ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ»

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «ΜΕΛΕΤΗ ΧΗΜΙΚΗΣ ΣΥΝΘΕΤΙΚΗΣ ΕΝΩΣΗΣ Η ΟΠΟΙΑ ΔΙΑΣΠΑ ΤΟ ΣΥΜΠΛΟΚΟ GEMININ CDT1, ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΣΕΙΡΕΣ» Κανέλλου Αλεξάνδρα Βιολόγος ΠΑΤΡΑ, 2012

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «ΜΕΛΕΤΗ ΧΗΜΙΚΗΣ ΣΥΝΘΕΤΙΚΗΣ ΕΝΩΣΗ Η ΟΠΟΙΑ ΔΙΑΣΠΑ ΤΟ ΣΥΜΠΛΟΚΟ GEMININ CDT1, ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΣΕΙΡΕΣ» Κανέλλου Αλεξάνδρα Βιολόγος Επιβλέπων Καθηγητής κος Ταραβήρας Σταύρος Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών Τριμελής εξεταστική επιτροπή κος Ταραβήρας Σταύρος Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών κα Λυγερού Ζωή Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών κος Τσοπάνογλου Νικόλαος Επίκουρος Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών ΠΑΤΡΑ, 2012 2

Περιεχόμενα ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος 6 Περίληψη 7 Abstract 9 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 10 1.1 Ο κυτταρικός κύκλος 11 1.2 Η αντιγραφή του DNA 12 1.2.1 Οι κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες (Cyclin Dependent Kinases Cdks) και ο ρόλος τους στη ρύθμιση της αντιγραφής 12 1.3 Το σύστημα αδειοδότησης της αντιγραφής 13 1.3.1 Το προ-αντιγραφικό σύμπλοκο και η διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής 14 1.3.2 Η ενεργοποίηση των αδειοδοτημένων (licensed) αφετηριών αντιγραφής και η η έναρξη της αντιγραφής 14 1.4 Η ρύθμιση της αδειοδότησης της αντιγραφής 15 1.4.1 Μέσω της δράσης των CDKs 15 1.4.2 Μέσω της ρύθμισης του Cdc6 16 1.4.3 Μέσω ρύθμισης του Cdt1 17 1.4.3.1 Η αποικοδόμηση του Cdt1 κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου 17 1.4.3.2 Η αρνητική ρύθμιση του Cdt1 μέσω του ειδικού αναστολέα του, τη Geminin 17 1.5 Η ρύθμιση της Geminin κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου 18 1.5.1 Η ρύθμιση της Geminin σε μεταγραφικό επίπεδο 18 1.5.2 Η ρύθμιση της Geminin σε μετα-μεταφραστικό επίπεδο 18 1.5.3 Η ρύθμιση της Geminin σε επίπεδο υποκυτταρικού εντοπισμού 19 1.6 Ο διττός ρόλος της Geminin στον κυτταρικός πολλαπλασιασμός και στη διαφοροποίηση 20 1.7 Η λειτουργική σημασία της αλληλεπίδρασης Geminin-Cdt1 23 1.7.1 Δομική και λειτουργική περιγραφή του μορίου της Geminin 23 1.7.2 Δομική και λειτουργική περιγραφή του παράγοντα αδειοδότησης Cdt1 25 1.7.3 Δομική και λειτουργική περιγραφή του συμπλόκου Cdt1-Geminin 26 1.8 Ο ρόλος των κύριων ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου, Cdt1 και Geminin, στη διατήρηση της γονιδιωματικής ακεραιότητας και στην κακοήθη εξαλλαγή 28 1.8.1 Η απορύθμιση του Cdt1 εμπλέκεται στην καρκινογένεση 29 1.8.2 Η απορύθμιση της Geminin μπορεί να εμπλέκεται με γονιδιωματική αστάθεια 32 3

Περιεχόμενα 2. ΣΚΟΠΟΣ 36 3. ΥΛΙΚΑ και ΜΕΘΟΔΟΙ 38 3.1 Μέθοδοι ανασυνδυασμένου DNA 39 3.1.1 Πρωτεϊνικές μορφές κλωνοποίησης 39 3.1.2 Απομόνωση πλασμιδιακού DNA από βακτηριακά κύτταρα σε μεσαία κλίμακα (midi prep) 39 3.2 Μέθοδοι Κυτταρικής Βιολογίας 40 3.2.1 Κυτταροκαλλιέργεια γενικά 40 3.2.2 Διατήρηση της κυτταροκαλλιέργειας 40 3.2.3 Μέθοδοι διαχείρισης των καλλιεργειών των καρκινικών κυττάρων MCF7 και HeLa 41 3.2.3.1 Αραίωση κυττάρων (split) 41 3.2.3.2 Ψύξη κυττάρων 41 3.2.3.4 Απόψυξη κυττάρων 42 3.2.4 Παροδική συν-διαμόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων με πλασμιδιακό DNA (transfection) 42 3.2.5 Προσδιορισμός της φάσης του κυτταρικού κύκλου μέσω ανάλυσης DNA περιεχομένου με Fluorescence-Activated Cell Sorting - FACS 42 3.2.6 Προσδιορισμός της κυτταρικής βιωσιμότητας μέσω της μεθόδου ΜΤΤ 43 3.2.7 Μελέτη της ενδοκυτταρικής κατανομής της εξωγενούς Geminin σε κύτταρα MCF7 44 3.2.8 Ανοσοφθορισμός 44 3.2.8.1 Κλασσικό πρωτόκολλο ανοσοφθορισμού 45 3.2.8.2 Πρωτόκολλο ανοσοφθορισμού για ανίχνευση BrdU 46 3.3. Υλικά και Διαλύματα 48 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 51 4.1 In vivo χαρακτηρισμός της επιλεχθείσας συνθετικής χημικής ένωσης XIV 52 4.2 Η συνθετική χημική ένωση XIV εμφανίζει περιορισμένη κυτταροτοξικότητα 53 4.3 Η συνθετική χημική ένωση XIV επηρεάζει την ενδοκυτταρική κατανομή της εξωγενούς Geminin-GFP 54 4.4 Μελέτη της επίδρασης της συνθετικής χημικής ένωσης XIV στην έκφραση πρωτεϊνών που χαρακτηρίζουν συγκεκριμένες φάσεις του κυτταρικού κύκλου 58 4.4.1 Το ποσοστό των MCF7 και HeLa κυττάρων που βρίσκεται σε S φάση του κυτταρικού κύκλου μεταβάλλεται μετά από επώαση με τη συνθετική χημική ένωση XIV 59 4.4.2 Η συνθετική χημική ένωση XIV μειώνει το ποσοστό των MCF7 και HeLa κυττάρων που βρίσκονται σε G1 φάση του κυτταρικού κύκλου 62 4

Περιεχόμενα 4.4.3 Το ποσοστό των MCF7 και HeLa κυττάρων που βρίσκεται στις G2/M φάσεις του κυτταρικού κύκλου εμφανίζεται αυξημένο μετά από επώαση με την συνθετική χημική ένωση XIV 65 4.4.4 Η συνθετική χημική ένωση XIV μειώνει το ποσοστό των HeLa κυττάρων που βρίσκονται σε Μ φάση του κυτταρικού κύκλου 68 4.4.5 Η συνθετική χημική ένωση XIV προκαλεί αναστολή της προόδου του κυτταρικού κύκλου των MCF7 κυττάρων κατά το στάδιο μετάβασης G1/S 70 4.4.6 Η συνθετική χημική ένωση XIV προκαλεί αναστολή της προόδου του κυτταρικού κύκλου των HeLa κυττάρων κατά το στάδιο μετάβασης G1/S 73 5. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 75 5.1 Το σύμπλοκο Geminin-Cdt1 και ο ρόλος του στη ρύθμιση της αδειοδότησης της αντιγραφής 76 5.2 Geminin και Cdt1: ο ρόλος τους στην καρκινογένεση 77 5.3 Αντικαρκινική θεραπεία με στόχο το σύστημα αδειοδότησης της αντιγραφής 78 5.4 Σχεδιασμός και πραγματοποίηση μαζικού ελέγχου υψηλής κλίμακας (High Throughput Screening) για την αναγνώριση συνθετικών χημικών ενώσεων οι οποίες στοχεύουν το σύμπλοκο Geminin-Cdt1 80 5.5 Επίδραση της συνθετικής χημικής ένωσης XIV στην ενδοκυτταρική κατανομή της εξωγενούς Geminin-GFP 81 5.6 Επίδραση της συνθετικής χημικής ένωσης XIV στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου 82 5.7 Η συνθετικής χημικής ένωσης XIV και οι πιθανές μελλοντικές εφαρμογές της 83 6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 85 5

Πρόλογος Πρόλογος Η παρούσα διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε στο τμήμα Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια του μεταπτυχιακού προγράμματος σπουδών «Εφαρμογές στις Βασικές Ιατρικές Επιστήμες». Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Σταύρο Ταραβήρα, αναπληρωτή του τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, που μου έδωσε την ευκαιρία να γίνω μέλος της ερευνητικής του ομάδας. Η συνεχής ερευνητική του καθοδήγηση και η υποστήριξή του αποτέλεσαν καθοριστικούς παράγοντες στην ολοκλήρωση αυτής της εργασίας. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω την κ. Ζωή Λυγερού, αναπληρώτρια καθηγήτρια του εργαστηρίου Γενικής Βιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών, για τις καίριες παρατηρήσεις της, τις εύστοχες υποδείξεις και πολύτιμες συμβουλές της, καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της εργασίας. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον κ. Νικόλαο Τσοπάνογλου, επίκουρο καθηγητή του τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, για την προθυμία του να συμμετέχει στην τριμελή εξεταστική επιτροπή, για τις εύστοχες παρατηρήσεις τους και τα επιστημονικά ερωτήματα που έθεσε και που βοήθησαν στην εξέλιξη αυτής της εργασίας. Η ολοκλήρωση αυτής της εργασίας δεν θα ήταν εφικτή χωρίς τη βοήθεια, συμπαράσταση και φιλία που μου πρόσφεραν τα μέλη των εργαστηρίων Φυσιολογίας και Γενικής Βιολογίας, Μάγδα Σπέλλα, Νάνσυ Σταθοπούλου, Χριστίνα Κυρούση, Νικόλας Καραντζέλης, Δημήτρης Καραμήτρος, Δάφνη Πεφάνη, Ελεάννα Συμεωνίδου, Παναγιώτης Κωτσαντής, Νίκος Γιακουμάκης, Θοδωρής Γιαβρίδης, Νίκος Παπαλέξης, Παναγιώτης Καυκαλιάς, Ειρήνη Τσιαμάκη και τα νεότερα μέλη, Αλεξάνδρα Πατμανίδη, Μαριαλένα Λαλιώτη, Μαρίνα Αρμπή, Χρήστος Παπαδημητρίου και Ίωνας Χαμπέρης. Στους πολύ καλούς μου φίλους Ντίνο Γκρίντζαλη, Βαγγέλη Λάμπα και Θάλεια Φωτιάδου χρωστάω ένα μεγάλο ευχαριστώ, για την πίστη τους σε μένα και την αμέριστή υπομονή τους. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς μου, χωρίς την πολύπλευρη στήριξη και αγάπη των οποίων αυτό το ταξίδι δεν θα ήταν εφικτό. 6

Περίληψη Περίληψη Η διαδικασία της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA περιλαμβάνει αρχικά το σχηματισμό του προ-αντιγραφικού συμπλόκου στις αφετηρίες της αντιγραφής, με τελικό αποτέλεσμα την προσέλκυση των ελικασών MCM2-7 (Mini Chromosome Maintenance Complex) και την έναρξη της αντιγραφής. Ο παράγοντας Cdt1 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία αδειοδότησης και για τον λόγο αυτό ρυθμίζεται αυστηρά κατά την διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, εκτός από την αποικοδόμησή του, υπάρχει ένας επιπλέον τρόπος ρύθμισής του, μέσω της πρωτεΐνης της Geminin. Η Geminin προσδένεται στο Cdt1 και με αυτόν τον τρόπο αναστέλλει τη στρατολόγηση των MCM2-7 στη χρωματίνη και επομένως, την αδειοδότηση της αντιγραφής. Εκτός από την δράση της στην ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, η Geminin παίζει σημαντικό ρόλο και στην κυτταρική διαφοροποίηση, αλληλεπιδρώντας με μεταγραφικούς παράγοντες και πρωτεϊνικά σύμπλοκα αναδιοργάνωσης της δομής της χρωματίνης. Η γονιδιωματική αστάθεια είναι χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων, στην οποία συντελεί απορύθμισης παραγόντων του συστήματος αδειοδότησης της αντιγραφής και συγκεκριμένα των κύριων ρυθμιστών του, Geminin και Cdt1. Η υπερέκφραση του Cdt1 οδηγεί σε επαναντιγραφή και, συνεπώς, υπερδιπλασιασμό του DNA, ενώ την ίδια επίπτωση εμφανίζει και η αποσιώπηση της Geminin. Η σημαντικότητα της αλληλεπίδρασης των δυο αυτών μορίων οδήγησε στην αναζήτηση συνθετικών χημικών ουσιών με την ικανότητα διάσπασης του συμπλόκου Geminin- Cdt1. Οι συνθετικές αυτές χημικές ενώσεις μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μοριακά εργαλεία για την περαιτέρω μελέτη της in vivo αλληλεπίδρασης των Geminin και Cdt1 στις διαδικασίες του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης, καθώς επίσης και ως φαρμακολογικές ουσίες με πιθανή αντικαρκινική δράση. Η παρούσα εργασία εστιάστηκε στη μελέτη της συνθετικής χημικής ένωσης XIV, η οποία είχε ταυτοποιηθεί σε έναν προηγούμενο μαζικό έλεγχο υψηλής απόδοσης (High throughput Screening - HTS). Αρχικά καθορίστηκαν τα επίπεδα κυτταροτοξικότητάς της. Στη συνέχεια μελετήθηκε η ικανότητά της να μεταβάλλει την ενδοκυτταρική κατανομή της Geminin και τέλος, εξετάστηκε η επίδρασή της στον κυτταρικό κύκλο. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η συνθετική χημική ένωση XIV παρουσιάζει περιορισμένη κυτταροτοξικότητα. Επιπλέον, αυξάνει τον πυρηνικό εντοπισμό της εξωγενώς εκφρασμένης Geminin, υποδεικνύοντας ότι μπορεί να ανταγωνίζεται το Cdt1 για την πρόσδεσή του στη Geminin. Πειράματα ανοσοφθορισμού και ανάλυσης περιεχομένου του DNA, μέσω FACS, έδειξαν ότι η συνθετική χημική ένωση XIV προκαλεί αναστολή του 7

Περίληψη κυτταρικού κύκλου των καρκινικών κυττάρων κατά τα αρχικά στάδια της S φάσης. Συμπερασματικά, η συνθετική χημική ένωση XIV ενδέχεται να επηρεάζει την αλληλεπίδραση των Geminin και Cdt1. Χημικές ενώσεις ικανές να παρεμβαίνουν στην ειδικότητα αλληλεπίδρασης των δυο αυτών μορίων και συνεπώς στο σύστημα αδειοδότησης της αντιγραφής, μπορούν να αποτελέσουν τη βάση για την ανάπτυξη μια νέας γενιάς αντικαρκινικών φαρμάκων με βελτιστοποιημένες ιδιότητες. 8

Abstract Abstract The replication licensing begins with the formation of the pre-replicative Complex (prerc) on the origins of replication (ori), leading to the recruitment of the MCM2-7 helicases onto chromatin and the initiation of DNA replication. Cdt1 plays a crucial role in the licensing and is therefore strictly regulated during the cell cycle. Cdt1 is primarily regulated via proteolytic degradation, while in higher eukaryotes, is also negatively regulated by Geminin. Geminin s binding to Cdt1 inhibits the loading of the MCMs to chromatin and thus licensing of DNA replication. Geminin also has an additional role in differentiation processes by multiple interactions with transcriptional factors and chromatin remodeling complexes. Cancer cells are characterized by genomic instability. Deregulation of the components of the licensing system and especially of Geminin and Cdt1, leads to genomic instability and promotes malignant transformation. Geminin and Cdt1 complex could be used as could serve as target for the identification of chemical compounds that would be able to modulate proliferation. These chemical compounds can be used as molecular tools for further studying the in vivo interaction of these two molecules during the processes of cellular proliferation and differentiation, and ultimately serve as potential pharmacological agents with anti-cancer properties. In this study, we aimed to characterize the chemical compound XIV, which was identified in a previous High Throughput Screening (HTS). Specifically, we examined compound XIV in cellular assays in order to determine cytotoxity, its ability to alter the subcellular localization of Geminin and cell cycle profile of cancer cells. Our results, suggest that the chemical compound XIV exhibits limited cytotoxicity. It increases the nuclear localization of transiently expressed Geminin, suggesting that it might act by antagonizing Cdt1 for the binding of Geminin. Additionally, immunofluorescence and FACS experiments showed that chemical compound XIV causes cell cycle arrest during early S phase. Overall, in this study we propose that chemical compound XIV interferes with the Geminin and Cdt1 complex and affects proliferation of tumorigenic cells. 9

1. Εισαγωγή 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 10

1. Εισαγωγή 1.1 Ο κυτταρικός κύκλος Η ικανότητα αυτοαναπαραγωγής αποτελεί θεμελιώδες χαρακτηριστικό των κυττάρων αλλά και όλων των ζωντανών οργανισμών. Όλα τα κύτταρα αναπαράγονται με διαίρεση, κατά την οποία από ένα κύτταρο παράγονται δυο θυγατρικά κύτταρα. Η διαδικασία αυτή καλείται κυτταρικός κύκλος (cell cycle) και συνιστά το βασικό μηχανισμό αναπαραγωγής για όλα τα έμβια όντα. Κατά τον κυτταρικό κύκλο επιτελούνται τέσσερις συντονισμένες διεργασίες: η κυτταρική αύξηση, η αντιγραφή του DNA, η κατανομή των διπλασιασμένων χρωμοσωμάτων στα θυγατρικά κύτταρα και η κυτταρική διαίρεση. Κατά τη μικροσκοπική παρατήρηση διακρίνονται δυο κύριες περίοδοι του κυτταρικού κύκλου: η μίτωση (mitosis-m) και η μεσόφαση (interphase). Η μίτωση (πυρηνική διαίρεση) αποτελεί το στάδιο του κυτταρικού κύκλου που αντιστοιχεί στον διαχωρισμό των θυγατρικών χρωμοσωμάτων και συνήθως καταλήγει σε κυτταρική διαίρεση (κυτταροκίνησηcytokinesis). Η μεσόφαση αποτελεί την περίοδο ανάμεσα σε δυο μιτώσεις, κατά την οποία τα χρωμοσώματα αποσυμπυκνώνονται και καταλαμβάνουν ολόκληρο τον πυρήνα. Σε μοριακό επίπεδο, η μεσόφαση είναι η περίοδος κατά την οποία διεξάγεται, με μεγάλη τάξη και οργάνωση, τόσο η κυτταρική αύξηση όσο και η αντιγραφή του DNA καθώς το κύτταρο ετοιμάζεται για την επικείμενη διαίρεση. Εικόνα 1.1: Οι φάσεις του κυτταρικού κύκλου Ο κυτταρικός κύκλος των ευκαρυωτικών κυττάρων χωρίζεται σε τέσσερις διακριτές φάσεις (εικόνα 1). Η φάση Μ (M phase) του κυτταρικού κύκλου αντιστοιχεί στη μίτωση. Στη συνέχεια ακολουθεί η φάση G1 (G1 phase-gap 1 phase: φάση 1 ου μεσοδιαστήματος), κατά την οποία το κύτταρο είναι μεταβολικά ενεργό και η βιομάζα του αυξάνεται συνεχώς, χωρίς να αντιγράφεται το DNA του. Τη G1 φάση ακολουθεί η φάση S (S phase-synthesis phase: φάση σύνθεσης), όπου διεξάγεται η αντιγραφή του DNA. Μετά την ολοκλήρωση της σύνθεσης του DNA ξεκινά η φάση 11

1. Εισαγωγή G2 (G2 phase-gap 2 phase: φάση 2 ου μεσοδιαστήματος) κατά την οποία συνεχίζεται η κυτταρική αύξηση και συντίθενται πρωτεΐνες καθώς το κύτταρο προετοιμάζεται για τη μίτωση. Η διαίρεση όλων των κυττάρων πρέπει να ρυθμίζεται προσεκτικά και να συντονίζεται τόσο με την κυτταρική αύξηση όσο και με την αντιγραφή του DNA, ώστε τα θυγατρικά κύτταρα να φέρουν ακέραιο το γονιδίωμα των μητρικών. 1.2 Η αντιγραφή του DNA Η διατήρηση του γονιδιώματος των ευκαρυωτικών κυττάρων απαιτεί την ακριβή και συντονισμένη αντιγραφή ολόκληρου του γονιδιώματος, κάθε φορά που ένα κύτταρο διαιρείται. Για να επιτευχθεί αυτός ο συντονισμός, τα ευκαρυωτικά κύτταρα ακολουθούν μια καθορισμένη σειρά από βήματα για να σχηματίσουν διάφορα σύμπλοκα πρωτεϊνών-κλειδιών στις περιοχές έναρξης της αντιγραφής. Η ταυτότητα και η σειρά συγκρότησης των παραγόντων που συμμετέχουν στην αντιγραφή των ευκαρυωτικών κυττάρων είναι έντονα συντηρημένη ανάμεσα στα είδη, παρ όλο που υπάρχουν διακριτές διαφορές στη δομή των περιοχών έναρξης της αντιγραφής (Bell and Dutta, 2002). 1.2.1 Οι κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες (Cyclin Dependent Kinases Cdks) και ο ρόλος τους στη ρύθμιση της αντιγραφής Οι κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες (Cdks) αποτελούν μια οικογένεια κινασών σερίνης-θρεονίνης που ετεροδομερίζονται με μέλη της οικογένειας των κυκλινών και ενεργοποιούνται σε συγκεκριμένα σημεία του κυτταρικού κύκλου. Στο σύμπλοκο που σχηματίζεται, η κυκλίνη έχει ρυθμιστικό ρόλο ενώ η κινάση εμφανίζει καταλυτική ενεργότητα (Harper and Adams, 2001). Οι Cdks είναι απαραίτητες για την έναρξη της αντιγραφής σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς και φαίνεται να δρουν σε πολλαπλά επίπεδα με στόχο να ελέγχουν την πυροδότηση των αφετηριών της αντιγραφής, ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο και το στάδιο της ανάπτυξης (Fischer Daniel, Cell Cycle in Development, 2011). Τα μιτογόνα σήματα λαμβάνονται αρχικά από τις κυκλίνες D (D1, D2, D3), οι οποίες προσδένουν και ενεργοποιούν τις CDK4 και CDK6 κατά τη διάρκεια της G1 φάσης. Η ενεργοποίηση αυτών των συμπλόκων οδηγεί σε μερική ενεργοποίηση πρωτεϊνών όπως οι RB, RBL1, RBL2, οι οποίες επιτρέπουν την έκφραση των κυκλινών Ε (Ε1, Ε2). Οι κυκλίνες Ε προσδένουν και ενεργοποιούν τη CDK2 και το σύμπλοκο αυτό φωσφορυλιώνει περαιτέρω τις πρωτεΐνες RB, RBL1, RBL2 οδηγώντας στην απενεργοποίησή 12

1. Εισαγωγή τους. Η διαθεσιμότητα των κυκλινών Ε κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου ρυθμίζεται αυστηρά και περιορίζεται κατά τα αρχικά στάδια της S φάσης, ενώ το σύμπλοκο CDK2-κυκλίνη Ε φαίνεται ότι είναι απαραίτητο για τη G1/S μετάβαση. Στη συνέχεια, η CDK2 ενεργοποιείται από την κυκλίνη Α, κατά τα τέλος της S φάσης και υποβοηθά τη μετάβαση από την S στη G2 φάση του κυτταρικού κύκλου. Τελικά, η CDK1 φαίνεται ότι ενεργοποιείται από την κυκλίνη Α κατά το τέλος της G2 φάσης, για τη μετάβαση στη μίτωση. Με τη ρήξη της πυρηνικής μεμβράνης, η κυκλίνη Α αποικοδομείται, διευκολύνοντας τον σχηματισμό των συμπλόκων CDK1-κυκλινης Β, τα οποία είναι υπεύθυνα για την ορθή διεκπεραίωση της μίτωσης (Malumbres and Barbacid, 2009). 1.3 Το σύστημα αδειοδότησης της αντιγραφής Ο μηχανισμός μέσω του οποίου τα κύτταρα θα μπορούν να περιορίσουν την έναρξη της αντιγραφής του DNA σε μόνο μία φορά ανά κυτταρικό κύκλο χαρακτηρίστηκε για πρώτη φορά από τους Blow και Laskey το 1988 ως «υπόθεση αδειοδότησης». Αυτό που διατύπωσαν ήταν ότι η πυρηνική μεμβράνη αποτρέπει τον ανεφοδιασμό με έναν «παράγοντα αδειοδότησης», τον οποίο χρειάζονται τα χρωμοσώματα για να αρχίσουν την αντιγραφή και ο οποίος απομακρύνεται όταν πυροδοτούνται οι περιοχές έναρξης της αντιγραφής. Με αυτόν τον τρόπο, ένα χρωμόσωμα που έχει αντιγραφεί, μπορεί να αδειοδοτηθεί για ένα δεύτερο γύρο αντιγραφής μόνο μετά την διάλυση της πυρηνικής μεμβράνης κατά την μίτωση (Saxena and Dutta, 2005). Επίσης, πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στον S. cerevisiae (Diffley, 1994) αποκάλυψαν δυο καταστάσεις των αφετηριών της αντιγραφής, κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Η πρώτη λαμβάνει χώρα κατά τη G1 φάση, πριν ξεκινήσει η αντιγραφή του DNA, όταν ένα πολυπρωτεϊνικό σύμπλοκο που καλείται προ-αντιγραφικό σύμπλοκο (pre-replicative complex pre-rc) συγκροτείται στις περιοχές έναρξης της αντιγραφής και είναι εκείνο που τις αδειοδοτεί (licensed state). Η δεύτερη κατάσταση εμφανίζεται με την έναρξη της S φάσης και διαρκεί έως και το τέλος της μίτωσης, όπου στις περιοχές έναρξης της αντιγραφής επικρατεί ένα σύμπλοκο με λιγότερα συστατικά από το προ-αντιγραφικό, το οποίο καλείται μετα-αντιγραφικό σύμπλοκο (postreplicative complex post-rc). Σε αυτή την κατάσταση η χρωματίνη δεν μπορεί να υποστηρίξει εκ νέου την αντιγραφή και αποτρέπει την επαναπυροδότηση των αφετηριών (unlicensed state). 13

1. Εισαγωγή 1.3.1 Το προ-αντιγραφικό σύμπλοκο και η διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής Ο πρώτος κρίσιμος μηχανισμός που διασφαλίζει ότι κανένα τμήμα του DNA δεν θα παραμείνει χωρίς να αντιγραφεί, αλλά και ότι κανένα τμήμα του DNA δεν θα αντιγραφεί παραπάνω από μια φορά κατά τη διάρκεια του ίδιου κυτταρικού κύκλου, ρυθμίζεται από τη διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής. Η διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής λαμβάνει χώρα μόνο από το τέλος της μίτωσης και κατά τη διάρκεια της G1 φάσης και περιλαμβάνει τη διαδοχική συγκρότηση των μελών του προ-αντιγραφικού συμπλόκου στις περιοχές έναρξης της αντιγραφής. Το πρώτο συστατικό του προ-αντιγραφικού συμπλόκου που αλληλεπιδρά με την περιοχή έναρξης της αντιγραφής είναι το Origin Recognition Complex ORC, το οποίο με τη σειρά του δρα σαν σκαλωσιά για την προσέλκυση των πρωτεϊνών Cdc6 και Cdt1. Οι δυο αυτές πρωτεΐνες αποτελούν τους παράγοντες για τη στρατολόγηση του εξαμερούς συμπλόκου MCM2-7 (Mini Chromosome Maintenance proteins) στη χρωματίνη, οι οποίες έχουν δράση ελικάσης. Αυτό αποτελεί και το τελευταίο βήμα στο σχηματισμό ενός λειτουργικού προ-αντιγραφικού συμπλόκου, με αποτέλεσμα την αδειοδότηση των αφετηριών αντιγραφής (licensed state). Σε in vitro πειράματα που έχουν γίνει (Maiorano et al., 2000, Nishitani et al., 2000), έχει δειχθεί πως από τη στιγμή που θα στρατολογηθούν οι MCM πρωτεΐνες στη χρωματίνη, οι παράγοντες Cdc6 και Cdt1 δεν είναι πλέον απαραίτητοι (Xouri et al., 2007). 1.3.2 Η ενεργοποίηση των αδειοδοτημένων (licensed) αφετηριών αντιγραφής και η έναρξη της αντιγραφής Για την ενεργοποίηση των αδειοδοτημένων αφετηριών αντιγραφής είναι απαραίτητες δυο πρωτεϊνικές κινάσες, η CDK (Cyclin Dependent Kinase) και η DDK (Dbf4 Dependent Kinase). Η CDK αλληλεπιδρά με τις κυκλίνες των G1/S φάσεων, Cdk2-κυκλίνη Ε, και έχει σημαντικό ρόλο στην έναρξη της αντιγραφής του DNA, ενώ η DDK αποτελείται από την υπομονάδα της κινάσης Cdc7, της οποίας η περιοδική ενεργότητα ρυθμίζεται από τη συσσώρευση της ρυθμιστικής υπομονάδας Dbf4 κατά την μετάβαση από τη G1 στην S φάση (Nishitani and Lygerou, 2002). 14

1. Εισαγωγή Εικόνα 1.2: Η αδειοδότηση της αντιγραφής. Η συγκρότηση του προ-αντιγραφικού συμπλόκου (pre-rc) πραγματοποιείται με την προσέλκυση των παραγόντων Cdc6 και Cdt1 στις αφετηρίες αντιγραφής όπου έχουν προσδεθεί σύμπλοκα ORC. Ακολουθεί η στρατολόγηση των MCMs. Στη συνέχεια, συγκροτείται το προεναρκτήριο σύμπλοκο (pre-ic) με τη δράση των CDK και DDK, για τη στρατολόγηση των Cdc45 και GINS, με τελικό αποτέλεσμα την έναρξη της αντιγραφής (τροποποιημένη από Truong and Wu, 2011). Παρόλο που οι MCM2-7 πρωτεΐνες στρατολογούνται για τη συγκρότηση του προ-αντιγραφικού συμπλόκου κατά τη G1 φάση, η ενεργοποίησή τους από τις Cdk2 και Cdc7 για την εγκαθίδρυση του προεναρκτήριου συμπλόκου (pre-initiation complex pre-ic), δεν συμβαίνει παρά με την έναρξη της S φάσης. Κατά τη μετάβαση από τη G1 στην S φάση πραγματοποιούνται κάποιες φωσφορυλιώσεις από τις Cdk2 και Cdc7, σε συνδυασμό με τις δράσεις άλλων μορίων όπως της MCM10 πρωτεΐνης και τα γεγονότα αυτά είναι απαραίτητα για τη στρατολόγηση των Cdc45 και GINS στο σύμπλοκο MCM2-7. Τα Cdc45 και GINS είναι απαραίτητα για την ενεργοποίηση των MCM2-7 και προωθούν τη δράση DNA ελικάσης των τελευταίων. Μετά από αυτό το βήμα, στρατολογούνται τα RPA, DNA πολυμεράση α, RFC, PCNA και DNA πολυμεράση δ και εκκινείται η αντιγραφή του DNA (Truong και Wu, 2011). 1.4 Η ρύθμιση της αδειοδότησης της αντιγραφής Προκειμένου να διασφαλιστεί ότι δεν θα υπάρξει επαναντιγραφή του DNA στον ίδιο κυτταρικό κύκλο, τα κύτταρα έχουν αναπτύξει διάφορους μηχανισμούς. 1.4.1 Μέσω της δράσης των CDKs Η δραστηριότητα των CDKs φαίνεται ότι ελέγχει κάθε γύρο αντιγραφής του DNA. Στο τέλος της Μ φάσης η χαμηλή δραστηριότητα των CDKs επιτρέπει τη συγκρότηση του προαντιγραφικού συμπλόκου (αδειοδοτημένη κατάσταση). Η αύξηση δραστηριότητας των CDKs κατά τη μετάβαση 15

1. Εισαγωγή από τη G1 στην S φάση πυροδοτεί την έναρξη της αντιγραφής, ενώ την ίδια στιγμή μετατρέπει την αφετηρία της αντιγραφής στην μετα-αντιγραφική (μη αδειοδοτημένη) κατάσταση. Η υψηλή δραστηριότητα των CDKs μέχρι και το τέλος της Μ φάσης αποτρέπει τον σχηματισμό ενός νέου προ-αντιγραφικού συμπλόκου (Nishitani and Lygerou, 2002). Έχει δειχθεί ότι η υπομονάδα Orc1 του συμπλόκου των ORC στοχεύεται για αποικοδόμηση κατά την S φάση, η οποία φαίνεται ότι εξαρτάται από τη δράση των CDKs. Επιπλέον, το σύμπλοκο κυκλίνη A-CDK2 προσδένεται στο αμινοτελικό άκρο του Cdc6 και το φωσφορυλιώνει, με αποτέλεσμα την μετάθεση του από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα, αναστέλλοντας την δράση του στην αδειοδότηση της αντιγραφής. Οι CDKs μπορούν επίσης να αποτρέπουν την επαναδειοδότηση της αντιγραφής με το να φωσφορυλιώνουν το Cdt1 (CDK2 ή CDK4) και να το οδηγούν προς αποικοδόμηση. Τέλος, έχει δειχθεί ότι υπομονάδες του συμπλόκου των ελικασών MCM2-7, και συγκεκριμένα η MCM4, φωσφορυλιώνεται από το σύμπλοκο κυκλίνη A-CDK2 με αποτέλεσμα την αναστολή της δράσης τους κατά την αντιγραφή του DNA (Woo and Poon, 2003, Blow and Dutta, 2005). Η δράση αυτή των CDKs διαχωρίζει τις δυο καταστάσεις των αφετηριών αντιγραφής (αδειοδοτημένη μη αδειοδοτημένη) και συνδέει την έναρξη της S φάσης με την ολοκλήρωση της μίτωσης. 1.4.2 Μέσω της ρύθμισης του Cdc6 Το Cdc6 αποτελεί ένα από τα βασικά συστατικά του προαντιγραφικού συμπλόκου για την προσέλκυση των ελικασών MCM2-7 και για το λόγο αυτό, η ρύθμισή του είναι σημαντική για την αποτροπή επαναδειοδότησης των ίδιων αφετηριών. Το ανθρώπινο Cdc6 (hcdc6) αποσταθεροποιείται κατά το τέλος της G1 με τη δράση της λιγάσης της ουβικουιτίνης APC Cdh1 και του πρωτεασώματος. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι το hcdc6 μετατοπίζεται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα κατά τη μετάβαση από τη G1 στην S φάση, μειώνοντας με αυτόν τον τρόπο τον κίνδυνο επαναδειοδότησης της αντιγραφής. Κάποιες άλλες μελέτες έδειξαν ότι ένα μέρος του Cdc6 εξακολουθούσε να βρίσκεται στον πυρήνα και να παραμένει συνδεδεμένο με τη χρωματίνη σε όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Οι παρατηρήσεις αυτές υποδεικνύουν ότι εκτός από το ρόλο του Cdc6 στην αδειοδότηση της αντιγραφής, συμμετέχει και σε επιπλέον κυτταρικές λειτουργίες όπως τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου (checkpoints) και η είσοδος στη μίτωση (Borlado και Mendez, 2008). 16

1. Εισαγωγή 1.4.3 Μέσω ρύθμισης του Cdt1 1.4.3.1 Η αποικοδόμηση του Cdt1 κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου Η εξέλιξη πολλών διαφορετικών και εφεδρικών μονοπατιών για την πρωτεόλυση του Cdt1 υποδεικνύει το πόσο σημαντική είναι η απενεργοποίηση της λειτουργίας του κατά τη διάρκεια των S/G2/M φάσεων για την αποφυγή της επαναντιγραφής του DNA. Ένα από τα μονοπάτια αποικοδόμησης του Cdt1 είναι μέσω του συμπλόκου SCF-Skp2 E3 λιγάση της ουβικουτίνης, κατά το οποίο η πρωτεόλυση του Cdt1 ρυθμίζεται από τη δράση των CDKs. Ένα άλλο μονοπάτι αποικοδόμησης περιλαμβάνει το σύμπλοκο Cul4-Ddb1-Cdt2 E3 λιγάση της ουβικουτίνης και η πρωτεόλυση του Cdt1 μεσολαβείται από το PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen). Έχει προταθεί ότι η μεσολαβούμενη από PCNA πρωτεόλυση του Cdt1 μέσω του Cul4-Ddb1-Cdt2 αποτελεί έναν γρήγορο τρόπο αποικοδόμησης του προσδεμένου-στη-χρωματίνη Cdt1 κατά την S φάση (Truong και Wu, 2011). Έχει δειχθεί επίσης (Nishitani et al., 2006) ότι ενώ το μονοπάτι Cul4-Ddb1-Cdt2 λειτουργεί για αποικοδόμηση του Cdt1 μόνο κατά την S φάση, το μονοπάτι SCF-Skp2 δρα και κατά την S και κατά τη G2 φάση. Τέλος, το Cdt1 μπορεί να αποικοδομηθεί μέσω ουβικουϊτίνωσης και μέσω του APC/C Cdh1 συμπλόκου. Έχει δειχθεί ότι, το Cdt1 αλληλεπιδρά με τo σύμπλοκο APC/C Cdh1 μέσω τριών ειδικών μοτίβων αποικοδόμησης (destruction boxes), τα οποία εντοπίζονται στο αμινοτελικό του άκρο. Ο μηχανισμός αυτός φαίνεται ότι είναι απαραίτητος για τη γρήγορη αποικοδόμηση του Cdt1 σε κύτταρα που εξέρχονται από τον κυτταρικό κύκλο και εισέρχονται σε G0 φάση (Sugimoto et al., 2008). 1.4.3.2 Η αρνητική ρύθμιση του Cdt1 μέσω του ειδικού αναστολέα του, τη Geminin Στα μετάζωα έχει εμφανιστεί ένας επιπλέον μηχανισμός ρύθμισης του Cdt1, ο οποίος γίνεται μέσς της πρωτεΐνης Geminin. Η Geminin είναι μια πρωτεΐνη 25 kda που ανακαλύφθηκε αρχικά στον Xenopus laevis (McGarry και Kirschner, 1998) σε έναν έλεγχο που έγινε για πρωτεΐνες που αποικοδομούνται ειδικά κατά τη μίτωση και δείχθηκε ότι το μόριο αυτό μπορούσε να αναστείλει την αντιγραφή του DNA, αποτρέποντας τη στρατολόγηση του συμπλόκου των MCM στη χρωματίνη. Μεταγενέστερες μελέτες (Wohlschlegel et al., 2000, Tada et al., 2001) αποκάλυψαν και το στόχο της Geminin για αυτή της τη δράση, ο οποίος είναι ο Cdt1. 17

1. Εισαγωγή 1.5 Η ρύθμιση της Geminin κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου 1.5.1 Η ρύθμιση της Geminin σε μεταγραφικό επίπεδο Η ρύθμιση της Geminin σε μεταγραφικό επίπεδο πραγματοποιείται μέσω του μονοπατιού Rb/E2F. Οι μεταγραφικοί παράγοντες της οικογένειας E2F επάγουν την έκφραση των γονιδίων στόχων τους όταν δεν βρίσκονται σε σύμπλοκο με την πρωτεΐνη του ρετινοβλαστώματος (Rb). Σε κύτταρα με ανενεργό Rb παρατηρήθηκε αύξηση των επιπέδων της Geminin. Δεδομένου ότι η πρωτεΐνη Rb εμφανίζεται ανενεργή κατά το στάδιο μετάβαση G1/S και ενεργή κατά το τέλος της μίτωσης, το μονοπάτι Rb/E2F συμβάλλει στη ρύθμιση των επιπέδων της Geminin κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου (Yoshida and Inoue, 2004). 1.5.2 Η ρύθμιση της Geminin σε μετα-μεταφραστικό επίπεδο Η Geminin φαίνεται να αποικοδομείται κατά το τέλος της μίτωσης και μέχρι τη G1 φάση. Η αποικοδόμηση αυτή βασίζεται στη δράση του συμπλόκου APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome), το οποίο σηματοδοτεί τη Geminin για πρωτεόλυση μέσω ουβικουϊτίνωσης (McGarry και Kirschner, 1998). Μετά την πυροδότηση των αφετηριών αντιγραφής, νωρίς κατά την S φάση, η συσσώρευση της κυκλίνης Α-CDK2, αλλά κυρίως η σύνθεση του αναστολέα APC/C, Emi1, αποτρέπει την επαναντιγραφή, με το να οδηγεί το Cdc6 εκτός πυρήνα και με το να απενεργοποιεί το APC/C Cdh1 και να σταθεροποιεί με αυτόν τον τρόπο τη Geminin κατά την εξέλιξη της S φάσης. Η Geminin παραμένει σε ανασταλτικό σύμπλοκο με το Cdt1 μέχρι την επόμενη μίτωση, όπου το APC/C, είτε το Cdc20 είτε το Cdh1, ουβικουτινυλιώνει τη Geminin και απελευθερώνει το Cdt1 (Van Leuken et al., 2008). Έχει επίσης δειχθεί, ότι τα επίπεδα της Geminin μειώνονται με την έξοδο των κυττάρων από τον κυτταρικό κύκλο σε G0 φάση, επειδή το APC/C Cdh1 παραμένει ενεργό στα κύτταρα σε ηρεμία (Xouri et al., 2004, Van Leuken et al., 2008). Σε εκχυλίσματα από ωοκύτταρα του Xenopus έχει δειχθεί ότι η ενδογενής Geminin δεν πρωτεολύεται πλήρως και το υπόλοιπο ποσοστό αυτής υφίσταται μη πρωτεολυτική απενεργοποίηση. Ο συγκεκριμένος μηχανισμός ρύθμισης απαιτεί την εξαρτώμενη από CDK πολύουβικουϊτίνωση της πρωτεΐνης και αποτελεί μια παροδική μετα-μεταφραστική τροποποίηση που καθιστά τη Geminin ανενεργή. Αν και η φύση της απενεργοποίησης δεν είναι πλήρως τεκμηριωμένη, έχει προταθεί ότι η πολύ-ουβικουϊτίνωση πιθανόν να οδηγεί το μόριο σε ανενεργή στεροδιάταξη (Li και Blow, 2004). 18

1. Εισαγωγή 1.5.3 Η ρύθμιση της Geminin σε επίπεδο υποκυτταρικού εντοπισμού Η ρύθμιση της Geminin μέσω της αλλαγής της ενδοκυτταρικής της κατανομής προέκυψε για πρώτη φορά σε μια μελέτη στον Xenopus, η οποία έδειξε ότι το ποσοστό της ενδογενούς Geminin που δεν έχει αποικοδομηθεί κατά το τέλος της μετάφασης δεν έχει την ικανότητα να αλληλεπιδρά με τον παράγοντα Cdt1, λόγω εντοπισμού της (Hodgson et al., 2002). Επόμενες μελέτες έδειξαν ότι ο πυρηνικός εντοπισμός της Xgeminin είναι απαραίτητος για την παρεμπόδιση της επαναντιγραφής του DNA καθώς και για την επαγωγή της νευρωνικής διαφοροποίησης (Yoshida et al., 2005). Αυτό που αποκαλύφθηκε επίσης είναι η αμινοξική περιοχή της Xgeminin η οποία είναι υπεύθυνη για τη μεταφορά της στον πυρήνα. Η περιοχή αυτή εντοπίζεται το αμινοτελικό άκρο της Xgeminin και περιλαμβάνει τα αμινοξικά κατάλοιπα 57-79, τα οποία έχουν δράση σήματος πυρηνικού εντοπισμού (Nuclear Localization Signal, NLS) (Benjamin et al., 2004, Boos et al., 2006, Yoshida et al., 2005). Η NLS αλληλουχία της Xgeminin είναι αμφιμερής (KRK/KKAK). Παρόλο που το πρώτο μέρος της (KRK) είναι ευρέως συντηρημένο ανάμεσα στα διαφορετικά είδη, το δεύτερο μέρος (KKAK) βρέθηκε ότι είναι συντηρημένο σε όλα τα μη θηλαστικά αλλά δεν ήταν παρών στα θηλαστικά. Ο πυρηνικός εντοπισμός της hgeminin φαίνεται να εξαρτάται από ένα RRK αμινοξικό μοτίβο στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης, το οποίο βρέθηκε επίσης ότι αποτελεί μέρος της περιοχής αλληλεπίδρασής της με τον παράγοντα Cdt1 (Lee et al., 2006). Αυτό υποδηλώνει έναν επιπλέον μηχανισμό για την είσοδο της Geminin στον πυρήνα, ο οποίος μεσολαβείται από τον παράγοντα Cdt1, ειδικά στα θηλαστικά που δεν κατέχουν το ισχυρό διμερές NLS της Xgeminin. Η σημασία της αλληλεπίδρασης Cdt1 Geminin όσον αφορά στον πυρηνικό εντοπισμό της τελευταίας έχει επισημανθεί σε διάφορες μελέτες. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιώντας εκχυλίσματα από ωοκύτταρα του Xenopus και HEK-293 κύτταρα, έχει δειχθεί ότι ο παράγοντας Cdt1 είναι απαραίτητος για την μεταφορά της hgeminin από το κυτταρόπλασμα στο πυρήνα. Το ίδιο έχει παρατηρηθεί και σε μεταλλαγμένες μορφές της Xgeminin οι οποίες δεν φέρουν τμήματα της NLS αλληλουχίας (Boos et al., 2006, Yoshida et al., 2005). Σχετική μελέτη πραγματοποιήθηκε και στο εργαστήριό μας και αφορούσε στη ρύθμιση του μορίου της Geminin σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, μέσω αλλαγής του πυρηνικού εντοπισμού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο ενδοκυτταρικός εντοπισμός της εξωγενούς hgeminin σχετίζεται με τη 19

1. Εισαγωγή φάση του κυτταρικού κύκλου. Συγκεκριμένα, ο πυρηνικός αποκλεισμός της πρωτεΐνης εμφανίζεται μόνο σε κύτταρα που βρίσκονται στη G1 φάση, ενώ η μετατόπιση της hgeminin από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα φαίνεται ότι απαιτεί την αλληλεπίδρασή της με τον παράγοντα hcdt1 (Δημάκη Μ., διδακτορική διατριβή, 2008). Παρόμοια με τα αποτελέσματα που προέκυψαν στον Xenopus αποκαλύφθηκαν και στην όρνιθα. Μελέτη που έγινε στο συγκεκριμένο είδος έδειξε ότι η ενδοκυτταρική κατανομή της Geminin καθορίζεται από την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Αυτό που επίσης αποκαλύφθηκε ήταν ότι ο πυρηνικός εντοπισμός της πρωτεΐνης είναι απαραίτητος για την αναστολή της στρατολόγησης του συμπλόκου των MCMs στη χρωματίνη, καθώς και για τη ρύθμιση της έκφρασης των Hox γονιδίων (Luo et al., 2007). 1.6 Ο διττός ρόλος της Geminin στον κυτταρικός πολλαπλασιασμός και στη διαφοροποίηση Η Geminin είναι πολυλειτουργική πρωτεΐνη. Εκτός από τη δράση της στη ρύθμιση της αδειοδότησης της αντιγραφής μετά από την πρόσδεσή της με τον αδειοδοτικό παράγοντα Cdt1, έχει επίσης και την ικανότητα να αλληλεπιδρά κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης με μεταγραφικούς παράγοντες όπως οι Six3 και Hox και να αναστέλλει τις δράσεις τους. Οι λειτουργίες της Geminin στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό αλλά και στην εμβρυική ανάπτυξη υποδεικνύουν έναν ανταγωνιστικό συνδυασμό των δυο αυτών διαδικασιών. Στη μύγα Drosophila, μεταλλάγματα στα οποία απουσίαζε η Geminin παρουσίασαν μείωση των ραχιαίων νευρώνων, ενώ υπερέκφρασή της είχε ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό νευρικών κυττάρων εκτοπικά καθώς και μείωση του μεγέθους των οφθαλμών (Quinn et al., 2001). Ο ρόλος της Geminin στην ανάπτυξη των οφθαλμών επισημάνθηκε και στον ιχθύ Medaka (Del Bene et al., 2004). Η δράση αυτή αποδόθηκε στην άμεση αλληλεπίδραση της Geminin με την πρωτεΐνη Six3, η οποία εμπλέκεται στην ανάπτυξη του οφθαλμού. Μια ισχυρή αλληλεπίδραση υπερεκφρασμένης Geminin με Six3 κατέστησε την τελευταία μη διαθέσιμη για να επιτελέσει τη λειτουργία της, με αποτέλεσμα τη μείωση του οφθαλμικού ιστού. Ο φαινότυπος αυτός συσχετίστηκε με μείωση του αριθμού των διαιρούμενων κυττάρων και πρόωρη νευρογένεση στα οπτικά κυστίδια (optic vesicles). Κατά παρόμοιο τρόπο, η μείωση της λειτουργία της Geminin οδήγησε σε ενισχυμένη δράση της Six3, σε αυξημένο αριθμό μιτωτικά ενεργών κυττάρων και τελικά σε μεγαλύτερο μέγεθος οφθαλμών. Τα δεδομένα αυτά συνιστούν μια αμφίδρομη αναστολή μεταξύ Geminin και Six3. Η ισχυρή αλληλεπίδραση Geminin και Six3 in vitro, οδήγησε σε μια απελευθέρωση του 20

1. Εισαγωγή αδειοδοτικού παράγοντα Cdt1, καθιστώντας τον διαθέσιμο για την αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA. Η δραστηριότητα της Geminin δεν περιορίζεται μόνο με την πρωτεΐνη Six3, αλλά στα σπονδυλωτά έχει αναφερθεί και αλληλεπίδραση της με τις πρωτεΐνες Hox και Polycomb. Στα αναπτυσσόμενα έμβρυα σπονδυλωτών τα Hox γονίδια καθορίζουν τον εμπροσθοπίσθιο άξονα και η μεταγραφή τους ενεργοποιείται διαδοχικά. Το πρότυπο έκφρασης των Hox γονιδίων εγκαθιδρύεται νωρίς κατά την εμβρυογένεση και πρέπει να διατηρηθεί και να κληρονομηθεί κατά την ανάπτυξη. Απαραίτητη προϋπόθεση για την διατήρηση αυτού του προτύπου έκφρασης αποτελεί η διατήρηση της μεταγραφικής καταστολής των Hox γονιδίων από τις πρωτεΐνες της ομάδας Polycomb. Οι Polycomb πρωτεΐνες σχηματίζουν σύμπλοκα (Polycomb complex) τα οποία αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες αναδιοργάνωσης της χρωματίνης και συσχετίζονται με ρυθμιστικά στοιχεία DNA των Hox γονιδίων στη χρωματίνη, προκειμένου να καταστείλουν τη μεταγραφή τους. Η Geminin έχει την ικανότητα να επηρεάζει τη μεταγραφή των Hox γονιδίων μέσω αλληλεπίδρασής της με την πρωτεΐνη Scmh1 του Polycomb συμπλόκου (Luo et al., 2004). Όταν η Geminin υπερεκφράστηκε στη μια πλευρά του νευρικού σωλήνα εμβρύων όρνιθας, κατέστειλε την ενεργοποίηση του γονιδίου Hoxb9 και μετέθεσε την μεταγραφή του από το εμπρόσθιο τμήμα στο οπίσθιο. Η Geminin μπορεί επίσης να αλληλεπιδρά και άμεσα με τις ομοιοτικές περιοχές (homeodomains) των Hox πρωτεϊνών, αναστέλλοντας την ικανότητά τους να προσδένονται στο DNA και επηρεάζοντας με αυτόν τον τρόπο τη δράση τους ως μεταγραφικοί παράγοντες. Αυτή η αναστολή της Hox δράσης από τη Geminin, τόσο σε μεταγραφικό όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο, μπορεί να λειτουργεί είτε αυτόνομα είτε συνεργιστικά, για να διασφαλίζει την απόλυτη αναστολή της Hox δράσης. Επιπροσθέτως, έχει δειχθεί ότι οι πρωτεΐνες Hox είναι ικανές να μετατοπίσουν τη Geminin από το σύμπλοκό της με τον παράγοντα Cdt1. Η πρωτεΐνη Hoxa11 καθώς και ο Cdt1 αλληλεπιδρούν με τη Geminin μέσω του σπειροειδούς σπειράματός της. Κατά αυτόν τον τρόπο, μια άμεση αλληλεπίδραση της Geminin με τις πρωτεΐνες Hox μπορεί να καθιστά τον Cdt1 διαθέσιμο για την αντιγραφή του DNA. Ο ανταγωνισμός αυτός της Geminin για δυο λειτουργικά δίκτυα μπορεί να υποδεικνύει ένα σημαντικό ρόλο για την απαραίτητη ισορροπία μεταξύ πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης (Pitulescu et al., 2005). 21

1. Εισαγωγή Έχει βρεθεί επίσης ότι η Geminin αλληλεπιδρά με το Brg1, την καταλυτική υπομονάδα του συμπλόκου SWI/SNF (Seo et al., 2005). Το SWI/SNF αποτελεί ένα σύμπλοκο αναδιοργάνωσης της χρωματίνης το οποίο μπορεί να αλληλεπιδρά με διάφορους ειδικούς μεταγραφικούς παράγοντες, ακετυλάσες (HATs) και αποακετυλάσες (HDACs) των ιστονών και είτε να ενεργοποιεί είτε να καταστέλλει γονίδια-στόχους. Στα θηλαστικά, το σύμπλοκο SWI/SNF μπορεί να περιλαμβάνει μια από τις δυο καταλυτικές υπομονάδες: Brahma (Brm) ή Brahma related gene 1 (Brg1), αλλά όχι και τις δυο μαζί. Το σύμπλοκο SWI/SNF φαίνεται ότι αποτελεί έναν σημαντικό μεταγραφικό ρυθμιστή μιας πλειάδας κυτταρικών λειτουργιών, όπως είναι ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση. Η Brg1 καταλυτική υπομονάδα του συμπλόκου SWI/SNF αλληλεπιδρά με τους basic Helix-Loop- Helix (bhlh) μεταγραφικούς παράγοντες: Neurogenin (Ngn) και NeuroD και μεσολαβεί τις μεταγραφικές τους δράσεις για την επαγωγή της νευρογένεσης. Η χρησιμότητα αυτή του Brg1 στη νευρική διαφοροποίηση είναι διατηρημένη και σε κύτταρα θηλαστικών, αλλά και σε νευροεξώδερμα του Xenopus. Η Geminin αλληλεπιδρά με τον Brg1 και ανταγωνίζεται την δράση του κατά την κυτταρική διαφοροποίηση. Μείωση της δράσης της Geminin έχει ως αποτέλεσμα την πρόωρη νευρογένεση, ενώ υπερέκφρασή του γονιδίου της αποτρέπει την αλληλεπίδραση του Brg1 με τις προνευρικές bhlh πρωτεΐνες και αναστέλλει την νευρογένεση που μεσολαβείται από Ngn και NeuroD (Seo και Kroll, 2006). Εικόνα 1.3: Α. Υψηλά επίπεδα της Geminin, τα οποία βρίσκονται στα διαιρούμενα νευρικά προγονικά κύτταρα, μπορούν να αναστείλουν τις συντονισμένες δράσεις των νευρικών bhlh 22

1. Εισαγωγή πρωτεϊνών και των γονιδίων-στόχων του συμπλόκου SWI/SNF, είτε άμεσα, με αναστολή της bhlh-swi/snf αλληλεπίδρασης, είτε έμεσα, με την προσέλκυση των HDACs ή άλλων συγκαταστολέων. Β. Η μείωση των επιπέδων της Geminin καθιστά ικανά τα μεταγραφικά σύμπλοκο bhlh-swi/snf να ενεργοποιήσουν την μεταγραφή των γονιδίων-στοχων. Γ. Η Geminin μπορεί να προσδένεται στον αδειοδοτικό παράγοντα Cdt1 ή στον Six3 ή σε Hox μεταγραφικούς παράγοντες, με ανταγωνιστικό τρόπο, είτε ανταγονίζοντας την μεταγραφή γονιδίων που εξαρτάται από Six3/Hox, είτε ανταγονίζοντας την αλληλεπίδραση του Cdt1 με τα προαντιγραφικά σύμπλοκα (prerc) κατά τη μετάβαση G1/S του κυτταρικού κύκλου. Δ. Η Geminin μπορεί επίσης να ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση των Hox γονιδίων με το να αλληλεπιδρά με τις πρωτεΐνες Polycomb στους ενισχυτές των Hox γονιδίων (από Seo and Kroll, 2006). 1.7 Η λειτουργική σημασία της αλληλεπίδρασης Geminin-Cdt1 Η πρωτεΐνη Cdt1 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο κατά τη διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής, ενώ η πρωτεΐνη Geminin εμφανίζει διττό ρόλο, συμμετέχοντας στη ρύθμιση της αντιγραφής του DNA και της κυτταρικής διαφοροποίησης. Προκειμένου να κατανοηθεί πλήρως ο μηχανισμός δράσης των δύο πρωτεϊνών, έχουν πραγματοποιηθεί μελέτες με σκοπό το δομικό και λειτουργικό χαρακτηρισμό τους. Επίσης, παρόμοιες μελέτες που αφορούσαν το σύμπλοκο Cdt1- Geminin ανέδειξαν σημαντικές πληροφορίες για τον τρόπο αλληλεπίδρασης των δύο πρωτεϊνών καθώς και για το μηχανισμό μέσω του οποίου ρυθμίζουν την αδειοδότηση της αντιγραφής. 1.7.1 Δομική και λειτουργική περιγραφή του μορίου της Geminin Η αλληλουχία της Geminin υποδεικνύει ότι διαθέτει ένα εσωτερικό σπειροειδές σπείραμα (coiled coil), το οποίο αποτελείται από τουλάχιστον πέντε επταδικές επαναλήψεις. Περιλαμβάνει μια περιοχή εννέα αμινοξέων, το οποίο αποτελεί το ειδικό μοτίβο αποικοδόμησης (destruction box) και είναι απαραίτητο για την ουβικουτίνωση και την αποικοδόμηση της Geminin κατά τη μίτωση. Η περιοχή ανάμεσα στο σπειροειδές σπείραμα και την αλληλουχία αποικοδόμησης είναι πλούσια σε βασικά αμινοξέα τα οποία μπορούν να αποτελούν το NLS ή ακόμη και σημεία προσκόλλησης ουβικουιτίνης. Η καρβοξυτελική περιοχή της πρωτεΐνης είναι πλούσια σε όξινα αμινοξέα και δεν είναι αρκετά συντηρημένη ανάμεσα στα είδη. Σε μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί έχει δειχθεί ότι η Geminin ομοδιμερίζεται και ότι ο διμερισμός της αυτός προκύπτει μέσω του σπειροειδούς σπειράματός της (Saxena et al., 2004, 23

1. Εισαγωγή Benjamin et al., 2004). Ο διμερισμός της Geminin είναι απαραίτητος για να μπορέσει η πρωτεΐνη να επιτελέσει τις διάφορες λειτουργίες της. Υπάρχουν τρείς περιοχές της Geminin που συνεισφέρουν στην αλληλεπίδρασή της με τον παράγοντα Cdt1. Η πρώτη περιλαμβάνει τα υδροφοβικά κατάλοιπα στην διεπιφάνεια του σπειροειδούς σπειράματος, η δεύτερη τα κατάλοιπα του γλουταμινικού οξέος της επιφανείας και η τρίτη τα αμινοξικά κατάλοιπα 70-92. Μεταλλάξεις στα υδροφοβικά κατάλοιπα του σπειροειδούς σπειράματος διακόπτουν κάθε αλληλεπίδραση με τον παράγοντα Cdt1, ενώ μεταλλάξεις στις άλλες δυο περιοχές επιτρέπουν μια μικρή αλληλεπίδραση με αυτόν (Saxena et al., 2004). Επιπρόσθετα, σε μια άλλη μελέτη φάνηκε ότι το καρβοξυτελικό άκρο του εκτεταμένου σπειροειδούς σπειράματος, το οποίο στην Xgeminin περιλαμβάνει τα κατάλοιπα 140-160 και στην mgeminin τα 129-149, δεν αλληλεπιδρά άμεσα με τον παράγοντα Cdt1. Παρόλα αυτά φαίνεται ότι η περιοχή αυτή είναι ικανή να δρα σαν ασπίδα και να καλύπτει την περιοχή αλληλεπίδρασης του Cdt1 με το σύμπλοκο των MCMs, μη επιτρέποντάς τους να αλληλεπιδράσουν και συνεισφέροντας με αυτόν τον τρόπο στην αναστολή της έναρξης της αντιγραφής του DNA (Lee et al., 2004). Εικόνα 1.4: Α. Σχηματική αναπαράσταση της πρωτεΐνης της Geminin. Β. Η δομή του σπειροειδούς σπειράματος της Geminin. Έχει αποκαλυφθεί επίσης και η περιοχή της Geminin που είναι υπεύθυνη για την επαγωγή της νευρική διαφοροποίησης και η οποία στον Xenopus εντοπίζεται στην αμινοτελική περιοχή (κατάλοιπα 38-90). Η περιοχή αυτή είναι ικανή να προκαλέσει νευρική υπερτροφία και εκτοπική νευρογένεση, στην περίπτωση που RNA από αυτήν ενεθεί σε έμβρυα Xenopus. Επιπλέον, η περιοχή αυτή δεν εμφανίζει καμία επίπτωση στην αντιγραφή του DNA και στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου (Kroll et al., 1998). 24

1. Εισαγωγή 1.7.2 Δομική και λειτουργική περιγραφή του παράγοντα αδειοδότησης Cdt1 Για την πρωτεΐνη του παράγοντα Cdt1 έχουν αποκαλυφθεί τρεις πολύ σημαντικές περιοχές. Η πρώτη περιλαμβάνει την περιοχή στο κέντρο του μορίου, η οποία αλληλεπιδρά με τη Geminin, η δεύτερη είναι η αμινοτελική περιοχή η οποία είναι απαραίτητη για την πρωτεόλυσή του μέσω ουβικουιτίνωσης, ενώ περιέχει και ένα δεύτερο σημείο αλληλεπίδρασης με τη Geminin και η τρίτη περιοχή είναι η καρβοξυτελική η οποία απαιτείται για την αλληλεπίδρασή του με το σύμπλοκο των MCMs. Μελέτη που έχει πραγματοποιηθεί στον Xenopus έχει δείξει ότι 377 αμινοξικά κατάλοιπα (243-620) στο καρβοξυτελικό άκρο του Cdt1 είναι απαραίτητα για τη δράση του στην αδειοδότηση της αντιγραφής. Συγκεκριμένα τα αμινοξέα 447-620 φαίνεται να απαιτούνται για την αλληλεπίδρασή του με το σύμπλοκο των MCM (2, 4, 6, 7) (Ferenbach et al., 2005). Παρόμοια ήταν και τα αποτελέσματα σε μελέτη που πραγματοποιήθηκε στον ποντικό, όπου τα κατάλοιπα 407-477 στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης είναι απαραίτητα για την αλληλεπίδραση με την MCM 6 (Yanagi et al., 2002), ενώ η αντίστοιχη περιοχή στον άνθρωπο περιλαμβάνει τα αμινοξικά κατάλοιπα 410-445 του καρβοξυτελικού άκρου (Liu et al., 2011). Στον XCdt1, τουλάχιστον δυο περιοχές του μορίου αλληλεπιδρούν με τη Geminin. Μια κεντρική περιοχή (193-447) και μια περιοχή στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης(ferenbach et al., 2005). Και στον mcdt1 η περιοχή εντοπίζεται κεντρικά του μορίου (177-380) και φαίνεται ότι είναι συντηρημένη ανάμεσα στα μετάζωα (Yanagi et al., 2002). Στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης του hcdt1 εντοπίζεται μια αλληλλουχία (κατάλοιπα 48-71) πυρηνικού εντοπισμού (NLS) (Nishitani et al., 2004). Επιπροσθέτως, στο αμινοτελικό άκρο υπάρχει ένα Cy μοτίβο για την πρόσδεση κυκλίνης Α-CDK και ένα PIP μοτίβο για την πρόσδεση PCNA. Οι δυο αυτές περιοχές παίζουν σημαντικό ρόλο στην αποικοδόμηση του Cdt1 (Nishitani et al, 2004, Fujita, 2006). Τέλος, στο αμινοτελικό άκρο (ποντικός, 1-293) βρίσκεται και η περιοχή του Cdt1 που αλληλεπιδρά με το DNA(Yanagi et al., 2002). Τελευταίες μελέτες αποκάλυψαν ακόμη μια περιοχή στο αμινοτελικό άκρο του hcdt1, η οποία είναι διαθέσιμη για την πρόσδεση της αποακετυλάσης HDAC11 και ταυτοποίησαν σε αυτήν και δυο θέσεις ακετυλίωσης (λυσίνες 24 και 49). Η ακετυλίωση σταθεροποιεί και προστατεύει το Cdt1 από ουβικουϊτίνωση και επακόλουθη αποικοδόμηση. Όταν το μόριο χρειάζεται να αποικοδομηθεί, 25

1. Εισαγωγή η διαδικασία μπορεί να αντιστραφεί με αποακετυλίωση μέσω της δράσης της HDAC11 (Glozak και Seto, 2009). 1.7.3 Δομική και λειτουργική περιγραφή του συμπλόκου Cdt1-Geminin Η ανάλυση της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου Cdt1 172-368 :Geminin 79-157 (mtcdt1:mtgeminin) στον ποντικό έδειξε ότι πρόκειται για ένα ετεροτριμερές, αποτελούμενο από ένα μόριο Cdt1 και δυο μόρια Geminin (Cdt1: 2x Geminin) (Lee et al., 2004). Το ετεροτριμερές αυτό είναι ικανό να σχηματίζει και ένα εξαμερές (2x [Cdt1: 2x Geminin]), που υποδεικνύει ότι το σύμπλοκο Cdt1-Geminin μπορεί να υφίσταται σε τουλάχιστον δυο διακριτές τεταρτοταγείς δομές (De Marco et al., 2009). Εικόνα 1.5: Δομή του συμπλόκου htcdt1:htgeminin. Τα μόρια του Cdt1 απεικονίζονται με κίτρινο και πορτοκαλί χρώμα, ενώ τα μόρια της Geminin με πράσινο και μπλε χρώμα. Επίσης παρουσιάζεται σχηματική αναπαράσταση της αμινοξικής αλληλουχίας των Geminin και Cdt1 (από DeMarco et al., 2009). Για τον σχηματισμό του εξαμερούς είναι απαραίτητο το καρβοξυτελικό τμήμα του σπειροειδούς σπειράματος της Geminin (145-160), γιατί είναι η περιοχή που αλληλεπιδρά άμεσα με το Cdt1. Μεταλλάξεις στο καρβοξυτελικό τμήμα του σπειροειδούς σπειράματος οι οποίες δεν επηρεάζουν το συνολικό μήκος του έχουν ως αποτέλεσμα λειτουργικές διαφορές που σχετίζονται με την τεταρτοταγή δομή του συμπλόκου Cdt1-Geminin. Επιπλέον, τα κατάλοιπα του Cdt1 που είναι σε 26

1. Εισαγωγή άμεση επαφή με το καρβοξυτελικό τμήμα του σπειροειδούς σπειράματος της Geminin είναι λειτουργικά σημαντικά στον Xenopus αλλά και σε κυτταρικές σειρές θηλαστικών. Η συγκεκριμένη μελέτη (De Marco et al., 2009) προτείνει ένα μοντέλο για τη ρύθμιση της αδειοδότησης της αντιγραφής, το οποίο περιλαμβάνει μια ισορροπία μεταξύ του ετεροτριμερούς και του ετεροεξαμερούς, των οποίων η αφθονία ρυθμίζεται κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Το ετεροεξαμερές θα αντιπροσώπευε το ανασταλτικό σύμπλοκο που αποτρέπει την αδειοδότηση της αντιγραφής, κρατώντας κρυμμένα κατάλοιπα του Cdt1 που είναι απαραίτητα για τη δράση του. Το ετεροτριμερές, όπου τα ίδια κατάλοιπα του Cdt1 είναι ελεύθερα για να εμπλακούν στην αδειοδότηση της αντιγραφής (με το να προωθήσουν την αλληλεπίδραση του συμπλόκου των MCMs με τη χρωματίνη), θα αντιπροσώπευε το επιτρεπτό σύμπλοκο, το οποίο επιτρέπει την αδειοδότηση ακόμη και παρουσία Geminin. Με τον τρόπο αυτό, το σύμπλοκο Cdt1- Geminin πιθανόν να δρα σαν ένας διακόπτης, όπου η ισορροπία μεταξύ των διακριτών τεταρτοταγών καταστάσεων να ρυθμίζει την ενεργότητα. Εικόνα 1.6: Προτεινόμενος μηχανισμός ρύθμισης της αδειοδότησης της αντιγραφής από το σύμπλοκο Cdt1-Geminin. Το ετεροτριμερές σύμπλοκο Cdt1: 2x Geminin) επιτρέπει την αδειοδότηση του DNA, ενώ το εξαμερές (2x [Cdt1: 2x Geminin]) αναστέλλει την αδειοδότηση (τροποποιημένη από DeMarco et al., 2009). 27

1. Εισαγωγή 1.8 Ο ρόλος των κύριων ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου, Cdt1 και Geminin, στη διατήρηση της γονιδιωματικής ακεραιότητας και στην κακοήθη εξαλλαγή Ένας μηχανισμός μέσω του οποίου προκύπτουν οι καρκινικοί όγκοι είναι η γονιδιωματική αστάθεια. Όπως θα περίμενε κανείς, οποιαδήποτε απορύθμιση του συστήματος αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA, καθώς επίσης και των μηχανισμών που ελέγχουν αυτή τη διαδικασία, μπορεί να οδηγήσει σε επαναντιγραφή του DNA με αποτέλεσμα την γονιδιωματική αστάθεια και τελικά τον καρκίνο. Στην παρακάτω εικόνα συνοψίζονται οι μηχανισμοί αποτροπής ελέγχου της αντιγραφής του DNA και του προαντιγραφικού συμπλόκου, στα κύτταρα των θηλαστικών. Εικόνα 1.7: Μηχανισμοί αποτροπής της επαναντιγραφής του DNA σε κύτταρα θηλαστικών. Στο κέντρο της εικόνας φαίνεται το προαντιγραφικό σύμπλοκο (pre-rc), το οποίο είναι απαραίτητο για την έναρξη της αντιγραφής. Τα μονοπάτια σημειωμένα με μαύρο χρώμα είναι γνωστό ότι αναστέλλουν το σχηματισμό του προαντιγραφικού συμπλόκου και με αυτόν τον τρόπο αναστέλλουν την επαναντιγραφή του DNA. Τα μονοπάτια που φαίνονται με διακεκομμένη γραμμή αναστέλλουν επίσης το σχηματισμό του προαντιγραφικού συμπλόκου, αλλά δεν έχει δειχθεί ότι είναι ικανά να αναστείλλουν την επαναντιγραφή του DNA. Οι κόκκινοι κεραυνοί δηλώνουν τα μονοπάτια που ενεργοποιούνται μετά από βλάβη στο DNA (από Hook et al., 2007). 28