ΤΜΗΜΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ & ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ Προς: Υπόψιν: Θέµα: Tο κοινωφελές ίδρυµα «John S. Latsis Public Benefit Foundation» κ. Ρ. Κιράνη Τελική έκθεση του έργου «Ανάπτυξη καινοτόµου φιλικής προς το περιβάλλον µεθόδου για τον έλεγχο του οικονοµικής σηµασίας εντόµου Bactrocera oleae» (Επιστηµονικά Υπεύθυνος: Γεώργιος Σκάβδης, Επίκουρος Καθηγητής - Δ ηµοκρίτειο Πανεπιστήµιο Θράκης, Τµήµα Μοριακής Βιολογίας και Γενετικής. Α. Εισαγωγή Το έντοµο Bactrocera oleae (δάκος) αποτελεί το σηµαντικότερο παράσιτο των ελαιόδεντρων. Το παρόν έργο αφορά στην µελέτη των δυνατοτήτων αποσιώπησης γονιδίων µέσω της παρεµβολής RNA (RNAi) στο Bactrocera oleae. Η αποσιώπηση επιλεγµένων γονιδίων και µέσω αυτής η µείωση της βιωσιµότητας του εντόµου, θα µπορούσε να συµβάλει στον έλεγχο των πληθυσµών του και κατ επέκταση στην καταπολέµησή του. Στην παρούσα µελέτη: 1. Προσδιορίσαµε την µέγιστη ποσότητα βακτηρίων που µπορεί να περιληφθεί στην εργαστηριακή τροφή των προνυµφικών σταδίων του εντόµου χωρίς να οδηγήσει σε µείωση της βιωσιµότητας του. Τα πειράµατα αυτά αποσκοπούσαν στον προσδιορισµό της µέγιστης δόσης στην οποία είναι δυνατό να χορηγηθούν µέσω της τροφής βακτήρια που παράγουν, προκειµένου να επιτευχθεί το µέγιστο δυνατό επίπεδο αποσιώπησης των γονιδίων-στόχων. 2. Ελέγξαµε τη δυνατότητα χορήγησης σφαιροπλαστών αντί άθικτων βακτηρίων στην εργαστηριακή τροφή των προνυµφικών σταδίων του εντόµου. Τα πειράµατα αυτά αποσκοπούσαν στο να ελεγχθεί το ενδεχόµενο, η πέψη από το έντοµο των σφαιροπλαστών που στερούνται του κυτταρικού τοιχώµατος να είναι αποτελεσµατικότερη, µε αποτέλεσµα την απελευθέρωση µεγαλύτερων ποσοτήτων και συνακόλουθα την αποτελεσµατικότερη αποσιώπηση των γονιδίων-στόχων. 3. Ελέγξαµε τη δυνατότητα αποσιώπησης γονιδίων στο στάδιο του ενηλίκου µέσω χορήγησης στην εργαστηριακή τροφή των εντόµων βακτηρίων που παράγουν. ΩΩς στόχοι στα πειράµατα αποσιώπησης χρησιµοποιήθηκαν (α) η εύκολα ανιχνεύσιµη πρωτεΐνη RFP (Red Fluorescent Protein) σε µία διαγονιδιακή σειρά B. oleae στη οποία το αντίστοιχο γονίδιο εκφράζεται υπό τον έλεγχο ενός ιδιοστατικού υποκινητή (constitutive promoter) σε όλους τους ιστούς του ζώου, και (β) το γονίδιο της ακετυλοχολινεστεράσης του δάκου (boache).
Β. Πειραµατικά αποτελέσµατα (1) Πλασµιδιακές κατασκευές κατάλληλες για την παραγωγή σε βακτήρια ΩΩς βάση των πλασµιδιακών µας κατασκευών χρησιµοποιήθηκε το πλασµίδιο pl4440, το οποίο φέρει δύο Τ7 υποκινητές εκατέρωθεν της περιοχής του πολυσυνδέτη (Εικόνα 1). Εν συνεχεία, επιλέχθηκε τµήµα της µεταγραφόµενης περιοχής των υπό στόχευση γονιδίων και κλωνοποιήθηκε στον πολυσυνδέτη του pl4440. Η διαµόρφωση αυτή επιτρέπει τη µεταγραφή δύο συµπληρωµατικών, µονόκλωνων αλυσίδων RNA, που υβριδίζονται µέσα στα βακτήρια ώστε να σχηµατιστούν δίκλωνα µόρια. Εικόνα 1: Ο φορέας pl4440 Κατασκευή των πλασµιδίων pl4440-rfp1 & pl4440-rfp2 Ένα τµήµα του γονιδίου της RFP πολλαπλασιάστηκε µε PCR από γενοµικό DNA του διαγονιδιακού στελέχους RFP +/+ του Bactrocera oleae. Χρησιµοποιήθηκε ο εµπρόσθιος εκκινητής 5 -aaaccgcggaggagtt catgcgcttcaaggtgc-3 και ο ανάστροφος εκκινητής: 5 -aaaccgcggccctcggcgcgttcgtactgt-3, στα άκρα των οποίων είχε εισαχθεί µια θέση αναγνώρισης του ενζύµου SacII (επισηµαίνεται µε κεφαλαία) ενώ στο µέσο περίπου του µεγέθους 652 bp προϊόντος της PCR, υπήρχε µια θέση αναγνώρισης του ενζύµου PstI. Η αντίδραση PCR περιελάµβανε τα εξής: ένα βήµα 95 C για 2 λεπτά, 40 επαναλήψεις των βηµάτων 95 C για 30 δευτερόλεπτα, 66 C για 30 δευτερόλεπτα, 72 C για 30 δευτερόλεπτα και ένα τελικό βήµα 72 C για 2 λεπτά. Το προϊόν της αντίδρασης κόπηκε µε τα περιοριστικά ένζυµα SacII και PstI σε δύο τµήµατα 337 bp και 315 bp τα οποία κλωνοποιήθηκαν στις αντίστοιχες θέσεις του pl4440 ώστε να προκύψουν τα πλασµίδια pl4440-rfp1 και pl4440-rfp2 αντίστοιχα. Ακολούθησε έλεγχος της δοµής των δύο πλασµιδίων µε περιοριστικές πέψεις και αλληλούχιση. Κατά τον έλεγχο αυτό διαπιστώθηκε πως το pl4440-rfp2 είχε υποστεί κάποιου τύπου αναδιατάξεις και δεν χρησιµοποιήθηκε πέρα από κάποια πιλοτικά πειράµατα. Παράλληλα επιβεβαιώθηκε η ακεραιότητα του pl4440-rfp1 και ήταν αυτό που χρησιµοποιήθηκε περαιτέρω για την παραγωγή του.
Κατασκευή του πλασµιδίου pl4440-ache Ένα τµήµα 430 bp του γονιδίου AChE του Bactrocera oleae πολλαπλασιάστηκε µε PCR από γενοµικό DNA. Χρησιµοποιήθηκε ο εµπρόσθιος εκκινητής 5 -aatccgcggctaatggcggtgagcactccaat-3 (µε κεφαλαία επισηµαίνεται µια θέση αναγνώρισης του ενζύµου SacII στο άκρο του) και ο ανάστροφος εκκινητής 5 -attctgcagcaccaaacccgccgtcactg-3 (µε κεφαλαία επισηµαίνεται µια θέση αναγνώρισης του ενζύµου PstI στο άκρο του). Η αντίδραση PCR περιελάµβανε τα εξής: ένα βήµα 95 C για 2 λεπτά, 30 επαναλήψεις των βηµάτων 95 C για 30 δευτερόλεπτα, 66 C για 30 δευτερόλεπτα, 72 C για 30 δευτερόλεπτα και ένα τελικό βήµα 72 C για 2 λεπτά. Το προϊόν της PCR κόπηκε µε τα περιοριστικά ένζυµα SacII και PstI και κλωνοποιήθηκε στις αντίστοιχες θέσεις του pl4440. Έλεγχος της παραγωγής Πριν την ενσωµάτωση του βακτηριακού ιζήµατος στην τροφή, έγινε αποµόνωση από βακτήρια µετασχηµατισµένα µε την κατασκευή pl4440-rfp1. Χρησιµοποιήθηκε το βακτηριακό στέλεχος HT115 το οποίοι στερείται της ενεργότητας RNase III και φέρει το γονίδιο της T7 πολυµεράσης υπό τον έλεγχο ενός επαγόµενου από IPTG υποκινητή. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης και επιβεβαιώθηκε η παρουσία του επιθυµητού (Εικόνα 2). Marker - IPTG +IPTG 500 bp 400 bp 337 bp Εικόνα 2: Αποµόνωση από βακτήρια του στελέχους HT115 µετασχηµατισµένα µε την κατασκευή pl4440-rfp1. (2) Παρασκευή βακτηριακής πάστας και προσδιορισµός της ανοχής σε αυτή της προνύµφης του B. oleae Βακτηριακά κύτταρα HT115 µετασχηµατισµένα µε τα προαναφερθέντα πλασµίδια καλλιεργήθηκαν για 12 ώρες σε LB agar στους 37 C. Κατόπιν, αραιώθηκαν 50 φορές σε φρέσκο θρεπτικό και συνεχίστηκε η επώασή τους µέχρι η οπτική πυκνότητα να φτάσει στο 0,8 (OD 600 = 0,8) οπότε και έγινε επαγωγή της σύνθεσης του µε την προσθήκη IPTG (0,4 mm). Η καλλιέργεια αφέθηκε για επιπλέον 4 ώρες στους 37 C. Στη συνέχεια τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στις 4.000 στροφές για 25 λεπτά στους 4 C. Το βακτηριακό ίζηµα συλλέχθηκε και αποθηκεύτηκε στους 4 C. Ακολούθησε ενσωµάτωση της βακτηριακής πάστας στην τροφή προνυµφών. Η προσθήκη των βακτηρίων γίνεται ενώ η τροφή (Tzanakakis, M.E., A.P. Economopoulos and J.A. Tsitsipis. 1970. Rearing and nutrition of the olive fruit fly. I. Improved larval diet and simple containers. J. Econ. Entomol. 63:317-318. / Manoukas, A.G. 1975. Low cost larval diets for mass production of the olive fruit fly. J. Econ. Entomol. 68:22-24) είναι ακόµα σε υγρή µορφή (πριν την προσθήκη κυτταρίνης) ώστε να κατανεµηθούν οµοιογενώς. Δ οκιµάστηκαν διαφορετικές συγκεντρώσεις
βακτηρίων µε σκοπό να βρεθεί η υψηλότερη συγκέντρωση που δεν µειώνει τη βιωσιµότητα των εντόµων. Τα αποτελέσµατα αυτών των δοκιµών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. -% of solid nutrients +% of bacterial paste -10% +10% -10% +20% -20% +30% -20% +40% -40% +50% -40% +60% -75% +75% -90% +90% Number of eggs Number of pupae Number of adults % From egg to adult Fertile F1 90 50 47 52% Yes 100 90 85 85% Yes 100 80 78 78% Yes 230 162 140 60% Yes 100 85 69 69% Yes 90 67 58 64% Yes 120 18 3 3% Νο 120 1 0 0% - Πίνακας 1. Αποτελέσµατα δοκιµών ενσωµάτωσης διαφορετικών ποσοτήτων βακτηριακής πάστας στην τροφή της προνύµφης του B. oleae και προσδιορισµός της επίδρασης των βακτηρίων στη βιωσιµότητα και στη γονιµότητα των εντόµων. Με πράσινο χρώµα υποδεικνύεται η µέγιστη ποσότητα βακτηρίων της οποίας η χορήγηση δεν είχε αρνητικές επιπτώσεις στην ανάπτυξη των εντόµων. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσµατα τα πειράµατα αποσιώπησης που ακολούθησαν πραγµατοποιήθηκαν σε τροφή από την οποία είχε αφαιρεθεί το 40% του βάρους των στερεών συστατικών και είχε προστεθεί βακτηριακή πάστα σε ποσότητα που αντιστοιχούσε στο 60% του βάρους των στερεών συστατικών της. Κάθε 2 ηµέρες γινόταν προσθήκη φρέσκιας τροφής, µέχρι οι προνύµφες να φτάσουν στο δεύτερο στάδιο όπου είναι ασφαλής η µεταφορά τους σε φρέσκια τροφή, χωρίς να τραυµατιστούν (Πίνακας 2). ΗΜΕΡΑ 1 ΗΜΕΡΑ 2 ΗΜΕΡΑ 3 ΗΜΕΡΑ 5 ΗΜΕΡΑ 7 ΗΜΕΡΑ 9 ΗΜΕΡΑ 11 ΗΜΕΡΑ 12-13 ΗΜΕΡΑ 15 ΗΜΕΡΑ 21-22 Συλλογή ~ 100 αυγών Επώαση αυγών Μεταφορά αυγών σε 20 gr τροφής Προσθήκη 50 gr φρέσκιας τροφής Προσθήκη 200 gr φρέσκιας τροφής Μεταφορά προνυµφών σε 100 gr φρέσκιας τροφής Μεταφορά σε 100 gr φρέσκιας τροφής. Νύµφωση προνυµφών Συλλογή νυµφών Έξοδος ενηλίκων Πίνακας 2. Περιληπτική περιγραφή της καλλιέργειας των εντόµων κατά την πραγµατοποίηση των πειραµάτων αποσιώπησης. (3) Παρασκευή αποξηραµένων βακτηρίων και προσδιορισµός της ανοχής σε αυτά των ώριµων B. oleae Η τεχνητή τροφή των ενηλίκων του δάκου της ελιάς είναι σε µορφή σκόνης. Αποτελείται από µαγιά, ζάχαρη άχνη και κρόκο αυγού σε σκόνη (Tsitsipis, J.A. and A. Kontos. 1983. Improved solid adult diet for the olive fruit fly Dacus oleae. Entomologia Hellenica 1: 24-29.). Η προσθήκη βακτηριακού ιζήµατος το
οποίο βρίσκεται σε ρευστή µορφή, θα αλλοίωνε την υφή της. Εποµένως, µετά την παραγωγή βακτηριακού ιζήµατος προχωρήσαµε στην πλήρη αφυδάτωση και κονιορτοποίησή του. Η αφυδάτωση έγινε µε φυγοκέντρηση σε κενό αέρος (speed vac) και η κονιορτοποίηση µε µηχανική πίεση. Ακολούθησε η ενσωµάτωση της σκόνης βακτηρίων στην τροφή των ενηλίκων. Δ οκιµάστηκαν και εδώ 2 διαφορετικές συγκεντρώσεις: αντικατάσταση του 20% ή του 50% της τροφής µε βακτηριακή σκόνη. Στην δεύτερη η θνησιµότητα των εντόµων ήταν µεγάλη από τις πρώτες µέρες (50%). Η συγκέντρωση σκόνης βακτηρίων 20% έδωσε µικρή θνησιµότητα (10%) και ενήλικα τα οποία ήταν γόνιµα (απόδοση από αυγό σε ενήλικο 70%) οπότε και επιλέχθηκε για τα επόµενα βήµατα. (4) Έκθεση των εντόµων σε βακτήρια που εκφράζουν της RFP. Από ενήλικα έντοµα του στελέχους RFP +/+ του Bactrocera oleae έγινε συλλογή αυγών τα οποία επωάστηκαν για 48 ώρες στους 25 C. Στο ενδιάµεσο ετοιµάστηκαν τροφές που περιέχουν βακτήρια (όπως παρουσιάστηκε παραπάνω) που παράγουν ή όχι (χρησιµοποιήθηκε το πλασµίδιο pl4440-rfp1 και ως αρνητικός µάρτυρας ο φορέας pl4440). Στη συνέχεια µετρήθηκε ο φθορισµός των εντόµων που αναπτύσσονταν. Για την µέτρηση του φθορισµού προνύµφες τρίτου σταδίου οµογενοποιήθηκαν σε διάλυµα 50 mm TRIS ph8 (ένα έντοµο σε 300 µl) και 200 µl χρησιµοποιήθηκαν για κάθε µέτρηση, η οποία έγινε µε την χρήση φθορισµόµετρου (Μolecular Devices-Spectra MAX M2). Without With 145 188 173 208 462 20 347 68 179 128 165 48 137 97 269 100 246 114 177 60 259 172 197 190 148 189 207 142 286 148 127 117 133 184 336 18 217 194 164 222 / 88 127 / 60 350 300 250 200 150 100 50 0 - + Εικόνα 3: Αποτελέσµατα µετρήσεων του φθορισµού σε προνύµφες τρίτου σταδίου ύστερα από κανονικοποίηση µε βάση την συνολική ποσότητα πρωτεϊνών. Στην αριστερή στήλη του πίνακα επισηµαίνεται µε πράσινο η χαµηλότερη τιµή για την περίπτωση των εντόµων που δεν εκτέθηκαν σε. Στην δεξιά στήλη του πίνακα επισηµαίνονται µε πράσινο όσες τιµές εντόµων που εκτέθηκαν σε είναι χαµηλότερες από αυτή. Στο γράφηµα απεικονίζονται ο µέσος όρος και η τυπική απόκλιση (SD, standard deviation) των τιµών φθορισµού για τις δύο οµάδες εντόµων.
Στην Εικόνα 3 παρουσιάζονται οι µετρήσεις φθορισµού των εντόµων ύστερα από κανονικοποίηση µε βάση την συνολική ποσότητα πρωτεϊνών τους η οποία προσδιορίστηκε µε την δοκιµασία Bradford. Τα αποτελέσµατα αυτά υποδεικνύουν µια µικρή µείωση των επιπέδων της RFP της τάξεως του 43% στα έντοµα που έχουν εκτεθεί σε. Παρατηρείται όµως µια µεγάλη διαποίκιλση στις τιµές από έντοµο σε έντοµο, η οποία αποτυπώνεται στην υψηλή τιµή της τυπικής απόκλισης (βλ. γράφηµα Εικόνας 3). Είναι επίσης σηµαντικό να παρατηρήσουµε πως η χαµηλότερη τιµή στα έντοµα που δεν έχουν εκτεθεί σε (127) είναι υψηλότερη από τις τιµές περίπου των µισών εντόµων (9/20) που εκτέθηκαν σε. Με ανάλογο τρόπο πραγµατοποιήθηκαν µετρήσεις και σε νύµφες 6 ηµερών, χωρίς όµως να διαπιστωθεί κάποια διαφορά στις µετρήσεις του φθορισµού (20 νύµφες για κάθε δοκιµή). Το αποτέλεσµα αυτό θεωρήθηκε αναµενόµενο καθώς οι νύµφες δεν τρέφονται και εποµένως δεν ήταν δυνατή η έκθεση τους στο των βακτηρίων. Επίσης, τα ενήλικα που προήλθαν από αυγά που τράφηκαν µε δίαιτα µε, συνέχισαν στην επόµενη γενιά και τους δόθηκε τροφή µε βακτηριακό ίζηµα σε σκόνη (όπως αναφέρθηκε παραπάνω). Άτοµα ηλικίας 0-1 µέρας, διατηρήθηκαν χωρίς νερό και τροφή για 24 ώρες. Την επόµενη µέρα τους χορηγήθηκε βακτηριακή τροφή και νερό και µετρήθηκε ο φθορισµός τους µετά από 48 ώρες έκθεσης στη βακτηριακή τροφή. Οι µετρήσεις που πραγµατοποιήθηκαν στα ενήλικα (δύο πειράµατα µε 9-10 άτοµα εκτεθειµένα σε και αντίστοιχο αριθµό ατόµων ως αρνητικούς µάρτυρες) δεν έδειξαν κάποια διαφορά στον φθορισµό µεταξύ των εντόµων που εκτέθηκαν ή όχι σε. Στον Πίνακα 3 παρουσιάζονται ενδεικτικά τα αποτελέσµατα ενός τέτοιου πειράµατος. Without With 1098 876 987 670 789 924 1233 1312 1090 469 654 717 543 1234 431 1338 1311 1506 876 904 / 313 1.005 / 336 Πίνακας 3. Αποτελέσµατα µετρήσεων φθορισµού σε ενήλικα έντοµα, στην τροφή των οποίων είχαν προστεθεί βακτήρια µετασχηµατισµένα µε την κατασκευή pl4440-rfp1, ύστερα από κανονικοποίηση µε βάση την συνολική ποσότητα πρωτεϊνών τους η οποία προσδιορίστηκε µε την δοκιµασία Bradford. Δ οκιµάσαµε επίσης τη χορήγηση στις προνύµφες σφαιροπλαστών. Καθώς οι σφαιροπλάστες στερούνται κυτταρικού τοιχώµατος θα µπορούσαν ενδεχοµένως να είναι πέπτονται αποτελεσµατικότερα από τα έντοµα µε συνέπεια να ελευθερώνονται µέσα στα ζώα µεγαλύτερες ποσότητες προκαλώντας αποτελεσµατικότερη σίγηση του γονιδίου της RFP. Για την παρασκευή σφαιροπλαστών ακολουθήσαµε τα πρωτόκολλα των Blocker et al. 2001 και Zenk et al. 2007 µε µικρές τροποποιήσεις (Blocker A. et al. 2001. Structure and composition of the Shigella flexneri needle complex, a part of its typeiii secreton. Mol. Microbiol. 39, 652 663. / Zenk S. F. et al. 2007. Identification of minor inner-membrane components of the Shigella type III secretion system needle complex. Microbiology 153: 2405 2415.) ενώ ο σχηµατισµός σφαιροπλαστών ελέγχθηκε µε παρατήρηση στο µικροσκόπιο (Εικόνα 4).
Εικόνα 4. Βακτήρια E. coli (αριστερά) και σφαιροπλάστες (δεξιά). Δ ιακρίνεται εύκολα το ραβδοειδές σχήµα των βακτηρίων και το στρογγυλό των σφαιροπλαστών. Στον Πίνακα 4 παρουσιάζονται τα αποτελέσµατα ενός πειράµατος στο οποίο ενσωµατώθηκαν στην τροφή των εντόµων σφαιροπλάστες και πραγµατοποιήθηκαν µετρήσεις φθορισµού σε προνύµφες τρίτου σταδίου. Όπως φαίνεται η χορήγηση σφαιροπλαστών σε αντίθεση µε την χορήγηση άθικτων βακτηριών (βλ. Εικόνα 3) δεν προκαλεί καµία µείωση των επιπέδων της RFP. Αν και το είναι σχετικά σταθερό τόσο στην ενζυµική όσο και στην χηµική αποικοδόµηση (Soukup G. and Breaker R. 1999. Relationship between internucleotide linkage geometry and the stability of RNA. RNA 5, 1308-1325.), µια ενδεχόµενη εξήγηση για αυτό είναι πως λόγω της απουσίας κυτταρικού τοιχώµατος η ενσωµάτωση των σφαιροπλαστών στην τροφή προκαλεί τη λύση τους και πιθανώς, κάτω από τις συνθήκες που πραγµατοποιείται το πείραµα, την επακόλουθη αποικοδόµηση του πριν αυτό καταλήξει στο πεπτικό σύστηµα των εντόµων. Without With 200 206 153 184 383 458 56 190 266 225 166 261 160 295 174 346 124 276 299 436 350 230 240 175 200 302 137 153 93 211 122 252 85 155 151 98 100 220 89 282 177 / 90 248 / 90 Πίνακας 4. Αποτελέσµατα µετρήσεων φθορισµού σε προνύµφες τρίτου σταδίου στην τροφή των οποίων είχαν προστεθεί σφαιροπλάστες µετασχηµατισµένοι µε την κατασκευή pl4440-rfp1, ύστερα από κανονικοποίηση µε βάση την συνολική ποσότητα πρωτεϊνών η οποία προσδιορίστηκε µε την δοκιµασία Bradford.
Κατόπιν προσδιορίσαµε µε PCR πραγµατικού χρόνου τα επίπεδα του mrna της RFP σε προνύµφες τρίτου σταδίου στην τροφή των οποίων είχαν προστεθεί βακτήρια µετασχηµατισµένα µε την κατασκευή pl4440-rfp1. Για το σκοπό αυτό αποµονώθηκε ολικό RNA από τρεις οµάδες των πέντε εντόµων, που είχαν εκτεθεί είτε σε βακτήρια µετασχηµατισµένα µε την κατασκευή pl4440-rfp1 είτε σε βακτήρια µετασχηµατισµένα µε το φορέα pl4440, και χρησιµοποιήθηκε για τη σύνθεση cdna. Παρακάτω παρουσιάζονται οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν για το γονίδιο της RFP καθώς και για τα housekeeping γονίδια της ριβοσωµικής πρωτεΐνης Rps7 και της β-ακτίνης. Gene Forward primer Reverse primer Product size (bp) RFP GAAGGGCGAGATCCACAAG CTCGTTGTGGGAGGTGATGT 148 Rps7 TTCGGTAGCAAGAAGGCTGT GGTAGGTTTGGGCAGGATTT 156 Beta-actin CGGTATCCACGAAACCACAT ATTGTTGATGGAGCCAAAGC 159 Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του γονιδίου της RFP προσδιορίστηκαν χρησιµοποιώντας ως γονίδια αναφοράς αυτά της ριβοσωµικής πρωτεΐνης Rps7 και της β-ακτίνης σύµφωνα µε το µαθηµατικό µοντέλο του Pfaffl (Pfaffl M. W. 2001 A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29:e45). Από την ανάλυση των αποτελεσµάτων διαπιστώθηκε µια µικρή µείωση της τάξεως του 30% των επιπέδων του mrna της RFP στις προνύµφες που είχαν εκτεθεί στο. Συνοψίζοντας τα αποτελέσµατα της έκθεσης των εντόµων του στελέχους RFP +/+ εκφράζουν της RFP καταλήγουµε στα ακόλουθα συµπεράσµατα: σε βακτήρια που - Η έκθεση στο της RFP µέσω χορήγησης στην τροφή άθικτων βακτηριών µετασχηµατισµένων µε την κατασκευή pl4440-rfp1, οδηγεί σε πτώση των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου της RFP στις προνύµφες τρίτου σταδίου η οποία είναι σχετικά µικρής έκτασης, αποτυπώνεται όµως σαφώς στα αποτελέσµατα των µετρήσεων των επιπέδων της πρωτεΐνης RFP που παρουσιάζονται στην Εικόνα 3. - Η έκθεση στο της RFP µέσω χορήγησης στην τροφή άθικτων βακτηριών µετασχηµατισµένων µε την κατασκευή pl4440-rfp1, δεν καθιστά δυνατή τη µείωση των επιπέδων έκφρασης της RFP στις νύµφες και στα ενήλικα έντοµα. - Η έκθεση στο της RFP µέσω χορήγησης στην τροφή σφαιροπλαστών µετασχηµατισµένων µε την κατασκευή pl4440-rfp1, δεν προκαλεί πτώση των επιπέδων έκφρασης της RFP στις προνύµφες τρίτου σταδίου. (5) Έκθεση των εντόµων σε βακτήρια που εκφράζουν της boache. Με δεδοµένο πως στις προνύµφες τρίτου σταδίου είχαµε ανιχνεύσει µια µικρή µείωση των επιπέδων της RFP µέσω της χορήγησης στην τροφή βακτηριών τα οποία παρήγαγαν το του γονιδίου, πραγµατοποιήσαµε ένα ανάλογο πείραµα χρησιµοποιώντας βακτήρια µετασχηµατισµένα µε το πλασµίδιο pl4440-ache στο οποίο είχαµε κλωνοποιήσει ένα τµήµα 430 bp του γονιδίου της ακετυλοχολινεστεράσης του Bactrocera oleae. Οι πειραµατικοί χειρισµοί που ακολουθήθηκαν ήταν ταυτόσηµοι µε αυτούς στην περίπτωση βακτηρίων µετασχηµατισµένων µε το πλασµίδιο pl4440-rfp1. Προσδιορίστηκε η Vmax της ενζυµικής ενεργότητας της AChE και τα σχετικά αποτελέσµατα, µετά από κανονικοποίηση µε βάση τη συνολική ποσότητα πρωτεϊνών η οποία προσδιορίστηκε µε την δοκιµασία Bradford, παρουσιάζονται στον Πίνακα 5. Τα αποτελέσµατα αυτά υποδεικνύουν µια σχετικά µικρή µείωση των επιπέδων της AChE της
τάξεως του 19% στα έντοµα που έχουν εκτεθεί σε. Αν και το ποσοστό αυτό είναι σχετικά µικρό, αξίζει να σηµειωθεί πως η χαµηλότερη τιµή στα έντοµα που δεν έχουν εκτεθεί σε (16.73) είναι υψηλότερη από τις τιµές των περισσότερων εντόµων (7/10) που εκτέθηκαν σε. Without With 21.96 13.31 22.50 10.11 17.17 14.73 18.17 16.44 16.73 21.66 20.31 22.25 21.39 12.75 22.36 12.78 17.68 16.55 18.29 18.93 19,66 / 2,28 15,95 / 4,01 Πίνακας 5: Αποτελέσµατα µετρήσεων της ενζυµικής ενεργότητας της AChE (Vmax / συνολική ποσότητα πρωτεϊνών) σε προνύµφες τρίτου σταδίου ύστερα από κανονικοποίηση µε βάση τη συνολική ποσότητα πρωτεϊνών. Στην αριστερή στήλη του πίνακα επισηµαίνεται µε πράσινο η χαµηλότερη τιµή για την περίπτωση των εντόµων που δεν εκτέθηκαν σε. Στην δεξιά στήλη του πίνακα επισηµαίνονται µε πράσινο όσες τιµές εντόµων που εκτέθηκαν σε είναι χαµηλότερες από αυτή. Με εκτίµηση, Γ. Σκάβδης Επίκουρος Καθηγητής Μοριακής Βιολογίας Τµήµα Μοριακής Βιολογίας και Γενετικής Δ ηµοκρίτειο Πανεπιστήµιο Θράκης