Αποµόνωση µεµβρανικών λιπιδίων

Αποµόνωση µεµβρανικών λιπιδίων

50

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΛΙΠΙ ΙΩΝ ΑΠΟ ΕΡΥΘΡΑ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΑ ΜΕ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΟ ΦΑΣΕΩΝ Σκοπός της άσκησης : να γίνουν κατανοητά τα στάδια αποµόνωσης κυττάρων και στη συνέχεια των µεµβρανών τους, καθώς και η χρήση της χρωµατογραφίας δύο φάσεων για την αποµόνωση των µεµβρανικών λιπιδίων. ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ Η µελέτη των µεµβρανών αποτελεί για τη Βιολογία Κυττάρου ένα πεδίο έρευνας κεντρικής σηµασίας. Οι µεµβράνες µελετώνται από τη γενετική, βιοχηµική, φυσιολογική και υποµικροσκοπική πλευρά µε απώτερο σκοπό να κατανοηθούν οι πολύπλοκες κυτταρικές λειτουργίες που εκτελούνται πάνω σ αυτές ή µε τη συµµετοχή τους όπως π.χ. η φωτοσύνθεση και η οξειδωτική φωσφορυλίωση ή η εκλεκτική διαπερατότητα, η κυτταροφαγία και η έκκριση. Οι µεµβράνες αποτελούνται από πρωτεΐνες και λιπίδια και από µία µικρή ποσότητα πολυσακχαριτών. Αν και έχουν περάσει πολλά χρόνια από τότε που έγινε άµεσα αντιληπτή η ύπαρξη των µεµβρανών µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο (δύο σκοτεινόχρωµες γραµµές που χωρίζονται µε µία ανοικτόχρωµη), η µοριακή τους οργάνωση δεν είναι πλήρως γνωστή. Πάντως σήµερα είναι γενικά αποδεκτό το µοντέλο του ρευστού µωσαϊκού σύµφωνα µε το οποίο τα λιπίδια βρίσκονται στις µεµβράνες µε τη µορφή διπλού στρώµατος. Αυτό το δίστοιβο λιπιδικό στρώµα (lipid bilayer) αποτελεί το σκελετό. Οι πρωτεΐνες βρίσκονται διάσπαρτες, άλλες στην επιφάνεια του λιπιδικού στρώµατος (επιφανειακές) και άλλες εκτείνονται από τη µια πλευρά του λιπιδικού στρώµατος µέχρι την άλλη (διαµεµβρανικές). Η κατανοµή κάθε πρωτεΐνης εξυπηρετεί συγκεκριµένη λειτουργία σε κάθε τύπο µεµβράνης. 51

ίστοιβο λιπιδίων ιαµεβρανική πρωτεΐνη Επιφανειακή πρωτεΐνη Εικόνα 1. οµή της µεβράνης Μοντέλο ρευστού µωσαϊκού ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ ΕΡΥΘΡΩΝ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΩΝ Τα ερυθρά αιµοσφαίρια είναι τα πιο πολυάριθµα κύτταρα του αίµατος. Στον άνθρωπο αποτελούν το 40-45% του συνολικού όγκου του. Τα τριχοειδή αγγεία απ όπου περνούν έχουν πολύ µικρή εσωτερική διάµετρο γι αυτό τα ερυθρά αιµοσφαίρια αναγκάζονται να παραµορφωθούν για να περάσουν. Αυτό δείχνει πώς η µεµβράνη τους έχει µεγάλη αντοχή και ελαστικότητα. Οι περισσότερες γνώσεις µας για την κυτταροπλασµατική µεµβράνη προέρχονται από µελέτες των µεµβρανών που αποµονώνονται από τα ερυθρά αιµοσφαίρια θηλαστικών γιατί από τη µία πλευρά αποµονώνονται εύκολα και σε µεγάλη ποσότητα από το αίµα και από την άλλη γιατί δεν υπάρχει κίνδυνος µόλυνσής τους από άλλες µεµβράνες του κυττάρου κατά την αποµόνωση. Έτσι οι µεµβράνες αυτές µπορούν να αποµονωθούν πολύ απλά µε αραιό, ελαφρά αλκαλικό ρυθµιστικό διάλυµα µετά από ωσµωτική αιµόλυση. Περίπου το 55% της όλης µάζας της µεµβράνης των ερυθρών αιµοσφαιρίων είναι πρωτεΐνες, 40% λιπίδια και 5% υδατάνθρακες. Από τους υδατάνθρακες το 7% βρίσκεται µε τη µορφή γλυκοσφιγγολιπιδίων και το υπόλοιπο 93% µε τη µορφή µικρών ολιγοσακχαριτών που βρίσκονται προσδεµένοι µε Ο- και Ν-γλυκοσιδικούς δεσµούς σε πρωτεΐνες (γλυκοπρωτεΐνες). Γενικά το σακχαρικό µέρος µιας πρωτεΐνης είναι ιδιαίτερα σηµαντικό γιατί χρησιµεύει ως περιοχή αναγνώρισης. Όλοι οι ολιγοσακχαρίτες, που όπως είπαµε είναι οµοιοπολικά δεµένοι ή σε πρωτεΐνες ή σε λιπίδια, βρίσκονται στην εξωτερική επιφάνεια της µεµβράνης. 52

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Ανάλογα µε τη θέση τους στη µεµβράνη οι πρωτεΐνες αποµακρύνονται από αυτήν ως εξής: Οι επιφανειακές αποµακρύνονται από τη µεµβράνη µε ήπια µέσα π.χ. µε ελάττωση της ιοντικής ισχύος του περιβάλλοντος διαλύµατος. Οι ενσωµατωµένες αποµακρύνονται µόνο µετά από ολοκληρωτική καταστροφή του διπλού λιπιδικού στρώµατος µια και οι πρωτεΐνες αυτές εισχωρούν στο εσωτερικό του. Η αποµάκρυνσή τους γίνεται µε τη χρησιµοποίηση ειδικών απορρυπαντικών ή ενζύµων ή οργανικών διαλυτών κλπ. Τα απορρυπαντικά ασκούν διάφορες δράσεις πάνω στη µεµβράνη. Έτσι άλλα διαλυτοποιούν τις πρωτεΐνες σχηµατίζοντας σύµπλοκα ανάµεσα σ αυτές και στο υδρόφοβο τµήµα τους χωρίς να προκαλέσουν µετουσίωση της πρωτεΐνης και άλλα, όπως το SDS, προσβάλλουν και τις υδρόφιλες περιοχές της πρωτεΐνης και προκαλούν τη µετουσίωσή τους. Αλλά ακόµα και στην πρώτη περίπτωση, οι µεµβρανικές πρωτεΐνες και µετά την αποµάκρυνση των απορρυπαντικών είναι συχνά αδιάλυτες και συσσωµατώνονται σε ουδέτερα ρυθµιστικά διαλύµατα. Το άλας του δωδεκυλοθειικού οξέος µε νάτριο (SDS) είναι ένα είδος ανιοντικού απορρυπαντικού µε µεγάλη απορρυπαντική δύναµη. Έχει την ιδιότητα να διαλύει και να αποδιατάσσει τις πρωτεΐνες και τα λιπίδια. Ο κορεσµός της πολυπεπτιδικής αλυσίδας µε SDS εξουδετερώνει τα διάφορα επιµέρους φορτία της και τη φορτίζει αρνητικά (εξ αιτίας των θειικών οµάδων του SDS). Γι αυτό η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των πρωτεϊνών στην περίπτωση που έχουν κορεστεί µε SDS εξαρτάται µόνο από το µοριακό τους βάρος µε βάση δε αυτό γίνεται ο διαχωρισµός τους. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΤΩΝ ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΛΙΠΙ ΙΩΝ οµή λιπιδίων Τα λιπίδια αποτελούν τον σκελετό της µεµβράνης και απ αυτά το 58% είναι φωσφολιπίδια, το 29% ουδέτερα λιπίδια, κυρίως χοληστερόλη και το 13% γλυκολιπίδια. Έχει δειχτεί πώς το υδρόφοβο µέρος των φωσφολιπιδίων που βρίσκονται στο εσωτερικό του διπλού λιπιδικού στρώµατος συµπεριφέρεται ως 53

ρευστό και η παρουσία χοληστερόλης συµβάλλει κατά ένα µέρος στην ακινητοποίησή του. Ένα τυπικό φωσπολιπίδιο αποτελείται από ένα µόριο γλυκερόλης, όπου οι δύο υδροξυλοµάδες του είναι εστεροποιηµένες µε δύο λιπαρά οξέα και η τρίτη µε µια φωσφορική εστεροποιηµένη µε µια αλκοόλη (σερίνη, αιθανολαµίνη, χολίνη ινοσιτόλη, γλυκερόλη) (σχήµα 2). Η χοληστερόλη είναι ένα στεροειδές που ρυθµίζει τη ρευστότητα των µεµβρανών των ευκαρυωτικών κυττάρων. Και έχει στη δοµή της µόνο µια υδρόφιλη υδροξυλοµάδα. Ένα γλυκολιπίδιο αποτελείται από ένα µόριο σφιγγοσίνης (περιέχει παλµιτικό οξύ), µε µια υδροξυλοµάδα εστεροποιηµένη µε ένα δεύτερο λιπαρό οξύ και µια τρίτη που προσδένει µε γλυκοζιτικό δεσµό ένα σάκχαρο (γλυκόζη, γαλακτόζη). λιπαρό οξύ (παλµιτικό) λιπαρό οξύ (ελαϊκό) γλυ κε ρό λη φωσφορική ρίζα αλκοόλη Εικόνα 2. οµή ενός τυπικού φωσφολιπιδίου. Χηµικές ιδιότητες λιπιδίων Η αποµόνωση των µεµβρανικών λιπιδίων γίνεται µε χρωµατογραφία διαχωρισµού φάσεων που βασίζεται στην διαλυτότητας τους σε οργανικούς διαλύτες λόγω του ισχυρού υδρόφοβου χαρακτήρα τους. Η ανάλυση ενός µείγµατος λιπιδίων γίνεται µε χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας λόγω διαφορετικής διαλυτότητας των λιπιδίων σε διάφορα µείγµατα οργανικών διαλυτών. Στο παρακάτω πίνακα παρουσιάζονται τα µέρη των λιπιδίων από τα οποία εξαρτάται η διαλυτότητα τους. 54

Μεµβρανικό λιπίδιο Υδρόφοβη περιοχή Υδρόφιλη περιοχή Φωσφολιπίδιο Λιπαρά οξέα Φωσφορυλιωµένη αλκοόλη Γλυκολιπίδιο Χοληστερόλη Λιπαρά οξέα και σφιγγοσίνη Όλο το µόριο εκτός από την υδροξυλοµάδα Ένα ή περισσότερα σάκχαρα Η υδροξυλοµάδα Χρωµατογραφία διαχωρισµού φάσεων Η εκχύλιση είναι µια µέθοδος χρωµατογραφίας διαχωρισµού και στηρίζεται στην διαφορετική κατανοµή-διαλυτότητα µιας ουσίας, σε µια από δύο υγρές φάσεις µιας οργανικής και µιας υδατικής, που δεν αναµειγνύονται µεταξύ τους. Έστω ότι ένα υδατικό διάλυµα που περιέχει τα συστατικά Α και Β και το συστατικό Α κατανέµεται κατά 5% στο νερό και κατά 95% στον πετρελαϊκό αιθέρα ενώ το Β κατανέµεται κατά 90% στο νερό και 10% στο πετρελαϊκό αιθέρα. Τα συστατικά του Α και Β µπορούν να αποχωριστούν αν προσθέσουµε πετρελαϊκό αιθέρα. Γιατί όταν επέλθει ισορροπία το νερό θα περιέχει µόνο 5% Α και 90% Β. Αν η στοιβάδα αυτή του νερού αποµακρυνθεί και προστεθεί πάλι σ αυτή πετρελαϊκός αιθέρας, στην κατάσταση ισορροπίας το νερό θα περιέχει µόνο 5%x5%=0,25% της ουσίας Α και 90%x90%=81% της ουσίας Β. Με την επανάληψη της διαδικασίας αυτής τελικά θα εξαφανιστεί από την υδατική φάση το Α ενώ από το Β χάνουµε πολύ µικρή ποσότητα. 55

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΑ Σιφώνια pasteur Γυάλινες πιπέτες των 1, 2 ml Κλινική φυγόκεντρος Κωνικοί σωλήνες φυγοκέντρου Αναδευτήρας (vortex) Σωληνάκια Eppendorf ΙΑΛΥΜΑΤΑ Αίµα Χλωροφόρµιο Μεθανόλη Χλωροφόρµιο - Μεθανόλη 1:2 Φυσιολογικός ορός (0.9% χλωριούχο νάτριο) Υδατικό διάλυµα 0.1% BHT ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ Αποµόνωση ερυθρών αιµοσφαιρίων 1. Τοποθετούµε 1 ml αίµα µε αντιπηκτικό σε σωλήνα φυγοκέντρου των 15 ml. Προθέτουµε 5 ml φυσιολογικό ορό και φυγοκεντρούµε σε 3.000 rpm για 2 λεπτά σε κλινική φυγόκεντρο. 2. Όταν τελειώσει η φυγοκένρηση αφαιρούµε µε προσοχή το υπερκείµενο (που περιέχει το πλάσµα του αίµατος) και προσθέτουµε στο ίζηµα (ερυθρά αιµοσφαίρια) 5 ml φυσιολογικό ορό. Ανακατεύουµε καλά και φυγοκεντρούµε σε 3.000 rpm για 2 λεπτά. 56

Αποµόνωση µεµβρανών 3. Αφαιρούµε το υπερκείµενο και προσθέτουµε στο ίζηµα 5 ml Η 2 Ο µε 0.1% αντιοξειδωτικό των λιπιδίων (BHT). Ανακατεύουµε σε vortex και φυγοκεντρούµε σε 10.000 rpm για 5 λεπτά. 4. Χύνουµε το υπερκείµενο (κυτταρόπλασµα). Προσθέτουµε 5 ml Η 2 Ο µε 0.1% BHT, ανακατεύουµε καλά και φυγοκεντρούµε σε 10,000 rpm για 5 λεπτά. 5. Προσθέτουµε στο ίζηµα 400 λ φυσιολογικό ορό και αναδεύουµε. Εκχύλιση λιπιδίων 6. Προσθέτουµε 500 λ µεθανόλη, ανακατεύουµε, προσθέτουµε 1,5 ml διάλυµα χλωροφορµίου-µεθανόλης 1:2 και ανακατεύουµε 7. Προσθέτουµε 500 λ χλωροφόρµιο και ανακατεύουµε. 8. Προσθέτουµε 500 λ Η 2 Ο 0.1% BHT, ανακατεύουµε και φυγοκεντρούµε σε 3.000 rpm για 2 λεπτά (δηµιουργούνται δύο φάσεις). 9. Μεταφέρουµε την οργανική (κάτω φάση) σε καθαρό σωλήνα µε σιφώνιο pasteur αποφεύγοντας τη µεσόφαση και την άνω φάση (υδατική) και συνεχίζουµε µε ανάλυση χρωµατογραφίας λεπτής στοιβάδας. 57

58