Η έλλειψη ενζυματικής δράσης των κυτταροπλασματικών περιοχών υποδηλώνει ότι η μεταγωγή σήματος μέσω των ιντεγκρινών απαιτεί άμεση πρόσδεση σηματοδοτικών μορίων, όπως οι κυτταροπλασματικές κινάσες ή 47

49 πρωτεΐνες διασύνδεσης που προσελκύουν κινάσες ή άλλα μόρια μεταγωγής σήματος. Έχουν αναφερθεί δύο σημαντικές κινάσες που προσδένονται στην κυτταροπλασματική περιοχή της υπομονάδας β των ιντεγκρινών, οι FAK (focal adhesion kinase) και ILK (integrin linked kinase). Ε.4 ILK (Integrin-linked kinase) H ILK είναι μία πρωτεΐνη με δράση κινάσης σερίνης-θρεονίνης. Εκφράζεται στους περισσότερους τύπους κυττάρων και ιστούς των θηλαστικών, με τη μεγαλύτερη έκφραση να συναντάται στο καρδιακό και σκελετικό μυ. Ταυτοποιήθηκε 1 η φορά με σύστημα δύο υβριδίων, λόγω της αλληλεπίδρασής της με τη κυτταροπλασματική περιοχή της β1-ιντεγκρίνης. Μελέτες έδειξαν ότι η ILK προσδένεται στη κυτταροπλασματική περιοχή των β 1 και β 3 ιντεγκρινών (Hannigan et al., 1996) και ότι αυτή η αλληλεπίδραση μπορεί να διακοπεί, μεταλλάσσοντας τις υψηλά συντηρημένα κατάλοιπα θρεονίνης στις κυτταροπλασματικές περιοχές των ιντεγκρινών β 1 και β 3 (Wennerberg et al., 1998). Σε in vitro δοκιμές, χρησιμοποιώντας ανασυνδιασμένη ή ανοσοκατακριμνησμένη ILK από εκχυλίσματα κυττάρων, απέδειξαν ότι πρόκειται για μία λειτουργική πρωτεϊνη με δράση κινάσης σερίνης/ θρεονίνης, ικανή να αυτοφωσφορυλιωθεί και να φωσφορυλιώσει εξωγενή υποστρώματα (π.χ. MBP, υπομονάδα β 1 ιντεγκρινών) (Hannigan et al., 1996). Η κινάση ILK είναι πολύ συντηρημένη εξελικτικά, με αναγνωρισμένα ομόλογα στον άνθρωπο, στους μύες, στα τρωκτικά, στη Drosophila και στο C.elegans. Το γονίδιο που κωδικοποιεί την ανθρώπινη κινάση ILK εντοπίζεται στη θέση p15.5-p15.4 του ανθρώπινου χρωμοσώματος 11 (Hannigan et al., 1997). Τοπική απώλεια της ετεροζυγωτίας υποδηλώνει ότι αυτή η θέση του χρωμοσώματος 11 συνδέεται με την καρκινογένεση. Έτσι, είναι πιθανόν η δυσλειτουρία της κινάσης ILK να οφείλεται σε γονιδιωματικές ανακατατάξεις σε αυτή τη περιοχή. 48

50 E.4.1 Δομή της κινάσης ILK Η κινάση ILK περιλαμβάνει τρεις δομικά και λειτουργικά ξεχωριστές περιοχές, οι οποίες είναι συντηρημένες (Hannigan et al., 1996; Li et al., 1997; Delcommenne et al., 1998; Tu et al., 1999; Huang και Wu, 1999). 1. Η C-περιοχή περιέχει το καταλυτικό κέντρο της κινάσης, το οποίο εμφανίζει σημαντική ομολογία με άλλα ενεργά κέντρα κινασών, σε επίπεδο διάταξης των υποπεριοχών. Παρόλα αυτά, σε αυτές τις υποπεριοχές υπάρχει ένας αριθμός διαφορετικών αμινοξέων σε θέσεις που φυσιολογικά είναι πολύ συντηρημένες. Βέβαια, η αλληλουχία APE που είναι πολύ σημαντική, καταλυτικά παραμένει συντηρημένη στην κινάση ILK. Από μεταλλαγές σε αυτήν την περιοχή (E359K) προκύπτει μία ανενεργή μορφή της ILK, που λειτουργεί ως dominant-negative (Delcommenne et al., 1998). Επίσης, περιλαμβάνει τη θέση πρόσδεσης των κυτταροπλασματικών περιοχών των υπομονάδων β 1 και β 3 των ιντεγκρινών. 2. Το Ν-άκρο της καταλυτικής περιοχής αλληλοεπικαλύπτεται με ένα μοτίβο με ομολογία πλεκστρίνης (pleckstrin homology, PH-Like), στο οποίο πιθανά προσδένεται η 3,4,5-τριφωσφορική φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη, συμμετέχοντας έτσι στη ρύθμιση της ενδογενούς δράσης κινάσης της ILK (Hannigan et al., 1996; Delcommenne et al., 1998). 3. Η Ν-περιοχή περιέχει τέσσερις επαναλήψεις ανκυρίνης (ΑΝΚ), οι οποίες συμμετέχουν σε αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (Dedhar, 2000). Έχει αναφερθεί ότι η κινάση ILK αλληλεπιδρά με τη LIM περιοχή της πρωτεΐνης PINCH (Tu et al., 1999). H πρωτεΐνη Nck-2 αλληλεπιδρά με την PINCH ώστε να φέρει σε επαφή την κινάση ILK με αυξητικούς παράγοντες (Tu et al., 1998). Επιπλέον, οι επαναλήψεις ΑΝΚ ρυθμίζουν τον εντοπισμό της κινάσης ILK στις εστίες προσκόλλησης (Li et al., 1999). 49

51 E.4.2 Προσδέτες της κινάσης ILK Η κινάση ILK αποτελεί κύριο στοιχείο των δομών πρόσδεσης κυττάρουεξωκυτταρικού υλικού. Αλληλεπιδρά με ποικίλες πρωτεΐνες, οι οποίες βρίσκονται σε περιοχές αλληλεπίδρασης των ιντεγκρινών με ακτίνη κυτταροσκελετού. Έχει βρεθεί ότι η κινάση ILK προσδένεται στην κυτταροπλασματική περιοχή των υπομονάδων β 1 και β 3 των ιντεγκρινών (Hannigan et al., 1996). Η παρατήρηση ότι η κινάση ILK αλληλεπιδρά με τις ιντεγκρινες μέσω του C- άκρου υποδεικνύει ότι οι επαναλήψεις ANK του N-άκρου μπορεί να εμπλέκονται στις αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών, συνδέοντας το σύμπλοκο ILKιντεγκρίνη με άλλα σηματοδοτικά μονοπάτια ή με στοιχεία του κυτταροσκελετού. Μία πρόσφατα αναγνωρισμένη πρωτεΐνη, η δομή της οποίας επιτρέπει τη πρόσδεση μεγάλων πρωτεϊνικών συμπλόκων, είναι η PINCH (particularly interesting new Cys-His protein). Η PINCH είναι μία ευρέως εκφραζόμενη πρωτεΐνη, αποτελούμενη από 5 LIM (Lin-11, Isl-1, Mac-3) περιοχές πλούσιες σε κυστεΐνες, οι οποίες φαίνεται να μεσολαβούν στις πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις (Hobert et al., 1999; Tu et al., 1999) και στη μεταγωγή σήματος μέσω ιντεγκρινών. Σημαντικός είναι ο ρόλος της PINCH στον εντοπισμό της κινάσης ILK στις εστίες προσκόλλησης, όπου ενεργεί ως Ser/Thr κινάση κατα τη διάρκεια της μεταγωγής σήματος (μέσω ιντεγκρινών) (Li, et al., 1999). Μπλοκάροντας την αλληλεπίδραση ILK-PINCH (έλλειψη ANK1) αποκλείει τον εντοπισμό της κινάσης ILK στις εστίες προσκόλλησης (Li et al., 1999). Επίσης, είναι γνωστό ότι η PINCH αλληλεπιδρά με τη Nck-2 μέσω της 4 ης LIM περιοχής. Επομένως, η PINCH μπορεί να διευκολύνει το σχηματισμό συμπλόκου μεταξύ ILK και Nck-2, παρέχοντας έτσι μία φυσική επικοινωνία του σηματοδοτικού μονοπατιού ιντεγκρίνη-ilk με αυτό των αυξητικών παραγόντων και μικρών GTPασών (Tu et al., 1999). Ένα άλλο στοιχείο του κυτταροσκελετού που έχει βρεθεί να συνδέεται στην κινάση ILK είναι η LIM περιοχή της πρωτεΐνης παξιλίνης. Η ILK είναι γνωστό ότι περιέχει ένα LD-μοτίβο πρόσδεσης της παξιλίνης στο C-άκρο. Μεταλλαγές στην περιοχή αυτή, όχι μόνο επιβεβαίωσε τη λειτουργία της στη μεσολάβηση της πρόσδεσης της παξιλίνης, αλλά αποκάλυψε ότι είναι απαραίτητη και η λειτουργική 50

52 αλληλεπίδραση ILK-παξιλίνης για τον εντοπισμό της ILK στις εστίες προσκόλλησης (Nikolopoulos και Turner, 2001), όπως και με την PINCH (Tu et al., 1999). Είναι πλέον γεγονός ότι πολλαπλές αλληλεπιδράσεις συμβάλλουν στο σταθερό εντοπισμό της κινάσης ILK στις εστίες προσκόλλησης και ότι η φυσική γειτνίαση των θέσεων πρόσδεσης των ιντεγκρινών και της παξιλίνης μπορεί να εμπλέκονται στη μεταγωγή εξωτερικών σημάτων. H κινάση ILK συμμετέχει και στη ρύθμιση του σηματοδοτικού μονοπατιού Wnt/β-κατενίνη στα επιθηλιακά κύτταρα (Novak et al., 1998), άρα και στον έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης και της μεσεγχυματικής μορφογένεσης. Ένας πιθανός ρόλος της αλληλεπίδρασης ILKπαξιλίνης στις παραπάνω διαδικασίες υποδηλώνεται με συγκατακρήμνιση των ILK, παξιλίνης και μιας πρωτεΐνης από το μονοπάτι Wnt/β-κατενίνη, σε επιθηλιακά κύτταρα (Torres & Nelson, 2000). Η αφιξίνη επίσης συνεντοπίζεται με την κινάση ILK στις εστίες προσκόλλησης και στο άκρο των μεταναστευτικών κυττάρων (Yamaji et al., 2001). Η αφιξίνη μπορεί να αποτελεί υπόστρωμα για την κινάση ILK, συνδέοντας έτσι το σηματοδοτικό μονοπάτι ιντεγκρίνης-ilk με το σχηματισμό των εστιών προσκόλλησης (Yamaji et al., 2001). Φωσφορυλίωσή της από την ILK ενισχύει την ικανότητα της να αναστέλλει την κυτταρική εξάπλωση (Yamaji et al., 2001). Μία επιπλέον πρωτεΐνη που προσδένεται στην κινάση ILK και περιέχει την CH2 περιοχή, η CH-ILKBP, ταυτοποιήθηκε με ανάλυση σε σύστημα δύο υβριδίων (Tu et al., 2001). Περαιτέρω χαρακτηρισμός της αλληλεπίδρασης ILK- CH- ILKBP σε κύτταρα επιβεβαίωσε ότι η PINCH εμπλέκεται επίσης στο σχηματισμό του συμπλόκου ILK-CH-ILKBP. Αυτή η αλληλεπίδραση συμβαίνει στις εστίες προσκόλλησης και μάλλον είναι σημαντική για τη ρύθμιση της κυτταρικής προσκόλλησης και εξάπλωσης (Tu et al., 2001). Ένα νέο μέλος της PP2C οικογένειας φωσφατασών, η ILKAP (ILKassociated phosphatase) ταυτοποιήθηκε επίσης με ανάλυση σε σύστημα δύο υβριδίων (Leung-Hagesteijn et al., 2001). Οι ILK και ILKAP από εκχυλίσματα 51

53 HEK 293 κυττάρων, συγκατακρημνίζονται ανεξάρτητα από τις καταλυτικές δράσεις τους. Σε ανοσοσυμπλέγματα, επαγόμενη υπερέκφραση της ανασυνδιασμένης και καταλυτικά ενεργής ILKAP οδηγεί στην αναστολή της δράσης της ILK. Ενώ η ILKAP φαίνεται να αναστέλλει σημαντικά τη φωσφορυλίωση της GSK-3 στη σερίνη 9, δεν έχει κανένα αποτέλεσμα στη φωσφορυλίωση της PKB/Akt στη σερίνη 473. Έτσι, η ILKAP κάνει σύμπλοκα με την ILK με στόχο την εκλεκτική αναστολή του GSK-3 σήματος. Για αυτό το λόγο, η ILKAP μπορεί να αποτελέσει ένα φυσικό ρυθμιστή της σηματοδότησης μέσω της κινάσης ILK, υπεύθυνο για τη μείωση της δράσης της κινάσης ILK (Leung- Hagesteijn et al., 2001). E.4.3 Σηματοδοτικό μονοπάτι της κινάσης ILK Όπως προαναφέρθηκε, η κινάση ILK έχει βρεθεί να αλληλεπιδρά με τις κυτταροπλασματικές περιοχές των υπομονάδων β 1 και β 3 των ιντεγκρινών, σημαντικών ρυθμιστών της κυτταρικής μετανάστευσης (Hynes et al.,2002; Ridley et al., 2003; D Abaco and Kaye, 2007). H κινάση ILK σχηματίζει σύμπλοκο με την PINCH και την παρβίνη, γνωστό ως IPP σύμπλοκο (ILK, PINCH, Parvin). Η ILK προσδένεται στη PINCH μέσω της περιοχής ανκυρίνης (ΑΝΚ) και η παρβίνη μέσω της περιοχής με δράση κινάσης. Το σύμπλοκο αυτό αποτελεί μέρος των περιοχών αλληλεπίδρασης στις εστίες προσκόλλησης που ελέγχουν την οργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης (Wu and Dedhar, 2001; Legate et al., 2006) και συμμετέχει στη ρύθμιση της κυτταρικής εξάπλωσης και μετανάστευσης. Η περιοχή PH αποτελεί ένα μοτίβο πρόσδεσης των λιπιδίων φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης, ενεργοποιώντας τη λειτουργία της ως κινάση. Βιοχημικές αναλύσεις in vitro απέδειξαν ότι η δράση κινάσης μίας ανασυνδιασμένης ILK διεγείρεται από την 3,4,5-τριφωσφορική φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη (ΡΙΡ 3 ), και ότι είναι ευαίσθητη σε αναστολείς της PI3K (Delcommenne et al., 1998). Η κινάση ΡΙ3Κ καταλύει τη φωσφορυλίωση της 4,5- διφωσφορικής φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης (ΡΙΡ 2 ) σε ΡΙΡ 3. Αντίθετα, η πρωτεΐνη με 52

54 δράση φωσφατάσης τυροσίνης ΡΤΕΝ έχει ενεργότητα λιπιδικής φωσφατάσης και ρυθμίζει τη μετατροπή του ΡΙΡ 3 σε ΡΙΡ 2. Έτσι, αποτελεί τον κύριο αναστολέα της σηματοδότησης της ΡΙ3Κ, καθώς και της δράσης της ILK (Delcommenne et al., 1998 ; Morimoto et al., 2000). Μη σωστή ρύθμιση των σηματοδοτικών μονοπατιών που εξαρτώνται από ΡΙ3Κ και ΡΤΕΝ ενισχύει την ανάπτυξη καρκίνου. Μόλις η κινάση ILK ενεργοποιηθεί από την ΡΙ3Κ, οδηγεί στην ενεργοποίηση διάφορων υποστρωμάτων που συμμετέχουν στη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης, μετανάστευσης και επιβίωσης. Μικρά μόρια αναστολείς, ειδικά σχεδιασμένα να αναστέλλουν τη δράση κινάσης της ILK, υπέδειξαν την ILK ως ρυθμιστή της δράσης της ΡΚΒ/ΑKT και της GSK3 (Persad et al., 2000). Η PKB/AKT είναι μία πρωτεΐνη με δράση κινάσης σερίνης/θρεονίνης που συμμετέχει στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και επιβίωσης των κυττάρων. Το PKB/AKT- εξαρτώμενο σηματοδοτικό μονοπάτι εμπλέκεται στην ανάπτυξη ανοχής από τα καρκινικά κύτταρα στη χημειοθεραπεία και στη ραδιοθεραπεία (Wong et al., 2007). Η ενεργοποίηση της PKB/AKT εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση στα κατάλοιπα θρεονίνη 308 και σερίνη 473 από τα ισοένζυμα PDK1 και PDK2 (pyruvate dehydrogenase kinase). Η κινάση PDK1 οδηγεί στη φωσφορυλίωση της θρεονίνης 308 και η ILK αναγνωρίστηκε ως PDK2, φωσφορυλιώνοντας τη σερίνη 473 της PKB/AKT (Persad et al., 2001). Πιο πρόσφατες πληροφορίες προτείνουν ότι ο ρόλος της ΡDK2 μπορεί να είναι κυτταρο-ειδικός και να μοιράζεται από πολλές κινάσες, με την ILK να είναι μία από αυτές (Persad et al., 2000; 2001; Sakai et al., 2003). Κύρια λειτουργία της ενεργοποιημένης PKB/AKT είναι η ρύθμιση του mtor (mammalian target of rapamycin), που αποτελεί έναν κεντρικό ρυθμιστή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (ρύθμιση σταθερότητας, μεταγραφής και μετάφρασης πρωτεϊνών). Επιπλέον, η PKB/AKT φωσφορυλιώνει αποπτωτικούς δείκτες, όπως οι BAD και κασπάση-9, οδηγώντας στην απενεργοποίησή τους και στην επαγωγή της κυτταρικής επιβίωσης. Η ενεργοποιημένη GSK3β ρυθμίζει τη σταθερότητα και τον εντοπισμό της β-κατενίνης. Η GSK-3 εξαρτώμενη φωσφορυλίωση της β-κατενίνης, την οδηγεί σε 53

55 ουβικουιτινυλίωση και αποικοδόμηση. Αντίθετα, η φωσφορυλίωση της GSK3 από την ILK, απενεργοποιεί τη δράση κινάσης με αποτέλεσμα να μη φωσφορυλιώνεται η β-κατενίνη. Έτσι, η τελευταία δε προχωρεί σε αποικοδόμηση αλλά σταθεροποιείται και συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα, οδηγώντας τελικά σε μεταφορά της β-κατενίνης στο πυρήνα. Η πυρηνική β-κατενίνη αλληλεπιδρά με τους μεταγραφικούς παράγοντες TCF/LEF, μετατρέποντας το σύμπλοκο από μεταγραφικό καταστολέα σε μεταγραφικό ενεργοποιητή. Μεταγραφικοί στόχοι αποτελούν οι c-myc και κυκλίνη D1 που προάγουν το κυτταρικό πολ/σμό και ανάπτυξη (Novak and Dedhar, 1999). Τέλος, η κινάση ILK μπορεί να επάγει τη κυτταρική μετανάστευση ανεξάρτητα από το σύμπλοκο IPP (ILK, PINCH, Parvin). Η κινάση ILK μπορεί να ρυθμίσει την ΑΡ-1- εξαρτώμενη μεταγραφή που οδηγεί στην έκφραση της MMP-9. (D Amico et al., 2000; Troussard et al., 2000). Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες είναι γνωστό ότι αποικοδομούν το εξωκυττάριο υλικό και εμπλέκονται στον έλεγχο της κυτταρικής μετανάστευσης και διείσδυσης. Επιπλέον, η κινάση ILK εμπλέκεται στον έλεγχο της κυτταρικής μετανάστευσης που εξαρτάται από τη μυοσίνη. Η μυοσίνη αλληλεπιδρά με τα ινίδια ακτίνης και ρυθμίζει τη συσταλτικότητά τους, καθοριστικό γεγονός για τη κυτταρική κινητικότητα. Φωσφορυλίωση των ελαφριών αλυσίδων της μυοσίνης διευκολύνει την πρόσδεσή της στα ινίδια ακτίνης, ενώ αποφωσφορυλίωσή της την αποδεσμεύει από τα ινίδια. Τότε φωσφορυλιώνεται από την ILK, απενεργοποιώντας τη δράση φωσφατάσης της μυοσίνης (Kiss et al., 2002). 54

56 Εικόνα 6: Σηματοδοτικό μονοπάτι της ILK (D Abaco and Kaye, 2008). E.4.4 Βιολογικές δράσεις της κινάσης ILK Οι βιολογικές δράσεις της κινάσης ILK μεσολαβούν στη μεταγωγή σήματος από τα στοιχεία του ECM σε ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες μέσω των ιντεγκρινών (Wu et al., 1998) και από τους αυξητικούς παράγοντες μέσω της PINCH (Delcommenne et al., 1998; Wu et al., 1998). Έρευνες έχουν δείξει ότι υπερέκφραση της κινάσης ILK σε επιθηλιακά κύτταρα οδηγεί σε κυτταρική ανάπτυξη, προώθηση του κυτταρικού κύκλου και σημαντική αύξηση της έκφρασης της κυκλίνης D και A (Radeva et al., 1997). Επιπλέον, η ILK μπορεί να δρά ως πρωτο-ογκογονίδιο, επάγοντας το σχηματισμό όγκων σε αθυμικούς μύες (Wu et al., 1998). Η υπερέκφραση της ILK οδηγεί σε μεταφορά της β-κατενίνης στον πυρήνα, στο σχηματισμό συμπλόκου με το μεταγραφικό παράγοντα LEF-1 και στην ενεργοποίηση της μεταγραφής υποκινητών που περιέχουν θέση πρόσδεσης για τον LEF-1 (Novak et al., 1998). Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η αναστολή της κινάσης ILK έχει ως αποτέλεσμα τη σημαντική αναστολή της μεταγραφής του TCF-ρυθμιζόμενου γονιδίου κυκλίνη D1. Αυτή η αναστολή της κινάσης ILK οδηγεί σε μείωση της έκφρασης της β-κατενίνης και αναστολή της 55

57 φωσφορυλίωσης της GSK-3, ενώ επάγοντας τη δράση της ILK αυξάνεται η αποικοδόμηση της β κατενίνης (Tan et al., 2001). Επομένως, η ILK μπορεί να ενεργοποιεί το μονοπάτι Wnt, που οδηγεί στον εντοπισμό της β-κατενίνης στο πυρήνα και στην αυξημένη επαγωγή της μεταγραφής του LEF-1 (Novak et al., 1998). Η κυτταρική προσκόλληση μέσω των ιντεγκρινών είναι απαραίτητο στοιχείο για την κυτταρική επιβίωση. Η αλληλεπίδραση των επιθηλιακών και ενδοθηλιακών κυττάρων με το ECM αναστέλλει τα αποπτωτικά μονοπάτια. Όταν αυτές οι αλληλεπιδράσεις διακόπτονται, επάγεται απόπτωση που ονομάζεται anoikis. Υπερέκφραση της ILK σε κύτταρα SCP2 ευαίσθητα σε anoikis, προκάλεσε μειωμένη ευαισθησία στην anoikis και αναστολή της απόπτωσης των κυττάρων. Αντιθέτως, μείωση της δράσης της κινάσης ILK με dominant-negative ILK ή dominant negative PKB/AKT διατηρεί την ευαισθησία των κυττάρων SCP2 στην anoikis, υποδηλώνοντας για ακόμα μία φορά το ρόλο της κινάσης ILK στη ρύθμιση της PKB/Akt (Attwell et al., 2000). Παρατεταμένη κυτταρική επιβίωση επιφέρει η ενεργοποίηση της PKB/Akt από την κινάση ILK, μέσω της απενεργοποίησης downstream προ-αποπτωτικών παραγόντων, π.χ. BAD (Downward, 1998) και κασπάση-9 (Cardone et al., 1998). H ικανότητα της κινάσης ILK να επάγει έναν επεκτατικό φαινότυπο παρατηρήθηκε μετά από υπερέκφραση της ILK σε επιθηλιακά κύτταρα μαστού και εντέρου και συνδέεται με την αυξημένη έκφραση της μεταλλοπρωτεϊνάσης ΜΜΡ-9. Σε μελέτες, η υπερέκφραση της ILK σε επιθηλιακά κύτταρα εντέρου σε soft άγαρ οδήγησε σε ανεξάρτητη από προσκόλληση κυτταρική ανάπτυξη (Troussard et al., 1999; Radeva et al., 1997; Hannigan et al., 1996). Επιπλέον, αυτή η υπερέκφραση προκαλεί απώλεια της σύνδεσης μεταξύ κυττάρων, λόγω αναστολής της E-καντχερίνης (ενεργοποίησης του αναστολέα Snail), οδηγώντας πάλι σε μεταναστευτικό/επεκτατικό φαινότυπο(tan et al., 2001). Η κινάση ILK είναι σε μεγάλο βαθμό απούσα από τις αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου (Li et al., 1999). Υπερέκφραση της ILK σε επιθηλιακά κύτταρα IEC-18 επάγει μορφολογικές αλλαγές, μιμούμενες το φαινόμενο 56

58 epithelial-mesenchymal transition ή ΕΜΤ (Novak et al., 1998; Wu et al., 1998). Επιπλέον, αυτή η υπερέκφραση προκαλεί απώλεια της σύνδεσης μεταξύ κυττάρων, λόγω αναστολής της E-καντερίνης, οηδηγώντας πάλι σε μεταναστευτικό φαινότυπο (Novak et al., 1998; Wu et al., 1998; Tan et al., 2001). Μία πιο πρόσφατη έρευνα προσθέτει στις ήδη γνωστές λειτουργίες της ILK, τη ρύθμιση της οργάνωσης του κυτταροσκελετού, της κυτταρικής μορφολογίας και της μετανάστευσης μέσω ενός ROCK (Rho-associated coiled-coilcontaining kinase)- μεσολαβούμενο μονοπατιού (Khyrul et al., 2004). Η ROCK κινάση σερίνης /θρεονίνης αποτελεί έναν άμεσο τελεστή των ισομορφών RhoA, RhoB και RhoC (Bishop και Hall, 2000). Η Rho-οικογένεια GTPασών, που περιλαμβάνει τις Cdc42, Rac1 και RhoA (Etienne-Manneville and Hall 2002; Hall and Nobes, 2000), συμμετέχει στην αναδιοργάνωση των δομών του κυτταροσκελετού της ακτίνης (π.χ. φιλοπόδια, stress fibers κ.τ.λ), μετά από ανταπόκριση σε σημάτα των ιντεγκρινών (Mitra et al., 2005). Αυτές οι διαδικασίες είναι απαραίτητες για την κυτταρική εξάπλωση και κίνηση. Η σηματοδότηση από την κινάση ILK συνεισφέρει σημαντικά στη ρύθμιση της κυτταρικής μετανάστευσης. Σε κύτταρα οστεοσαρκώματος, υπερέκφραση της wild-type ILK αναστέλλει την κυτταρική εξάπλωση, πόλωση και κινητικότητα. Σε αυτό το μοντέλο, αναστολή της RhoA ή της ROCK και συνεχής ενεργοποίηση της Rac1 ανέστρεψε τον παραπάνω φαινότυπο. Επιπλέον, σταθερή έκφραση του dominant negative E359K ILK μεταλλάγματος, που αποτυγχάνει να προσδεθεί στη παξιλίνη και να εντοπιστεί στις εστίες προσκόλλησης, αυξάνει την κυτταρική κινητικότητα και αντιστρέφει το RhoA/ROCK downstream μονοπάτι. Η αυξημένη εξάπλωση των E359K ILK κυττάρων μπορεί να ανασταλλεί με ενεργή RhoA ή ανενεργή Rac1 (Khyrul et al., 2004). Επιπροσθέτως, η κινάση ILK φαίνεται να ενεργοποιεί την Rac1, μέσω του παράγοντα β-pix στους ινοβλάστες και στα ενδοθηλιακά κύτταρα (Boulter E. et al., 2006). Εκτός από τις in vitro μελέτες, η δράση της ILK στην καρκινογένεση και κυτταρική επέκταση έχει φανεί και σε in vivo πειράματα. Διαγονιδιακοί μύες, που υπερεκφράζουν την ILK μέσω ενός ιού καρκίνου μαστού (MMTV/ILK), 57

59 ανέπτυξαν αδενοκαρκινώματα και όγκους των οποίων το σχήμα ήταν ατρακτοειδές (White et al., 2001). Πρόσφατα, η ILK αρχίζει και αποτελεί προγνωστικό μάρτυρα ανάπτυξης καρκίνου. Microarrays σε ιστούς και ανοσοϊστοχημεία σε 67 πρόωρα μελανώματα, έδειξαν ότι η έκφραση της ILK φαίνεται να αυξάνει την επέκταση και ανάπτυξη του μελανώματος και συνδέθηκε αντιστρόφως με την επιβίωση των ασθενών. Ε.4.5 ILK και καρκίνος Εφόσον η κινάση ILK εμπλέκεται στη ρύθμιση της κυτταρικής επιβίωσης, είναι φανερό ότι θα παίζει κάποιο ρόλο στον καρκίνο. Έχει παρατηρηθεί αύξηση της έκφρασης αυτής της κινάσης σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού, του κόλον, του προστάτη, του πνεύμονα και μελανωμάτων. Συχνά, η αύξηση αυτή εξαρτάται από το στάδιο του καρκίνου και συνδέεται με μεταστατικές περιπτώσεις (Dai et al., 2003; Graff et al., 2001; Marotta et al., 2001; Takanami, 2005). Υπερέκφραση της ILK σε επιθηλιακά κύτταρα μαστού προκάλεσε υπερπλασία του μαστικού αδένα και σχηματισμό όγκων σε διαγονιδιακούς μύες (White et al., 2001). Επομένως, η αυξημένη μεταγραφή, μετάφραση και σταθερότητα mrna/πρωτεΐνης της ILK σε καρκινικά κύτταρα θέτουν την ILK ως στόχο για θεραπευτικές προσεγγίσεις. Η δράση της κινάσης ILK είναι πολύ χαμηλή σε φυσιολογικά κύτταρα. Σε αντίθεση, στα καρκινικά κύτταρα η δράση της ILK συχνά αυξάνεται ίσως λόγω δυσλειτουργίας των upstream μορίων στα σηματοδοτικά μονοπάτια των ιντεγκρινών και αυξητικών παραγόντων pathways (Marotta et al., 2001; Persad et al., 2000). Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι σταθερά μετασχηματισμένα επιθηλιακά κύτταρα εντέρου και μαστού που υπερεκφράζουν την ILK, υιοθετούν έναν πολύ επεκτατικό φαινότυπο με τελικό αποτέλεσμα το σχηματισμό όγκου. Οι κινάσες ILK και PKB είναι ενεργές σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα προστάτη, με έλλειψη της έκφρασης της PTEN (Persad et al., 2000). Μετασχηματισμός των κυττάρων αυτών με dominant-negative ILK προκαλεί 58

60 μείωση της φωσφορυλίωσης της PKB στη σερίνη 473 (Persad et al., 2000; 2001). Επίσης, μετασχηματισμός των PTEN-μεταλλαγμένων κυττάρων με wild-type PTEN ανέστειλε τη δράση της κινάσης ILK (Persad et al., 2000). Επομένως, η ILK είναι ένας downstream μόριο στο σηματοδοτικό μονοπάτι της PTEN και θα μπορούσε να αποτελέσει θεραπευτικό στόχο σε καρκίνους που χαρακτηρίζονται από μεταλλαγές στην PTEN. Έχει βρεθεί ότι σε ασθενείς με οικογενειακή αδενωματώδη πολυποδίαση και με καρκίνωμα στο κόλον, τα επίπεδα της έκφρασης και ενεργοποίησης της κινάσης ILK είναι αυξημένα (Marotta et al., 2001), γεγονός που υποδηλώνει το ρόλο της ILK στην ανάπτυξη των κυτταρικών ανωμαλιών. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες συνδέουν την έκφραση της ILK με το στάδιο του καρκίνου του προστάτη (Graff et al., 2001). Microarrays σε ιστούς και ανοσοϊστοχημεία σε 67 πρόωρα μελανώματα, έδειξαν ότι η έκφραση της ILK φαίνεται να αυξάνει την επέκταση και ανάπτυξη του μελανώματος και συνδέθηκε αντιστρόφως με την επιβίωση των ασθενών (Dai et al., 2003). Ε.5 FAK (Focal Adhesion Kinase) H κινάση FAK είναι μία κυτταροπλασματική πρωτεΐνη με δράση κινάσης τυροσίνης και παίζει σημαντικό ρόλο σε πολλές διαφορετικές κυτταρικές διαδικασίες, μέσω της λειτουργίας της ως μορίου διασύνδεσης (Schlaepfer and Mitra, 2004). Εμπλέκεται στα μονοπάτια μεταγωγής σήματος των ιντεγκρινών και των υποδοχέων αυξητικών παραγόντων, με τελικό αποτέλεσμα τη ρύθμιση της προσκόλλησης, σχήματος και κινητικότητας των κυττάρων. Πρώτη φορά αναγνωρίστηκε το 1992 ως υπόστρωμα της κινάσης Src και αναφέρεται ως μία πολύ φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη, που συνεντοπίζεται με τις ιντεγκρίνες σε εστίες προσκόλλησης (Lipfert et al., 1992). Είναι μία πρωτεΐνη 125 kda που εκφράζεται σε αφθονία και αποτελείται από μία περιοχή FERM στο Ν-άκρο, μία κεντρική καταλυτική περιοχή με δράση κινάσης, τρεις περιοχές πλούσιες σε προλίνη και μία FAT (focal adhesion 59

61 targeting) περιοχή στο C- άκρο. Η περιοχή FERM συμμετέχει σε άμεσες αλληλεπιδράσεις με κινάσες τυροσίνης και με την πρωτεΐνη ezrin (Sieg et al., 2000; Dunty et al., 2004). Σε αντίθεση, οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ της FAK με τις ιντεγκρίνες φαίνεται να γίνονται μέσω άλλων πρωτεϊνών (Sieg et al., 2000). Επιπλέον, η FERM περιοχή έχει βρεθεί να αλληλεπιδρά με την περιοχή με δράση κινάσης της FAK, αναστέλλοντας έτσι τη δράση της (Cooper et al., 2003). Η FAT περιοχή του C-άκρου είναι υπεύθυνη για την πρόσδεση πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με την κινάση ILK και τις ιντεγκρίνες (π.χ. παξιλίνη, ταλίνη) και για τον εντοπισμό της κινάσης FAK στις εστίες προσκόλλησης (Schlaepfer and Mitra, 2004). Μία μεγαλύτερη περιοχή του C-άκρου, που περιλαμβάνει τη FAT περιοχή μαζί με τις PR1 και PR2 (περιοχές πλούσιες σε προλίνες), είναι γνωστή ως FRNK (FAK-related non-kinase domain). Αυτή η περιοχή μπορεί να εκφραστεί ανεξάρτητα από ολοκληρη τη FAK πρωτεΐνη, μέσω εναλλακτικού ματίσματος του FAK γονιδίου σε συγκεκριμένα όργανα (π.χ. πνεύμονες, όρχεις). Όταν εκφραστεί, λειτουργεί ως αρνητικός ρυθμιστής της FAK, ανταγωνιζόμενη την αλληλεπίδρασή της με τις πρωτεΐνες που προσδένονται στις ιντεγκρίνες, π.χ. παξιλίνη (Schlaepfer and Mitra, 2004). Ε.5.1 Κινάση FAK και σηματοδοτικό μονοπάτι ιντεγκρινών Η κινάση FAK συνεντοπίζεται με τις ιντεγκρίνες σε θέσεις αλληλεπίδρασης και η φωσφορυλίωσή της, μαζί με τη δράση κινάσης τυροσίνης, ρυθμίζονται από την πρόσδεση των κυττάρων στο ECM (Schlaepfer and Hunter, 1998). Η φωσφορυλίωση της FAK επάγεται επίσης από τη συνάθροιση απομονωμένων κυτταροπλασματικών περιοχών υπομονάδων β ιντεγκρινών, που συμβαίνει όταν αυτοί οι υποδοχείς προσδένουν τους φυσικούς τους προσδέτες (Hanks et al., 2003). Η κινάση FAK δεσμεύεται στην κυτταροπλασματική περιοχή πλησίον της μεμβράνης των υπομονάδων β 1, β 2 και β 3 των ιντεγκρινών (Schaller et al., 1995), μέσω της περιοχής FERM, αλληλεπίδραση που οδηγεί σε άμεση αυτοφωσφορυλίωση της τυροσίνης 397 της κινάσης FAK (Schaller et al., 1994). Φαίνεται ότι οι συνάθροιση των ιντεγκρινών προκαλεί αλλαγές στη διαμόρφωση 60

62 της FAK, αναστέλλοντας την πρόσδεση της FERM περιοχής στη περιοχή κινάσης της FAK (Cooper et al., 2003). Φωσφορυλίωση σε αυτή τη θέση μπορεί να είναι ένα ενδο- ή διαμοριακό γεγονός (Toutant et al., 2002). Επίσης, έχει αναφερθεί ότι η FAK συγκατακρημνίζεται με β 1 ιντεγκρίνες από συγκαλλιέργειες Schwann κυττάρων και νευρόνων (Chen et al., 2000). Κάτω από αυτές τις συνθήκες, η παξιλίνη επίσης συγκατακρημνίζεται με τη FAK και τις β 1 ιντεγκρίνες, γεγονός που δηλώνει την πιθανότητα έμμεσης πρόσδεσης της FAK στις β 1 ιντεγκρίνες. Η πρόσδεση της FAK και στην ταλίνη (Borowsky και Hynes, 1998; Chen et al., 1995 ) αποτελεί έναν ακόμα μηχανισμό έμμεσης πρόσδεσης της FAK στις ιντεγκρίνες. Τόσο η ταλίνη, όσο και η παξιλίνη, αλληλεπιδρούν με τη FAK και σε αυτές οφείλεται ο εντοπισμός της FAK στις εστίες προσκόλλησης (Hildebrand et al., 1993; Brown et al., 1996). Οι αλληλεπιδράσεις της FERM περιοχής με την υπομονάδα β των ιντεγκρινών και της FAT περιοχής με τις ταλίνη και παξιλίνη είναι απαραίτητες για τον εντοπισμό και την αυτοφωσφορυλίωση της FAK στις εστίες προσκόλλησης. H ενεργοποίηση της κινάσης FAK προϋποθέτει αυτοφωσφορυλίωση στο κατάλοιπο τυροσίνης 397. Η φωσφορυλίωση αυτή, όπως προαναφέραμε, μπορεί να προκαλείται είτε από συνάθροιση των ιντεγκρινών, είτα από αλληλεπίδραση με υποδοχείς αυξητικών παραγόντων, μέσω της FERM περιοχής του Ν-άκρου (Hanks et al., 2003; Schlaepfer and Mitra, 2004). Το φωσφορυλιωμένο κατάλοιπο 397 αποτελεί θέση πρόσδεσης για την κινάση c-src μέσω της SH2 περιοχής, αλληλεπίδραση που οδηγεί στην ανηγμένη διαμόρφωση της Src και στην ενζυματική ενεργοποίησή της, φωσφορυλιώνοντας έτσι τις τυροσίνες 407, 576 και 577 της FAK (Schaller et al., 1994). Οι τυροσίνες 576 και 577 βρίσκονται στην περιοχή με δράση κινάσης και η φωσφορυλίωσή τους οδηγεί στην ενίσχυση της δράσης κινάσης της FAK (Calalb et al., 1995; Hanks et al., 2003). Επιπλέον, ο σχηματισμός του συμπλόκου FAK-Src οδηγεί στη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 925, δημιουργώντας θέση πρόσδεσης για τη Grb2 και συνδέοντας τη FAK με το μονοπάτι των MAP κινασών (Schlaepfer et al., 1994; Schlaepfer and Hunter, 1997). Η φωσφορυλίωση της FAK στην τυροσίνη 925, φαίνεται να συνδέεται και 61

63 με την προσκόλληση μέσω ιντεγκρινών και με τη μείωση των επιπέδων της Ε- καντερίνης στο επαγόμενο από Src φαινόμενο ΕΜΤ σε κύτταρα από καρκίνο του πρωκτού (Brunton et al., 2005). Η φωσφορυλίωση της FAK στην τυροσίνη 397 είναι ένας από τους πολλούς τρόπους με τους οποίους οι ιντεγκρίνες μπορούν να ενεργοποιήσουν την κινάση Src. Μελέτες σε αιμοπετάλια έχουν δείξει ότι οι ιντεγκρίνες μπορούν να ενεργοποιήσουν την κινάση Src πριν και ανεξάρτητα από την κιινάση FAK. Η κυτταροπλασματική περιοχή της υπομονάδας β 3 των ιντεγκρινών μπορεί να προσδεθεί άμεσα στην περιοχή SH3 της κινάσης Src και ίσως να ευθύνεται για τη μέγιστη ενεργοποίηση της Src κατά τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων (Arias- Salgado et al.,2003; Shattil, 2005). Έτσι, η σύνδεση Src-β3 μπορεί να είναι ένας εναλλακτικός τρόπος σχηματισμού του συμπλόκου Src-FAK, με την κινάση c-src να διαδραματίζει και άμεσο ρόλο στη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 397 της FAK, καθώς έχει βρεθεί ότι κύτταρα που έχουν έλλειψη σε κινάσες Src παρουσιάζουν μειωμένη φωσφορυλίωση της Y397 της FAK (Hanks et al., 2003). Επομένως η c- Src μπορεί να ενεργεί upstream και downstream της FAK. Εκτός από κατάλοιπα τυροσίνης, η κινάση FAK περιέχει και τέσσερα κατάλοιπα σερίνης S722, S732, S843 και S910. Η θέση S722 φωσφορυλιώνεται από την κινάση GSK-3 κατά τη διάρκεια της κυτταρικής εξάπλωσης, μειώνοντας έτσι τη δράση κινάσης της FAK. Αντιστρόφως, η αναστολή της δράσης GSK-3 μειώνει τη φωσφορυλίωση της S722 και αυξάνει την ενεργοποίηση της FAK σε κύτταρα που μεταναστεύουν. Επιπλέον, είναι γνωστό ότι η αποφωσφορυλίωση της S722 μπορεί να οφείλεται στη φωσφατάση σερίνης/ θρεονίνης τύπου 1 (Bianchi et al., 2005). Ενεργοποίηση της FAK προκαλεί ποικίλα βιολογικά αποτελέσματα, όπως κυτταρική προσκόλληση, μετανάστευση, πολλαπλασιασμός και επιβίωση. Αυτές οι διαδικασίες είναι σημαντικές για το σχηματισμό, λειτουργία και αναδιαμόρφωση των κυττάρων, ιστών και οργάνων. Έλλειψη της κινάσης FAK σε έμβρυα μυών επιφέρει το θάνατο την ημέρα 8,5 (Ilic et al., 1995). Επιπλέον, η FAK είναι σημαντική στην ανάπτυξη των αγγείων, στη μετανάστευση των 62

64 ενδοθηλιακών κυττάρων και στο σχηματισμό αυλών. Ενισχυμένη σηματοδότηση από τη FAK οδηγεί σε μη ελεγχόμενο πολλαπλασιασμό, επιβίωση ή μετανάστευση κυττάρων, όπως παρατηρήθηκε στην καρκινική ανάπτυξη. 63

65 ΣΚΟΠΟΣ Η πλειοτροπίνη (pleiotrophin, PTN) είναι ένας αυξητικός παράγοντας 18 kda με υψηλή συγγένεια για την ηπαρίνη (Rauvala et al., 1992; Courty et al., 1991; Hampton et al., 1992). Σε παλαιότερες μελέτες (Papadimitriou et al., 2000 και 2001), η ερευνητική μας ομάδα έχει δείξει ότι ανασυνδυασμένη ανθρώπινη PTN μπορεί να επάγει την αγγειογένεση τόσο in vitro, επάγοντας τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και τη διαφοροποίηση διαφορετικών τύπων ενδοθηλιακών κυττάρων, όσο και in vivo στο σύστημα της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης (CAM) εμβρύου όρνιθας. Η ενδογενής ΡΤΝ επίσης φαίνεται να είναι σημαντική στη δημιουργία αγγείων in vivo, αφού μείωση της έκφρασής της στην CAM εμβρύου όρνιθας οδηγεί σε μείωση του αριθμού των αγγείων (Drosou et al., 2008). Τέλος, ΡΤΝ που παράγεται και εκκρίνεται από ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα προστάτη φαίνεται να είναι σημαντική τόσο για την ανάπτυξή τους in vitro, όσο και για την ικανότητά τους να επάγουν αγγειογένεση in vivo και in vitro (Hatziapostolou et al., 2005). Η δράση της PTN σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα φαίνεται να διαμεσολαβείται τόσο από τον υποδοχέα της με δράση φωσφατάσης τυροσίνης RPTPβ/ζ (Polykratis et al., 2005), όσο και από την ιντεγκρίνη α ν β 3 (Mikelis et al., 2009), τα οποία φαίνεται να σχηματίζουν λειτουργικό σύμπλοκο στη μεμβράνη των κυττάρων (Mikelis et al., 2009). Στο μονοπάτι μεταγωγής σήματος που ενεργοποιείται με τη δέσμευση της ΡΤΝ και οδηγεί σε επαγωγή της κυτταρικής μετανάστευσης, συμμετέχουν η κινάση c-src (Polykratis et al., 2005; Mikelis et al., 2009), η κινάση εστιακής προσκόλλησης (FAK), η 3-κινάση των φωσφοϊνοσιτιδίων (PI3K) και οι κινάσες ERK1/2 (Polykratis et al., 2005). Παρόλα αυτά, δεν είναι γνωστό αν άλλα μόρια συμμετέχουν σε κάποιο σημείο του μονοπατιού αυτού και με ποιο τρόπο. Η ιντεγκρίνη α ν β 3 εκφράζεται στην επιφάνεια ενεργοποιημένων ενδοθηλιακών κυττάρων και συμμετέχει στις αγγειογενετικές τους δραστηριότητες (Watt, 2002; Brakebusch and Fassler, 2003). Στη μεταγωγή σήματος από τις 64

66 ιντεγκρίνες γενικά, αλλά και ειδικά από την α ν β 3, σημαντικό ρόλο φαίνεται να έχει η κινάση FAK (Hanks et al., 2003; Kuphal et al., 2005), η οποία ενεργοποιείται από δέσμευση της ΡΤΝ στα ενδοθηλιακά κύτταρα και συμμετέχει στην επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση (Polykratis et al., 2005). Επιπλέον, σημαντικό ρόλο φαίνεται να παίζει και η κινάση ILK (Dedhar, 2000; Wu and Dedhar, 2001), μία κυτταροπλασματική πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με τις υπομονάδες β 1 και β 3 των ιντεγκρινών (Hannigan et al., 1996). Η ILK είναι κινάση σερίνης/θρεονίνης (Hannigan et al., 1996) και ο βιολογικός της ρόλος σχετίζεται με τη σύνδεση ιντεγκρινών και υποδοχέων αυξητικών παραγόντων με μονοπάτια μεταγωγής σήματος (Delcommenne et al., 1998; Wu et al., 1998). Αυξημένη έκφραση ή ενεργοποίηση της κινάσης ILK έχει συσχετιστεί με επαγωγή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης (Radeva et al., 1997; D Amico et al., 2000; Troussard et al., 2000; Tan et al., 2001) και επαγωγή της αγγειογένεσης (Janji et al., 2000; Wu et al., 1998). Δεν είναι γνωστό αν η κινάση ILK συμμετέχει στην επαγόμενη από ΡΤΝ μετανάστευση των κυττάρων, είναι όμως γνωστό ότι αλληλεπιδρά με ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες, όπως η κινάση FAK (Li et al., 1999), που όπως αναφέρθηκε παραπάνω, εμπλέκεται στην επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση. Η κινάση FAK αποτελεί κομβική πρωτεΐνη για πολλά μονοπάτια μεταγωγής σήματος, καθώς αποτελεί πρωτεΐνη διασύνδεσης για πολλά άλλα μόρια. H φωσφορυλίωση της κινάσης FAK σε διαφορετικές θέσεις οδηγεί σε εκλεκτική ενεργοποίηση διαφορετικών μονοπατιών μεταγωγής σήματος, τα οποία δύνανται να συμμετέχουν σε διαφορετικές δράσεις σε πολλά βιολογικά συστήματα (Calalb et al., 1995; Sonoda et al., 2000; Hanks et al., 2003). Σε προηγούμενες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας είχαμε δει ότι η ΡΤΝ επάγει τη φωσφορυλίωση σε τυροσίνη της κινάσης FAK (Polykratis et al., 2005), χωρίς όμως να είναι γνωστό ποιές είναι οι τυροσίνες που φωσφορυλιώνονται. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση της ΡΤΝ στη φωσφορυλίωση της FAK στις τυροσίνες 397, 576 και 925. Μελετήθηκε επίσης η πιθανή συμμετοχή της κινάσης ILK στην επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική 65

67 μετανάστευση, καθώς και η αλληλεπίδραση της με άλλα μόρια που είναι γνωστό ότι συμμετέχουν στην επαγόμενη από ΡΤΝ μετανάστευση ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων, όπως για παράδειγμα η κινάση FAK. 66

68 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Μ.1 Παρασκευή πλήρους θρεπτικού μέσου για HUVEC Υλικά και διαλύματα Θρεπτικό µέσο Μ199* για τα κύτταρα HUVEC M ml Πενικιλλίνη-στρεπτοµυκίνη 100 ΙU/ml Γενταμυκίνη 50 μg/ml Αμφοτερικίνη 2,5μg/ml Ν-ακετυλ- L αλάνυλ-l-γλουταµίνη 2mM Πλήρες θρεπτικό µέσο για τα κύτταρα HUVEC M199* 85ml FBS (Ορρός νεογέννητου βοός) 15ml Endothelial cell growth supplement (ECGS) Hπαρίνη 60 mg απομονωμένου ECGS 5U/ml To εκχύλισµα ECGS είναι εµπλουτισµένο σε αυξητικό παράγοντα των ινοβλαστών (FGF) και είναι απαραίτητο για την ικανοποιητική ανάπτυξη των HUVEC. Η ηπαρίνη χρησιμοποιείται προκειμένου να ενεργοποιηθεί ο ECGS. Το θρεπτικό µέσο αποστειρώνεται µε διοχέτευσή του µέσα από φίλτρο µε πόρους που έχουν διάµετρο 0,2 µm και φυλάσσεται στους 4 ο C. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Ανοίγεται η σφραγισμένη φιάλη των 500 ml θρεπτικού μέσου Μ199 (earl s). 2. Τοποθετούνται τα αντιβιoτικά: πενικιλίνη στρεπτομυκίνη (5ml), γενταμυκίνη (2.5 ml) και αμφοτερικίνη (5ml). Σε θρεπτικά μέσα Μ199* με ένδειξη ότι στερούνται γλουταμίνης (w/o glutamine) προσθέτουμε και γλουταμίνη (5ml). Η πενικιλίνη στρεπτομυκίνη έχει δράση ενάντια σε βακτήρια, ενώ η γενταμυκίνη και η αμφοτερικίνη έχουν δράση ενάντια σε μύκητες. Σε αυτό το στάδιο έχουμε το 67

69 θρεπτικό μέσο Μ199*. Είναι το ένα διάλυμα που χρησιμοποιούμε στις κυτταροκαλλιέργειες ενδοθηλιακών κυττάρων. 3. Παρασκευάζεται το πλήρες θρεπτικό μέσο για τα κύτταρα HUVEC (100 ml). Αυτό αποτελείται από 85 ml θρεπτικό μέσο Μ199*, 15 ml ορό νεογέννητου βοός (fetal calf serum, FCS), 100λ διαλύματος ηπαρίνης (5000 Units/ml) και 15 mg ECGS (Endothelial cell growth supplement). Το εκχύλισμα ECGS είναι εμπλουτισμένο σε FGF και είναι απαραίτητο για την ικανοποιητική ανάπτυξη των HUVEC. Η ηπαρίνη χρησιμοποιείται για να ενεργοποιηθεί ο ECGS. 4. Το θρεπτικό μέσο αποστειρώνεται με διοχέτευσή του με σύριγγα των 20 ml μέσα από φίλτρο με πόρους που έχουν διάμετρο 0,2 μm. Φυλάσσεται στους 4 0 C. Μ.2 Απομόνωση κυττάρων HUVEC από φλέβα ομφάλιου λώρου ανθρώπου (Pipili-Synetos et al., 1998) Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν ενδοθηλιακά κύτταρα τα οποία απομονώνονταν από φλέβα ομφάλιου λώρου ανθρώπου. Οι ομφάλιοι λώροι προμηθεύονταν από ιδιωτική κλινική της Πάτρας και προέρχονταν από καισαρικές επεμβάσεις, oι οποίες πραγματοποιούνταν 1-5 ώρες πριν από την έναρξη της απομόνωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων. Μετά το τέλος της καισαρικής, κάθε ομφάλιος λώρος εμβαπτίζεται σε αποστειρωμένο ισοτονικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS 1Χ) και μεταφέρεται στον εργαστηριακό χώρο, όπου και πραγματοποιείται η απομόνωση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Υλικά και διαλύματα PBS (10X) ph : NaHPO 4 KH 2 PO 4 NaCl 100mM 40mM 40mM 68

70 Το διάλυµα διατηρείται στους 4 0 C και αραιώνεται 10 φορές πριν από τη χρήση του, οπότε και επαναρυθμίζεται το ph του. Αποστειρώνεται στο αυτόκαυστο. Διάλυµα κολλαγενάσης 1 % 100 mg κολλαγενάσης τύπου 1Α σε 10 ml Μ199* Θρεπτικό µέσο Μ199* για τα κύτταρα HUVEC Πλήρες θρεπτικό µέσο για τα κύτταρα HUVEC ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Αραίωση της κολλαγενάσης με θρεπτικό μέσο μέχρι τελικής συγκέντρωσης 1%. Η αραίωση γίνεται πάντα σε θρεπτικό µέσο ή σε άλλο διάλυµα το οποίο περιέχει Ca 2+, τα οποία είναι απαραίτητα για τη δράση του ενζύµου. Το θρεπτικό µέσο που χρησιµοποιείται δεν πρέπει να περιέχει ορό, ο οποίος περιέχει αναστολείς διαφόρων ενζύµων. 2. Ο οµφάλιος λώρος έχει δύο αρτηρίες και µία φλέβα, η οποία είναι µεγαλύτερη, πιο εύκολα διακριτή και µε µαλακότερα τοιχώµατα. Σταθεροποιούµε µε αιµοστάτες τον οµφάλιο λώρο µε τέτοιο τρόπο, ώστε να είναι εύκολη η πρόσβαση στη φλέβα. 3. Ξεπλένεται η φλέβα µε PBS, ώστε να αποµακρυνθούν υπολείµµατα αίµατος και θρόµβοι. Στο σηµείο αυτό παρατηρείται εάν η φλέβα του οµφάλιου λώρου είναι ακέραια. Τυχόν αλλοιώσεις του τοιχώµατος της φλέβας καθιστούν αδύνατη την αποµόνωση κυττάρων. 4. Ερμητικό κλείσιμο με τη βοήθεια αιµοστάτη του ενός άκρου του οµφάλιου λώρου. 5. Διοχέτευση του θρεπτικού μέσου μέσο µε την κολλαγενάση από την άλλη είσοδο της φλέβας του ομφάλιου λώρου, χρησιμοποιώντας σύριγγα των 20 ml. Η φλέβα αρχίζει να διογκώνεται λόγω του εισερχομένου διαλύματος. 69

71 6. Ερμητικό κλείσιμο, µε τη βοήθεια αιμοστάτη, και του δεύτερου άκρου του ομφάλιου λώρου. Σε αυτό το στάδιο, αυτός είναι κλεισμένος και από τα δύο άκρα ενώ στο εσωτερικό της φλέβας βρίσκεται το διάλυµα της κολλαγενάσης. 7. O ομφάλιος λώρος τοποθετείται σε αποστειρωμένο δοχείο και επωάζεται σε υδατόλουτρο για λεπτά στους 37 o C. 8. Μετά τη συµπλήρωση της επώασης, αφαιρείται ο αιµοστάτης από τη µία πλευρά του οµφάλιου λώρου. 9. Συλλογή του υπερκειμένου (θρεπτικό μέσο µε κολλαγενάση, HUVEC) σε αποστειρωµένο σωλήνα των 50 ml. 10. Αφαίρεση του αιµοστάτη και από το άλλο άκρο του οµφάλιου λώρου. 11. Έκπλυση της φλέβας µε PBS συλλέγοντας το έκλουµα στον ίδιο σωλήνα όπου βρίσκεται το θρεπτικό µέσο µε τα κύτταρα. 12. Φυγοκέντρηση των κυττάρων σε θερµοκρασία δωµατίου, στα 1660 g για 4 λεπτά. 13. Απόρριψη του υπερκειµένου και επαναιώρηση των κυττάρων σε 10 ml πλήρους θρεπτικού µέσου. 14. Μεταφορά του θρεπτικού µέσου µε τα κύτταρα σε τρυβλίο κατάλληλο για την καλλιέργεια κυττάρων. 15. Επώαση των κυττάρων σε ολική υγρασία, στους 37 ο C και σε ατµόσφαιρα 5% CO 2 για µία ηµέρα. 16. Την επόµενη ηµέρα αφαιρείται µε πιπέτα Pasteur υπό κενό το θρεπτικό µέσο, στο οποίο περιέχονται και τα ερυθρά αιμοσφαίρια που δεν έχουν προσκολληθεί στο δάπεδο του τρυβλίου. 17. Έκπλυση των κυττάρων που έχουν προσκολληθεί στον πυθμένα του τρυβλίου δύο φορές µε PBS. 18. Προσθήκη 10 ml πλήρους θρεπτικού µέσου και παρατήρηση στο µικροσκόπιο. Εάν η αποµόνωση των κυττάρων είναι επιτυχής, διακρίνονται ομάδες κυττάρων τα 70

72 οποία είναι προσκολληµένα στο δάπεδο του τρυβλίου και τα οποία αναπτύσσονται γύρω από νοητές εστίες. 19. Επώαση των κυττάρων, ανανεώνοντας το θρεπτικό µέσο κάθε 3-4 ηµέρες, µέχρι να φτάσουν σε έναν βαθµό 80-90% πλήρους κάλυψης του πυθµένα του τρυβλίου. Μ.3 Μέτρηση κυττάρων σε αιματοκυτταρόμετρο Neubauer Είναι η πιο άμεση, απλή και αποδοτική μέθοδος μέτρησης κυττάρων που βρίσκονται σε εναιώρημα. Το αιματοκυτταρόμετρο (εικόνα Μ.1) είναι μια τροποποιημένη και διαβαθμισμένη αντικειμενοφόρος πλάκα, που περιέχει δυο κατάλληλα επεξεργασμένες, λείες επιφάνειες. Σε κάθε μια απ αυτές διακρίνεται μια διαγράμμιση σε μορφή τετραγωνισμένου πλέγματος, το οποίο αποτελείται από 9 κύρια τετράγωνα με μήκος πλευράς 1 mm (συνεπάγεται ότι το εμβαδόν του τετραγώνου είναι 1mm 2 ). Το καθένα από αυτά τα τετράγωνα ορίζεται από τρεις παράλληλες γραμμές που απέχουν μεταξύ τους μόλις 2,5 μm, που χρησιμεύουν για τον καθορισμό της θέσης των κυττάρων (το αν αυτά βρίσκονται μέσα ή έξω από το πλέγμα). Το κάθε τετράγωνο εμφανίζει διαβαθμίσεις (χωρίζεται σε μικρότερα τετράγωνα) που εξυπηρετούν την ευκολότερη μέτρηση των κυττάρων. Το αιματοκυτταρόμετρο εμφανίζει δυο ίσου μεγέθους, λείες, προεξέχουσες επιφάνειες, με επίπεδο παράλληλο με τις διαγραμμισμένες, που ονομάζονται «ράχες», και στις οποίες στηρίζεται η καλυπτρίδα. Οι διαγραμμισμένες επιφάνειες βρίσκονται 0,1 mm χαμηλότερα από τις «ράχες». Μεταξύ της εξωτερικής πλευράς κάθε τετραγωνισμένης γυαλισμένης επιφάνειας και των σημείων που στηρίζεται η καλυπτρίδα υπάρχει μια κοίλη επιφάνεια (αυλάκωση). Στην κοίλη αυτή επιφάνεια τοποθετείται το κυτταρικό εναιώρημα, το οποίο με τριχοειδικά φαινόμενα απλώνεται στην τετραγωνισμένη επιφάνεια. Ο όγκος του κυτταρικού εναιωρήματος που θα καλύπτει ένα από τα εννέα 71

73 τετράγωνα είναι 0,1 mm 3 (1,0 mm 2 x 0,1 mm) ή 1 x 10-4 ml. Έτσι, η συγκέντρωση των κυττάρων στο αρχικό εναιώρημα (σε κύτταρα / ml) είναι: Μέτρηση στο ένα από τα κύρια τετράγωνα Χ mm Πρώτο τετράγωνο περι οχή βάθος όγκος = μετρήσιμα = μη μετρήσιμα Εικόνα Μ.1: Αιματοκυτταρόμετρο Neubauer. Παρουσιάζεται σχηματικά και ο τρόπος υπολογισμού των κυττάρων. Μ.4 Ανακαλλιέργεια κυττάρων HUVEC Υλικά και Διαλύματα Διάλυμα ζελατίνης 1% κ.β. σε PBS. Τρυψίνη EDTA. Θρεπτικό µέσο Μ199* για τα κύτταρα HUVEC: Πλήρες θρεπτικό µέσο για τα κύτταρα HUVEC : PBS (10X) ph : NaHPO 4 100mM KH 2 PO 4 40mM NaCl 40mM 72

74 Το διάλυµα διατηρείται στους 4 0 C και αραιώνεται 10 φορές πριν από τη χρήση του, οπότε και επαναρυθμίζεται το ph του. Αποστειρώνεται στο αυτόκαυστο. Αιματοκυτταρόμετρο. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Για την ανακαλλιέργεια κυττάρων (HUVEC), γίνεται επίστρωση όλων των τρυβλίων που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν με διάλυμα ζελατίνης 1% κ.β και τοποθετούνται στον επωαστή τουλάχιστον 20 λεπτά πριν την έναρξη της ανακαλλιέργειας. Η επίστρωση αυτή γίνεται για να διευκολυνθούν τα επιθηλιακά κύτταρα (HUVEC) στην προσκόλλησή τους στον πυθμένα του τρυβλίου. 2. Αρχικά γίνεται παρατήρηση του τρυβλίου στο μικροσκόπιο. Η εικόνα των κυττάρων είναι ενδεικτική της κατάστασής τους. Τα κύτταρα που είναι προσκολλημένα στο δάπεδο του τρυβλίου θεωρούνται υγιή. Αυτά τα οποία έχουν πιο σφαιρική μορφή και επιπλέουν στο θρεπτικό μέσο θεωρούνται νεκρά. Εκτός από τη θέση και τη μορφολογία των κυττάρων παρατηρείται και η συγκέντρωσή τους, από την οποία εξαρτάται το αν θα πραγματοποιηθεί η ανακαλλιέργεια (split). Η ανακαλλιέργεια πραγματοποιείται όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει το % της επιφάνειας του δαπέδου του τρυβλίου, οπότε θεωρείται ότι υπάρχει πλήρης κάλυψη. 3. Μεταφορά του τρυβλίου με τα κύτταρα σε θάλαμο νηματικής ροής, όπου είναι δυνατή η εργασία υπό στείρες συνθήκες. Αναρρόφηση υπό κενό του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας και ξέπλυμα των κυττάρων δύο φορές με PBS (1X). Με τη διαδικασία αυτή απομακρύνονται τυχόν εναπομείναντα ίχνη ορού, τα οποία περιέχουν αναστολείς της τρυψίνης. 4. Προσθήκη 1ml- 1,5ml τρυψίνης ανά τρυβλίο 100mm. Η πορεία αποκόλλησης των κυττάρων παρακολουθείται στο μικροσκόπιο. Η επιβίωση των κυττάρων κινδυνεύει σε περίπτωση παραμονής τους πλέον των 10 λεπτών στην τρυψίνη. 5. Με την ολοκλήρωση της αποκόλλησης των κυττάρων, η τρυψίνη αναστέλλεται με την προσθήκη 3ml πλήρους θρεπτικού μέσου Μ199 που περιέχει 15% ορό 73

75 6. Μεταφορά του εναιωρήματος των κυττάρων σε αποστειρωμένο σωλήνα των 15ml. Προσθήκη PBS και συλλογή των κυττάρων που έχουν εναπομείνει μέσα σε τρυβλίο. Φυγοκέντρηση για 4 λεπτά στους 26 0 C στα 1660 g. 7. Απομάκρυνση του υπερκείμενου θρεπτικού μέσου και προσθήκη πλήρους θρεπτικού μέσου Μ199 μέχρι τελικού όγκου 3ml. Επαναιώρηση των κυττάρων με τη βοήθεια πιπέτας. 8. Προσθήκη 10μl από το εναιώρημα των κυττάρων στην ειδική υποδοχή του αιματοκυτταρόμετρου και μέτρηση του αριθμού των κυττάρων στο μικροσκόπιο. 9. Για κάθε ανακαλλιέργεια κυττάρων HUVEC χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα ανά τρυβλίο 100mm. Μ.5 Κατάψυξη κυττάρων HUVEC Η διατήρηση των ζωικών κυττάρων για μεγάλο χρονικό διάστημα είναι δυνατή με την αποθήκευση τους σε υγρό άζωτο σε θερμοκρασίες μεταξύ C και C. Για την επιτυχή διατήρηση τους, είναι απαραίτητο να βρίσκονται σε καλή μεταβολική κατάσταση πριν από την ψύξη τους και για το λόγο αυτό, κατά γενικό κανόνα, η ψύξη των κυττάρων πραγματοποιείται όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου. Επιπλέον, η ψύξη των κυττάρων πραγματοποιείται βαθμιαία (περίπου 1 0 C ανά ώρα), μέχρι η θερμοκρασία τους να φτάσει ένα κρίσιμο σημείο (-20 0 C), προκειμένου να αποφευχθεί ο σχηματισμός πάγου στο εσωτερικό τους και να ελαχιστοποιηθεί η απώλεια νερού. Επίσης, για να αποφευχθεί ο σχηματισμός πάγου στο εσωτερικό των κυττάρων, καταψύχονται παρουσία διμέθυλου-σουλφοξύδιου (DMSO) ή γλυκερόλης 74

76 Υλικά και Διαλύματα DMSO (dimethylsulfoxide, διμέθυλο-σουλφοξύδιο). Μ199*. Πλήρες θρεπτικό μέσο Μ199. FCS. Cryovials. Ειδικό δοχείο ψύξης κυττάρων µε ισοπροπανόλη. Δοχείο ψύξης κυττάρων με υγρό άζωτο. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Αποκόλληση των κυττάρων από την επιφάνεια του τρυβλίου στο οποίο καλλιεργούνται, όπως περιγράφτηκε παραπάνω. 2. Φυγοκέντρηση για 4 λεπτά στα 500 g και τους 26 0 C. 3. Ενώ πραγµατοποιείται η φυγοκέντρηση, προστίθενται σε ένα cryovial 100 µl DMSO. Σηµειώνουµε στο cryovial τον κυτταρικό τύπο, την ηµεροµηνία ψύξης, τον αριθµό των κυττάρων και η γενιά που θα είναι τα κύτταρα όταν θα ξεπαγώσουν. 4. Όταν ολοκληρωθεί η φυγοκέντρηση, αφαιρείται το υπερκείµενο θρεπτικό µέσο. 5. Επαναιώρηση του ιζήµατος των κυττάρων σε 900 µl ορού. 6. Προσθήκη του εναιωρήµατος των κυττάρων στα 100 µl DMSO και πολύ γρήγορη ανάδευσή τους προκειµένου να επιτευχθεί η οµοιογενής κατανοµή του DMSO. Η τελική συγκέντρωση του DMSO είναι 10% (δεν πρέπει να υπερβαίνει το 20% καθώς αυξάνεται η τοξική του επίδραση στα κύτταρα) και χρησιµοποιείται προκειµένου να αµβλυνθεί η επίδραση της δηµιουργίας κρυστάλλων νερού στο εσωτερικό των κυττάρων. 75

77 7. Τοποθέτηση των κυττάρων σε κατάλληλες υποδοχές σε δοχείο ψύξης κυττάρων που περιέχει παγωµένη ισοπροπανόλη, στους C για ώρες. Με τον τρόπο αυτό, επιτυγχάνεται η σταδιακή µείωση της θερµοκρασίας των κυττάρων (περίπου 1 0 C ανά ώρα). Η σταδιακή µείωση της θερµοκρασίας συµβάλλει στη µεγαλύτερη βιωσιµότητα τους. 8. Τοποθέτηση των κυττάρων σε ειδικές υποδοχές στο υγρό άζωτο, έως ότου απαιτηθεί η επαναχρησιµοποίησή τους. Μ.6 Απόψυξη κυττάρων HUVEC Κατά τη διαδικασία αυτή κύτταρα, τα οποία έχουν παραμείνει παγωμένα ακόμα και για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα, είναι δυνατόν να επανακαλλιεργηθούν. Η διαδικασία γίνεται και αυτή υπό άσηπτες συνθήκες και όσο το δυνατόν ταχύτερα, προκειμένου τα κύτταρα να μην εκτεθούν στο DMSO, το οποίο μπορεί να δράσει τοξικά. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Σε αποστειρωµένο σωληνάκι των 15 ml προστίθενται 9 ml πλήρους θρεπτικού µέσου Μ Αφαίρεση των κυττάρων από το υγρό άζωτο. 3. Ξεπάγωµα των κυττάρων όσο το δυνατόν πιο γρήγορα, µε ανακίνηση σε υδατόλουτρο 37 0 C. 4. Μεταφορά των κυττάρων στα 9 ml του θρεπτικού µέσου που είναι ήδη έτοιµο και ανάµιξη µε γρήγορες κινήσεις. Το στάδιο αυτό αποσκοπεί στην αραίωση του DMSO στο οποίο βρίσκονται τα κύτταρα, που σε θερµοκρασία δωµατίου είναι πολύ τοξικό για αυτά. 5. Φυγοκέντρηση για 4 λεπτά στα 500 g σε θερµοκρασία δωµατίου. 76

78 6. Αφαίρεση του υπερκείµενου µε πιπέτα Pasteur υπό κενό. 7. Επαναιώρηση του ιζήµατος των κυττάρων σε 1 ml πλήρους θρεπτικού μέσου Μ Προσθήκη επιπλέον πλήρους θρεπτικού µέσου µέχρι τελικού όγκου 10 ml. 9. Φυγοκέντρηση για 4 λεπτά στα 500 g και σε θερµοκρασία δωµατίου. 10. Αφαίρεση του υπερκείµενου µε πιπέτα Pasteur υπό κενό. 11. Επαναιώρηση του ιζήµατος των κυττάρων σε 1 ml πλήρους θρεπτικού µέσου. Προσθήκη επιπλέον πλήρους θρεπτικού µέσου µέχρι τελικού όγκου 10 ml. 12. Μεταφορά των κυττάρων σε τρυβλίο καλλιέργειας. 13. Παρατήρηση των κυττάρων στο µικροσκόπιο. 14. Καλλιέργεια των κυττάρων, ανανεώνοντας το θρεπτικό µέσο κάθε 3-4 ηµέρες, µέχρι να φτάσουν σε ένα βαθµό 80-90% κάλυψης του τρυβλίου Μ.7 Επώαση κυττάρων HUVEC με ουσίες για μελέτη φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών Η επώαση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC με τις προς μελέτη ουσίες πραγματοποιήθηκε όταν τα κύτταρα είχαν καλύψει το 70-80% της επιφάνειας του τρυβλίου. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Μεταφορά των τρυβλίων σε θάλαμο νηματικής ροής για να επιτευχθούν στείρες συνθήκες για την πραγματοποίηση της διαδικασίας. 2. Αναρρόφηση του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 3. Ήπιο ξέπλυμα του πυθμένα του τρυβλίου (κυττάρων) δυο φορές με (2-3 ml) 77

79 PBS. 4. Προσθήκη Μ199* χωρίς ορό στην περίπτωση της μελέτης φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών. Ο λόγος της επώασης των κυττάρων σε συνθήκες «πείνας», δηλαδή σε θρεπτικό μέσο χωρίς καθόλου ορό (0,25% BSA), γίνεται για να μειωθεί η συγκέντρωση των αυξητικών παραγόντων που υπάρχουν σε αυτόν, ώστε να μπορέσουν τα κύτταρα να ανταποκριθούν καλύτερα στις ουσίες με τις οποίες θα επωασθούν. Η επώαση στο νέο θρεπτικό μέσο (starvation) διαρκεί 16 ώρες σε θερμοκρασία 37 ο C και ατμόσφαιρα περιεκτικότητας 5% σε CO Με το πέρας των 16 ωρών ακολουθεί μεταφορά των τρυβλίων σε θάλαμο νηματικής ροής. 6. Ακολουθεί αναρρόφηση του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 7. Ήπιο ξέπλυμα του πυθμένα του τρυβλίου (κυττάρων) δυο φορές με (2-3 ml) PBS. 8. Προσθήκη θρεπτικού μέσου Μ199* χωρίς ορό (0,25% BSA) για τη μελέτη φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών. Στο θρεπτικό προστίθενται οι προς μελέτη ουσίες για καθορισμένους για κάθε πείραμα χρόνους. 9. Με το πέρας του χρόνου επώασης γινόταν λύση των κυττάρων με το διάλυμα ομογενοποίησης των δειγμάτων, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Μ.8. Μ.8 Εκχύλιση πρωτεϊνών από κύτταρα σε καλλιέργεια Η ανάλυση και μελέτη των πρωτεϊνών έγινε σε ολικά εκχυλίσματα από τις καλλιέργειες των κυττάρων που χρησιμοποιήθηκαν. Κατά τη διαδικασία αυτή, τα κύτταρα λύονται με διάλυμα το οποίο περιέχει απορρυπαντικό, προκειμένου να σπάσουν οι μεμβράνες των κυττάρων και αναστολείς πρωτεϊνασών για να προστατευθούν οι πρωτεΐνες από πρωτεολυτική διάσπαση. Κατόπιν, πραγματοποιείται φυγοκέντρηση και το υπερκείμενο περιλαμβάνει το διαλυτό 78

80 κλάσμα των ολικών πρωτεϊνών των κυττάρων. Η διαδικασία πραγματοποιείται σε πάγο ή στους 4 0 C, προκειμένου να ανασταλεί η δράση των πρωτεϊνασών και να παραταθεί η διατήρηση των πρωτεϊνών. Υλικά και Διαλύματα PBS 1X ph 7, 4 Διάλυμα ομογενοποίησης* PBS 1X ph 7,4 99 ml Triton X-100 1% SDS 0,1% EDTA 1 mm Απροτινίνη 2 μg /ml PMSF 1 mm Na 3 VO 4 1 mm ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Απομάκρυνση υπό κενό του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας. 2. Έκπλυση των κυττάρων 2 φορές με PBS. 3. Προσθήκη στο τρυβλία (των 5 ml) 400 μl διαλύματος ομογενοποίησης*. Επώαση για 5 λεπτά σε πάγο ώστε να μεγιστοποιηθεί η ποσότητα των εκχυλιζόμενων πρωτεϊνών. 4. Φυγοκέντρηση του δείγματος για 30 λεπτά στα g και στους 4 0 C. 5. Λήψη του υπερκειμένου ομογενοποιήματος. Το ομογενοποίημα χρησιμοποιείται άμεσα ή διατηρείται μέχρι 2 μήνες στους C. 79

81 Μ.9 Εκτίμηση της συγκέντρωσης ολικής πρωτείνης σε διάλυμα (Μέθοδος Bradford, Bradford et al., 1976) Υλικά και Διαλύματα Διάλυμα Bradford (1X) Coomasie G-250 0,1m M 95% αιθανόλη 5% κ.ο 85% Η 3 PO 4 10% κ.ο. Διήθηση του διαλύματος 5 φορές με χρήση διηθητικού χαρτιού. Φασματοφωτόμετρο Hitachi U-1100 ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Προσθήκη 3 μl δείγματος σε 1 ml αντιδραστήριο Bradford και ανάδευση σε αναδευτήρα Vortex. 2. Παραμονή για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και φωτομέτρηση στα 595 nm. 3. Για την κατασκευή της πρότυπης καμπύλης χρησιμοποιείται αλβουμίνη βόιου ορού (Bovine Serum Albumin, BSA). Μ.10 Ανοσοκατακρήμνιση πρωτεϊνών Η ανοσοκατακρήμνιση αποτελεί μία μορφή χρωματογραφίας συγγένειας. Σε αυτήν, ως στερεή φάση χρησιμοποιούνται σφαιρίδια από αγαρόζη ή κάποιο ανάλογο υλικό. Πάνω στα σφαιρίδια βρίσκεται ομοιοπολικά δεσμευμένη πρωτεΐνη Α και πρωτεΐνη G, πρωτεΐνες βακτηριακής προέλευσης που δεσμεύουν με μεγάλη συγγένεια την Fc περιοχή ορισμένων τύπων IgG ανοσοσφαιρινών. Με τη χρήση της δημιουργείται ένα σύμπλοκο σφαιριδίων-πρωτεϊνών Α και G-αντισωμάτων στο οποίο δεσμεύεται επιλεκτικά το αντιγόνο που θέλουμε να κατακρημνίσουμε. 80

82 Το σύμπλοκο αυτό είναι δυνατό νασυλλεχθεί μετά από φυγοκέντρηση και οι πρωτεΐνες που υπάρχουν σε αυτό να αποδεσμευτούν με τη χρήση αποδιατακτικών παραγόντων. PBS 1X ph 7, 4 Υλικά και Διαλύματα Εναιώρημα 50% πρωτεΐνης Α/G σεφαρόζης (Calbiochem) Αντισώματα: Αντίσωμα Εταιρία Χρησιμοποιούμενη αραίωση ILK (4G9) Cell Signaling 1:500 Integrin β3 Chemicon 1:250 FAK Santa Cruz Biotechnology, Inc. 1:200 Src (CD11) Upstate 1:250 ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Πραγματοποιείται λύση κυττάρων που έχουν καλύψει πλήρως την επιφάνεια του τρυβλίου. Το πρωτεϊνικό εκχύλισμα συλλέγεται και ποσοτικοποιείται η περιεκτικότητά του σε ολική πρωτεΐνη με τη μέθοδο Bradford ,5mg από το πρωτεϊνικό εκχύλισμα προστίθενται σε σωληνάριο eppendorf και αραιώνεται μέχρι όγκου 1 ml με ρυθμιστικό διάλυμα PBS. 3. Το δείγμα επωάζεται με 10 μl ενυδατωμένων σφαιριδίων πρωτεϊνών Α και G για 2 ώρες στους 4 0 C. Στο στάδιο αυτό απομακρύνονται τυχόν πρωτεΐνες οι οποίες δεσμεύονται μη ειδικά στα σφαιρίδια. 4. Το δείγμα φυγοκεντρείται ( g, 5 λεπτά, 4 0 C) και το υπερκείμενο μεταφέρεται σε νέο σωλήνα eppendorf. 5. Στο υπερκείμενο του προηγούμενου σταδίου προστίθεται αντίσωμα έναντι του αντιγόνου που θέλουμε να ανοσοκατακρημνίσουμε. Η ποσότητα του αντισώματος που θα χρησιμοποιηθεί είναι σημαντική για την επιτυχία του πειράματος και 81

83 πρέπει να είναι τέτοια, ώστε να επιτυγχάνεται η ποσοτική δέσμευση του αντιγόνου, χωρίς όμως να δεσμεύεται μη ειδικά σε άλλες πρωτεΐνες. 6. Το δείγμα επωάζεται για 16 ώρες, στους 4 0 C, υπό συνεχή ανακίνηση. 7. Στο δείγμα προστίθενται 10 μl εναιωρήματος 50% κ.ό. πρωτεΐνης-α, G σεφαρόζης και η επώαση συνεχίζεται για 2 ώρες στους 4 0 C. 8. Τα σφαιρίδια σεφαρόζης συλλέγονται με φυγοκέντρηση του δείγματος (5.000 g, 5 λεπτά, 4 0 C) και απόρριψη του υπερκειμένου. 9. Επαναδιάλυση των σφαιριδίων σε 1 ml κρύου διαλύματος λύσης των κυττάρων (ξέπλυμα των σφαιριδίων). 10. Επανάληψη των σταδίων 8-9 ακόμα 2 φορές. 11. Τα σφαιρίδια τα οποία έχουν συλλεχθεί μετά από την τελευταία φυγοκέντρηση αναδιαλύονται σε 50 μl ρυθμιστικού διαλύματος δειγμάτων για SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση 2Χ. Πραγματοποιείται ηλεκτροφορητική ανάλυση των δειγμάτων. Μ.11 SDS ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) Η ανάλυση των πρωτεϊνών έγινε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου, παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων SDS και διθειοθρεϊτόλης (DTT). Το SDS είναι ένα ιοντικό απορρυπαντικό το οποίο δεσμεύεται στις πρωτεΐνες με σταθερή αναλογία βάρους (1,4 g SDS ανά g πρωτεΐνης). Η επιπλέον χρήση αναγωγικών παραγόντων, όπως είναι η DTT ή η β- μερκαπτοαιθανόλη, έχει ως αποτέλεσμα την αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών των πρωτεϊνών. Η πλήρης αποδιάταξη των πρωτεϊνών επιτυγχάνεται με θέρμανση των πρωτεϊνικών δειγμάτων για 5 λεπτά στους C, παρουσία όλων των παραπάνω αποδιατακτικών παραγόντων. Εξαιτίας του SDS, οι πρωτεïνες που περιέχονται στα δείγματα έχουν φορτιστεί αρνητικά και είναι δυνατή η κίνησή τους όταν βρεθούν εντός ηλεκτρικού πεδίου. Η ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα είναι συνάρτηση του μοριακού τους βάρους. 82

84 1,5 M Tris-HCl ph 8,8: Υλικά και Διαλύματα Τris-base 45,4 g Απεσταγμένο H 2 O 180 ml Το διάλυμα ρυθμίζεται σε ph=8,8 με τη χρήση διαλύματος HCl 37% και συμπληρώνεται απεσταγμένο H 2 O μέχρι τελικού όγκου 250 ml. 0,5 M Tris-HCl ph 6,8: Τris-base 6,055 g Απεσταγμένο H 2 O 80 ml Το διάλυμα ρυθμίζεται σε ph=6,8 με τη χρήση διαλύματος HCl 37% και συμπληρώνεται απεσταγμένο H 2 O μέχρι τελικού όγκου 100 ml. Διάλυμα ακρυλαμιδίου / μεθυλεν-δις-ακρυλαμιδίου 30% (30:1): Ακρυλαμίδιο Μεθυλεν-δις-ακρυλαμίδιο Απεσταγμένο H 2 O 150 g 5 gr Μέχρι τελικού όγκου 500 ml Διάλυμα SDS 10% κ.β.: SDS Απεσταγμένο H 2 O 10 g 100 ml Διάλυμα υπερθεϊικού αμμωνίου 20% κ.β.: Υπερθεϊικό αμμώνιο Απεσταγμένο H 2 O 20 g Μέχρι τελικού όγκου 100 ml 83

85 TEMED Ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων ( 2Χ ) ουρία SDS Tris-base γλυκερόλη μπλε της βρωμοφαινόλης β-μερκαπτοαιθανόλη 4 Μ 0,03 Μ 0,05 Μ 10% κ.ο. 2% κ.β. 10% κ.ο. Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροδίων (5Χ) Tris-base 250 mm Γλυκίνη 2 M SDS 0,5% Απεσταγμένο H 2 O Μέχρι τελικού όγκου 1 lt Το διάλυμα διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου και αραιώνεται 1:5 με απεσταγμένο Η 2 Ο πριν από τη χρήση του. Πήκτωμα συμπυκνώσης (3,5%) dh 2 O 2 ml Διάλυμα ακρυλαμιδίου/μεθυλεν-δις-ακρυλαμιδίου 4,9 ml 0,5 M Tris-HCl ph 6,8 0,94 ml SDS 80 μl Ammonium persulfate (AP) 20% 80 μl TEMED 8 μl Πήκτωμα διαχωρισμού 7,5% 10% dh 2 O 4,24 ml 3,41 ml Διάλυμα ακρυλαμιδίου / μεθυλεν-δις-ακρυλαμιδίου 2,51 ml 3,34 ml 1,5 M Tris-HCl ph 8,8 2,5 ml 2,5 ml SDS 100 μl 100 μl AP 20% 100 μl 100 μl TEMED 10 μl 10 μl 84

86 ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Διαμορφώνεται ειδική υάλινη μήτρα διαστάσεων 9,5 cm X 7,5 cm X 0,1 cm, μέσα στην οποία θα πραγματοποιηθεί ο πολυμερισμός των πηκτωμάτων διαχωρισμού και συμπυκνώσεως. 2. Πραγματοποιείται πολύ καλή και γρήγορη ανάδευση των συστατικών που απαρτίζουν το πήκτωμα διαχωρισμού. 3. Απόχυση των υγρών ακόμα συστατικών του πηκτώματος διαχωρισμού στην υάλινη μήτρα και επικάλυψη με απεσταγμένο νερό. Παρατηρούμε τον πολυμερισμό του πηκτώματος έτσι ώστε να βεβαιωθούμε ότι πραγματοποιείται φυσιολογικά (2-15 λεπτά, ανάλογα με τη σύσταση του πηκτώματος ή/και τη θερμοκρασία του περιβάλλοντος). 4. Απόχυση του απεσταγμένου νερού από την επιφάνεια του πηκτώματος. 5. Πραγματοποιείται πολύ καλή και γρήγορη ανάδευση των συστατικών που απαρτίζουν το πήκτωμα συμπύκνωσης. 6. Απόχυση των υγρών ακόμα συστατικών του πηκτώματος συμπυκνώσεως στην υάλινη μήτρα, πάνω από την επιφάνεια του πηκτώματος διαχωρισμού. Προσθήκη κατάλληλης ελαστικής μήτρας, η οποία είναι υπεύθυνη για τη δημιουργία των φρεατίων στο πήκτωμα συμπυκνώσεως. Παρατηρούμε τον πολυμερισμό του πηκτώματος για να βεβαιωθούμε ότι πραγματοποιείται φυσιολογικά (5-15 λεπτά ανάλογα με τη θερμοκρασία του περιβάλλοντος). 7. Ανάμιξη των δειγμάτων που θα ηλεκτροφορηθούν με ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων 5Χ σε αναλογία 4:1. 8. Θέρμανση των δειγμάτων για 5 λεπτά στους C. 9. Φυγοκέντρηση των δειγμάτων για 5 λεπτά στα g και σε θερμοκρασία δωματίου. 10. Προσθήκη των δειγμάτων στις ειδικές υποδοχές του πηκτώματος συμπύκνωσης. 85

87 11. Πραγματοποίηση της ηλεκτροφόρησης σε θερμοκρασία δωματίου με την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου σταθερής έντασης 35 ma, μέχρι η χρωστική μπλε της βρωμοφαινόλης να φθάσει 0,5 cm πριν το άκρο του πηκτώματος της ηλεκτροφόρησης. 12. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφορητικής ανάλυσης, γίνεται τοποθέτηση του πηκτώματος διαχωρισμού σε κατάλληλη συσκευή, για μεταφορά των πρωτεινών από το πήκτωμα σε μεμβράνη PVDF (Western Blot). M.12 Ανοσοστύπωμα (Western blot) Η μέθοδος αυτή επιτρέπει την εκλεκτική ανίχνευση μιας πρωτεΐνηςαντιγόνου, με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων που έχουν παρασκευαστεί γι αυτό. Η μέθοδος περιλαμβάνει την ηλεκτροφορητική ανάλυση ενός πρωτεϊνούχου διαλύματος σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου, την ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνες και τέλος τη δέσμευση των ειδικών αντισωμάτων στο αντιγόνο. Μετά από την κάλυψη των κενών θέσεων της μεμβράνης (blocking) πραγματοποιείται επώαση της μεμβράνης με ειδικό έναντι του υπό μελέτη αντιγόνου αντίσωμα. Στη συνέχεια, η μεμβράνη επωάζεται με αντίσωμα που αναγνωρίζει την Fc περιοχή του πρώτου αντισώματος. Το δεύτερο αντίσωμα είναι σημασμένο είτε ενζυμικά είτε ραδιενεργά, οπότε είναι δυνατή η ανίχνευση του συμπλόκου αντιγόνου αντισώματος μετά από την προσθήκη κατάλληλου υποστρώματος. Στα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία, όλα τα δεύτερα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν σημασμένα ενζυμικά με την υπεροξειδάση (horse-raddish peroxidase, HRP). 86

88 Υλικά και Διαλύματα Ρυθμιστικό διάλυμα για τη συσκευή μεταφοράς πρωτεϊνών (10Χ): Γλυκίνη 400 mm Tris base 500 mm SDS 0,37% κ.β. Το διάλυμα διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου και αραιώνεται πριν από τη χρήση του με αναλογία ρυθμιστικού διαλύματος:απεσταγμένο Η 2 Ο:μεθανόλη ίση με 1:7:2. Ρυθμιστικό διάλυμα TBS ph 7,6 (10Χ): Tris base 200 mμ NaCl 1,36 Μ Απεσταγμένο Η 2 Ο 800 ml Ρυθμίζεται το ph του διαλύματος σε τιμή ίση με 7,6 με τη χρήση πυκνού διαλύματος HCl (37%) και συμπληρώνεται ο όγκος του μέχρι 1lt με απεσταγμένο Η 2 Ο. Το διάλυμα διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου και χρησιμοποιείται ως 1Χ μετά από αραίωση 1:9 με απεσταγμένο Η 2 Ο. Μεμβράνη PVDF (polyvinylidene fluoride): Millipore Immobilon-P Transfer Membrane. Άπαχο γάλα σε σκόνη (Regilait). BSA. Ρυθμιστικό διάλυμα TBS Tween 20 ph 7,6 (ΤΒS-T). Σύστημα Χημειοφωταύγειας: Χρησιμοποιήθηκε το ολοκληρωμένο σύστημα χημειοφωταύγειας από την εταιρεία Chemicon (ChemiLucent TM #2600). 87

89 Πίνακας M.1: Αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν κατά τα πειράματα με ανοσοστύπωμα. Αντίσωμα PTN Actin phospho-β-catenin (Thr41/Ser45) (#9565, rabbit) β-catenin antibody (#9562, rabbit) PY20 (#sc-508, mouse) FAK (sc-932, rabbit) ILK1 (#3862, rabbit) ILK (4G9) (#3856, rabbit) Integrin β3 phospho-fak Y397(#MAB1144, mouse) phospho-fak Y925 (#3284, rabbit) phospho-fak Y576 (#44-652G, rabbit) Src (clone GD11, #05-184, mouse) Anti-rabbit IgG (A0545, goat) Anti-goat IgG (B3148, mouse, clone GT-34) Anti-mouse IgG (A9917, goat) Προέλευση Πολυκλωνικό αντίσωμα, Lab. CRRET,France Πολυκλωνικό αντίσωμα, Chemicon Πολυκλωνικό αντίσωμα, Cell Signaling Πολυκλωνικό αντίσωμα, Cell Signaling Μονοκλωνικό αντίσωμα, Santa Cruz Biotechnology, Inc. Πολυκλωνικό αντίσωμα, Santa Cruz Biotechnology, Inc. Πολυκλωνικό αντίσωμα, Cell Signaling Μονοκλωνικό αντίσωμα, Cell Signaling Πολυκλωνικό αντίσωμα, Chemicon Μονοκλωνικό αντίσωμα, Chemicon Πολυκλωνικό αντίσωμα, Cell Signaling Πολυκλωνικό αντίσωμα, Biosource Μονοκλωνικό αντίσωμα, Upstate Συνδεδεμένο με υπεροξειδάση, Sigma Συνδεδεμένο με υπεροξειδάση, Sigma Συνδεδεμένο με υπεροξειδάση, Sigma 88

90 Πίνακας M.2: Συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν κατά τα πειράματα με ανοσοστύπωμα. Πρωτεΐνη Actin PY20 Παρεμπόδιση μη ειδικής δέσμευσης (2 ώρες, RT) 5% γάλα σε TBS-T 0,05% 3% BSA σε TBS-T 0,1% 1 ο Αντίσωμα (16 ώρες, 4 o C) 1:500 (3% γάλα σε TBS-T 0,05%) 1:5000 (1% BSA σε TBS-T 0,1%) 2 ο Αντίσωμα (1 ώρα,rt) Anti-mouse IgG 1:5000 (3% γάλα σε TBS-T 0,05%) Anti-mouse IgG 1:5000 (σε TBS-T 0,1%) phospho-β-catenin (Thr41/Ser45) β-catenin Integrin β3 FAK PTN (goat) ILK1 ILK (4G9) pfak Y397 5% γάλα σε TBS-T 0,1% 5% γάλα σε TBS-T 0,1% 5% γάλα σε TBS-T 0,05% 5% γάλα σε TBS-T 0,1% 3% BSA σε TBS-T 0,05% 5% γάλα σε TBS-T 0,1% 5% γάλα σε TBS-T 0,1% 3% γάλα σε TBS-T 0,05% 1:1000 (5% BSA σε TBS-T 0,1%) 1:1000 (5% BSA σε TBS-T 0,1%) 1:1000 (σε TBS-T 0,05%) 1:600 (3% γάλα σε TBS-T 0,1%) 1:5000 σε TBS-T 0,05% 1:1000 (5% BSA σε TBS-T 0,1%) 1:1000 (5% BSA σε TBS-T 0,1%) 1 :1000 (TBS-T 0,1%) Anti-rabbit IgG 1:12500 (σε TBS-T 0,1%) Anti-rabbit IgG 1:12500 (σε TBS-T 0,1%) Anti-rabbit IgG 1:5000 (σε TBS-T 0,05%) Anti-rabbit IgG 1:12500 (σε TBS-T 0,1%) Anti-goat 1:7500 (σε TBS-T 0,05%) Anti-rabbit IgG 1:12500 (σε TBS-T 0,1%) Anti-mouse IgG 1:5000 (σε TBS-T 0,1%) Anti-mouse IgG 1 :5000 (TBS-T 0,1%) pfak Y925 pfak Y576 Src 5% γάλα σε TBS-T 0,05% 3% γάλα σε TBS-T 0,05% 5% γάλα σε TBS-T 0,1% 1:1000 (5% BSA σε TBS-T 0,1%) 1:1000 (3% BSA σε TBS-T 0,1%) 1:1000 (γάλα 3% σε TBS-T 0,1%) Anti-rabbit IgG 1:12500 (σε TBS-T 0,1%) Anti-rabbit IgG 1:12500 (σε TBS-T 0,1%) Anti-mouse IgG 1:5000 (γάλα 3% σε TBS-T 0,1%) 89

91 ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφορητικής ανάλυσης, γίνεται τοποθέτηση του πηκτώματος διαχωρισμού σε κατάλληλη συσκευή, για μεταφορά των πρωτεϊνών από το πήκτωμα σε μεμβράνη PVDF. 2. Εφαρμογή σταθερής ένταση ρεύματος 400 ma για 3 ώρες. Τα δείγματα μεταφέρονται από τον αρνητικό στο θετικό πόλο. 3. H μεμβράνη υφίσταται κατάλληλη επεξεργασία ανάλογα με το είδος της πρωτεΐνης που αναλύεται, προκειμένου να πραγματοποιηθεί η παρεμποδιστεί η μη ειδική δέσμευση των αντισωμάτων (Πίνακας M.1 και Μ.2). 4. Πραγματοποιούνται 3 ξεπλύματα της μεμβράνης για 5 λεπτά το καθένα με διάλυμα TBS-T σε θερμοκρασία δωματίου. 5. Εμβάπτιση της μεμβράνης και επώαση σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει το πρώτο αντίσωμα σε κατάλληλη αραίωση, όπως φαίνεται στον Πίνακα M Συλλογή του πρώτου αντισώματος. 7. Πραγματοποιούνται 3 ξεπλύματα της μεμβράνης για 5 λεπτά με διάλυμα TBS- T σε θερμοκρασία δωματίου. 8. Επώαση της μεμβράνης σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει το δεύτερο αντίσωμα, σε θερμοκρασία δωματίου υπό ανακίνηση, όπως φαίνεται στον Πίνακα M Πραγματοποιούνται 3 ξεπλύματα της μεμβράνης για 5 λεπτά με διάλυμα TBS- T σε θερμοκρασία δωματίου και ένα ξέπλυμα των 5 λεπτών με TBS. 10. Εμφάνιση του ανοσοστυπώματος της πρωτεΐνης στη μεμβράνη με σύστημα χημειοφωταύγειας. 90

92 Εικόνα Μ.2: Σχηματική αναπαράσταση της συσκευής ηλεκτρομεταφοράς πρωτεϊνών. Αριστερά, σε μεγέθυνση απεικονίζεται η διάταξη που απαιτείται για τη σωστή ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών. Αυτή περιλαμβάνει σπόγγους, χαρτιά Whatman, την PVDF μεμβράνη, το πήκτωμα και την πλαστική κασετίνα, η οποία τα συμπιέζει. Η φορά της κίνησης των πρωτεϊνών είναι από τον αρνητικό στο θετικό πόλο. Μ.13 Ποσοτικοποίηση ανοσοστυπωμάτων με σύστημα ανάλυσης εικόνας Προκειμένου να εξάγουμε ποσοτικά συμπεράσματα από ανοσοστυπώματα, έγινε ποσοτικοποίηση των ζωνών με τη χρήση συστήματος ανάλυσης εικόνας. Η διαδικασία της ποσοτικοποίησης περιλαμβάνει τρία στάδια: 1. Τη φωτογράφηση των ανοσοστυπωμάτων. 2. Την προκαταρκτική επεξεργασία των φωτογραφιών. 3. Την πραγματοποίηση των ποσοτικοποιήσεων. Η φωτογράφηση των ανοσοστυπωμάτων και των ηλεκτροφορημάτων πραγματοποιήθηκε με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή Olympus Camedia C-2500L. Στην περίπτωση των ανοσοστυπωμάτων, η φωτογράφηση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση διερχόμενου λευκού φωτός. Στη συνέχεια, οι φωτογραφίες μεταφέρονταν σε ηλεκτρονικό υπολογιστή και αναλύονταν με το πρόγραμμα Scion Image (Scion Corporation). Το λογισμικό είχε ρυθμιστεί κατάλληλα, έτσι 91

93 ώστε για κάθε ζώνη που περιγράφαμε, καταγράφονταν αυτόματα σε ένα λογιστικό φύλλο η επιφάνεια της ζώνης και η μέση ένταση της. Το γινόμενο των δύο αυτών παραμέτρων είναι ανάλογο της ποσότητας της πρωτεΐνης που αντιστοιχεί σε κάθε ζώνη του ηλεκτροφορήματος και χρησιμοποιήθηκε για τις ποσοτικές αναλύσεις και συγκρίσεις που έγιναν στην παρούσα εργασία. Μ.14 Διαδικασία αποδέσμευσης αντισώματος από μεμβράνη PVDF (stripping) Η διαδικασία αποδέσμευσης του αντισώματος από τη μεμβράνη PVDF συμβαίνει μόνο όταν έχει χρησιμοποιηθεί το σύστημα της χημειοφωταύγειας για το ανοσοστύπωμα της πρωτεΐνης. Υλικά και Διαλύματα Διάλυμα αποδέσμευσης αντισωμάτων από τη μεμβράνη: 62,5 mm Tris-HCl ph 6,8 2 % SDS 100 mm β-μερκαπτοαιθανόλη Ρυθμιστικό διάλυμα TBS-Tween 20, ph 7,6 (TBS-T): 0,05 % κ.ό. Tween 20 σε TBS ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Μετά την έκθεση της μεμβράνης στο φιλμ, ακολουθεί πλύσιμο της μεμβράνης 3 φορές με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T, διάρκειας 5 λεπτών τη φορά. 92

94 2. Επώαση της μεμβράνης με το διάλυμα αποδέσμευσης αντισωμάτων για 30 λεπτά σε θερμοκρασία ο C και με ήπια ανάδευση ανά τακτά χρονικά διαστήματα. 3. Ακολουθούν 6 πλυσίματα της μεμβράνης, διάρκειας 5 λεπτών το καθένα με το διάλυμα TBS-T. 4. Επώαση της μεμβράνης με κάποιο ρυθμιστικό διάλυμα παρεμπόδισης της μη ειδικής δέσμευσης, ανάλογα με το αντίσωμα με το οποίο πρόκειται η μεμβράνη να επωαστεί (αναφέρεται στο προηγούμενο κεφάλαιο). Μ.15 Διαμόλυνση των κυττάρων HUVEC με παρεμβαλόμενο RNA (sirna, RNAi) Κατά την πειραματική αυτή διαδικασία, πραγματοποιήθηκε παροδική διαμόλυνση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC με παρεμβαλλόμενο RNA, το οποίο έχει ως στόχο το mrna της κινάσης ILK. Η μεταφορά του παρεμβαλλόμενου RNA στο εσωτερικό των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με τη χρησιμοποίηση ανιονικής ιμίνης ως φορέα. Με τη διαδικασία που ακολουθήθηκε είναι δυνατή η διαμόλυνση των κυττάρων με ικανοποιητική απόδοση και σε σύντομο χρονικό διάστημα. Λόγω της χαμηλής θνητότητας που παρατηρείται, είναι δυνατή η λήψη ικανοποιητικής ποσότητας βιολογικού υλικού, προκειμένου να χρησιμοποιηθεί σε περαιτέρω βιολογικές μελέτες και λειτουργικά πειράματα. Κρίνεται όμως απαραίτητος ο πειραματισμός προκειμένου να εντοπισθεί η κατάλληλη συγκέντρωση παρεμβαλλομένου RNA, αλλά και η αρχική συγκέντρωση των κυττάρων που θα χρησιμοποιηθούν, καθώς οι παράγοντες αυτοί είναι δυνατόν να επηρεάσουν τόσο το ποσοστό μετασχηματισμού, όσο και την παρατηρούμενη τοξικότητα. Υλικά και διαλύματα Μ199 (χωρίς αντιβιοτικά) Πλήρες θρεπτικό μέσο (χωρίς αντιβιοτικά) 93

95 jetsi-endo (Polyplus transfection, # 1111) ILK sirna. Χρησιμοποιήθηκε το SignalSilence ILK1 sirna (Human Specific), Cell Signaling, ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Καλλιέργεια των κυττάρων σε μικροκυψελίδες ή σε τρυβλία κυτταρικής καλλιέργειας. Ο αριθμός των κυττάρων τα οποία θα χρησιμοποιηθούν σε κάθε μικροκυψελίδα ή τρυβλίο είναι πολύ σημαντικός, καθώς μπορεί να επηρεάσει σημαντικά το ποσοστό μετασχηματισμού των κυττάρων. Στον πίνακα που ακολουθεί φαίνεται ένα πρότυπο, το οποίο σε γενικές γραμμές αντικατοπτρίζει την αρχική ποσότητα κυττάρων που απαιτείται ανάλογα με την επιφάνεια στην οποία αυτά καλλιεργούνται. (*) Ενδεικνυόμενος αριθμός κυττάρων στην περίπτωση που η αποσιώπηση του επιθυμητού γονιδίου μελετάται ώρες μετά από τη διαμόλυνση. (**)Ενδεικνυόμενος αριθμός κυττάρων στην περίπτωση που η αποσιώπηση του επιθυμητού γονιδίου μελετάται 24 ώρες μετά από τη διαμόλυνση 2. Επώαση των κυττάρων για 24 ώρες σε θρεπτικό μέσο, το οποίο δεν περιέχει αντιβιοτικά. 94

96 3. Παρατήρηση των κυττάρων. Την επομένη ημέρα που πραγματοποιείται η διαμόλυνση τους, τα κύτταρα θα πρέπει να έχουν καλύψει περίπου 30-50% της επιφάνειας του τρυβλίου ή της μικροκυψελίδας κυτταρικής καλλιέργειας. 4. Προετοιμασία των συμπλόκων ιμίνης-παρεμβαλόμενου RNA και διαμόλυνση. Για κάθε μικροκυψελίδα ή τρυβλίο προστίθεται η αναγκαία ποσότητα ιμίνης jetsitm-endo σε θρεπτικό μέσο που δεν περιέχει ορό, σύμφωνα με τον Πίνακα Μ.Ι. Ανάμιξη με έντονη ανάδευση (vortex) και διατήρηση σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Για κάθε μικροκυψελίδα ή τρυβλίο προστίθεται η αναγκαία ποσότητα παρεμβαλόμενου RNA σε θρεπτικό μέσο που δεν περιέχει ορό. Ανάμιξη με ήπια ανάδευση (vortex). Προσθήκη του θρεπτικού μέσου με την ιμίνη στο θρεπτικό μέσο με το παρεμβαλλόμενο RNA. Είναι υποχρεωτική η ανάμιξη των συστατικών με αυτή τη φορά. Άμεση ανάδευση του δείγματος για 10 δευτερόλεπτα. Επώαση των συμπλόκων ιμίνης-παρεμβαλλόμενου RNA σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. 5. Κατά τη διάρκεια της επώασης των συμπλόκων αμίνης-παρεμβαλλόμενου RNA απομακρύνεται το θρεπτικό μέσο των κυττάρων με αναρρόφηση υπό κενό και αναπληρώνεται με νέα ποσότητα θρεπτικού μέσου, σύμφωνα με τον Πίνακα.3, το οποίο έχει προηγουμένως θερμανθεί στους 37 0 C. 6. Προσθήκη στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων των συμπλόκων ιμίνηςπαρεμβαλλόμενου RNA και ήπια ανακίνηση προκειμένου να γίνει όσο το δυνατόν καλύτερη η κατανομή τους στο θρεπτικό μέσο. 7. Επώαση των κυττάρων για 4 ώρες στους 37 0 C. 95

97 8. Προσθήκη σε κάθε μικροκυψελίδα ή τρυβλίο κυτταρικής καλλιέργειας του υπόλοιπου θρεπτικού μέσου που απαιτείται προκειμένου να συμπληρωθεί ο όγκος που είναι απαραίτητος για την ομαλή ανάπτυξη των κυττάρων. 9. Συνεχής παρατήρηση των κυττάρων και λήψη των δειγμάτων για περαιτέρω Έκπλυση των κυττάρων 2 φορές με PBS. 11. Τα κύτταρα χρησιμοποιούνται περαιτέρω είτε για ανάλυση του πρωτεϊνικού τους περιεχομένου είτε για λειτουργικά πειράματα. Πίνακας Μ.3: Συνθήκες που χρησιμοποιούνται για τη διαμόλυνση κυττάρων με παρεμβαλλόμενο RNA. 96

98 Μ.16 Μελέτη του χημειοτακτισμού των κυττάρων HUVEC (Θάλαμος Transwell) Σε αυτό το πείραμα χρησιμοποιείται μικροπλακίδιο, στην κάθε μικροκυψελίδα του οποίου εισέρχεται μία ένθεση που χωρίζει το κελί σε δύο μέρη με τη βοήθεια μιας πολυμερούς κινητής μεμβράνης ανθρακικών (transwell plates). Στη μικροκυψελίδα υποδοχής προσθέτουμε το θρεπτικό μέσο και τον παράγοντα που θέλουμε να μελετήσουμε, ενώ στην ένθετη υποδοχή προσθέτουμε τα κύτταρα στο ανάλογο θρεπτικό μέσο. Η ποσοτική εκτίμηση της επίδρασης του υπό μελέτη παράγοντα στο χημειοτακτισμό των κυττάρων επιτυγχάνεται μετά από τη μονιμοποίηση, τη χρώση και την καταμέτρηση των κυττάρων που έχουν μεταναστεύσει σε δεδομένο χρονικό διάστημα μέσα από τους πόρους της μεμβράνης (φίλτρο). Εικόνα Μ.3: Ο θάλαμος Transwell που χρησιμοποιείται για τη μελέτη της κυτταρικής μετανάστευσης (Polytarchou et al., 2006). 97

99 Υλικά και διαλύματα Θάλαμοι μελέτης χημειοτακτισμού (Μικροπλακίδια Transwell, Costar #3244). Μ199* με 0,25 % BSA Το διάλυμα επωάζεται για 15 λεπτά στους 37 0 C και κατόπιν αποστειρώνεται με διήθηση από βακρηριοστατικό φίλτρο. Διάλυμα θειαζίνης Κυανούν της τολουϊδίνης 30 mg PBS 100 ml Διάλυμα μονιμοποίησης Carson s Φορμαλδεΰδη 37 % NaH 2 PO 4 NaOH Απεσταγμένο Η 2 Ο 100 ml 18,6 g 4,2 g 900 ml ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Σε κάθε μικροκυψελίδα και στο κάτω μέρος της μεμβράνης (εξωτερική μικροκυψελίδα), προστίθενται 600 μl θρεπτικού μέσου που περιέχει 0,25% BSA, αν πρόκειται για κελί αναφοράς (μάρτυρας). Στην περίπτωση που θέλουμε να μελετήσουμε τη χημειοτακτική δράση μιας ουσίας, στο κάτω μέρος της μεμβράνης προστίθεται και η ουσία σε θρεπτικό μέσο ίδιο με αυτό του κελιού-μάρτυρα. 2. Στη συνέχεια προστίθενται 100 μl θρεπτικού μέσου που περιέχει 0,25% BSA και κύτταρα στο πάνω μέρος της μεμβράνης (εσωτερική μικροκυψελίδα). 3. Επώαση του πλακιδίου στον κλίβανο των κυττάρων για 4 ώρες. 4. Μονιμοποίηση των κυττάρων εμβαπτίζοντας τη μεμβράνη σε μονιμοποιητικό διάλυμα Carson s για τουλάχιστον 20 λεπτά. 98

100 5. Απομάκρυνση των κυττάρων που βρίσκονται στο πάνω μέρος της μεμβράνης με ένα βαμβακοφόρο στυλεό. Απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή καθώς εάν ασκηθεί ισχυρή πίεση υπάρχει κίνδυνος να παραμορφωθεί η μεμβράνη. 6. Με μεγάλη προσοχή κόβεται περιφερειακά η μεμβράνη με τη βοήθεια νυστεριού. 7. Τοποθέτηση της μεμβράνης σε αντικειμενοφόρο πλάκα έτσι ώστε τα κύτταρα τα oποία έχουν μεταναστεύσει μέσα από τους πόρους να βρίσκονται στην πάνω επιφάνεια. 8. Χρώση των κυττάρων με προσθήκη 1-2 σταγόνων διαλύματος θειαζίνης στη μεμβράνη για 15 λεπτά. 9. Αποχρωματισμός της μεμβράνης με 3-4 διαδοχικές εμβαπτίσεις σε νερό και τοποθέτηση σε αντικειμενοφόρο πλάκα, με τα κύτταρα προς την κάτω επιφάνεια. 10. Καταμέτρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο, με τη βοήθεια κατάλληλα διαμορφωμένου πλέγματος που έχει κατασκευαστεί για το σκοπό αυτό. Μ.17 Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων Τα αποτελέσματα εξήχθησαν από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα μεταξύ τους πειράματα. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με τη χρήση του unpaired t-test ή του test ANOVA. Οι συγκρίσεις (μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα) έγιναν μεταξύ της κάθε πειραματικής ομάδας και του αντίστοιχου μάρτυρα. Επιπλέον, σε ορισμένες περιπτώσεις, μελετήθηκε η μεταβολή σε σχέση με συγκεκριμένη πειραματική ομάδα. 99

101 Μ.18 Ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός της ενεργοποιημένης και ολικής FAK με τη μέθοδο ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) Χρησιμοποιήθηκε το σύστημα FACE (Fast Activated Cell-based ELISA) FAK kit, της εταιρείας Active Motif. Πρόκειται για ένα σύστημα, το οποίο σχεδιάστηκε ειδικά για το ποσοτικό προσδιορισμό της ενεργοποιημένης (φωσφορυλιωμένης) FAK και/ή ολικής FAK. Σε αυτή τη μέθοδο, τα κύτταρα καλλιεργούνται σε πλακίδιο 96 μικροκυψελίδων και διεγείρονται ώστε να επάγουν το επιθυμητό σηματοδοτικό μονοπάτι. Μετά τη διέγερση, τα κύτταρα μονιμοποιούνται άμεσα ώστε να διατηρήσουν τις επαγόμενες πρωτεΐνικές τροποποιήσεις. Στη συνέχεια, κάθε μικροκυψελίδα επωάζεται με το 1 ο αντίσωμα που αναγνωρίζει είτε φωσφορυλιωμένη, είτε ολική FAK. Με την προσθήκη δεύτερου αντισώματος που φέρει δεσμευμένη υπεροξειδάση, επιτυγχάνεται παραγωγή χρώματος και ποσοτικός προσδιορισμός με φασματοφωτομετρία. Ο σχετικός αριθμός των κυττάρων της κάθε μικροκυψελίδας καθορίζεται με τη χρήση διαλύματος Crystal violet. Υλικά και Διαλύματα Πλακίδιο 96 μικροκυψελίδων Θρεπτικό Μ199* 0,25% BSA Πλειοτροπίνη (100 ng/ml) Σύστημα FACE (Fast Activated Cell-based ELISA) FAK kit, της εταιρείας Active Motif 100

102 ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Στάδιο 1 ο : Καλλιέργεια, μονιμοποίηση και μπλοκάρισμα κυττάρων 1. Καλλιέργεια κυττάρων σε πλακίδιο 96 μικροκυψελίδων ώστε να φθάσουν περίπου σε 80% τη στιγμή της μονιμοποίησης, αφού έχουν ήδη διεγερθεί. 2. Διέγερση HUVEC με πλειοτροπίνη (100 ng/ml) σε θρεπτικό Μ199 με 0,25% BSA, για 15 λεπτά. 3. Μονιμοποίηση κυττάρων, αντικαθιστώντας το θρεπτικό υλικό με 100μl 4% φορμαλδεϋδη σε PBS. Για να μειωθεί η απελευθέρωση αερίων φορμαλδεΰδης, καλύπτουμε το πλακίδιο με parafilm. Επωάζουμε τουλάχιστον για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 4. Απομάκρυνση διαλύματος φορμαλδεΰδης και πλύσιμο κάθε μικροκυψελίδας με 200 μl διαλύματος έκπλυσης 1Χ (3 φορές). Κάθε ξέπλυμα γίνεται μα απαλή ανάδευση για 5 λεπτά. 5. Απομάκρυνση διαλύματος έκπλυσης και προσθήκη 100μl διαλύματος Quenching. Επώαση για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 6. Απομάκρυνση διαλύματος Quenching και πλύσιμο κάθε μικροκυψελίδας με 200 μl διαλύματος έκπλυσης 1Χ (2 φορές). 7. Απομάκρυνση διαλύματος έκπλυσης και προσθήκη 100μl διαλύματος παρεμπόδισης ειδικής δέσμευσης. Επώαση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Στάδιο 2 ο : Δέσμευση 1 ου και 2 ου αντισώματος 1. Απομάκρυνση διαλύματος παρεμπόδισης ειδικής δέσμευσης και πλύσιμο κάθε μικροκυψελίδας με 200 μl διαλύματος έκπλυσης 1Χ (2 φορές). 2. Απομάκρυνση διαλύματος έκπλυσης, προσθήκη 40μl διαλυμένου 1 ου αντισώματος (ή διαλύματος διάλυσης αντισωμάτων για αρνητικό control) και κάλυψη πλακιδίου με parafilm. Επώαση για 16h στους 4 o C. 101

103 3. Απομάκρυνση 1 ου αντισώματος και πλύσιμο κάθε μικροκυψελίδας με 200 μl διαλύματος έκπλυσης 1Χ (3 φορές). 4. Απομάκρυνση διαλύματος έκπλυσης, προσθήκη 100μl διαλυμένου 2 ου αντισώματος και κάλυψη πλακιδίου με parafilm. Επώαση για 1h σε θερμοκρασία δωματίου. 5. Κατά τη διάρκεια αυτής της επώασης, μεταφέρουμε την απαιτούμενη ποσότητα του διαλύματος ανάπτυξης σε άλλο δοχείο, σε θερμοκρασία δωματίου τουλάχιστον για 1h (μακριά από φως). Στάδιο 3 ο : Χρωμογόνος αντίδραση 1. Απομάκρυνση 2 ου αντισώματος, πλύσιμο κάθε μικροκυψελίδας με 200 μl διαλύματος έκπλυσης 1Χ (3 φορές) και με 200 μl PBS 1Χ (2 φορές). 2. Απομάκρυνση PBS και προσθήκη 100 μl διαλύματος ανάπτυξης ανά μικροκυψελίδα. 3. Επώαση για 2-20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, με αποφυγή της άμεσης έκθεσης σε φως. Η επώαση διαρκεί μέχρι την ανάπτυξη κυανού και σκούρου κυανού χρώματος στα δείγματα και στο θετικό μάρτυρα. 4. Προσθήκη 100 μl διαλύματος αναστολής της αντίδρασης. Το διάλυμα αυτό περιέχει οξύ, οπότε το χρώμα από κυανό μετατρέπεται σε κίτρινο. 5. Τα επόμενα 5 λεπτά, ακολουθεί φωτομέτρηση σε μήκος κύματος 450 nm με μήκος κύματος αναφοράς τα 655 nm. Κυτταρική Χρώση με Cristal Violet 1. Μετά τη φωτομέτρηση στα 450 nm, πλύσιμο κάθε μικροκυψελίδας με 200 μl διαλύματος έκπλυσης 1Χ (2 φορές) και με 200 μl PBS 1Χ (2 φορές). 2. Απομάκρυνση PBS και προσθήκη 100 μl διαλύματος Crystal Violet σε κάθε μικροκυψελίδα για 30 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου. 3. Πλύσιμο κάθε μικροκυψελίδας με 200 μl PBS 1Χ (3 φορές). 102

104 4. Προσθήκη 100μl διαλύματος SDS 1% και επώαση υπό ανάδευση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. 5. Ακολουθεί φωτομέτρηση σε μήκος κύματος 595 nm 6. Οι τιμές OD450 ανάγονται σε σχέση με τον αριθμό των κυττάρων, διαιρώντας την OD450 κάθε μικροκυψελίδας με την αντίστοιχη OD595. Μ.19 Ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός της ενεργότητας της κινάσης ILK Χρησιμοποιήθηκε το σύστημα PathScan Phospho-Akt1 (Ser473) Sandwich ELISA kit, της εταιρείας Cell Signaling. Πρόκειται για ένα σύστημα, το οποίο ανιχνεύει ενδογενή επίπεδα φωσφορυλιωμένης Akt1 πρωτεΐνης. Παρέχεται πλακίδιο που αποτελείται από 96 μικροκυψελίδες. Στον πυθμένα των μικροκυψελίδων έχει προσκολληθεί μονοκλωνικό αντίσωμα phospho-akt (Ser473). Η φωσφορυλιωμένη Akt, που περιέχεται στα κυτταρικά εκχυλίσματα των HUVECs, δεσμεύονται στο αντίσωμα p-akt και ανιχνεύεται με μονοκλωνικό αντίσωμα Akt1(2H10). Με την προσθήκη δεύτερου αντισώματος που φέρει δεσμευμένη υπεροξειδάση, επιτυγχάνεται παραγωγή χρώματος και ποσοτικός προσδιορισμός με φασματοφωτομετρία. Με τη μέθοδο αυτή διαπιστώνεται οποιαδήποτε μεταβολή στα ενδοκυτταρικά επίπεδα της φωσφορυλιωμένης Akt1, μετά από κάποιο ερέθισμα. Διάλυμα κινάσης*: Υλικά και Διαλύματα NaCl ( Applichem) MgCl 2 (Sigma) MnCl 2 (Sigma) ATP (Sigma) 100mM 10mM 10mM 100 mm 103

105 Πλακίδιο 96 μικροκυψελίδων επικαλυμμένες με αντίσωμα Phosho-Akt (Ser473) Μονοκλωνικό αντίσωμα ανίχνευσης Akt1 (2H10) Anti-mouse IgG HPR- δεσμευμένο αντίσωμα Υπόστρωμα ανάπτυξης TMB Διάλυμα αναστολής Κολλητική ταινία 20X διάλυμα έκπλυσης Διαλύτης δειγμάτων 10X διάλυμα κυτταρικής λύσης Στάδιο 1 ο : Προεοιμασία αντιδραστηρίων 1. Πριν τη χρήση, φέρνουμε τις απαραίτητες μικροκυψελίδες σε θερμοκρασία δωματίου. 2. Ετοιμάζουμε 1X διάλυμα έκπλυσης, χρησιμοποιώντας Milli-Q Η2Ο. Στάδιο 2 ο : Προετοιμασία δειγμάτων 1. Επώαση HUVEC με 100 ng/ml πλειοτροπίνης για 15 λεπτά σε θρεπτικό M199 0,25% BSA. 2. Απομάκρυνση θρεπτικού μέσου, πλύσιμο με PBS 1X και λύση κυττάρων (δες παράγραφο Μ.8). 3. Εκτίμηση συγκέντρωσης ολικής πρωτεΐνης από τα κυτταρικά εκχυλίσματα, με τη μέθοδο Bradford (δες παράγραφο Μ.9). 4. Ανοσοκατακρήμνιση 1mg πρωτεϊνικού εκχύλισματος για ILK (δες παράγραφο Μ.10). 5. Επώαση ανοσοκατακρημνισμάτων με 100 ng/25 μl Akt1 κινάση, σε διάλυμα κινάσης* παρουσία 100 mm ATP, για 30 λεπτά στους 30 0 C με συνεχή ανακίνηση. 104

106 Στάδιο 3 ο : Διαδικασία δέσμευσης 1 ου και 2 ου αντισώματος και μέτρηση οπτικής απορρόφησης 1. Μεταφορά 100 μl διαλύτη δείγματος σε ένα eppendorf. Προσθήκη 100 μl πρωτεϊνικού εκχυλίσματος και ανακίνηση για λίγα δευτερόλεπτα. 2. Προσθήκη 100 μl από το διαλυμένο πρωτεϊνικό εκχύλισμα στη μικροκυψελίδα, η οποία στη συνέχεια καλύπτεται με κολλητική ταινία. Επώαση πλακιδίου για 16 ώρες στους 4 ο C. 3. Απομάκρυνση περιεχομένου μικροκυψελίδας και πλύσιμο με 200 μl 1X PBS (4 φορές). 4. Προσθήκη 100 μl αντισώματος ανίχνευσης, κάλυψη με κολλητική ταινία και επώαση πλακιδίου για 1 ώρα στους 37 ο C. 5. Απομάκρυνση περιεχομένου μικροκυψελίδας και πλύσιμο με 200 μl 1X PBS (4 φορές). 6. Προσθήκη 100 μl 2 ου αντισώματος, κάλυψη με κολλητική ταινία και επώαση πλακιδίου για 30 λεπτά στους 37 0 C. 7. Απομάκρυνση περιεχομένου μικροκυψελίδας και πλύσιμο με 200 μl 1X PBS (4 φορές). 8. Προσθήκη 100μl υποστρώματος ΤΜΒ, κάλυψη με κολλητική ταινία και επώαση πλακιδίου για 10 λεπτά στους 37 0 C ή 30 λεπτά στους 25 0 C. Ανάπτυξη κυανού και σκούρου κυανού χρώματος στα δείγματα. 9. Προσθήκη 100 μl διαλύματος αναστολής. Απαλή ανακίνηση. Το διάλυμα αυτό περιέχει οξύ, οπότε το χρώμα από κυανό μετατρέπεται σε κίτρινο. 10. Τα επόμενα 30 λεπτά, ακολουθεί φωτομέτρηση σε μήκος κύματος 450 nm. 105

107 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Α.1 Επίδραση της ΡΤΝ στη φωσφορυλίωση των τυροσινών των θέσεων 397, 576 και 925 της κινάσης FAK Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση της ΡΤΝ στη φωσφορυλίωση της κινάσης FAK στις τυροσίνες 397, 576 και 925. Η συγκέντρωση της ΡΤΝ που χρησιμοποιήθηκε ήταν 100 ng/ml, που είναι η συγκέντρωση που προκαλεί τη μέγιστη επαγωγή στη φωσφορυλίωση της κινάσης FAK στα κύτταρα HUVEC (Polykratis et al., 2005). Α.1.1 Η ΡΤΝ επάγει τη φωσφορυλίωση της κινάσης FAK στην τυροσίνη 397 σε κύτταρα HUVEC Αρχικά μελετήθηκε η επίδραση της ΡΤΝ στη φωσφορυλίωση της κινάσης FAK στην τυροσίνη 397 σε κύτταρα HUVEC. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας μέχρι να καλύψουν περίπου το 80% της επιφάνειας των τρυβλίων και στη συνέχεια, επωάστηκαν για 16 ώρες σε θρεπτικό μέσο το οποίο δεν περιείχε ορό. Μετά από ανανέωση του θρεπτικού μέσου, χορηγήθηκε εξωγενώς PTN σε συγκέντρωση 100 ng/ml για 15 λεπτά. Ακολούθησε λύση των κυττάρων και ανάλυση ίσης ποσότητας ολικής πρωτεΐνης σε αποδιατακτικές συνθήκες, χρησιμοποιώντας πήκτωμα διαχωρισμού 7,5% σε ακρυλαμίδιο. Η αλλαγή των επιπέδων φωσφορυλίωσης της κινάσης FAK στην τυροσίνη 397 διερευνήθηκε με τη μέθοδο του ανοσοστυπώματος και τη χρήση κατάλληλων αντισωμάτων. Όπως φαίνεται στην Εικόνα A.1.1.1, η διέγερση κυττάρων HUVEC με PTN επάγει τη φωσφορυλίωση της κινάσης FAK στην τυροσίνη

108 Α PTN - + Y397pFAK tfak Β 120 ** % Y397pFAK/tFAK Μάρτυρας PTN (100ng/ml) Εικόνα A.1.1.1: Η ΡΤΝ επάγει τη φωσφορυλίωση της κινάσης FAK στην τυροσίνη 397 σε κύτταρα HUVEC. (Α) Αντιπροσωπευτική εικόνα ανάλυσης κατά Western για την φωσφορυλιωμένη στην τυροσίνη 397 (Y397pFAK) ή την ολική (tfak) κινάση FAK, σε εκχυλίσματα λύσης κυττάρων, από πέντε ανεξάρτητα μεταξύ τους πειράματα. (Β) Τα επίπεδα των φωσφορυλιωμένης και ολικής πρωτεΐνης FAK ποσοτικοποιήθηκαν με σύστημα ανάλυσης εικόνας και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % μεταβολής στα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης στην τυροσίνη 397 ως προς την ολική FAK, σε σχέση με μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας). Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με το μάρτυρα. **Ρ<0.01 Για την επιβεβαίωση του παραπάνω αποτελέσματος χρησιμοποιήθηκε το σύστημα FACE (Fast Activated Cell-based ELISA) FAK kit. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 96 θέσεων μέχρι να καλύψουν περίπου το 80% της επιφάνειας των θέσεων καλλιέργειας και στη συνέχεια επωάστηκαν για 16 ώρες σε θρεπτικό μέσο το οποίο δεν περιείχε ορό. Μετά από ανανέωση του θρεπτικού μέσου, χορηγήθηκε εξωγενώς PTN σε συγκέντρωση 100 ng/ml για 15 λεπτά. Ακολούθησε ποσοτικός προσδιορισμός της φωσφορυλιωμένης στην τυροσίνη 397 κινάσης FAK, η οποία βρέθηκε να είναι στατιστικά σημαντικά αυξημένη σε σχέση με κύτταρα που δε διεγέρθηκαν (Σχήμα A.1.1.2). 107

109 120 ** % Y397pFAK/tFAK Μάρτυρας PTN (100 ng/ml) Σχήμα Α.1.1.2: Η PTN επάγει τη φωσφορυλίωση της κινάσης FAK στην τυροσίνη 397 στα κύτταρα HUVEC. Τα επίπεδα των φωσφορυλιωμένης στην τυροσίνη 397 (Y397pFAK) και της ολικής (tfak) κινάσης FAK ποσοτικοποιήθηκαν με το σύστημα FACE FAK kit σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % μεταβολής στα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης στην τυροσίνη 397 ως προς την ολική FAK, σε σχέση με μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας), από τρία ανεξάρτητα μεταξύ τους πειράματα. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με το μάρτυρα. **Ρ<0.01 Α.1.2 Η ΡΤΝ μειώνει τη φωσφορυλίωση της κινάσης FAK στην τυροσίνη 576 σε κύτταρα HUVEC Μελετήθηκε η επίδραση της ΡΤΝ στη φωσφορυλίωση της FAK στην τυροσίνη 576 σε κύτταρα HUVEC. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας μέχρι να καλύψουν περίπου το 80% της επιφάνειας των τρυβλίων και στη συνέχεια, επωάστηκαν για 16 ώρες σε θρεπτικό μέσο το οποίο δεν περιείχε ορό. Μετά από ανανέωση του θρεπτικού μέσου, χορηγήθηκε εξωγενώς PTN σε συγκέντρωση 100 ng/ml για 15 λεπτά. Ακολούθησε λύση των κυττάρων και ανάλυση ίσης ποσότητας ολικής πρωτεΐνης σε αποδιατακτικές συνθήκες, χρησιμοποιώντας πήκτωμα διαχωρισμού 7,5% σε ακρυλαμίδιο. Η αλλαγή των επιπέδων φωσφορυλίωσης της κινάσης FAK στην τυροσίνη 576 διερευνήθηκε με τη μέθοδο του ανοσοστυπώματος και τη χρήση κατάλληλων αντισωμάτων. Όπως 108

110 φαίνεται στην Εικόνα A.1.2, η διέγερση κυττάρων HUVEC με PTN μειώνει τη φωσφορυλίωση της κινάσης FAK στην τυροσίνη 576. Α Y576pFAK PTN - + tfak Β 100 % Y576pFAK/tFAK *** 40 Μάρτυρας PTN (100 ng/ml) Εικόνα A.1.2: Η ΡΤΝ μειώνει τη φωσφορυλίωση της κινάσης FAK στην τυροσίνη 576 σε κύτταρα HUVEC. (Α) Αντιπροσωπευτική εικόνα ανάλυσης κατά Western για την φωσφορυλιωμένη στην τυροσίνη 576 (Y576pFAK) ή την ολική (tfak) κινάση FAK, σε εκχυλίσματα λύσης κυττάρων, από πέντε ανεξάρτητα μεταξύ τους πειράματα. (Β) Τα επίπεδα των φωσφορυλιωμένης και ολικής πρωτεΐνης FAK ποσοτικοποιήθηκαν με σύστημα ανάλυσης εικόνας και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % μεταβολής στα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης στην τυροσίνη 576 ως προς την ολική FAK, σε σχέση με μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας). Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με το μάρτυρα. ***Ρ<0,001 Α.1.3 Η ΡΤΝ επάγει τη φωσφορυλίωση της κινάσης FAK στην τυροσίνη 925 σε κύτταρα HUVEC Μελετήθηκε η επίδραση της ΡΤΝ στη φωσφορυλίωση της FAK στην τυροσίνη 925 σε κύτταρα HUVEC. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας μέχρι να καλύψουν περίπου το 80% της επιφάνειας των τρυβλίων και στη συνέχεια, επωάστηκαν για 16 ώρες σε θρεπτικό μέσο το οποίο δεν περιείχε ορό. Μετά από ανανέωση του θρεπτικού μέσου, χορηγήθηκε εξωγενώς PTN σε 109

111 συγκέντρωση 100 ng/ml για 15 λεπτά. Ακολούθησε λύση των κυττάρων και ανάλυση ίσης ποσότητας ολικής πρωτεΐνης σε αποδιατακτικές συνθήκες, χρησιμοποιώντας πήκτωμα διαχωρισμού 7,5% σε ακρυλαμίδιο. Η αλλαγή των επιπέδων φωσφορυλίωσης της κινάσης FAK στην τυροσίνη 925 διερευνήθηκε με τη μέθοδο του ανοσοστυπώματος και τη χρήση κατάλληλων αντισωμάτων. Όπως φαίνεται στην Εικόνα A.1.2, η διέγερση κυττάρων HUVEC με PTN επάγει τη φωσφορυλίωση της κινάσης FAK στην τυροσίνη 925. Α Y925pFAK PTN - + tfak Β % Y925pFAK/tFAK Μάρτυρας PTN (100 ng/ml) Εικόνα A.1.3: Η ΡΤΝ επάγει τη φωσφορυλίωση της κινάσης FAK στην τυροσίνη 925 σε κύτταρα HUVEC. (Α) Αντιπροσωπευτική εικόνα ανάλυσης κατά Western για την φωσφορυλιωμένη στην τυροσίνη 925 (Y925pFAK) ή την ολική (tfak) κινάση FAK, σε εκχυλίσματα λύσης κυττάρων, από πέντε ανεξάρτητα μεταξύ τους πειράματα. (Β) Τα επίπεδα των φωσφορυλιωμένης και ολικής πρωτεΐνης FAK ποσοτικοποιήθηκαν με σύστημα ανάλυσης εικόνας και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % μεταβολής στα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης στην τυροσίνη 925 ως προς την ολική FAK, σε σχέση με μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας). 110

112 A.2 H κινάση ILK εντοπίζεται στα κύτταρα HUVEC Αρχικά διερευνήθηκε η έκφραση της κινάσης ILK στα κύτταρα HUVEC. Κύτταρα HUVEC καλλιεργήθηκαν μέχρι να καλύψουν πλήρως την επιφάνεια των τρυβλίων καλλιέργειας και στη συνέχεια τα κύτταρα λύθηκαν, προκειμένου να εκχυλιστούν οι ολικές τους πρωτεΐνες. Οι τελευταίες αναλύθηκαν ηλεκτροφορητικά σε SDS-PAGE, χρησιμοποιώντας πήκτωμα διαχωρισμού 7,5% σε ακρυλαμίδιο και διερευνήθηκε η παρουσία της κινάσης ILK με τη μέθοδο του ανοσοστυπώματος και κατάλληλο αντίσωμα. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α.2, η πρωτεΐνη ILK εντοπίζεται στα κύτταρα HUVEC, ως μια διπλή ζώνη με εκτιμώμενο μοριακό μέγεθος περίπου 51 kda ILK Εικόνα Α.2: Η κινάση ILK εκφράζεται ως πρωτεΐνη στα κύτταρα HUVEC. Κύτταρα HUVEC καλλιεργήθηκαν μέχρι να καλύψουν πλήρως την επιφάνεια του τρυβλίου καλλιέργειας και στη συνέχεια, το ολικό πρωτεϊνικό εκχύλισμα ελέγχθηκε με ανοσοστύπωμα, χρησιμοποιώντας κατάλληλο μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της ILK. 111

113 Α.3 Η μείωση της έκφρασης της κινάσης ILK με sirna στα κύτταρα HUVEC έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της επαγόμενης από PTN κυτταρικής μετανάστευσης Προκειμένου να μελετήσουμε την πιθανή εμπλοκή της κινάσης ILK στην επαγωγική δράση της PTN στη μετανάστευση των κυττάρων HUVEC, καταστείλαμε την έκφραση της κινάσης ILK με sirna και ελέγξαμε εάν μια τέτοια καταστολή είναι δυνατό να επηρεάσει τη διεγερτική δράση της PTN στην κυτταρική μετανάστευση. Η καταστολή της έκφρασης της κινάσης ILK έγινε με διαμόλυνση των κυττάρων HUVEC με παρεμβαλλόμενο RNA (sirna), το οποίο είχε σχεδιαστεί κατάλληλα ώστε να αναστέλλει τη μετάφραση του mrna της κινάσης ILK (Vouret-Craviari V. et al., 2004 ; Joshi M.B. et al., 2007). Για να καθορίσουμε τις συνθήκες για τη διαμόλυνση των κυττάρων HUVEC με sirna για την κινάση ILK, πραγματοποιήθηκε σειρά πειραμάτων, καταλήγωντας στις βέλτιστες συνθήκες καλλιέργειας των κυττάρων και συγκέντρωσης του sirna για τα συγκεκριμένα κύτταρα, όπως αναφέρονται στις Μεθόδους (Μ.15). Έτσι, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες θρεπτικό μέσο απουσία αντιβιοτικών και 24 ώρες μετά την ανακαλλιέργειά τους, πραγματοποιήθηκε η διαμόλυνση με sirna έναντι της κινάσης ILK σε τελική συγκέντρωση 50 nm ή με την ίδια συγκέντρωση sirna το οποίο δεν έχει ομολογία με κανένα γνωστό γονιδιακό προϊόν (si negative). Μετά από 48 ώρες, το ολικό πρωτεϊνικό εκχύλισμα ελέγχθηκε για την κινάση ILK, χρησιμοποιώντας κατάλληλο μονοκλωνικό αντίσωμα. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α.3.1, το sirna για την κινάση ILK αναστέλλει σε ποσοστό περίπου 50% τη μετάφραση του mrna της κινάσης ILK. Δεν κατέστη δυνατό να επιτευχθεί μεγαλύτερη μείωση της έκφρασης της κινάσης ILK. 112

114 Α ILK ακτίνη Β 100 C siilk sineg % ILK/ακτίνη ** 40 Μάρτυρας siilk sineg Εικόνα A.3.1: Κύτταρα HUVEC διαμολύνθηκαν με sirna έναντι της ILK (siilk) ή με sirna το οποίο δεν έχει ομολογία με κανένα γνωστό γονιδιακό προϊόν (sineg). (Α) Tο ολικό πρωτεϊνικό εκχύλισμα ελέγχθηκε για την κινάση ILK και β-ακτίνη, με ανοσοαποτύπωμα και τη χρήση κατάλληλων αντισωμάτων. (Β) Τα επίπεδα των ILK και ακτίνης ποσοτικοποιήθηκαν με σύστημα ανάλυσης εικόνας και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % μεταβολής στα επίπεδα της κινάσης ILK ως προς τα επίπεδα της ακτίνης, σε σχέση με μη διαμολυσμένα κύτταρα (μάρτυρας). Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με το μάρτυρα. **Ρ<0.01 Από τη στιγμή που καθορίστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες για τη διαμόλυνση των κυττάρων HUVEC με sirna για την κινάση ILK, πραγματοποιήθηκε σειρά πειραμάτων με σκοπό τη μελέτη της επίδρασης της καταστολής της έκφρασης της κινάσης ILK στην επαγόμενη από PTN μετανάστευση των κυττάρων HUVEC. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες θρεπτικό μέσο απουσία αντιβιοτικών και 24 ώρες μετά από την ανακαλλιέργειά τους, πραγματοποιήθηκε η διαμόλυνση με sirna έναντι της κινάσης ILK σε τελική συγκέντρωση 50 nm ή με negative sirna. Η συγκέντρωση της ΡΤΝ που χρησιμοποιήθηκε ήταν 100 ng/ml, που είναι η συγκέντρωση που προκαλεί τη μέγιστη επαγωγή στη μετανάστευση των κυττάρων HUVEC (Polykratis et al., 2005; Mikelis et al., 2009), μέσω της ιντεγκρίνης α ν β 3 (Mikelis et al., 2009). Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α.3.2, μείωση 113

115 της έκφρασης της κινάσης ILK αναστέλλει την επαγωγική δράση της PTN στη μετανάστευση των κυττάρων HUVEC. Η αναστολή είναι περίπου 50%, σε αναλογία με το ποσοστό αναστολής της έκφρασης της κινάσης ILK που επιτυγχάνεται με το πρωτόκολλο που χρησιμοποιήσαμε, όπως αναφέρθηκε παραπάνω. % Κυτταρική Μετανάστευση *** *** P<0,001 ** Μάρτυρας PTN 100 ng/ml 40 μη διαμολυσμένα si Neg si ILK Εικόνα A.3.2: Η κινάση ILK συμμετέχει στην επαγόμενη από PTN μετανάστευση των κυττάρων HUVEC. Κύτταρα HUVEC διαμολύνθηκαν με sirna έναντι της ILK και στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση της PTN στο χημειοτακτισμό των κυττάρων με σύστημα transwell, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. sineg: Κύτταρα που διαμολύνθηκαν με sirna το οποίο δεν έχει ομολογία με κανένα γνωστό γονιδιακό προϊόν. siilk: Κύτταρα που διαμολύνθηκαν με sirna έναντι της ILK. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της μεταβολής του αριθμού των κυττάρων που έχουν μεταναστεύσει μέσα από τους πόρους του φίλτρου, σε σχέση με τα κύτταρα μάρτυρες της κάθε ομάδας, από τέσσερα ανεξάρτητα μεταξύ τους πειράματα. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστική σημαντικότητα σε σχέση με τους αντίστοιχους μάρτυρες της κάθε ομάδας. *** P<0,001 και ** P<0,01 114

116 Α.4 Η ΡΤΝ επάγει την ενεργοποίηση της κινάσης ILK σε κύτταρα HUVEC Στη συνέχεια διερευνήθηκε εάν η επώαση των κυττάρων HUVEC με PTN ενεργοποιεί την κινάση ΙLK. Από τη διεθνή βιβλιογραφία είναι γνωστό ότι η ενεργοποιημένη ILK διεγείρει τη φωσφορυλίωση της PKB/Akt στη σερίνη 473 και την ενεργοποιεί (Persad et al., 2000; Wu and Dedhar, 2001). Με βάση αυτό, έχει αναπτυχθεί μια μεθοδολογία μέτρησης της ενεργότητας της κινάσης ILK έμμεσα, μετρώντας την ικανότητά της να φωσφορυλιώνει εξωγενώς χορηγούμενη Akt ( Delcommenne M. et al., 1998 ; Persad S. et al., 2000 ; Kaneko Y. et al., 2004). Κύτταρα HUVEC καλλιεργήθηκαν μέχρι να καλύψουν περίπου το 80% της επιφάνειας των τρυβλίων καλλιέργειας. Στη συνέχεια τα κύτταρα επωάστηκαν για 16 ώρες σε θρεπτικό μέσο απουσία ορού και ακολούθησε διέγερση με PΤΝ (100 ng/ml) για 15 λεπτά. Τα κύτταρα λύθηκαν και απομονώθηκε το εκχύλισμα των ολικών πρωτεϊνών τους. Σε ίσες ποσότητες ολικών πρωτεϊνών από αυτό το εκχύλισμα πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση έναντι της κινάσης ILK. Το ανοσοΐζημα επωάστηκε με την κινάση Akt1 παρουσία 100mM ATP, για 30 λεπτά, στους 30 ο C και προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης Akt1. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α.4, επώαση των HUVEC με PΤΝ έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της κινάσης ILK. 115

117 % Ενεργοποίηση της κινάσης ILK Μάρτυρας PTN (100 ng/ml) Σχήμα Α.4: Η PTN επάγει την ενεργοποίηση της κινάσης ILK στα κύτταρα HUVEC. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % μεταβολής της ικανότητας της ενδογενούς κινάσης ILK να φωσφορυλιώνει εξωγενή Akt1 σε σχέση με μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας), από τρία ανεξάρτητα μεταξύ τους πειράματα. Α.5 Διερεύνηση των μορίων που αλληλεπιδρούν με την κινάση ILK και συμμετέχουν στην επαγόμενη από ΡΤΝ μεταγωγή σήματος στα κύτταρα HUVEC Προκειμένου να διερευνηθεί η θέση της κινάσης ILK στο μονοπάτι μεταγωγής σήματος που ενεργοποιείται από την ΡΤΝ στα κύτταρα HUVEC, μελετήσαμε την πιθανή αλληλεπίδραση της κινάσης ILK με άλλα μόρια που είναι γνωστό ότι συμμετέχουν στο μονοπάτι αυτό, όπως η κινάση c-src και η κινάση FAK. Κύτταρα HUVEC καλλιεργήθηκαν μέχρι να καλύψουν πλήρως την επιφάνεια των τρυβλίων καλλιέργειας και στη συνέχεια λύθηκαν και απομονώθηκε το εκχύλισμα των ολικών πρωτεϊνών τους. Σε 1 mg ολικών πρωτεϊνών από αυτό το εκχύλισμα πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση έναντι της ιντεγκρίνης β 3, της κινάσης c-src ή της κινάσης FAK. Το ανοσοΐζημα αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση ακρυλαμιδίου 7,5% σε αποδιατακτικές συνθήκες και ελέγχθηκε με ανοσοστύπωμα για την κινάση ILK. Όπως φαίνεται και στην 116

118 Eικόνα Α.5.1, η κινάση ILK αλληλεπιδρά σε μεγάλο βαθμό με την κινάση FAK. Μικρού βαθμού αλληλεπίδραση φαίνεται και με τις ιντεγκρίνη β 3 και κινάση c-src ILK IP : Src α ν β 3 FAK Eικόνα Α.5.1: Η κινάση ILK αλληλεπιδρά με την κινάση FAK και σε μικρότερο βαθμό με τις ιντεγκρίνη β3 και κινάση c-sr. Σε 1mg εκχυλίσματος ολικών πρωτεϊνών κυττάρων HUVEC πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση έναντι των ιντεγκρίνη β 3, κινάση c-src και κινάση FAK. Τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν με ανοσοστύπωμα για την κινάση ILK. Στη συνέχεια μελετήθηκε εάν η ΡΤΝ επηρεάζει το βαθμό αλληλεπίδρασης της κινάσης FAK με την κινάση ILK. Κύτταρα HUVEC καλλιεργήθηκαν μέχρι να καλύψουν περίπου το 80% της επιφάνειας των τρυβλίων καλλιέργειας. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν για 16 ώρες σε θρεπτικό μέσο απουσία ορού και ακολούθησε διέγερση με PΤΝ 100 ng/ml για 15 λεπτά. Τα κύτταρα λύθηκαν και σε ίσες ποσότητες ολικών πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση έναντι της FAK. Το ανοσοΐζημα αναλύθηκε σε SDS-PAGE και ελέγχθηκε για το περιεχόμενό του σε κινάσες FAK και ILK. Όπως φαίνεται στην Eικόνα Α.5.2, το ποσό της κινάσης ILK που συγκατακρημνίζεται με την κινάση FAK είναι σημαντικά αυξημένο σε κύτταρα HUVEC που έχουν διεγερθεί με PTN. 117