'~ Πανεπιστήμιο Ιωαωίυων Σχολή Θετικών Επιστημών Τμήμα Χημείας ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΙΟΝΤΩΝ ΝΙ(ΙΙ) ΚΑΙ Cu(ΙΙ) ΜΕ ΙΙΕΙΙΤΙΔΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΤΗΣ ΙΣΤΟΝΗΣ Η2Β Μελέτη των Μηχανισμών Τοξικότητας κατ Καρκτνογενεσης που Προκαλούνται από Μεταλλικά Ιόντα Διδακτορική Διατριβή Κίμων Ξ. Ζαβιτσάνος Χημικός ΙΩΑΝΝΙΝΑ 2009 κqδ, ΕΡrοΥ: 62
Περίληψη περίληψη Είναι ευρέως τεκμηριωμένο ότι πολλά μεταλλικά ιόντα των στοιχείων μετάπτωσης, όπως το νικέλιο και ο χαλκός, είναι καρκινογόνα για τον άνθρωπο και άλλα Θηλαστικά. Οι μοριακοί μηχανισμοί, με τους οποίους επιτυγχάνεται η καρκινογένεση από μεταλλικά ιόντα δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Παρόλα αυτά, πιστεύεται ότι σχετίζεται με καταστροφή τον DNA και/ή επιγενετικές μεταβολές που πηγάζουν από την δέσμευση των ιόντων στον πυρήνα τον κυττάρου. Είναι γνωστό ότι τα ιόντα Ni(ΙΙ), δεσμεύονται ασθενώς από τις φωσφορικές ομάδες τον DNA και τα φωσφολιπίδια των κυτταρικών μεμβρανών. Για το λόγο αυτό, οι πυρηνικές πρωτεϊνες και πιο συγκεκριμένα οι ιστόνες, που απαντούν σε υψηλότερη συγκέντρωση εντός του πυρήνα, είναι οι κύριοι υποψήφιοι υποκαταστάτες για δέσμευση του μετάλλου. Αντίθετα, τα ιόντα Cu2+, δεσμέυονται ισχυρά τόσο με τις βάσεις τον DNA, όσο και με πεπτιδικά μοντέλα ιστονών. Εντός τον πυρήνα τον κυττάρού, τα 2 αυτά συστατικά ανταγωνίζονται ως προς τη δέσμευση τον μετάλλου. Υπάρχουν αρκετά στοιχεία που συνηγορούν στο γεγονός ότι το νικέλιο μπορεί να εμπλακεί στις χημικές τροποποιήσεις που λαμβάνουν χώρα φυσιολογικά στις ιστόνες και κατ' αυτόν τον τρόπο να απορρυθμίσει την διαχείριση της γενετικής πληροφορίας. Επιπροσθέτως, η δημιουργία συμπλόκων τον μετάλλου με τμήματα ιστονών που παρουσιάζουν αυξημένη οξειδοαναγωγική ικανότητα, μπορεί να προκαλέσει αυξημένη παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου που δρούν απευθείας πάνω στο DNA. Ο χαλκός, δεδομένου ότι παρουσιάζει πιο πλούσια οξειδοαναγωγική χημεία από το νικέλιο, μπορεί να οδηγήσει άμεσα σε αυξημένη παραγωγή τέτοιων επιβλαβών προϊόντων, όταν βρίσκεται σε περίσσεια εντός του οργανισμού. Πάντως, όταν συμπλέκεται με ιστόνες ή προταμίνες μπορεί είτε να καταλύσει την δημιουργία τέτοιων ειδών, υποβοηθώντας την καταστροφή τον DNA, είτε να δράσει προστατευτικά και να μειώσει την έκταση της οξειδωτικής βλάβης. Στη διεθνή βιβλιογραφία, υπάρχουν πολλές μελέτες αλληλεπίδρασης πεπτιδικών μοντέλων των πυρηνικών ιστονών Η3, Η4 και Η2Α, με Νί2+ και Cu2+. Αντίθετα, η ιστόνη Η2Β, δεν έχει μελετηθεί διεξοδικά, παρόλο που πρόσφατες έρευνες έχουν δείξει ότι το νικέλιο μπορεί να επιδράσει όχι μόνο στις χημικές τροποποιήσεις που λαμβάνουν χώρα σε αυτή, αλλά και να προκαλέσει οξείδωση σε διάφορα αμινοξικά κατάλοιπα της πρωτεΐνης. Προκειμένου να διερευνήσουμε τον ρόλο της ιστόνες Η2Β, στην τοξικότητα και καρκινογένεση που προκαλείται από Νί(ΙΙ) και Cu(ΙΙ), συνθέσαμε τα πεπτίδια (SRKQSYSVYVYKVLKQVΗPDTGISSKAMGIM) και ΚΩΔ. ΕΡΓΟ Η2Β32-62 Η2Β9α-ι25 175 2
περίληψη (IQTAVRLLLPGELAKHAVSEGTKAVTKYTSSK), τα οποία αποτελούν μοντέλα της ιστονικής πτύχωσης και C-τελικής ουράς της ιστόνης Η2Β, αντίστοιχα, και μελετήσαμε την αλληλεπίδραση τούς με Ν1(ΙΙ) και Cu(ΙΙ). Η πεπτιδική σύνθεση πραγματοποιήθηκε σε στερεή φάση με την Fmoc / tbu μεθοδολογία. Ο καθαρισμός των επιθυμητών πεπτιδικών προϊόντων, επιτεύχθηκε με χρωματογραφικές τεχνικές (gel fιltration, RP-HPLC) και η ταυτοποίηση τους έγινε με φασματοσκοπία μάζας (ESI-MS) και φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR). Η αλληλεπίδραση των πεπτιδίων με Νί(ΙΙ) και Cu(ΙΙ), μελετήθηκε με ποτενσιομετρικές τιτλοδοτήσεις και διάφορες φασματοσκοπικές τεχνικές (UV-Vis, CD, EPR, NMR), ενώ η μελέτη της επίδρασης των συμπλόκων στην διάσπαση της διπλής έλικας τον DNA, πραγματοποιήθηκε με ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη, χρησιμοποιώντας ως στόχο το πλασμίδιο puc 19. Η αναπάντεχη καταβύθιση του ελεύθερου πεπτιδίου Η2Β32-62, σε ph> 7,8 δεν επέτρεψε τον υπολογισμό των σταθερών ιονισμού των καταλοίπων Lys και Tyr. Η καταβύθιση ήταν εμφανής και στα διαλύματα που περιείχαν Ni(ΙΙ), υποδηλώνοντας ότι το πεπτίδιο αυτό δεν συμπλέκεται αποτελεσματικά με τα ιόντα Ni(ΙΙ). Εντούτοις, η μελέτη της οξειδωτικής συμπεριφοράς τον συστήματος Η2Β32-62/Νί(ΙΙ)/Η2Ο2 είναι αρκετά διαφορετική από αυτή του συστήματος Ν1(1Ι)/Η202, όσον αφορά την ικανότητα τους να προάγουν διάσπαση της διπλής έλικας και αποικοδόμηση τον πλασμιδίού puc19. Συγκεκριμένα, παρουσία τον πεπτιδίου, παρατηρήθηκε ελάττωση στην αποικοδόμηση τον πλασμιδιακού DNA σε μικρά τμήματα, με ταυτόχρονη όμως αύξηση στην συχνότητα διάσπασης της διπλής έλικας. Τα δύο αυτά φαινόμενα, αποδίδονται στην ισχυρή σύμπλεξη τον πεπτιδίου με το πλασμιδιακό DNA, η οποία δημιουργεί ένα προστατευτικό στρώμα γύρω από αυτό. Όσον αφορά την αύξηση της συχνότητας εμφάνισης σχάσεων στην διπλή έλικα, αυτή αποδίδεται σε άλκνλο και περόξυρίζες που δημιουργούνται από την περαιτέρω οξείδωση των σουλφοξειδίων μεθειονίυης του πεπτιδίου, δεδομένου ότι από την βιβλιογραφία είναι γνωστό ότι το Ni(ΙΙ) προκαλεί διάσπαση μόνο της μιας έλικας. Σε αντίθεση με το Ni(ΙΙ) η σύμπλεξη με τα ιόντα Cu(ΙΙ) είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική. Η καταβύθιση που παρατηρήθηκε στα διαλύματα τον ελεύθερου υποκαταστάτη απομακρύνεται και μια σειρά ευδιάλυτων συμπλόκων τον εν λόγω πεπτιδίου με Cu(ΙΙ), ανιχνεύονται στην ρη-μετρική κλίμακα 4-10,5. Σε φυσιολογικές τιμές ρη, τα κύρια σχηματιζόμενα είδη είναι δύο 3Ν σύμπλοκα, που χαρακτηρίζονται από έναν τρόπο ένταξης του τύπον {Νι, 2Ν} και διαφέρουν μόνο ως προς την επιπλέον σύμπλεξη της καρβοξυλομάδας του Asp20 σε αξονική 176 πενεδ 03 ΚΩΔ. ΕΡΓΟΥ: 52
Περίληψη θέση. Τα σύμπλοκα αυτά είναι οξειδοαναγωγικά ενεργά, δεδομένου ότι ενισχύουν την οξειδωτική διάσπαση τον πλασμιδιακού DNA και την αύξηση στη συχνότητα σχάσης της διπλής έλικας. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται στην εν λόγω διατριβή, υποδεικνύουν ότι η σύμπλεξη τον Cu(ΙΙ) με το πεπτίδιο Η2Β32.62, μπορεί να συνδέεται άμεσα με την καρκιυογένεση που προκαλείται από την οξείδωση τον DNA, μέσω ελευθέρων ριζών. Η σύμπλεξη τον πεπτιδικού μοντέλου Η2Β9α425 με Ν1(ΙΙ), ξεκινάει σε ρη περίπου ίσο με 5 με το σχηματισμό ενός παραμορφωμένου οκταεδρικού συμπλόκου του τύπου{ν1ιη }. O σχηματισμός των επίπεδων τετραγωνικών συμπλόκων του Ni(ΙΙ) ξεκινάει σε ρη > 8 ενώ η πλήρης συμπλοκοποίηση του ελεύθερου Ν1(ΙΙ), επέρχεται σε ρη περίπου ίσο με 10. Ο σχηματισμός τον επίπεδου τετραγωνικού συμπλόκου, μελετήθηκε με φασματοσκοπία NMR και η επίλυση της δομής τον με το οκταπεπτιδικό τμήμα G1u12-Leu13-A1a14-Lys15-Hisι6Α1α17-Va118-Ser19-, κατέστη δυνατή από τις παρατηρούμενες ΝΟΕ συζεύξεις. Δυστυχώς, η έλλειψη σημαντικού αριθμού ΝΟΕ συζεύξεων δεν επέτρεψε τον υπολογισμό της δομής όλον του πεπτιδικού τμήματος, υπάρχουν όμως ενδείξεις ότι κατά την σύμπλεξη επηρεάζεται και το C-τελικό τμήμα του πεπτιδίου, το οποίο τείνει να προσεγγίσει το επίπεδο τον συμπλόκου. Μία τέτοια δομική μεταβολή, εάν συμβεί υπό φυσιολογικές συνθήκες μπορεί να εμπλακεί με την διαδικασία ονβικιτίνωσης τον καταλοίπου Lyst20. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι το νικέλιο επηρεάζει την ουβικιτίνωση της εν λόγω Lys σε κύτταρα, χωρίς όμως να έχει προταθεί κάποιος μηχανισμός για την ανωτέρω διαδικασία. Τα πειραματικά μας δεδομένα, μας επιτρέπουν να υποδείξουμε έναν μηχανισμό, όπου η ουβικιτίνωση επηρεάζεται λόγω της σύμπλεξης του μετάλλου στην His16 τον πεπτιδίου Η2Β9α425 Το γεγονός ότι παρουσία του πεπτιδίου, η οξειδωτική καταστροφή που πραγματοποιείται στο πλασμιδιακό DNA, από τις ελεύθερες ρίζες που παράγονται κατά την αντίδραση Fenton μεταξύ Νί(ΙΙ) και Η2Ο2, είναι μικρότερη, υποδηλώνει ότι εάν το εν λόγω πεπτιδικό τμήμα εμπλέκεται στη διαδικασία καρκιυογένεσης, ο μηχανισμός πρέπει να οφείλεται σε επιγενετικές μεταβολές και όχι σε καταστροφή του DNA λόγω αυξημένης παραγωγής ROS σωματιδίων. Το πεπτίδιο Η2Β9α.125 αλληλεπιδρά ιδιαίτερα αποτελεσματικά με τα ιόντα Cu(H). Η ποτενσιομετρία ανιχνεύει μια σειρά συμπλόκων στην ρη-μετρική κλίμακα 4-11,5. Σε φυσιολογικές τιμές ρη, το κύριο σχηματιζόμενο είδος είναι ένα 3Ν σύμπλοκο με τρόπο ένταξης {Nim, 2Ν-}, το οποίο όμως σε αντίθεση με το αντίστοιχο σύμπλοκο τον πεπτιδίου Η2Β32-62 δεν καταλύει την αποικοδόμηση τον πλασμιδιακού DNA, αλλά δρα προστατευτικά ως προς αυτό. Παρόλα αυτά, είναι πιθανό το σύμπλοκο τον χαλκού να επιφέρει την ίδια ΙW1ΝεΔ ρ3 ΚΩΔ. ΕΡΓΟΥ: β2 ι77
Περίληψη δομική μεταβολή στην C-τελική ουρά τον πεπτιδίον, που παρατηρήσαμε για το 4Ν σύμπλοκο του νικελίού και να εμπλακεί, μέσω τον ίδιου μηχανισμού, με την ουβικιτίνωση της Lysι2o. Πιστεύουμε ότι τα στοιχεία που παρουσιάζονται στην εν λόγω διατριβή, μπορούν να βοηθήσουν σε μια βαθύτερη κατανόηση στον ρόλο της ιστόνης Η2Β, στους μηχανισμούς τοξικότητας καιή καρκινογένεσης που προκαλούνται από μεταλλικά ιόντα. 178 KQA. ΕΡΓΟΥ: 62