Εισαγωγή στη Real Time PCR. Καραπέτσας Θανάσης PhD, MSc

Transcript

1 Εισαγωγή στη Real Time PCR Καραπέτσας Θανάσης PhD, MSc

2 Μειονεκτήματα της κλασικής PCR Ανάλυση ύστερα από ηλεκτροφόρηση(συνήθως αγαρόζης) Τεχνική τελικού σημείου(end-point detection), Σύγκριση της έντασης των ζωνών προϊόντων PCR παρόμοιου μεγέθους, Ποιοτική και ημι-ποσοτική σύγκριση, Χαμηλήακρίβεια, Μικρήευαισθησία, Μη- αυτοματοποιημένη μέθοδος, Σχετικά χρονοβόρα (προετοιμασία αντιδράσεων PCR ηλεκτροφόρηση ανάλυση αποτελεσμάτων) Συνήθως χρώση με EtBr(μεταλλαξιογόνο, καρκινογόνο)

3 Η κλασική PCR δεν είναι ποσοτική Μ Μήτρα 10ngDNA 2. Μήτρα 40ngDNA Πως είναι δυνατό να προκύπτουν ζώνες παρόμοιας έντασης από διαφορετικές ποσότητες μήτρας;

4 Η κλασική PCR δεν είναι ποσοτική 3 φάσεις: Εκθετική (τα προϊόντα διπλασιάζονται σε κάθε κύκλο) Γραμμική (τα συστατικών της αντίδρασης εξαντλούνται, επιβράδυνση) Πλατό Πηγή: Applied Biosystems

5 Η κλασική PCR δεν είναι ποσοτική Αντιδράσεις PCRμε διαφορετικέςκαμπύλες εκθετικής φάσης(δηλ διαφορετική αρχική ποσότητα μήτρας) αλλά φθάνουν στο ίδιο πλατό. Πηγή: Applied Biosystems

6 Η PCRπραγματικού χρόνου Real time PCR Η Real-time PCR επιτρέπει την ανίχνευση των παραγόμενων προϊόντων PCR σε πραγματικό χρόνο και έτσι κατ επέκταση είναι δυνατή η ποσοτικοποίηση της αρχικής μήτρας. 2 μέθοδοι ανίχνευσης: Α) Φθορίζουσες χρωστικές που προσδένονται σε δίκλωνο DNA (πχ. SYBR Green) Β) Φθορίζοντες ανιχνευτές-ολιγονουκλεοτίδια

7 Η PCRπραγματικού χρόνου Real time PCR Α) Φθορίζουσες χρωστικές που προσδένονται σε δίκλωνο DNA (πχ. SYBR Green) Denat. Fluorescent dye Β) Φθορίζοντες ανιχνευτέςολιγονουκλεοτίδια Quencher dye Annealing Taq Taq Taq Taq

8 Πλεονεκτήματα της Real time PCR Ανίχνευση των προϊόντων PCR σε πραγματικό χρόνο, Ποσοτικήσύγκριση, Υψηλή ευαισθησία και ακρίβεια, Αυτοματοποίηση, Ασφάλεια, Ταχύτητα

9 Εφαρμογές της Real time PCR Διαγνωστική (πχ. ανίχνευση και ποσοτικοποίηση ιικού φορτίου) Μικροβιολογία (πχ. ανίχνευση παθογόνων στη γραμμή παραγωγής και επεξεργασίας τροφίμων) ΒασικήΈρευνα (πχ. ποσοτικοποίηση και σύγκριση επιπέδων mrna σε διαφορετικά δείγματα, ύστερα από διάφορες επιδράσεις κλπ.)

10 Real time PCR Ποσοτικοποίηση πηγή: BioRad

11 Real time PCR Ποσοτικοποίηση Ανάλυση της έντασης του φθορισμού συναρτήσει του αριθμού των κύκλων της PCR(δηλ. του χρόνου). Threshold: Το επίπεδο έντασης του παραγόμενου φθορισμού πάνω από το background(3-5 πλάσια της τυπικής απόκλισης του σήματος πάνω από το «θόρυβο»). Ct (ή Cq) Cycle threshold: Ο κύκλος στον οποίο το επίπεδο έντασης του παραγόμενου φθορισμού είναι πάνω από το background. Πάντοτε μέσα στην εκθετική φάση της PCR

12 Real time PCR Ποσοτικοποίηση 3 μέθοδοι ποσοτικοποίησης: 1. Απόλυτη ποσοτικοποίηση (με πρότυπη καμπύλη), 2. Σχετική ποσοτικοποίηση με πρότυπες καμπύλες 3. Σχετική ποσοτικοποίηση με τη μέθοδο ΔΔCt

13 Real time PCR Ποσοτικοποίηση 1. Απόλυτη ποσοτικοποίηση Χρησιμοποιείται για τον απόλυτο προσδιορισμό της ποσότητας του στόχου. Απαραίτητη η ύπαρξη πρότυπων δειγμάτων με γνωστή συγκέντρωση(standards) και η χρήση πρότυπης καμπύλης. Ct standard sample Quantity (ng)

14 Real time PCR Ποσοτικοποίηση 1. Απόλυτη ποσοτικοποίηση Περιορισμοί: Καθαρότητα και προέλευση των standards Ακρίβεια στους χειρισμούς(πχ. πιπετάρισμα) Δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί DNA ως standard για cdna (πρόβλημα αποτελεσματικότητας της αντίστροφης μεταγραφής) Χρήσεις: Ποσοτικοποίηση ιικού φορτίου

15 Real time PCR Brain Liver Kidney Heart Gut Ct (gene x) Ct (housekeeping) Η έννοια της σχετικής ποσοτικοποίησης Σε ποιον ιστό εκφράζεται περισσότερο το γονίδιο x; Κανονικοποίηση των επιπέδων ενός στόχου ως προς ένα εσωτερικό δείγμα ελέγχου. Πχ. Τα επίπεδα έκφρασης ενός γονιδίου κανονικοποιημένα ως προς τα αντίστοιχα ενός ιδιοστατικά εκφραζόμενου γονιδίου. Ορισμός ενός δείγματος ως δείγμα αναφοράς (calibrator ή reference sample). Όλα τα άλλα δείγματα συγκρίνονται με αυτό.

16 Real time PCR Ποσοτικοποίηση 2 μέθοδοι σχετικής ποσοτικοποίησης: Α) Σχετική ποσοτικοποίηση με πρότυπες καμπύλες Β) Σχετική ποσοτικοποίηση με τη μέθοδο ΔΔCt

17 Real time PCR Ποσοτικοποίηση 2. Σχετική ποσοτικοποίηση με πρότυπες καμπύλες 1. Κατασκευή πρότυπων καμπυλών για το εκάστοτε γονίδιο και το housekeeping gene. 2. Καθορισμός της ποσότητας του γονιδίου και του housekeeping για κάθε δείγμα σύμφωνα με τις πρότυπες καμπύλες 3. Διαίρεση της τιμής του γονιδίου με την αντίστοιχη του housekeeping για το εκάστοτε δείγμα 4. Διαίρεση των νέων τιμών με την τιμή του δείγματος αναφοράς

18 Real time PCR Ποσοτικοποίηση 2. Σχετική ποσοτικοποίηση με πρότυπες καμπύλες brain Γονίδιο Χ (ng) 0.4 housekeeping (ng) 0.8 Κανονικοποίηση ως προς το housekeeping 0.5 Κανονικοποίηση ως προς τοbrain 1 kidney liver heart gut

19 Real time PCR Ποσοτικοποίηση 3. Σχετική ποσοτικοποίηση με τη μέθοδο ΔΔCt Παρόμοια μέθοδος με την relative standard curve με τη διαφορά ότι βασίζεται σε μαθηματικούς αλγόριθμους και αριθμητικές φόρμουλες για την ποσοτικοποίηση. Η σχετική ποσοτικοποίηση δίνεται από τον τύπο: RQ=2 -ΔΔCt όπουrq:ησχετικήποσοτικοποίηση ΔΔCt: η διαφορά του ΔCt του δείγματος απότοδctτουδείγματοςαναφοράς, ΔCt sample ΔCt calibrator ΔCt: ηδιαφοράτουctτουγονιδίου από το Ct του housekeeping, Ctgenex Cthousekeeping

20 Real time PCR Ποσοτικοποίηση 3. Σχετική ποσοτικοποίηση με τη μέθοδο ΔΔCt Ct (gene x) Ct (housekeeping) ΔCt ΔΔCt RQ Brain Liver Kidney Heart Για να χρησιμοποιηθεί με αξιοπιστία η μέθοδος ΔΔCt προϋποθέτει ότι η PCR αντίδραση με τους εκκινητέςγια το γονίδιο x έχει την ίδια αποτελεσματικότητα με την αντίδραση για το housekeeping gene.

21 Real Time PCR Προσομοίωση πραγματικού πειράματος

22 Μελέτη των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου CXCL9 σε 8 δείγματα όγκων ωοθηκών Μέθοδος ανίχνευσης: SYBR Green Μήτρα: cdnaαπό 1μgολικού RNA από 8 διαφορετικούς όγκους ωοθηκών Housekeeping gene: b-actin Reference sample (calibrator): cal, ανάμιξη ίσης ποσότητας όλων των δειγμάτων Οι αντιδράσεις για το CXCL9 θα γίνουν εις τριπλούν για κάθε δείγμα. Οι αντιδράσεις για το b-actin θα γίνουν εις διπλούν για κάθε δείγμα. Δείγματα αρνητικού ελέγχου: αντιδράσεις χωρίς μήτρα

23 neg neg neg neg cal cal cal cal CXCL9 CXCL9 b-actin b-actin CXCL9 CXCL9 b-actin b-actin 230 CXCL9 261 CXCL9 314 CXCL9 254 CXCL9 555 CXCL9 288 CXCL9 522 CXCL9 395 CXCL9 230 CXCL9 261 CXCL9 314 CXCL9 254 CXCL9 555 CXCL9 288 CXCL9 522 CXCL9 395 CXCL CXCL9 CXCL9 CXCL9 CXCL9 CXCL9 CXCL9 CXCL9 CXCL9 230 b-actin b-actin 261 b-actin 314 b-actin 254 b-actin 555 b-actin 288 b-actin 522 b-actin 395 b-actin 230 b-actin 261 b-actin 314 b-actin 254 b-actin 555 b-actin 288 b-actin 522 b-actin 395 b-actin

24 Master mix 1 2X SYBR Green mix Cxcl9 forward primer (10μM) Cxcl9 reverse primer (10μM) ddh2o Final Volume V 10 0,4 0,4 7,2 18 X 30 αντιδράσεις Master mix 2 2X SYBR Green mix b-actin forward primer (10μM) b-actin reverse primer (10μM) ddh2o Final Volume V 10 0,4 0,4 7,2 18 X22 αντιδράσεις

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34 Άσκηση: Υπολογισμός των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου PARC σε 8 δείγματα όγκων ωοθηκών Μέθοδος ανίχνευσης: SYBR Green Μήτρα: cdnaαπό 1μgολικού RNA από 8 διαφορετικούς όγκους ωοθηκών Housekeeping gene: b-actin Reference sample (calibrator): cal, ανάμιξη ίσης ποσότητας όλων των δειγμάτων Οι αντιδράσεις για το PARCθα γίνουν εις τριπλούν για κάθε δείγμα. Οι αντιδράσεις για το b-actin θα γίνουν εις διπλούν για κάθε δείγμα. Δείγματα αρνητικού ελέγχου: αντιδράσεις χωρίς μήτρα

35