Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA

Θέση περιορισμού συμμετρική ως προς τον άξονα που περνά από το μέσο της. Στην εικόνα φαίνεται η θέση αναγνώρισης της EcoRI RI. Η αλληλουχία είναι παλίνδρο- μη: είναι ίδια και στις δύο αλυσίδες του DNA όταν διαβάζεται στην ίδια κατεύθυνση (στο παράδειγμα αυτό είναι 5 GAATTC 3 ). 3

Frequent cutters Rare cutters

Παραδείγματα του τρόπου με τον οποίο τα ένζυμα περιορισμού κόβουν το DNA. (α) Η SmaI δημιουργεί λεία (τυφλά) άκρα. (β) Η BamHI δημιουργεί προεξέχοντα 5 μονόκλωνα (κολλώδη) άκρα. (γ) Η PstI δημιουργεί προεξέχοντα 3 μονόκλωνα (κολλώδη) άκρα.

Πέψη του DNA από το ένζυμο περιορισμού EcoRI RI. Το ένζυμο EcoRI δημιουργεί δύο συμμετρικές εγκοπές που ονομάζονται ασυμπτωτικές. Έτσι προκύπτουν κολλώδη άκρα. Όταν δύο τμήματα DNA προέρχονται από πέψη με το ίδιο ένζυμο, έχουν τα ίδια κολλώδη άκρα και μπορούν να συνδεθούν μέσω ζευγαρώματος των συμπληρωματικών βάσεων. Οι εγκοπές που παραμένουν είναι δυνατόν να κλείσουν με το σχηματισμό ομοιοπολικών δεσμών από την DNA λιγάση.

Ο πλασμιδιακός φορέας κλωνοποίησης puc19. Τοπλασμίδιοαυτόφέρειμια θέση έναρξης της αντιγραφής (ori), το δείκτη επιλογής amp R και έναν πολυσυνδέτη που εδράζεται στο τμήμα άλφα του γονιδίου της β-γαλακτοζιδάσης, lacz +.

Ένθεση ενός τμήματος DNA στον πλασμιδιακό φορέα κλωνοποίησης puc19 και δημιουργία ενός ανασυνδυασμένου μορίου DNA.

Τυπικό τεχνητό χρωμόσωμα ζυμομύκητα (YAC). To YAC περιέχει ένα τελομερές ζυμομύκητα (TEL) σε κάθε άκρο, ένα κεν- τρομερές ζυμομύκητα (CEN), ένα δείκτη επιλογής ζυμομύκητα σε κάθε βρα- χίονα (εδώ τους TRP1 και URA3), μία αυτόνομα αντιγραφόμενη αλληλουχία (ARS) και θέσεις περιορισμού για την κλωνοποίηση του εξωγενούς DNA.

Παραγωγή τμημάτων DNA κατάλληλου μεγέθους για την κατασκευή μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης, μέσω μερικής πέψης με ένζυμο περιορισμού.

Σύνθεση δίκλωνου cdna από πολυαδενυλιωμένο mrna με τη χρήση της αντίστροφης μεταγρα- φάσης, της RNάσης Η, της DNA πολυμεράσης Ι και της DNA λιγάσης.

Κλωνοποίηση cdna με τη χρήση συνδετών BamHI HI.

Σάρωση μιας βιβλιοθήκης cdna με τη χρήση ενός σημασμένου αντισώματος.

Σάρωση μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης σε πλασμιδιακό φορέα με ιχνηθέτη ένα σημασμένο μόριο DNA.

Παράδειγμα κλωνοποίησης ενός γονιδίου ζυμομύκητα (του ARG1) μέσω λειτουργικής συμπληρωματικότητας.

Χαρτογράφηση περιορισμού.

Παράδειγμα χαρτογρά- φησης περιορισμού με σκοπό τον προσδιορισμό του προσανατολισμού ενός τμήματος DNA που έχει κλωνοποιηθεί σε κάποιο πλασμίδιο.

Ανάλυση κατά Southern γονιδιω- ματικού DNA με σκοπό τον εντο- πισμό αλληλουχιών συμπληρωμα- τικών προς ένα σημασμένο ιχνη- θέτη (για παράδειγμα, ένα μόριο cdna). Σε αυτό το θεωρητικό παράδειγμα, ο ιχνηθέτης υβριδοποιείται με τρία τμήματα DNA. Οι αντίστοιχες ζώ- νες καθίστανται ορατές μέσω αυτο- ραδιογραφίας ή χημειοφωταύγειας.

Ανάλυση κατά Southern γονιδιω- ματικού DNA με σκοπό τον εντο- πισμό αλληλουχιών συμπληρωμα- τικών προς ένα σημασμένο ιχνηθέτη (για παράδειγμα, ένα μόριο cdna). Σε αυτό το θεωρητικό παράδειγμα, ο ιχνηθέτης υβριδοποιείται με τρία τμήματα DNA. Οι αντίστοιχες ζώ- νες καθίστανται ορατές μέσω αυτο- ραδιογραφίας ή χημειοφωταύγειας.

Αλληλούχιση με διδεοξυνουκλεοτίδια. Ο «αριθμός νουκλεοτιδίου» αναφέρεται στη θέση που καταλαμβάνουν στην υπό προσδιορισμό αλληλουχία τα νουκλεοτί- δια τα οποία διαβάζονται σε κάθε διαδρο- μή. Για παράδειγμα, τα Α που διαβάζονται στην πρώτη διαδρομή βρίσκονται στις θέσεις 1, 6 και 8 της υπό προσδιορισμό αλληλουχίας. Ο «αριθμός νουκλεοτιδίου» αντιστοιχεί στην απόσταση ανάμεσα στο 3 άκρο του εκκινητή και στη θέση που ενσωματώθηκε το ddntp. Στο «μήκος των σημασμένων τμημάτων σε νουκλεοτίδια» δε λαμβάνεται υπόψη το μήκος του εκκινητή. igenetics

Αυτοραδιογράφημα ενός πηκτώματος αλλη- λούχισης με τη χρήση διδεοξυνουκλεοτιδίων. Τα γράμματα πάνω από τις δια- δρομές (A, C, G και T) υποδεικνύουν το διδεοξυνουκλεοτίδιο που χρησιμοποιήθηκε στην αντίστοιχη αντίδραση.

Αποτελέσματα αυτοματοποιημένης αλληλούχισης με διδεοξυνουκλεοτίδια σημασμένα με φθορίζουσες χρωστικές.

Αποτελέσματα αυτοματοποιημένης αλληλούχισης με διδεοξυνουκλεοτίδια σημασμένα με φθορίζουσες χρωστικές και ανίχνευση σημειακών αλλαγών.

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR).